1

Semnalizarea celulara Moleculele extracelulare semnalizatoare sunt recunoscute de receptori specifici situati pe sau in celula tinta Faptul ca mecanismele de semnalizare intercelulara au existat cu mult inainte ca organismele pluricelulare sa apara , este ilustrat de drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae). Desi, in mod normal, celulele de drojdie duc o viata independenta, ele comunica cind se pregatesc pentru imperechere sexuata. Cind un individ haploid ce prolifereaza prin inmugurire este pregatit pentru imperechere, el secreta un peptid-factorul de imperechere, ce semnalizeaza celulelor de sex opus sa inceteze proliferarea si sa se pregateasca pentru conjugare. Are loc apoi fuziunea a doua celule haploide de sex opus pentru a produce o celula haploida ce va suferi procesul de meioza si sporulare pentru a genera noi celule haploide cu un nou set de gene. Daca celulele de drojdie comunica prin secretia citorva tipuri de peptide mici, animalele superioare comunica prin intermediul a sute de molecule semnalizatoare ce includ proteine, peptide mici, aminoacizi, nucleotide, steroizi, retinoizi, derivati ai acizilor grasi si chiar gaze dizolvate ca oxidul de azot si monoxidul de carbon. Majoritatea acestor molecule semnalizatoare sunt secretate de celula semnalizatoare prin exocitoza. Altele sunt eliberate prin difuzie prin membrana plasmatica in timp ce unele ramin strins legate de membrana plasmatica si influienteaza numai celulele ce vin in contact cu celula semnalizatoare . Indiferent de natura semnalului, celula tinta raspunde prin intermediul unei proteine specifice numite receptor. Aceasta leaga specific molecula semnalizatoare si initiaza un raspuns in celula tinta. Multe din moleculele extracelulare semnalizatoare actioneaza in concentratii foarte mici (in general ≤ 10-8M) iar receptorii care le recunosc, le leaga cu o afinitate foarte mare (constanta de afinitate Ka ≥ 108 litri/mol). In cele mai multe cazuri, receptorii sunt proteine transmembranare situate la suprafata celulei tinta; cind leaga molecula extracelulara semnalizatoare (ligandul), ele se activeaza, generind o cascada de semnale intracelulare care altereaza comportamentul celulei. In unele cazuri totusi receptorii sunt situati in interiorul celulei tinta si ligandul semnalizator trebuie sa patrunda in celula pentru a o activa; aceste molecule trebuie sa fie deci hidrofobice si suficient de mici pentru a difuza prin membrana plasmatica.

2

NO semnalizeaza prin legarea directa de o enzima in interiorul celulei Desi majoritatea semnalelor extracelulare sunt mediate de molecule hidrofile ce se leaga de receptori la suprafata celulei tinta, unele molecule semnalizatoare sunt suficient de hidrofobice si/sau suficient de mici pentru a trece direct prin membrana plasmatica a celulei tinta; odata patrunse in interior, ele regleaza acivitatea proteinelor intracelulare specifice. Oxidul nitric (NO) gazos, recunoscut doar relativ recent in calitatea sa de molecula semnalizatoare la vertebrate, este un exemplu remarcabil in acest sens. Cind acetilcolina este eliberata de nervii autonomi in peretii vaselor sanguine, aceasta determina relaxarea muschilor din peretii vasulului. Acetilcolina actioneaza indirect, determinind celulele endoteliale sa elibereze NO care semnalizeaza apoi celulelor muschiului neted sa se relaxeze. Acest efect al NO asupra vaselor sanguine explica mecanismul de actiune al nitroglicerinei, utilizata de peste 100 de ani in tratamentul anginei pectorale. Nitroglicerina este convertita in NO care relaxeaza vasele sanguine din inima, asigurind cresterea fluxului sanguin spre muschiul cardiac. NO este deasemenea produs ca mediator local de neutrofilele si macrofagele activate pentru a ucide microorganismele invadatoare. In plus, este utilizat de multe tipuri de celule nervoase pentru a trimite semnale spre celulele vecine: NO eliberat de nervii autonomi din penis, de exemplu, determina dilatarea locala a vaselor sanguine responsabile pentru erectie.

Exista date recente ca si monoxidul de carbon (CO) este deasemenea utilizat ca semnal intercelular , actionind in acelasi mod cu NO, respectiv stimulind enzima intracelulara guanilil ciclaza. Hormonii steroizi, hormonii tiroidieni, retinoizii si vitamina D se leaga de receptori intracelulari ce sunt proteine reglatoare de gene, activate de ligand. Hormonii steroizi, hormonii tiroidieni, retinoizii si vitamina D sunt molecule hidrofobice mici ce difera mult una de alta prin structura chimica si functia lor.

Cu toate aceste, mecanismul lor de actiune este similar. Ele difuzeaza direct prin membrana plasmatica a celulei tinta si se leaga de proteinele intracelulare receptoare. Asocierea de ligand activeaza receptorii, care regleaza apoi direct transcriptia unor gene specifice. Acesti receptori sunt inruditi structural si constituie superfamilia receptorilor intracelulari (sau superamilia receptorilor pentru hormonii steroizi)

3

Tehnicile ADN-ului recombinant au revolutionat studiul receptorilor si al proteinelor membranare implicate in semnalizarea celulara. Intrucit aceste proteine constituie sub 0.01% din masa totala a proteinelor celulare, izolarea si purificarea lor a fost extrem de dificila. Clonarea secventelor ADN ce codifica aceste proteine a accelerat mult caracterizarea lor si majoritatea proteinelor semnalizatoare descrise in acest capitol au fost descrise in acest mod. O contributie majora a acestor studii de clonare si secventializare a ADN a fost relevarea faptului ca diversitatea coplesitoare a proteinelor receptoare cunoscute poate fi redusa la un numar mic de familii largi. Receptorii intracelulari constituie o asemenea familie. O serie de alte familii constituie marea clasa a receptorilor localizati pe suprafata membranara. Toate moleculele semnalizatoare solubile in apa (incluzind neurotransmitatorii, proteinele hormonale si proteinele factorilor de crestere) precum si cele solubile in lipide, se leaga de proteinele receptoare specifice de la suprafata celulei tinta. Aceste proteine receptoare de la suprafata celulei actioneaza ca traductori de semnal: leaga cu afinitate mare ligandul semnalizator si convertesc acest eveniment extracelular intr-unul sau mai multe semnale intracelulare ce moduleaza/altereaza comportarea celulei tinta. Proteinele receptoare de pe suprafeta membranei sunt asociate structural si transmit mesajul receptionat catre interiorul celulei (proteinelor efectoare) prin intermediul 1/canalelor ionice, 2/proteinei G si 3/enzimelor. Majoritatea receptorilor de la suprafata celulei apartin uneia din cele trei clase, ce se deosebesc dupa mecanismul de traducere folosit. Receptorii legati de canalele ionice, cunoscuti si sub numele de canale ionice “transmitter-gated” sunt implicate in semnalizarea sinaptica rapida intre celulele excitabile. Acest tip de semnalizare este mediat de un numar restrins de neurotransmitatori care inchid sau deschid tranzitoriu canalul ionic format de proteina de care acestia se leaga, schimbind, pentru scurt timp, permeabilitatea membranei plasmatice, respectiv excitabilitatea celulei postsinaptice. Receptorii legati de canalul ionic apartin familiei proteinelor omoloage transmembranare multipass. Receptorii legati de proteina G actioneaza indirect pentru reglarea unei proteine tinta asociate membranei plasmatice, ce poate fi o enzima sau un canal ionic. Interactia intre receptor si proteina tinta este mediata de o a treia proteina reglatoare trimerica ce leaga GTP (proteina G). Activarea proteinei tinta poate altera concentratia unuia sau mai multor mediatori intracelulari (daca proteina tinta este o enzima) sau altereaza permeabilitatea ionica a membranei plasmatice (daca proteina tinta este un canal ionic). Mediatorii intracelulari pot altera, la rindul lor, comportarea altor proteine in celula. Toti receptorii legati de proteina G apartin marii superfamilii de proteine omoloage transmembranare 7-pass.

4

Receptorii legati de enzime functioneaza, la activare, fie direct ca enzime, fie in asociere cu enzime. Majoritatea sunt proteine membranare single-pass, cu situs-ul pentru atasarea ligandului situat in afara celulei si cu situs-ul catalitic –spre interior. Majoritatea receptorilor legati de enzime sunt protein-kinaze sau sunt asociate cu protein kinazele care fosforileaza seturi specifice de proteine in celula tinta. Receptorii activati de la suprafata celulara declanseaza atasarea gruparilor-fosfat la o retea de proteine celulare Modul de operare al receptorilor legati de proteina G sau de enzime este urmatorul: semnalele primite la suprafata celulara de aceste tipuri de receptori sunt deseori dirijate prin relee proteice spre nucleul celular, unde altereaza expresia unor gene specifice, alterind astfel comportamentul celulei. Seturi complicate de proteine intracelulare semnalizatoare constituie asemene relee. Majoritatea acestor proteine apartin uneia din cele doua categorii: 1/proteine ce sunt fosforilate de protein kinaze si 2/proteine ce sunt determinate sa se lege de GTP la sosirea semnalului. In ambele cazuri proteinele primesc unul sau mai multi fosfati in starea lor activata si pierd fosfatii la disparitia semnalului. Aceste proteine determina la rindul lor fosforilarea unui flux consecutiv de proteine in cadrul scenariului denumit “cascada fosforilarii”. Cascada fosforilarii este mediata de doua tipuri principale de protein-kinaze: serin/treonin kinazele, ce fosforileaza proteinele pe serinele si treoninele acestora si tirozin kinazele, ce fosforileaza proteinele pe tirozine. Ocazional, anumite kinaze functioneaza in ambele moduri. Se estimeaza ca cca 1% din genele noastre codifica protein- kinaze si o singura celula de mamifer poate contine pina la 100 de asemenea enzime, din care majoritatea serin/treonin –kinaze. Raspunsuri celulare complexe, cum ar fi supravietuirea sau proliferarea, sunt, in general, stimulate mai degraba de combinatii specifice de semnale decit de un semnal singular. Celula trebuie sa integreze informatia ce vine de la semnale separate pentru a elabora raspunsul adecvat: sa ramina in viata sau sau sa moara, sa prolifereze sau sa ramana in repaos. Aceasta integrare pare sa depinda de interactia dintre diferite cascade de fosforilare a proteinelor care sunt activate de diferite semnale extracelulare. Unele din proteinele din aceste cascade functioneaza ca dispozitive de integrare, echivalente microprocesoarelor dintr-un computer: ca raspuns la intrari de semnal multiple, acestea produc o iesire calibrata pentru producerea efectului biologic dorit. Exemple a doua moduri de operare a protinelor de integrare sunt date in fig.15-16. Complexitatea acestor sisteme semnal-raspuns ce contin relee multiple de proteine semnalizatoare in interactie este coplesitoare. Totusi tehnologia ADN-ului recombinant, impreuna cu analiza genetica clasica efectuate la Drosofila, la

5

nematodul C.elegans si drojdii, precum si metodele biochimice si farmacologice mai conventionale, contribuie rapid la descifrarea detaliilor intricate ale acestor mecanisme prin care proteinele receptoare activate modifica comportamentul celulei. Receptorii dependenti de proteina G Receptorii dependenti de proteina G constituie cea mai mare familie a receptorilor de la suprafata membranei celulare. Peste 100 din membri ei s-au ientificat la mamifere.prin tehnica ADN-ului recombinant; o biblioteca de molecule cADN preparate din celule si tesuturi ce exprima receptorul respectiv este copiata in molecule de ARN ce sunt apoi injectate in ovocite de Xenopus. Ovocitele traduc moleculele de ARN in proteine. Aceste proteine sunt apoi inserate in membrana plasmatica unde sunt detectate prin proprietatile lor de asociere cu ligandul sau de activare a celulei. Receptorii dependenti de proteina G mediaza raspunsul celular la o diversitate enorma de molecule semnalizatoare variate din punct de vedere structural si functional ce include hormonii, neurotransmitatorii si mediatorii locali; lista lor include proteine si peptide mici precum si acizi aminati si derivati ai acizilor grasi. Acelasi ligand poate activa multi membri diferiti ai familiei. De exemplu, cel putin 9 receptori diferiti dependenti de proteina G sunt activati de adrenalina, altii 5 sunt activati de acetilcolina si cel putin 15-de serotonina. In ciuda duversitatii chimice si functionale a moleculelor semnalizatoare pe care le leaga, toti receptorii dependenti de prot.G a caror secventa de aminoacizi s-a determinat prin secventializare de ADN, au o structura similara si sunt aproape sigur corelati evolutiv. Toti constau dintr-un singur lant polipeptidic ce taverseaza membrana bistratul lipidic de 7 ori. Din aceeasi superfamilie a proteinelor receptoare transmembranare seven-pass face parte si rodopsina-proteina activata de lumina - din retina vertebratelor precum si receptorii olfactivi din mucoasa nasala a vertebratelor. Alti membri ai familiei ii gasim la organismele unicelulare: receptorii din drojdii ce recunosc factorul de imperechere al drojdiilor sau bacteriorodipsina – pompa de H+ activata de lumina din bacteriile Halobacterium Halobium. Toate aceste date pledeaza pentru faptul ca receptorii dependenti de prot.G ce mediaza semnalizarea intercelulara in organismele pluricelulare au evoluat din receptorii senzoriali ai stramosilor lor unicelulari. Membrii acestei familii de receptori si-au conservat nu numai secventa de aminoacizi dar si relatia lor functionala cu proteina G prin intermediul careia semnalizeaza in interiorul celulei prezenta ligandului extracelular. Secventa intracelulara a evenimentelor ce incepe cu activarea proteinei G va fi analizata in cele ce urmeaza. Proteinele G trimerice difuzeaza semnalul dinspre receptorii membranari dependenti de proteina G catre interorul ccelulei, activand proteine efectoare specifice (enzime, canale etc).

6

Proteinele trimerice ce se leaga de GTP (proteinele G) cupleaza functional acesti receptori de enzimele tinta sau canalele ionice din membrana plasmatica. Aceste proteine sunt GTPaze si functioneaza drept comutatoare moleculare ce oscileaza intre doua stari: activa, cind sunt legate de GTP si inactiva, cind nu sunt legate de GTP. Activa inseamna in acest context starea in care molecula actioneaza drept semnal pentru declansarea altor evenimente in celula. Cand ligandul extracelular se leaga de receptorul dependent de proteina G, receptorul isi schimba conformatia, legindu-se de proteinele G trimerice, determinindu-le sa elimine GDP-ul (de care sunt legate in lipsa semnalului) pe care il inlocuiesc cu un GTP. Inactivarea se produce cind proteina G isi hidrolizeaza propriul GTP, convertindu-l in GDP. Inainte ca aceasta sa se intimple, proteinele au insa timpul sa difuzeze dinspre receptor, eliberindu-si mesajul catre tintele intracelulare. Majoritatea receptorilor dependenti de proteina G activeaza un lant de evenimente ce altereaza concentratia uneia sau mai multor molecule semnalizatoare mici intracelulare. Aceste molecule mici, numite de regula, mediatori intracelulari (sunt numiti, deasemenea, mesageri intracelulari sau mesageri secundari) transmit la rindul lor semnalul prin alterarea comportamentului anumitor proteine celulare. Doi dintre cei mai utilizati mediatori celulari sunt AMP-ul ciclic si Ca2+. Majoritatea receptorilor dependenti de proteina G regleaza concentratia unuia dintre acestia sau a ambilor. Unii receptori induc cresterea AMP-ului ciclic intracelular prin activarea adenil ciclazei cu ajutorul proteinei G stimulatoare (Gs) AMP-ul ciclic a fost pentru prima data identificat ca mediator intracelular al actiunii hormonale in 1950 si de atunci s-a gasit ca actioneaza ca molecula semnalizatoare intracelulara in toate celulele animale si procariote care s-au studiat. Ca AMP-ul ciclic sa functioneze ca mediator intracelular, trebuie ca concentratia sa intracelulara (in mod normal ≤ 10-7M) sa poata sa creasca si sa scada rapid ca raspuns la semnalele extracelulare; in stimularea hormonala, nivelul AMPului ciclic se poate modifica de 5 ori in decursul citorva secunde. O asemenea viteza de raspuns necesita ca sinteza rapida a moleculei sa fie echilibrata de descompunerea si indepartarea ei rapida. AMP-ul ciclic este sintetizat din ATP de catre enzima adenilat-ciclaza legata de membrana si este rapid si continuu distrus de una sau mai multe fosfodiesteraze ale AMP-ului ciclic, care hidrolizeaza AMP reducindu-l la adenosin 5’-monofosfat (5’-AMP). Multe molecule semnalizatoare extacelulare actioneaza prin controlul nivelului de AMP ciclic; ele fac asta alterind activitatea adenilciclazei mai degraba decit a fosfodiesterazei. Toti liganzii care activeaza adenilciclaza intr-un tip dat de celule tinta, produc, de regula, acelasi efect; de exemplu, cel putin patru hormoni diferiti activeaza adenil ciclaza din celulele grase, toti patru stimulind descompunerea

7

trigliceridelor (forma de stocare a gasimilor) pina la acizi grasi (vezi tabelul). Diferitii receptori pentru acesti hormoni activeaza o colectivitate comuna de molecule de adenil ciclaza, la care se cupleaza prin intermediul proteinei G trimerice. Deoarece proteina G determina o activare a unei enzime, ea se numeste proteina G stimulatoare (Gs). Indivizii deficienti genetic in proteina Gs prezinta raspunsuri scazute la anumiti hormoni, ceea ce duce la anomalii metabolice, dezvoltare anormala a sistemului osos si retardare mintala. Cele mai bine studiate exemple de receptori cuplati la activarea adenil-ciclazei sunt receptorii β–adrenergici, care mediaza unele din actiunile adrenalinei si noradrenalinei. Sistemul adenilciclaza activat de adrenalina poate fi reconstituit in vezicule fosfolipidice sintetice, utilizind receptori β-adrenergici, Gs si molecule de adenil ciclaza, ceea ce arata ca aceste trei proteine sunt suficiente pentru procesul de activare. Proteinele G trimerice se dezasambeaza la activare O proteina trimerica G se compune din 3 lanturi polipeptidice diferite, respectiv α, β si γ. Lantul α al proteinei Gs (αs) este legat de GDP in forma sa de repaus, inactiva. Cand proteina receptoare din vecinatatea acestuia leaga molecula semnal pe fata externa a membranei, ea sufera o modificare conformationala favorabila legarii de subunitatea αs a proteinei G pe fata citoplasamatica a membranei. Aceasta cuplare presupune insa inlocuirea GDP-ului cu GTP. In aceasta forma subunitatea αs este activa inducand activitatea enzimei adenilat-ciclaza care produce AMP ciclic. Legarea de adenilat ciclaza favorizeaza insa tranzitia conformaationala inversa catre complexul αs-GDP. Subunitatea αs este deci o GTP-aza capabila sa hidrolizeze GDP in GTP pentru a le inlocui pe unul cu celalalt in functie de contextul molecular/energetic invecinat. Lanturile β si γ ale proteinei Gs formeaza un complex strins (βγ) care se desprinde de subunitatea α, devenind, deasemenea, activ si disponibil pentru legarea de alte proteine de pe fata citoplasmatica a membranei, pentru a le face active. In forma sa inactiva Gs este un trimer cu GDP legat de subunitatea sa αs. Ca celulele sa fie capabile sa raspunda rapid la modificari in concentratia unei molecule semnalizatoare extracelulare, activarea adenilciclazei trebuie sa inceteze rapid indata ce ligandul semnalizator se disociaza de receptor. Aceasta abilitate de a raspunde rapid la schimbare este asigurata prin faptul ca timpul de viata al formei active a αs este scurt: activitatea de GTPaza a αs este stimulata atunci cind aceasta se leaga de adenilciclaza , astfel ca GTP legat este hidrolizat in GDP, lasind inactive αs cit si adenilciclaza. αs se reasociaza apoi cu βγ pentru a reforma o molecula inactiva de Gs. Importanta activitatii GTPazice a αs in oprirea raspunsului se observa, de exemplu, la pacientii suferind de holera, in cazul careia toxinele bacteriene responsabile de simptomele respective inhiba mecanismul de autoactivare al αs.

8

Toxina holerei este o enzima ce catalizeaza transferul ribozei ADP de pe NAD+ intracelular pe αs. Ribozilarea ADP altereaza αs astfel incit aceasta nu mai poate hidroliza GTPul legat. O molecula de adenilciclaza, activata de o asemenea subunitate alterata αs, ramine intr-o stare activa un timp indefinit. Activarea prelungita rezultata a nivelului AMP ciclic in celulele epiteliale intestinale, provoaca un eflux mare de Na+ si apa in lumenul intestinal, provocand diareea severa caracteristica holerei.

*************** Purtatori de informatie in semnalizarea celulara sunt molecule de cele mai diverse categorii structurale precum si stimuli concretizati in diferite forme de energie-mecanica (apasari, vibratii), electroctromagnetica (lumina) si termica. Acestia interactioneaza cu proteine receptoare specifice situate pe suprafata sau in interorul celulei, determinand modificari conformationale ale acestora ce le fac active in sensul capacitatii de a se lega de alte porteine care la randul lor declanseaza o cascada de reactii enzimatice ce sfarseste prin afectarea un proteine tinta cu rol-cheie intr-un proces celular. In functie de modalitatea lor de a raspunde la stimul se disting trei feluri de proteine receptoare Proteinele receptoare ce sunt canale ionice cu poarta Proteinele receptoare asociate proteinelor G si Proteinele receptoare asociate enzimelor Despre receptorii membranari cu rol de canale ionice "transmitter-gated" am discutat anterior. Acestia declanseaza modificari ale potentialului de membrana ce activaza la randul lor canalele "voltage-gated" modificand astfel compozitia ionica celulara care, la randul ei, poarta un mesaj pentru o serie de proteine efectoare intracelulare. Receptorii asociati proteinelor G sunt proteine membranare "7 pass" a caror capat situat la suprafata celulei contine situsul receptor, iar capatul dinspre interiorul celulei sufera, la interactia cu semnalul, o modificare conformationala ce-l determina sa se lege de proteinele G aflate in vecinatate, ancorate pe fata celulara a bistratului lipidic. Contactul dintre cele doua molecule se face prin ciocniri intamplatoare repetate, in cadrul agitatiei termice continue ce aduce in vecinatatea receptorului mereu noi molecule de proteina G. Numai cand capatul intracelular al receptorului este activat (adica are conformatia spatiala corespunzatoare) acesta se poate lega de proteina G, complexul rezultat fiind mai avantajos din punct de vedere energetic. Aceasta asociere induce insa doua evenimente conformationala in proteina G: separarea subunitatii α de complexul βγ si, ca o consecinta, fosforilarea GDP-lui legat de sub. α, transformandu-l in

9

GTP. Subunitatea α fosforilata devine astfel activa si este capabila, la randul ei, sa activeze canale ionice cu poarta, sa activeze enzime importante pentru semnalizarea celulara sau sa declanseze un lant de fosforilari succesive ale unor proteine ce devin astfel active si pot determina diferite efecte metabolice, la nivelul citoscheletului sau la nivelul transcriptiei genetice. Legarea de proteinele (enzimele) tinta are loc, deasemenea, in cadrul ciocnirilor termice intamplatoare, astfel ca o singura proteina G poate activa sute de proteine pe secunda, la fel cum capatul intracelular al proteinei receptoare poate activa sute de subunitati α pe secunda. Astfel are loc pe langa o propagare succesiva, si o amplificare a semnalului initial. Complexul subunitatilor βγ, odata desprins de subunitatea α, devine si el capabil sa activeze alte proteine aflate in preajma, pe fata interna (citoplasmatica) a membranei. Exista o varietate structurala de proteine G in functie de enzimele pe care le activeaza. Desi inrudite ca structura de baza, ele prezinta deosebiri care le permit "adaptarea" la stuctura substratului pe care il activeaza. De cele mai multe ori, efectul interventiei proteinei G este fie cresterea fie scaderea concentratiei intracelulare a unor mesageri secundari-molecule mici cu rol esential in monitorizarea unor procese celulare-cheie. Exemplele cele mai importante de mesageri secundari sunt: cAMP, cGMP, Ca2+, inositol-trifosfatul (IPPP). Reglarea concentratiei de cAMP si cGMP se face prin activarea enzimelor adenilat-ciclaza, respectiv guanilat-ciclaza sau a enzimelor fosfodiesteraze, care descompun continuu acesti mesageri cu structura ciclica. Trebuie subliniat ca in celula, ciclazele si fosfodiesterazele lucreaza continuu pentru sinteza si descompunerea acestor compusi ciclici, iar interventia proteinei G consta doar in accentuarea unuia dintre procese prin modularea (activarea) enzimei ciclaza sau fosfodiesteraza. Astfel concentratia de echilibru a mesagerului rezultata din activitatea celor doua enzime se deplaseaza fie spre cresterea, fie spre diminuarea concentratiei mesagerului. O alta enzima pe care o poate activa legarea de subunitatea α-GTP este lipaza, implicata in eliberarea trifosfat inositolului, un alt mesager intracelular important. Daca receptorul insusi este o proteina transmembranara cu rol de enzima, interactia cu molecula semnal nu poate induce modificari conformationale semnificative intrinseci la nivelul acesteia, intrucat enzimele din membrane sunt de regula proteine single-pass. De cele mai multe ori, activarea proteinei prin legarea de molecula semnal o face apta de dimerizarea cu o molecula vecina identica, dimerul astfel format capatand activitatea enzimatica ce lipsea inainte. Enzimele asfel rezultate se numesc kinaze, avand rol in fosforilarea unor aminoacizi specifici de pe lantul polipeptidic al unor proteine celulare cu rol functional important. Cele mai raspandite sunt treonin , serin si tirozin-kinazele. Fosforilarea proteinelor efectoare intracelulare, cu rol cheie in diferite procese

10

celulare le declanseaza acivitatea. Evident, ca eficienta activarii unor proteine depinde si de posibilitatea rapida a dezactivarii lor; aceasta are loc prin activitatea continua a fosfatazelor ce descompun compusii fosforilati respectivi, facand proteinele apte pentru a primi noi semnale. Proteinele Ras Exisenta unei proteine mici denumita Ras, atasata pe fata citoplasmatica a membranei este legata de medierea proliferarii celulare in cazul vindecarii plagilor. Ras devine activa si semnalizeaza proliferarea celulara cand este fosforilata in urma legarii factorului de crestere (PDGF) de receptorul tirozinikinaza. Semnalizarea proliferarii are loc prin declansarea unei cascade de fosforilari succesive in care etapa finala consta in fosforilare unei proteine ce regleaza transcriptia genica. Aceasta modifica expresia genelor din zona respectiva, ceeace poate stimula proliferarea sau diferentierea celulara . Cca 30% din tipurile de cancer uman prezinta gene Ras mutante iar multe alte tipuri de cancer sunt legate deasemenea de mtatii ale genelor ce codifica proteine in calea de semnalizare Ras. de aceea genele ce codifica proteinele normale din cascada de semnalizare Ras se numesc proto-oncogene intrucat ele pot deveni oncogene prin mutatie. Implicarea curenta in cancer a genelor mutante responsabile pentru proteine celulare semnalizatoare reflecta o alterare a comunicarii celulare ce asigura, in organismul sanatos, coordonarea necesara unei colectivitate celulare stabile. Olfactia si vederea depind de receptori legati de proteina G si de canale ionice “cyclic nucleotide-gated” Oamenii disting peste 10 000 de mirosuri diferite (odorante), detectate de neuronii olfactivi specializati din mucoasa nazala. Aceste celule recunosc mirosurile cu ajutorul receptorilor olfactivi specifici dependenti de proteina G aflati pe cililii modificati de la suprafata fiecarei celule neuronale olfactive. Multi dintre acesti receptori actioneaza prin intermediul AMP-ului ciclic: cind sunt stimulati prin legarea de odorant, ei activeaza proteina G trimerica olfactiv-specifica (Golf), care activeaza, la rindul sau, adenilat ciclaza; cresterea rezultata a nivelului de AMP provoaca deschiderea canalelor ionice dependente de AMP ciclic ceea ce permite un influx de Na.+ Acesta depolarizeaza celula si initiaza un impuls nervos ce calatoreste prin axon spre creer. Alti receptori olfactivi actioneaza prin intermediul caii fofolipid inozitolului si a canalelor de Ca.2+ dependente de IP3 din membrana plasmatica; acest mecanism de traducere este mai putin cunoascut; va fi mentionat mai tirziu. Se presupune ca exista sute de diferiti receptori olfactivi, fiecare codat de o gena diferita si fiecare recunoscind odoranti diferiti dar cu totii apartin superfamiliei de receptori dependenti de proteina G. Desi se stie ca fiecare celula olfacitiva

11

raspunde la un set specific de odoranti nu se stie inca daca fiecare celula contine un singur tip de receptori ce recunoase un set de odoranti sau fiecare celula contine un set de receptori, fiecare fiind specific penru un singur odorant. Receptorii dependenti de proteinaG par sa medieze si anumite forme de gust dar despre acestia se cunosc mai putine. Canalele ionice “cyclic-nucleotide-gated” sunt implicate, deasemenea, in traducerea semnalului din retina de verebrat dar aici nucleotidul ciclic implicat este GMP ciclic si nu AMP ciclic. Ca si in cazul AMP ciclic, concentratia GMP ciclic din celule este controlata de sinteza (de catre guanililciclaza) si degradarea (de catre fosfodiesteraza GMPului ciclic) rapida a acestuia. In mecanismul de traducere al vederii, activarea receptorului este determinata de lumina, constind in scaderea si nu in cresterea nivelului de nucleotid ciclic. Aceasta cale a fost foarte bine studiata in cazul celulelor fotoreceptoare (bastonaselor ) din retina vertebratelor. Bastonasul fotoreceptor este o celula inalt specializata, posedind un segment extern si unul intern precum si un corp celular si o regiune sinaptica in care bastonasul transmite semnalul chimic catre celulele nervoase ale retinei; acestea conduc semnalul catre caile vizuale superioare. Bastonasele sunt responsabile pentru vederea monocroma in lumina obscura iar conurile pentru vederea colorata in lumina puternica. Aparatul fototraductor se afla in segmentul extern ce contine o suprapunere de discuri; fiecare disc este format dintr-un sac membranar inchis in peretii caruia se afla moleculele fotosensibile de rodopsina. Membrana plasmatica ce inconjoara segmentul contine canale de Na+ dependente de GMP ciclic. Aceste canale de Na+ sunt deschise la intuneric datorita legarii de moleculele de GMP ciclic. In mod paradoxal, lumina provoaca hiperpolarizarea membranei plasmatice, ceea ce inhiba semnalizarea sinaptica, intrucit activarea moleculelor de rodopsina din membrana discurilor determina inchiderea canalelor de Na+ din zona corespunzatoare (iluminata) a membranei plasmatice. Dupa cum s-a mai aratat anterior, rodopsina este o proteina transmembranara multipass omoloaga altor membri ai familiei receptorilor legati de protein G si, ca si verii ei, actioneaza prin intermediul proteinei trimerice G. Semnalul extracelular care o activeaza, insa, este un foton luminos si nu o molecula. Fiecare molecula de rodopsina contine un cromofor legat covalent - 11-cis retinalul, care se izomerizeaza instantaneu trecind in all-trans retinal cind absoarbe un foton.Izomerizarea modifica forma retinalului, provocind o modificare conformationala mai lenta a partii proteice a rodopsinei (opsina). Proteina activata se leaga apoi de proteina-G trimerica (transducina=Gt); aceasta determina disocierea subunitatii α (αt) si activarea de catre aceasta a fosfodiesterazei GMP-ului ciclic care hidrolizeaza GMP ciclic, scazind nivelul acestuia in citosol. In consecinta, GMPul ciclic se disociaza de canalele de Na+ din membrana plasmatica si astfel semnalul luminos se converteste intr-un semnal electric.

12

Canalele de Na+ sunt permeabile si pentru Ca2+ astfel ca inchiderea lor provoaca o inhibarea a influxului normal de Ca2+, respectiv o scadere a Ca2+ citosolic; scaderea Ca2+ stimuleaza guanilil ciclaza sa refaca rezervele de GMP ciclic, aducind asfel rapid celula la starea ei dinainte de stimulare. Acest mecanism dependent de Ca2+ este de o importanta cruciala din doua puncte de vedere. In primul rind, permite receptorilor revenirea rapida la starea de repaos dinainte de iluminare, facind posibila perceperea duratei scurte a unui flash luminos.In al doilea rind, permite adaptarea fotoreceptorilor, respectiv diminuarea raspunsului atunci cind sunt stimulati (iluminati) continuu. Adaptarea este un proces care permite celulei receptoare sa functioneze ca detector sensibil al schimbarilor in intensitatea stimulului in cadrul unei game enorme de registre de intensitate in raport cu nivelul de baza al stimulului. In tabelul 15-3 sunt prezentate citeva exemple selectate de diferite tipuri de proteine G. La mamifere au fost descrise cca 20 de tipuri de subuniti α, minimum 4 subunitati β si 7 subuniti γ. Familiile sunt definite pe baza inrudirii secventei de aminoacizi din subunitatile α. Semnalele extracelulare sunt mult amplificate cu ajutorul mediatorilor intracelulari si a cascadelor enzimatice In ciuda diferentelor in detalii moleculare, toate sisemele de semnalizare care sunt comandate de receptori legati de proteine G impartasesc anumite trasaturi comune si sunt guvernate de principii generale asemanatoare. Majoritatea depind de cascade complexe sau lanturi intermediare de mediatori intracelulari. Spre deosebire de semnalizarea mai directa utilizate de receptorii intracelulari si de receptorii legati de canale ionice, cascadele catalitice ale mediatorilor intracelulari asigura numeroase ocaziii pentru amplificarea raspunsului la semnalele extacelulare. De exemplu, in cascada traducerii vizuale, o singura molecula de rodopsina activata catalizeaza sute de molecule de transducina cu o viteza de cca 1000 de molecule de transducina/secunda. Fiecare molecula activata de transducina activeaza o molecula de fosfodiesteraza a GMPului ciclic iar fiecare din acestea hidrolizeaza cca 4000 de molecule de GMP ciclic pe secunda. Aceasta cascada catalitica dureaza cca 1 secunda si are drept rezultat hidroliza a peste 105 molecule de GMP ciclic pentru o singura cuanta de lumina absorbita, ceea ce detrmina inchiderea tranzitorie a canalelelor de Na+ din membrana plasmatica. In mod similar, cind o molecula semnalizatoare extraclulara se leaga de un receptor ce activeaza indirect adenilil ciclaza via Gs, fiecar proteina receptoare poate activa multe molecule de de proteina Gs,fiecare din acestea acivind o molecula de ciclaza. Cum fiecare molecula de Gs persista in forma activa timp de citeva secunde inainte de a-si hidroliza GTP-ul de care este legata, pentru a se inhiba, ea mentine activa molecula de ciclaza de care este legata timp de secunde, astfel ca ciclaza pote cataliza conversia unui numar mare de molecule

13

de ATP in molecule de AMP ciclic. Acelasi tip de amplificare actioneaza pe traseul de semnalizare al fosfolipid inositolului. Drept rezultat, o concentratie nanomoleculara (10-9) de semnal extracelular induce deseori concentratii micromoleculare (10-6) de mesager intracelular secundar cum ar fi AMPul ciclic sau Ca2+. Intrucit acesti mesageri functioneaza ca factori alosterici pentru activarea unor enzime sau canale ionice specifice, o singura molecula semnalizatoare extracelulara poate cauza alterarea a mii de molecule in celula tinta. Mai mult, fiecare proteina din releul semnalizator poate constitui o tinta separata pentru reglarea unui alt proces, de exemplu pentru reglarea cascadei de descompunere a glicogenului in celulele muschiului scheletal. Fiecare din aceste cascade de semnale stimulatoare impune existenta unui mecanism compensator, in fiecare etapa a cascadei, care sa readuca sistemul in starea de repaos atunci cind stimularea inceteaza. Pentru aceasta celulele poseda mecanisme eficiente pentru degradarea rapida (si resinteza) nucleotidelor ciclice si pentru neutralizarea si indepartarea rapida a Ca2+ citosolic precum si pentru inactivarea enzimelor si proteinelor transportoare activate. Acestea sunt esentiale atit pentru oprirea raspunsului dar si pentru definirea starii de repaos pe care o intrerupe raspunsul. Raspunsul la o stimulare poate fi rapid numai daca mecanismele de inactivare sunt deasemenea rapide. Pentru a utiliza Ca2+ ca semnal extracelular, celulele in repaos trebuie sa pastreze Ca2+citosolic la nivele scazute Concentratia Ca2+ citosolic in orice celula este extrem de scazuta (≤10-7M ) in timp ce concentratia Ca2+ in fluidul extrcelular (∼10-3M) si in reticolul endoplasmic (ER) este mare. Exista astfel un gradient de concentratie mare ce tinde sa deplaseze ionii de Ca atit prin membrana plasmatica cit si prin membrana ER spre citosol. Cind un semnal deschide tranzitoriu canalele de Ca2+ in oricare din aceste membrane, Ca2+ intra in citosol, marind dramatic concentratia locala de Ca2+ si declansind activarea proteinelor Ca2+-sensibile din celula. Pentru ca mecanismul de semnalizare sa fie eficient, concentratia de repaos a Ca2+-citosolic trebuie sa fie mentinuta la nivele scazute; acest lucru se poate realiza pe mai multe cai. Toate celulele eucariote au in membrana lor plasmatica ATPaze care folosesc energia ATP pentru a pompa Ca2+ in afara celulei.Celulele ce folosesc pe scara larga semnalizarea prin Ca2+ , cum sunt celulele nervoase si musculare, au in membrana lor plasmaica o pompa suplimentara de Ca2+ ce cupleaza efluxul de Ca2+ cu un influx de Na+. Acest schimbator de Ca2+- Na+ are o afinitate relativ scazuta pentru Ca2+ si intra in actiune numai cind nivelul intracelular de Ca2+ depaseste de 10 ori nivelul normal, cum se intimpla in stimularea repetata a celulelor musculare sau nervoase. Si in membrana reticolului endoplasmic exista o pompa de Ca2+ ce joaca deasemenea un rol important in mentinerea nivelului scazut al Ca2+ citosolic. Aceasta ATPaza

14

permite preluarea unor cantitati importante de Ca2+ din citosol impotriva gradientului de concentratie chiar in situatiile in care concentratia Ca2+ citosolic este scazuta. In mod normal, concentratia Ca2+ citosolic variaza intre cca 10-7M, cind celula este in repaos, pina la cca 5x10-6M, cind celula este activata de un semnal extracelular. Dar atunci cind celula a fost lezata si nu poate pompa in mod eficient Ca2+ in afara, concentratia acestuia poate creste pina la nivele ingrijoratoare (>10-5M ). In aceste situatii intra in functiune, pentru a prelua Ca2+ din. Citosol, pompa de Ca2+ din membrana interna mitocondriala (de capacitate mare si afinitate scazuta, aceasta pompa foloseste gradientul electrochimic generat prin membrana mitocondriei in cadrul fosforilarii oxidative). Ca2+ functioneaza ca mesager intracelular ubicuitar Prima evidenta experimentala a faptului ca ionii de Ca functioneaza ca mediatori intracelulari provine dintr-un experiment efectuat in 1947 care arata ca injectarea intracelulara a unei mici cantitati de Ca2+ determina contractia celulei musculare. In ultimii ani a devenit evident ca Ca2+ actioneaza deasemenea ca mesager intracelular intr-o multitudine variata de alte raspunsuri celulare, incluzind secretia si proliferarea. S-au identificat clar doua cai de semnalizare prin Ca2+, una utilizata cu precadere de celulele excitabile (electric active) si alta, utilizata in aproape toate celulele eucariote. Prima cale a fost bine studiata in cazul celulelor nervoase, in care depolarizarea membranei plasmatice provoaca un influx de Ca2+ spre terminatia nervoasa, initiind secretia de neurotransmitator; Ca2+ intra in celula prin canalele ionice “voltage-gated”care se deschid cind membrana plasmatica este depolarizata de potentialul de actiune ce o invadeaza . In cea de-a doua cale, omniprezenta, legarea moleculelor extracelulare semnalizatoare de receptorii de pe suprafata membranei determina eliberarea Ca2+ din ER. Deschiderea canalelor de Ca2+ din ER este determinata de fenomene de la suprafata acestuia, pe calea unei alte molecule mesagere intracelulare, inositol-trifosfatul . Unii receptori legati de proteina G activeaza calea de semnalizare prin inositol fosfolipide Peste 25 de receptori de la suprafata membranei sunt cunoscuti a folosi aceasta cale de traducere. Desi detaliile procesului de activare nu sunt asa de bine intelese ca in calea AMPului ciclic, se presupune ca si in cazul inositol fosfolipidelor, in membrana plasmatica opereaza acelasi tip de mecanism de activare in trepte. Inositol fosfolipidele cele mai importante in traducerea de semnal sunt doi derivati fosforilati ai fosfolipid-inositolului (PI), respectiv PI-fosfat (PIP) si PI-difosfat (PIP2), presupusi a fi localizati in jumatatea

15

citoplasmatica a bistratului lipidic. Desi PIP2 este mai putin abundent in membranele celulelor animale decit PI, constituind sub 10% din lipidele inositolice si sub 1% din totalul fosfolipidelor, hidroliza acestuia este cea care constituie semnalul celular cel mai important. Lantul de procese ce duc la descompunerea PIP2 incepe prin legarea unei molecule-semnal de un receptor asociat cu proteina G din membrana plasmatica. Receptorul activat stimuleaza proteina trimerica G care activeaza la rindul sau o fosfolipaza inositid-specifica. In mai putin de o secunda aceasta enzima cliveaza PIP2 generind inositol trifosfatul (IP3). IP3 este o molecula mica solubila in apa ce paraseste membrana plasmatica si difuzeaza rapid in citosol , unde elibereaza Ca2+ din ER legindu-se de canalele de Ca2+ cu porti dependente de IP3 (“IP3 gated”) din membrana reticolului endoplasmic.