1. im s ro proteine enzime 2015 2016

7/25/2019 1. IM S Ro Proteine Enzime 2015 2016

1/17

CATEDRA BIOCHIMIE I BIOCHIMIE CLINICINDICAII METODICE

FACULTATEA STOMATOLOGIE, ANUL I Pag. 1 / 17

Analizat i aprobatlaedina catedrei

din 11.01.2016, proces verbal nr.11

eful Catedrei de biochimiei biochimie clinic

Tagadiuc O., conf. universitar, dr. hab. nt. med.____________________

Indicaia metodicnr. 1Tema nr. 1: Convorbire introductiv.

Importana biochimiei pentru disciplinile medicale.Aminoacizii structura, clasificarea i rolul biomedical.

Experiena 1. Identificarea aminoacizilor ce conin sulf (reacia Fol)Principiul metodei: La degradareaproteinelor i peptidelor sub aciunea hidroxidului de

sodiu din gruprile sulfhidril se elibereazsulful sub formde sulfurde sodiu, care reacionnd cu

plumbitul de sodiu, formeazprecipitatul de sulfurde plumb de culoare neagrsau brun.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug5 picturi de reactiv Fol. Amestecul se

pune la fiert. Dup1-2 minute de fierbere apare un precipitat negru sau brun de sulfurde plumb(PbS).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Experiena 2. Reacia xantoproteic(Mulder)Principiul metodei: Aminoacizii aromatici la fierbere cu HNO3concentrat se supun nitrrii.

Ca rezultat soluia capo culoare galbencare trece n oranj la adugare bazei.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug3 picturi de HNO3concentrat. n urma

fierberii, coninutul eprubetei se coloreazn galben. Dacduprcire n eprubetadugm 10-15picturi soluie de NaOH 20%, culoarea soluiei devine oranj ca rezultat al obinerii srii de sodiu adinitrotirozinei.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

Experiena 3. Reacia cu ninhidrinPrincipiul metodei: Ninhidrina interacionez cu gruprile alfa-amino ale proteinelor i

aminoacizilor cu formarea unui compus colorat n albastru-violet.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug5 picturi soluie de ninhidrin0,5%.

Coninutul eprubetei se fierbe 1-2 minute. n cazul prezenei grupelor alfa-amino apare o culoareroz-violet, care trece apoi n albastr.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2/17



Experiena 4. Reacia biuretic(Piotrovschi)Principiul metodei: Legturile peptidice (-NH-CO-) ale proteinelor n mediul alcalin

interacioneazcu CuSO4formnd compui compleci colorai n rou- violet.

Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug5 picturi soluie de NaOH 10% i 2picturi soluie de CuSO41%. Eprubeta se agit. Apare culoarea violet.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nivel iniial de cunoatere:1. Structura i proprietile aminoacizilor proteinogeni.

ntrebri pentru autopregtire:1. Obiectul biochimiei i importana n medicina practic, inclusiv, stomatologie.2. Particularitile materiei vii. Proprietile generale de biomoleculelor.3. Rolul biologic al proteinelor. Rolul proteinelor n meninerea integritii esuturilor dentare.4. Aminoacizii proteinogeni i neproteinogeni. Clasificarea aminoacizilor proteinogeni dup

structura chimic, proprietile fizico-chimice i biologic. Aminoacizii de interes stomatologic:prolina, hidroxiprolina, lizina, hidroxilizina, alizina, acidul -carboxiglutamic strcutura i rolulbiologic.

5. Teoria polipeptidic a structurii proteinelor, esena ei i dovezile experimentale. Modul delegtur a aminoacizilor n molecula proteic. Notarea i citirea aminoacizilor n peptide i

proteine. Aminoacizii N i C terminali.6.

Peptidele biologic active (glutationul, angiotenzina).

Probleme de situaie1. Divizai urmtorii aminoacizi n grupe conform clasificrii biologice: Thr, Cys, Phe, Gln, His,

Met, Gly, Arg. Scritei peptida formatdin aminoacizii indispensabili. Dai definiia noiunii,indicai ce aminoacizi se referla acest grup i care sunt sursele acestor aminoacizi?

2. Divizai aminoacizii proteinogeni conform proprietilor fizico-chimice (completai tabelul):Aminoacizii hidrofobi Aminoacizii hidrofili

neutriAminoacizii acizi Aminoacizii bazici

3. Scriei urmtoarele tripeptide: Lys-Val-Pro; Glu-Pro-Arg; Pro-Asp-His. Evideniai legturile

peptidice tipice i atipice. Indicaii deosebirile lor.

Teste pentru autoevaluare

1.

Selectai polimerii biologici:a. nucleozidele;b. aminoacizii;c. glucoza;

d. ADN;e. colagenul


3/17



2. Ce grupe de aminoacizi sunt prezente n proteine?a. hidroxiaminoacizii;

b. aminoacizii homociclici;

c.

beta-aminoacizi;

d. aminoacizii diaminodicarboxilici;e. aminoacizii seriei D.

3. Ceuniti constituente ale aminoacizilor sunt ntlnite n lanul polipeptidic?a. purina;

b. tiofen;c. imidazol;d. pirimidin;

e. scatol.

4. Selectai aminoacizii hidrofobi:a. Ser;

b. Val;c. Ile;d. Trp;

e. Glu.

5.Selectai aminoacizii bazici:a. Ala;

b. Ser;c. Tyr;d. Gln;

e. Lys.

6. Care afirmaii referitor la serinsunt corecte?

a.

este un hidroxiaminoacid;b. are punctul izoelectric n zona de pH bazic;c. intra n categoria aminoacizilor neesentiali sau dispensabili;d. intra n categoria aminoacizilor esentiali sau indispensabili;e. n solutiile cu pH=4 migreazspre anod.

7. Care afirmaii sunt corecte referitor la arginin?a. la pH=3 are sarcinnegativ;

b. are pH-uI izoelectric n mediul bazic;c. n formhidroxilatintrn structura colagenului;d. este un aminoacid acid;e. are n structurun rest de guanidin.

8. Care afirmaii sunt corecte referitor la metionin?a. este un derivat al acidului butanoic;

b. n structura sa sulful este slab fixat;c. la pH izoelectric aminoacidul migreazspre catod;d. n solutiile cu pH-ul mai mic dect pI migreaza spre anod;e. este un aminoacid neesenial.

Indicaia metodicnr. 2Tema: Structura proteinelor. Clasificarea proteinelor.

Caracteristica generala proteinelor simple i conjugate.

Proteinele fixatoare de calciu.Experiena 1. Identificarea aminoacizilor prin metoda cromatografiei pe hrtie.Principiul metodei: Metoda se bazeaz pe diferena coeficientului de repartiie a amino-

acizilor n ap i solvent organic (butanol), care nu se amestec cu apa. Viteza migrrii amino-acizilor pe hrtie este direct proporionalcu gradul de dizolvare n solventul organic (butanol).

Mod de lucru:1. Pe banda de hrtie cromatograficcu creionul simpluse noteazlinia de start(aproximativ la 1

cm).2. Pe linia de start cu ajutorul capilarului se aplico pictur de amestec de aminoacizi (pata nu

mai mare de 5 mm).

3.

Dup uscare la aer (fixare), banda se introduce ntr-un vas nchis cu amestec butanol-acidacetic-ap, astfel nct lichidul snu depeasclinia de start (5 mm). Cu ajutorul dopului bandase fixeazvertical, fsatingpereii vasului.


4/17



4. Dup 1,5 ore de incubare la temperatura camerei, banda se scoate din vas, se noteaz cucreionul simpluhotarul solventului i se usucn termostat (10 minute la temperatura de 70-100C).

5.

Banda se trece prin soluia alcoolicde ninhidrinde 0,2%.6. Banda se usuc n termostat la temperatura de 100C. Pe cromatogram apar pete violete sau

galbene, localizate la diferite distane de linia de start.7. Cu ajutorul riglei se msoarurmtoarele distane:

de la linia de start pnla centrul fiecrei pete distana parcursde aminoacid (a); de la linia de start pnla hotarul solventului distana parcursde solvent (b).

8. Raportul dintre distanele parcurse de aminoacid (a) i de solvent (b) poart denumirea decoeficient de repartiie(R), care este specific pentru fiecare aminoacid n condiii standard i secalculeazastfel: Rf=a/b. Duptabelul cu Rf standard identificm aminoacidul.

Aminoacidul Rf stand Aminoacidul Rf stand Desenai cromatogramahistidina 0,11 cysteina 0,40glutamina 0,13 prolina 0,43lizina 0,14 tirozina 0,45arginina 0,20 asparagina 0,50acidul aspartic 0,24 metionina 0,55glicina 0,26 valina 0,61serina 0,27 triptofan 0,66acidul glutamic 0,30 fenilalanina 0,68treonina 0,35 izoleucina 0,72alanina 0,38 leucina 0,73

Valoarea diagnostic. Metoda permite determinarea att calitativ, ct i cantitativ aaminoacizilor n obiectele biologice, ce este necesar pentru aprecierea metabolismuluiaminoacizilor i cel al proteinelor. n diferite afeciuni ereditare (fenilcetonurie, tirozinemie,cistinoz etc.) i dobndite ale ficatului, rinichilor i altor organe se constat modificareaconinutului de aminoacizi n lichidele biologice (serul sangvin, urin, lichid cefalorahidian etc.)

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nivel iniial de cunoatere:1. Legturile chimice intra- i intermoleculare: covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe, forele

van der Waals mecanismele formrii lor.2. Histonele tipurile, rolul biologic.

ntrebri pentru autopregtire:1. Nivelurile de organizare structural-funcional a moleculei proteice: structura primar,

secundar, teriar i cuaternar; caracteristica general, legturile specifice acestor structuri.Noiuni despre domeniile structurale.

2. Clasificarea contemporana proteinelor.3. Proteinele simple, proprietile, particularitile structurale. Rolul biologic.4.

Proteinele conjugate: nucleoproteinele, fosfoproteinele, lipoproteinele, glicoproteinele,metaloproteinele, cromoproteinele (hemo- i flavoproteinele), caracteristica lor general.


5/17



5. Proteinele fibrilare: colagenul i elastina particularitile componenei aminoacidice istructurale. Rolul biologic.

6. Proteinele fixatoare de Ca2+(calmodulina, colagenul, osteocalcina). Particularitile structurale

ce determinfixarea calciului. Rolul acestor proteine n organism i esuturile dentare.

Probleme de situaie:1. Ce modificare a structurii hemoglobinei este caracteristicpentru anemia cu celule falciforme?

Care sunt cauzele acestei modificri? Ce repercusiuni are modificarea structurii primare asupranivelurilor superioare structurale, funciei proteinei i a strii eritrocitelor?

2. Care sunt asemrile i deosebirile structurale i funcionale ale mioglobinei i hemoglobinei?Care este nivelul normal al hemoglobinei sangvine? Ce tip de hipoxie se dezvoltn carenelehemoglobinei?

3. Care sunt deosebirile dintre glicoproteine i proteoglicani?a.

b.

c.4. Colagenul, osteocalcina, calmodulina, factorii plasmatici ai coagulrii II, VII, IX i X etc. sunt

proteine fixatoare de calciu. Ce particularitate structuralcomunposedaceste proteine. Carevitamin asigur realizarea acestei proprieti? Scriei reacia respectiv. Care sunt surselevitaminei?

5. Completai tabelul de mai jos:Succesiunea aminoacizilor n lanul

polipeptidic determinatgenetic esteCe legturchimicse formeazla

interaciunea grupei

-carboxilice a unuiAA cu -aminogrupa urmtorului AACoplanarea reprezint

Ce legturi chimice posedforme derezonan(ceto i enol)?Reprezentai configuraia trans asubstituenilor n raport cu legtura C-NCe grupri chimice au capacitatea de aforma legturi de hidrogen?

6.

sii care aminoacizi sunt n concentraii crescute n snge i urin n urmtoareleaminoacidurii primare. Completai tabelul.

Denumireapatologiei

Aminoaciziiconcentraia crora

este crescutn sngei urin

Enzima defect Manifestri clinice

Fenilcetonurie Fenilalaninhidroxilaza /dihidrobiopterinreductaza

Retard mental,convulsii, eczema

Boala urinei cumiros de sirop de

arar

Decarboxilaza cetoacizilor culanramificat

Acidoza, vrsturi afectareasistemului nervos central,

retard mental,

insuficienta respiratorie,deces,miros caracteristic desirop de arar al urinei.


6/17



Citrulinemie Argininosuccinatsintetaza Forma neonatal:hipertonie, vrsturi, deces

Forma subacut: retard

mental, ataxie, encefalopatieArgininemie Arginaza Spasticitate, ataxie,convulsii, vrsturi,

hepatomegalie, retardmental, encefalopatie

Teste pentru autoevaluare:1. Selectai afirmaiile corecte referitor la structura primara proteinei:

a. prezinto succesiune de aminoacizi unii prin legturi peptidice;b. fiecare aminoacid se poate include n lannumai o singurdat;c. se distruge la denaturare;

d.

nu este afectatde hidroliza;e. reprezintforma activbiologic a moleculei.2. Selectai afirmaiile corecte referitor la structura secundara proteinei prezint:

a. aranjamentul intr-o structurordonat;b. e stabilitde interaciuni hidrofobe i ionice;c. este alfa helixul i beta structur;d. nu este stabilizatde legturi de hidrogen;e. este stabilizatde legturile peptidice.

3. Selectai afirmaiile corecte referitor la structura la structura teriara proteinei:a. este modalitatea de mpachetare 3D a moleculei proteice;

b. domeniile se includ in structura respectiv;

c.

domeniile determinfuncii speciale n protein;d. radicalii AA nu contribuie la stabilizarea structurii teriare;e. e posibilinteraciunea ntre radicalii AA-Ser - Ser.

4. Selectai afirmaiile corecte referitor la structura cuaternara proteinei:a. este organizarea subunitilor ntr-o moleculproteicunicfuncional;

b. se formeazgraie legturilor necovalente dintre suprafeele de contact ale domeniilor;c. este rigid i nu se modificn timpul exercitrii funciei;d. se realizeazexclusiv prin legturi covalente;e. molecula proteicposedmobilitate i suferfluctuaii conformaionale cooperatiste.

5. Selectai oligomerii:a. hemoglobina (Hb);

b.

mioglobina;c. LDH (lactatdehidrogenaza);

d. imunoglobulinele;

e.

creatinkinaza.

6. Care din proprietile enumerate sunt corecte referitor la colagen?a. circa 1/3 din aminoacizi sunt reprezentai de glicin;

b. secvena AA din lanul polipeptidic este de tipul (Gly-X-Y)n;c. lanul polipeptidic e constituit dintr-un numar mic de radicali ai AA;d. lanul polipeptidic prezintconformaie de alfa-elice clasic;e. unitatea structuraldin care se asambleazfibrele este pro-tropocolagenul.

7. Selectai afirmaiile ce caracterizeaztropocolagenul (TC):a. este unitatea structurala colagenului i elastinei;

b. molecula de TC reprezintun helix triplu rsucit spre dreapta;c.

moleculele de TC sunt aranjate n trepte i deplasate una fade alta cu din lungimea lor;d. TC este stabilizat de legaturi de hidrogen i disulfidice;e. are lungimea de 3000 nm i diametrul de 30 nm.


7/17



8. Selectai afirmaiile ce caracterizeazcolagenul tip I:a. este unul din tipurile nefibrilare de colagen;

b. este format doar din catene primare de tip 1;

c.

este prezent n piele, tendoane, oase, ligamente, dentin, tesuturile interstiiale;d. formeazfibre de diametru mic;e. este sintetizat de osteoblaste i fibroblaste.

9. Selectai afirmaiile ce caracterizeazosteocalcina:a. este o proteinfixatoare de calciu;

b. este un factor plasmatic al coagulrii;c. esteo proteinnecolagenica esuturilor mineralizate;d. fixeazde regul10 ioni de calciu;e. contribuie la includerea calciului n reeaua cristalina apatitei.

Indicaia metodicnr. 3

Tema: Proprietile fizico-chimice ale proteinelor.Metodele de separare i purificare ale proteinelor

Experiena 1. Dializa proteinelorPrincipiul metodei: Metoda se bazeazpe separarea macromoleculelor din soluiile coloidale

de substanele micromoleculare cu ajutorul membranelor semipermeabile, care pot fi traversate demicromolecule, dar sunt impermeabile pentru macromolecule.

Mod de lucru:1. ntr-un balon se toarn 20 ml soluie de ovalbumin la care se adaug 20 picturi de soluie

saturatde sulfat de amoniu.2. Dintr-o foide celofan, umezit n prealabil cu apdistilat, se confecioneazun scule n

care se toarnconinutul balonului.3. culeul se introduce ntr-un pahar cu apdistilat i se cufundastfel ca nivelul de lichid n

culesfie mai jos de nivelul apei n pahar.4. Se efectueazdializa timp de 90 minute.5. La finele dializei se iau cte 1 ml de soluie din scule i din vas i se transfern 2 eprubete.6. Cu ambele soluii se efectueazreacia de identificare a ionului sulfat cu BaCl2: la 5 picturi de

soluie de cercetat se adaug 3-4 picturi soluie de BaCl2 de 5%. n prezena ionului sulfat,reacia este pozitiv i se observapariia precipitatului de BaSO4, conform ecuaiei:

(NH4)2SO4+ BaCl2= 2NH4Cl + BaSO4

7. Cu ambele soluii se efectueazreacia biureticcu scopul identificrii proteinelor: la 5 picturi

de soluie de cercetat se adaug5 picturi de NaOH de 10% i 2 picturi de CuSO4de 1%. nprezena legturilor peptidice (-NH-CO-) ale proteinelor soluia se coloreazn roz-violet.

8. Rezultatele experienei se introduc n urmtorul tabel i se trage concluzia despre capacitateamoleculelor, ce se deosebesc dupmasa molecular i dimensiuni de a traversa membranelesemipermeabile.

Valoarea diagnostic: Dializa este o metodaplicatpentru purificarea sngelui de produitoxici, utilizatn insuficiena renalacut, insuficiena renalcronicsau n intoxicaii.

Rezultat:

Soluia cercetatSubstanele prezente

pnla dializ

DIAL

IZA

Reaciabiuretic

Reaciacu BaCl2

Substanele prezentedupdializ

Soluiadin scule

Protein(ovalbumin),(NH4)2SO4

Soluiadin vas

H2O


8/17



Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nivel iniial de cunoatere:1. Proprietile amfotere ale aminoacizilor. Sarcina electric a aminoacizilor. Factorii ce

determinsarcina electrica aminoacizilor.

ntrebri pentru autopregtire:1. Masa moleculara proteinelor. Noiuni generale referitor la metodele de determinare a masei

moleculare a proteinelor.2. Proprietile amfotere ale proteinelor. Sarcina electric a proteinelor. Factorii ce determin

sarcina proteinei. Punctul i starea izoelectric.3. Solubilitatea proteinelor. Proprietile hidrofile ale proteinelor n funcie de componena

aminoacizilor i de particularitile structurale. Factorii de stabilizare n soluie a substanelor

coloidale. Starea soluiilor coloidale: sol, gel, xerogel. Exemple.4. Saliva soluie coloidal proteic. Proprietile salivei determinate de prezena proteinelor.

Originea, reprezentanii i rolul biologic al proteinelor salivare.5. Denaturarea proteinelor, agenii ce provoacdenaturarea. Modificrile structurale ale proteinei

la denaturare.6. Metodele de studiere a componenei calitative i cantitative a proteinelor: a) hidroliza; b) croma-

tografia; c) electroforeza; d) salifierea; e) dializa.7. Importana biomedicala metodelor de evaluare calitativ i cantitativa proteinelor.

Probleme de situaie1. Divizai n grupe conform solubilitii urmtoarele proteine: albumina, hemoglobina, keratina,

transferina, IgM, fibrina, protombina, colagenul. Ce factori influeneaz solubilitateaproteinelor?

Solubile Insolubile

2. ntr-o soluie sunt dizolvate histone i albumine. Alegei soluia tampon care trebuie utilizat

pentru precipitarea fiecrui tip de protein: Sol. 1, pH=1.7; Sol. 2 pH=4.7; Sol. 3 pH=7.5, Sol. 4pH=10.0. Care este mecanismul acestei metode de separare a proteinelor individuale dinamestecuri?

3. O soluie ce conine un ameste de albumine i globuline este tratat cu soluie de sulfat deamoniu ([NH4]2SO4) pnla semisaturare, iar ulterior pnla saturare. Ce efecte va avea aceasttratare asupra solubilitii albuminelor i globulinelor? Care este mecanismul de aciune a(NH4)2SO4asupra soluiei proteice?

4. Spre care electrod vor migra albuminele, globulinele i histonele la pH=7,0, daclinia de starteste la mijlocul distanei dintre anod i catod? Explicai.

5. Ce caracter hidrofil sau hidrofob, are fragmentul -Gly-Ser-Asn-Trp-Tyr- din structura primara unei proteine? n conformaia proteinei secvena este localizat n interiorul structurii sau la

suprafaa ei? Explicai, de ce. Scriei structura secvenei.


9/17



Teste pentru autoevaluare:1. Selectai afirmaiile corecte referitor la solubilitatea proteinelor:

a. proteinele fibrilare sunt uor solubile n apa pur;

b.

depinde de sarcina electric i membrana apoas;c. depinde de natura solvenilor i temperatura lor;d. proteinele fibrilare sunt mai solubile ca cele globulare;e. este maximn punctul izoelectric:

2. Care factori determinstabilitatea proteinei n soluie?a. membrana apoas, ce apare la hidratarea grupelor funcionale hidrofile;

b. sarcina electric, dependentde pH-ul mediului;c. sarcina electric, dependentde radicalii hidrofobi a aminoacizilor;d. membrana apoas, ce apare la hidratarea grupelor funcionale hidrofobe;e. sarcina electric, dependentde aminoacidul N i C terminal.

3. Care sunt condiiile de sedimentare ale proteinelor?

a.

nlturarea membranei apoase;b. neutralizarea sarcinei electrice;c. aducerea proteinei bazice la pI prin adaus de acid;d. aducerea proteinei acide la pI prin adaus de baza;e. deteriorarea membranei apoase prin nlturarea apei imobilizate.

4. Care afirmaii caracterizeazsalifierea?a. este hidratarea moleculei proteice;

b. este dehidratarea moleculei proteice;c. este un proces ireversibil;d. este trecerea micromoleculelor prin membrana semipermeabil;e. se distruge structura teriara proteinei.

5. Afirmaii corecte referitor la molecula proteicdenaturatsunt:a. se distruge structura primar;

b. crete activitatea biologic;c. se distruge structura teriar i cuaternar;d. se distrug legturile peptidice;e. nu se modificstarea nativ.

6. De ce depinde sarcina neta proteinei?a. componena aminoacidic;

b. pH-ul soluiei;c. grupele -COOH i -NH2terminale ale lanului polipeptidic;

d.

grupele -COOH i -NH2ale radicalilor aminoacizilor;e. radicalii hidrofobi.7. Selectai proteinele exclusiv salivare:

a. mucinele;b. lactoferina;c. transferina;

d. cistatinele;e. imunoglobulinele

8. Care din proteinele salivare enumerate sunt enzime?a. -amilaza;

b. lactoferina;c. cistatinele;

d. lizocimul;e. kalikrein

9. Cu scop diagnostic n salivpot fi determinate urmtoarele proteine:

a.

proteina C-reactiv;b. -amilaza pancreatic;c. IgA secretorie;

d.

lactoferina;e. ceruloplasmina.


10/17



Indicaia metodicnr. 4Tema: Natura chimic i structura enzimelor.

Vitaminele ca coenzime. Mecanismul de aciune al enzimelor

Experiena 1. Identificarea vitaminelor B1, B2, B6, PP (B5).

a) Identificarea vitaminei B1 (tiaminei).Principiul metodei: Lainteraciunea tiaminei cu diazoreactivul n mediul alcalin se formeaz

un compus complex de culoare oranj.Mod de lucru: La 5 picturi de diazoreactiv (care constdin volume egale de soluie de acid

sulfanilic 1% i soluie de nitrit de sodiu 5%), se adaug1-2 picturi soluie de cercetat. nclinndeprubeta se picur atent pe pereii ei 5-7 picturi de carbonat de sodiu (Na2CO3) 10%. La hotaruldintre lichide apare un inel colorat n oranj, dacsoluia de cercetat conine tiamin.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

b) Identificarea vitaminei B2 (riboflavinei).Principiul metodei: Vitamina B2 posed proprietatea de a se reduce. n form oxidat

vitamina are culoare galben, la nceputul reaciei de reducere roz, iar forma redusa vitamineieste incolor.

Mod de lucru: ntr-o eprubetse iau 10 picturi de soluie de cercetare, se adaug5 picturide acid clorhidric concentrat i o granulde zinc metalic. Se observdegajarea bulelor de hidrogen,lichidul galben se coloreaz treptat n roz, dup care se decoloreaz, dac soluia de cercetareconine riboflavin.

Rezultat:____________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

c) Identificarea vitaminei PP (B5acidului nicotinic sau nicotinamidei)Principiul metodei: La interaciunea vitaminei PP cu acetatul de cupru se formeaz un

precipitat albastru al srii de cupru a acidului nicotinic.Mod de lucru: ntr-o eprubet se iau 20 picturi de soluie de cercetare se agit i se

nclzete pnla fierbere. Se agitsoluia de acetat de cupru 5% i se adaug20 picturi la soluiafierbinte de cercetare. Eprubeta se nclzete din nou pnla fierbere i ulterior se rcete ntr-un jetde ap rece. La fundul eprubetei se depune un precipitat de culoare albastr de sare de cupru aacidului nicotinic, dacsoluia de cercetare conine vitaminPP (B5).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

d) Identificarea vitaminei B6(piridoxinei)Principiul metodei: La interaciunea vitaminei B6 cu clorura de fier se formeaz o sare

complexde tipul fenolatului de fier de culoare roie.Mod de lucru: La 5 picturi soluie de cercetare se adaugun volum egal soluie de clorur

de fier 1%. Amestecul se agit. Apare o coloraie roie, dacsoluia de cercetare conine piridoxin.Rezultat:____________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

Concluzii:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


11/17



Experiena 2. Dozarea vitaminei C (acidului ascorbic) n urin.Principiul metodei: Vitamina C posed capacitatea de a reduce 2,6-diclorfenolindofenolul

(2,6-DCPIP), ce determinschimbarea coloraiei soluiei cercetate:

Acid ascorbic + 2,6-DCPIP oxidat (coloraie albastr) Acid dihidroascorbic + 2,6-DCPIP redus (coloraie roz).

Mod de lucru:1. ntr-un balon se iau:

10 ml urin, 10 ml apdistilat 20 picturi soluie de HCl de 10%.

2. Amestecul se titreazcu soluie de 2,6-DCPIP 0,001 N pnla apariia culorii roz.Calculul: Cantitatea vitaminei C n urina cercetatse determindupformula:

C (mg/24ore) = (0,088 A C) / Bunde: 0,088 coeficientul de recalculare;

A cantitatea de 2,6-DCPIP consumatla titrarea probei;B cantitatea de urinutilizatn experien(10 ml);C diureza nictimeral(n medie 1500 ml la brbai i 1200 ml la femei).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Valoarea diagnostic: Vitamina C sau acidul ascorbic, este un compus cu proprieti

antioxidante semnificative, care protejeaz compuii biologic activi de degradri oxidative,stimuleazprocesele de biosinteza colagenului, hormonilor steroidici i a unor neurotransmitori,etc. Lipsa vitaminei C din organism determindezvoltare scorbutului, caracterizat prin gingivite,

paradontoze, sporirea motilitii i pierderea dinilor, fragilitatea crescut a vaselor de snge,inflamarea articulaiilor i anemie.

Nivel iniial de cunoatere:1.Noiune de cataliz. Rolul i proprietile catalizatorilor neorganici.

ntrebri pentru autopregtire:1.Noiune despre enzime i rolul lor biologic. Asemrile i deosebirile dintre enzime i

catalizatorii nebiologici.2.Natura chimica enzimelor. Dovezile naturii proteice a enzimelor. Structura enzimelor. Centrul

activ i centrul alosteric al enzimelor.3. Enzimele simple i conjugate. Noiune de holoenzim, apoenzim, cofactor, coenzim,

cosubstrat i grupprostetic. Funciile de coenzime ale vitaminelor i microelementelor. Naturachimic(structura) a vitaminelor B1, B2, B6, PP, C i rolul lor ca coenzime.

4. Mecanismul de aciune al enzimelor. Centrul activ al enzimelor i rolul lui n formarea itransformarea complexelor intermediare dintre enzim i substrat. Rolul modificrilorconformaionale reciproce ale moleculei enzimei i substratului la favorizarea catalizei (reaciei).

5.Nomenclatura (denumirea) i clasificarea enzimelor. Caracteristica general a claselor i

subclaselor principale de enzime. Numrul de cod al enzimei.6. Specificitatea enzimelor.


12/17



Probleme de situaie1. Este posibil de separat din enzime centrul activ, pstrndu-i integritatea structural i

funcional? Argumentai.

2.

La ce clas i subclasse referurmtoarele enzime?pepsina amilaza lipaza

3. Ce tip de specificitate este caracteristic pentru urmtoarele enzime: carboanhidraza, fumaraza,amilaza, ureaza, alcool dehidrogenaza, monooxigenaza microzomal? Scriei reaciile catalizatede 3 dintre enzimele nominalizate.

4. Scriei cte o reacie la care participurmtoarele coenzime: TPP, NAD+, NADP+, FAD, FMN,PALP (PAMP), ascorbatul.

Teste pentru autoevaluare:

1. Centru activ al enzimelor reprezint:a. o linie frntn molecula enzimei;

b. un plan in molecula enzimei;c. o structurcompus, unical, tridimensional;d. un punct din structura teriara;e. locul unde se fixeazmodulatorii.

2. Selectai afirmaiile corecte referitor la centrul activ al enzimelor:a. este partea enzimei care fixezesubstratul;

b. grupele funcionale aparin aminoacizilor amplasai succesiv n lanul polipeptidic;c. n centrul activ se fixeazactivatorul sau inhibitorul;d. centrul activ se formeaznumai pe baza structurii cuaternare;e.

centrul activ se formeaznumai pe baza structurii teriare.3. Selectai afirmrile corecte referitor la substrat (S):

a) e substana asupra careia acioneazenzima;b) este inhibitor sau activator al enzimei;c) toate enzimele fixeazdoar un singur substrat;d) unele enzime interacioneazcu cteva substrate;e) este legat de centru activ prin legturi covalente.

4. Care sunt afirmaiile corecte referitor la centrul alosteric?f) este separat spaial de centrul activ;g) este locul fixrii substratului;

h)

este caracteristic tuturor enzimelor;i) este sinonimul centrului activ;j) este locul n care se fixeazactivatorii i inhibitorii.

5. Care sunt afirmaiile corecte referitor enzimele alosterice?a) modulatorii se leagcovalent n centrele alosterice;

b) cinetica reaciilor alosterice e asemtoare cu cea a enzimelor obinuite;c) efectorii fixndu-se nu modificconformaia moleculei enzimei;d) modulatorii se leagcovalent n centrul activ al enzimei;e) modulatorii modificconformaia moleculei enzimei.

6. Selectai afirmaiile corecte referitor la mecanismul de aciune al enzimelor:a) scad energia de activare a reaciei;

b)

are loc formarea complexului enzima-substrat [ES]c) complexul ES este o structura rigid, stabil;d) complexul ES este o structurinstabil;e) formarea complexului ES este prima etapa mecanismului de aciune.


13/17



7. Selectai afirmaiile corecte referitor la mecanismul de aciune al enzimelor:a) n complexul ES substratul nu se modific;

b) n complexul ES substratul se deformeaz;

c)

n centrul activ al enzimi are loc cataliza covalent;d) n centrul activ al enzimei are loc cataliza acido-bazic;e) la interaciunea substratului i enzimei se modific att structura enzimei, ct i a

substratului.

Indicaia metodicnr. 5Tema: Proprietile generale ale enzimelor.

Determinarea activitii enzimatice. Enzimele salivare

Experiena 1. Determinarea activitii -amilazei urinare cu substrat stabil de amidon(metoda Caraway).

Principiul metodei: -amilaza scindeazamidonul cu obinerea produilor finali care nu secoloreazcu soluia de iod. Activitatea amilazei se apreciazdupmicoararea cantitii de amidonscindat.

Mod de lucru: Experiene se efectueazn eprubete calibrate de 10 ml!

Nr. Reagent Eprubeta de experien Eprubeta martor1. Soluie de amidon 1 ml

(conine 0,0004 g amidon)1 ml

(conine 0,0004 g amidon)2. Incubare 5 minute n baia de apla

temperatura de 370C-

3. Urin 0,02 ml -4. Amestecul se agit ise introduce din nou n baia de apla 370C exact 7,5 minute(calculul timpului se face din momentul adugrii urinei)

5. Soluie de iod 1 ml 1 ml6. Urin - 0,02 ml7. H2O dist. pnla 10 ml pnla 10 ml8. Imediat se determindensitatea opticasoluiilor din eprubeta de martor (Em) i de

experien(Eexp)faa de apa distilatla fotocolorimetru (filtrul rosu, =630-690 nm)n cuve de 10 mm.

Calculul: n unitii SI activitatea amilazei se exprim n grame de amidon hidrolizat decantitatea de enzimcare se conine ntr-un litru de urintimp de o orde incubare la temperatura

de 370C. Calculul se face conform formulei:

Activitatea amilazei (g/orL) = [(Em Eexp) / Em] 0,0004 8 50000 = [(Em Eexp) / Em] 160,

unde:Em extincia probei martor,Eexp extinia probei de experien;0,0004 cantitatea de amidon n prob(g);8 coeficientul de transformare la o orde incubare (60 min : 7,5 min = 8);50000 coeficientul de transformare la 1 L de urin(1000 ml : 0,02 ml = 50000).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________


14/17



Valorile normaleale activitii amilazei din urin 20-160 g/orLValoarea diagnostic. n pancreatitele acute i parotitele epidemice se observ creteri

importante ale -amilazei n snge i urin. Creteri moderate se depisteaz n pancreatitele

cronice, litiaz pancretic, tumori ale pancreasului, litiaz biliar, ulcerul gastric, insuficienrenalcronic i, uneori, dupadministrarea de opiacee (morfina, codeina, papaverina etc.).

ntrebri pentru autopregtire:1. Cinetica enzimatic. Influena concentraiei enzimei i a substratului, a pH-ului i a temperaturii

asupra activitii enzimatice.2. Principiul determinrii activitii enzimelor. Unitile de activitate a enzimelor (unitatea

internaional, katalul, activitatea specific). Metodele de obinere i purificare a enzimelor.Cromatografia de afinitate.

3. Activarea i inhibiia enzimelor:a. Activarea enzimelor prin proteoliza limitat. Zimogenii (proenzimele).

b.

Inhibiia activitii enzimelor (specific i nespecific, reversibil i ireversibil, competitivi necompetitiv).

4. Reglarea activitii enzimelor (reglarea alosteric, reglarea covalent). Importana principiului deretroinhibiie.

5. Izoenzimele particularitile structurale i funcionale, valoarea lor biomedical.6. Organizarea enzimelor n celul(ansamblurile enzimatice, compartimentalizarea). Deosebirile n

componena enzimatica organelor i esuturilor. Enzimele organospecifice.7. Utilizarea enzimelor n practica medical: a) enzimodiagnosticul; b) enzimoterapia; c) utilizarea

enzimelor n laborator.8. Enzimele salivei reprezentanii principali, funciile lor, originea, modificrile activitii lor n

afeciunile sistemului stomatognat i de altnatur.

Probleme de situaie:1. Ce enzime salivare posedizoenzime? Ce reacii catalizeazele? Care este semnificaia biologic

a acestor izoenzime?2. Explicai de ce enzimele proteolitice gastrice i pancreatice se produc i secret n form de

proenzime neactive? Care este mecanismul activrii lor?3. Ce mecanism de aciune posed sulfanilamidele, fluoruracilul i alopurinolul? De ce depinde

eficiena tratamentului cu aceste medicamente? Explicai i ilustrai cu formulelecorespunztoare.

4. Aceste enzime posed structur i proprieti fizico-chimice diferite, dar catalizeaz aceeai

reacie. Frecvent ele sunt proteine oligomere formate din monomeri diferii. Aceste enzime sunt:alosterice, izoenzime, proenzime sau zimogeni? Dai exemple concrete de asemenea enzime iexplicai care este valoarea lor clinico-diagnostic.

Teste pentru autoevaluare:1. Care sunt mecanismele activrii enzimelor?

a. proteolizparial;b. modificarea covalent;c. autoasamblarea secundar;

d. activarea alosteric;e. activarea prin exces de substrat;

2. Care afirmaii referitor la influena pH-ului asupra activitii enzimelor sunt corecte?a. fiecare enzimare pH-ul su optim;

b.

pH-ul nu modificactivitatea catalitica enzimei;c. pH-ul influeneazdisocierea grupelor funcionale ale enzimei;d. pH-ul optim pentru pepsineste de 7-8;e. pH-ul optim al tripsinei este de 1-2.


15/17



3. Selectai afirmaiile ce caracterizeazinhibiia competitiv:a. nu se nlaturprin exces de substrat;

b. reprezinto inhibiie ireversibil;

c.

inhibitorul este analog structural al substratului;d. e posibilsimultan fixarea substratului i a inhibitorului;e. inhibitorul se ataeazn centrul alosteric.

4. Care afirmaii referitor la inhibiia alostericsunt corecte?a. apare la enzimele oligomere

b. inhibitorul se unete n centrul activ i schimbconformaia enzimeic. inhibitorul se nlaturprin exces de substratd. enzimele respective preponderent au structurteriare. inhibitorul se leagn centrul alosteric

5. Selectai afirmaiile corecte referitor la creatinfosfokinaza (CPK) :a. este compusdin lanuri M si H, prezentnd 3 izoenzime;

b.

este compusdin lanuri M si B, prezentnd 5 izoenzime;c. este un dimer alctuit din asocierea de lanuri M i B;d. creterea concentraiei serice a formei MB confirminfarctul miocardic;e. creterea concentraiei serice a formei BB confirminfarctul miocardic.

6. Selectai afirmaiile corecte referitor la amilaz:a. face parte din clasa hidrolazelor;

b. este o glicozidaz;c. scindeazlegturile -1,6-glicozidice din amidon i glicogen;d. hiperactivitatea n snge sugerprezena pancreatitei;e. este sintetizatde celulele stomacului

7. Selectai afirmaiile corecte referitor la lipaz:a.

face parte din clasa hidrolazelor;b. existformele izoenzimatice: lingual, esofageal, stomacal i intestinal;c. scindeazfosfogliceridele alimentare;d. lingualare pH-ul optim de 4,5-5,4;e. lingualnu necesitemulsionarea lipdelor alimentare de ctre acizii biliari.

8. Selectai afirmaiile corecte referitor la succinatdehidrogenaz(SDH):a. face parte din clasa transferazelor;

b. acidul malic provoaco inhibiie ireversibil;c. n inhibiie se modificstructura primara substratului ;d. inhibiia nu depinde de concentraia acidului malic;

e.

SDH catalizeazreacia: Succinat + FAD Fumarat + FADH2.

Indicaia metodicnr. 6Totalizare pe capitolele I i II

Chimia proteinelor i Enzimele

1. Obiectul biochimiei i importana n medicina practic, inclusiv, stomatologie.2. Particularitile materiei vii. Proprietile generale de biomoleculelor. Metodele de studiu

utilizate n biochimie.3. Aminoacizii proteinogeni i neproteinogeni. Clasificarea aminoacizilor proteinogeni dup

structura chimic, proprietile fizico-chimice i biologic. Aminoacizii de interes stomatologic:prolina, hidroxiprolina, lizina, hidroxilizinz, alizina, acidul -carboxiglutamic strcutura i rolulbiologic.


16/17



4. Rolul biologic al proteinelor. Rolul proteinelor n meinerea integritii esuturilor dentare.5. Teoria polipeptidic a structurii proteinelor, esena ei i dovezile experimentale. Modul de

legtur a aminoacizilor n molecula proteic. Notarea i citirea aminoacizilor n peptide iproteine. Aminoacizii N i C terminali.

6. Peptidele biologic active: rolul biologic, exemple (glutation, angiotensina, endotelina, etc.).7. Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura primara proteinelor. Legtura

peptidic: strucutra, tipurile, proprietile ei. Modificrile ereditare ale structurii primare iimpliciile biomedicale (anemia falciform).

8. Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura secundara proteinei: tipurile,legturile ce stabilizeazstructura secundar.

9. Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura teriara proteinei. Tipurile delegturi intramoleculare n protein. Proteinele globulare i fibrilare particulariti structurale

i ale proprietilor fizico-chimice, exemple.10.Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura cuaternar a proteinelor.

Tipurile de legturi intramoleculare n protein. Modificrile cooperatiste ale conformaieiprotomerilor (pe exemplul hemoglobinei n comparaie cu mioglobina). Noiune de "domen".

11.Colagenul: particularitile componenei aminoacidice i ale structurii. Rolul biologic.12.Elastina: particularitile componenei aminoacidice i ale structurii. Rolul biologic.13.Proteinele fixatoare de calciu colagenul, osteocalcina calmodulina, factorii coagulrii

sngelui. Particularitile compoziiei aminoacidice ce determinfixarea calciului. Rolul acestorproteine n organism.

14.

Proteinele fixatoare de calciu. Particularitile compoziiei aminoacidice ce determin fixareacalciului. Rolul vitaminei K n asigurarea fixrii calciului. Sursele vitaminei K. HipovitaminozaK cauze, manifestri biochimice i semnele clinice.

15.Clasificarea proteinelor. Proteinele simple. Albuminele, globulinele, histonele caracteristicalor, rolul biologic.

16.Clasificarea proteinelor. Proteinele conjugate. Caracteristica general a cromoproteinelor,metaloproteinelor, nucleoproteinelor, fosfoproteinelor, glicoproteinelor i lipoproteinelor, rolullor biologic, exemple.

17.Masa moleculara proteinelor. Noiuni generale referitor la metodele de determinare a maseimoleculare a proteinelor.

18.

Proprietile amfotere ale proteinelor. Sarcina electric a proteinelor. Factorii ce determinsarcina proteinei. Punctul i starea izoelectric. Importana biomedical.

19.Solubilitatea proteinelor. Proprietile hidrofile ale proteinelor n funcie de componenaaminoacizilor i de particularitile structurale. Factorii de stabilizare n soluie a substanelorcoloidale. Starea soluiilor coloidale: sol, gel, xerogel. Exemple.

20.Saliva soluie coloidal proteic. Proprietile salivei determinate de prezena proteinelor.Originea, reprezentanii i rolul biologic al proteinelor salivare.

21.Denaturarea proteinelor, agenii ce provoacdenaturarea. Modificrile structurale ale proteineila denaturare.

22.

Metodele de determinare, separare i purificare a proteinelor: salifierea, dializa, electroforeza,cromatografia i gelfiltrarea. Valoarea lor biomedical.


17/17



23.Enzimele. Natura chimic. Rolul biologic. Asemrile i deosebirile enzimelor de catalizatoriinebiologici.

24.Noiune de apoenzim i cofactor, grupprostetic i coenzim. Exemple.25.

Cofactorii. Structura vitaminei B1i cofactorii acestei vitamine, rolul ei metabolic. Exemple dereacii n care participtiamin-pirofosfatul.

26.Cofactorii. Structura vitaminei B2, cofactorii acestei vitamine, rolul lor metabolic. Exemple dereacii n care participFMN-ul i FAD-ul

27.Cofactorii. Structura vitaminei B6, cofactorii acestei vitamine, rolul lor metabolic. Exemple dereacii n care particippiridoxal-fosfatul.

28.Cofactorii. Structura vitaminei PP, cofactorii acestei vitamine, rolul lor metabolic. Exemple dereacii n care participNAD+i NADPH.

29.Cofactorii. Structura vitaminei C, rolul ei metabolic. Exemple de reacii n care particip.

30.

Funciile de coenzimatice ale microelementelor.31.Mecanismul de aciune al enzimelor. Centrul activ al enzimelor i rolul lui n formarea i

transformarea complexelor intermediare dintre enzim i substrat. Rolul modificrilorconformaionale reciproce ale moleculei enzimei i substratului la favorizarea catalizei (reaciei)

modelul clasic (Fischer) i modelul coincidenei induse (Koshland).32.Specificitatea de aciune a enzimelor, tipurile. Exemple.33.Cinetica enzimatic. Influena concentraiei enzimei i a substratului, a pH-ului i a temperaturii

asupra activitii enzimatice34.Activarea enzimelor. Activarea enzimelor prin proteoliza limitat. Zimogenii (proenzimele).

Exemple de enzime activitatea crora este reglatprin aceste mecanisme.35.Inhibiia activitii enzimelor (specific i nespecific, reversibil i ireversibil, competitiv inecompetitiv). Exemple de enzime activitatea crora este reglatprin aceste mecanisme.

36.Reglarea activitii enzimelor (reglarea alosteric, reglarea covalent). Importana principiuluide retroinhibiie. Exemple de enzime activitatea crora este reglatprin aceste mecanisme.

37.Izoenzimele. Rolul biologic. Exemple.38.Clasificarea enzimelor. Oxidoreductazele, transferazele, hidrolazele. Cofactorii

oxidoreductazelor i ai transferazelor. Exemple de reacii catalizate de enzime ale acestor clase.39.Clasificarea enzimelor. Liazele, izomerazele, ligazele. Cofactorii acestor enzime. Exemple de

reacii catalizate de enzime ale acestor clase.

40.

Organizarea enzimelor n celul(ansamblurile enzimatice, compartimentalizarea). Deosebirilen componena enzimatica organelor i esuturilor. Enzimele organospecifice.

41.Principiul determinrii activitii enzimelor. Unitile de activitate a enzimelor (unitateainternaional, katalul, activitatea specific).

42.Utilizarea enzimelor n practica medical: enzimodiagnosticul, enzimoterapia, utilizareaenzimelor n laborator.

43.Enzimele salivei reprezentanii principali, funciile lor, originea, modificrile activitii lor nafeciunile sistemului stomatognat i de altnatur.

1. im s ro proteine enzime 2015 2016

Documents