UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Domeniu: BIOTEHNOLOGII

Rezumatul Tezei de Doctorat

Studiul activităŃii unor enzime vegetale (lipoxigenaze şi lipaze) implicate în biotehnologia

şi metabolismul lipidelor

Conducător ştiinŃific Prof.Dr. Carmen SOCACIU

Doctorand Ing.Veronica Sanda CHEDEA

Cluj-Napoca 2009

CUPRINS

CUPRINS..............................................................................................................................................2 INTRODUCERE: Scop şi obiective.....................................................................................................3 I. STUDII ALE ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZICE ..........................................................................8

I.1. CINETICA DIVERSELOR LIPOXIGENAZE DIN BOABELE DE SOIA ESTE INFLUENłATĂ DE pH, DISPONIBILTATEA SUBSTRATULUI ŞI PROCEDURA DE EXTRACłIE ..............................................................................................................................8 I.2. CINETICA OXIDĂRII SN1-PALMITOIL, SN2-LINOLEOIL FOSFATIDIL COLINEI (PC) CA SUBSTRAT PENTRU LIPOXIGENAZA RECOMBINATĂ DIN PORUMB (RM9-LOX) ..................................................................................................................11 I.3. EVALUAREA COMPARATIVĂ A ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI ÎN DIFERITE CONDIłII DE REACłIE, UTILIZÂND PARAMETRII SĂI CINETICI .................14

I.3.1. Determinarea parametrilor cinetici KM şi Vmax pentru LOX-1 standard având ca substrat acidul linoleic în absenŃa şi prezenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de reacŃie ....................................................................................................................14 I.3.2. Cinetica oxidării acidului linoleic de către LOX-1 din soia într-un mediu de reacŃie saturat în oxigen ..............................................................................................................15 I.3.3. InfluenŃa unor detergenŃi asupra oxidării acidului linoleic şi a 1-linolenoil-ras-glicerolului de către LOX-1 standard şi RZM9-LOX.................................................................16 I.3.4. Determinarea parametrilor cinetici (KM, Vmax) a LOX pure folosind ca substrat acidul docosadienoic acid (acid brasic) (22:2)............................................................................19

II. STUDII PRIVIND INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI ......................................................................21 II.1. INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI DE CĂTRE QUERCETINĂ ...............................................21

II.1.1. InfluenŃa quercetinei pure asupra oxidării linoleatului de sodiu de către lipoxigenaza pură din boabele de soia LOX-1............................................................................21 II.1.2. InteracŃiunea intermoleculară între lipoxigenază şi quercetină este influenŃată de pH şi timpul de incubare ........................................................................................................26

II.2. EFECTUL INHIBITOR AL IZOFLAVONELOR DIN SOIA ASUPRA ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI DIN BOABELE DE SOIA.....................................................28 II.3. ACTIVITATEA LIPOXIGENAZEI ÎN PREZENłA CATECHINEI, EPICATECHINEI ŞI A UNOR PROCIANIDINE ÎN MEDIU BIOTIC ŞI ABIOTIC.................32

II.3.1. CompoziŃia în polifenoli şi stabilitatea extractului apos din sâmburi de struguri din soiul Merlot Recaş...................................................................................................32 II.3.2.CompoziŃia în polifenoli a extractului enzimatic LE ........................................................38 II.3.3. InteracŃiunea dintre lipoxigenaza pură şi din extract şi catechina pură şi dintr-un extract polifenolic ca model de studiu al modulării echilibrului oxidant/antioxidant în condiŃii abiotice şi biotice.......................................................................39

II.4. EVALUAREA UNOR CAROTENOIDE CA INHIBITORI DE LIPOXIGENAZĂ…43

CONCLUZII GENERALE.................................................................................................................49

INTRODUCERE: Scop şi obiective

Lipazele şi lipoxigenazele sunt enzime cheie implicate în metabolismul

lipidic atât la nivelul celulei vegetale cât şi al celei animale. Date extinse din

literatura de specialitate se referă la implicaŃiile acestor enzime în bolile umane şi

mult mai puŃin la implicaŃiile lor în fiziologia şi patologia plantelor. Tehnologia şi

biotehnologia alimentară au profitat de cunoştintele deja acumulate despre lipaze

şi lipoxigenaze, în special pentru găsirea unor soluŃii în vederea modulării sau

inhibării activităŃii acestora, evitându-se distrugerea (prin hidroliză şi oxidare) a

matricelor lipidice şi formarea de mirosuri neplăcute.

Lipoxigenazele, care se găsesc atât în regnul vegetal cât şi cel animal, sunt

o familie de proteine monomerice dioxigenaze care conŃin ionul de fier neheminic

ca şi cofactor, nu conŃin sulf şi catalizează oxidarea acizilor graşi polinesaturaŃi

cum ar fi, acidul linoleic, linolenic şi arahidonic, acizi ce conŃin în molecula lor cel

puŃin un fragment structural 1Z, 4Z-pentadienă. În urma reacŃiei lipoxigenazei se

formează hidroperoxizi folosind trecerea de la ionul Fe+2 la Fe+3 şi oxigenul

molecular, prin transfer de electroni între radicali intermediari. Enzima poate să

catalizeze de asemenea şi cooxidarea carotenoidelor, ducând astfel la pierdera

culorii naturale şi a anumitor nutrienŃi esenŃiali. LOX sunt implicate in generarea

aromelor în numeroase produse din plante, în decolorarea pigmenŃilor şi în

potenŃiala compromitere a statusului antioxidant. De exemplu ele sunt

responsabile pentru mirosurile nedorite produse în timpul procesării şi depozitării

produselor proteice derivate din seminŃele de leguminoase şi dezvoltarea gustului

de învechit a berii în timpul păstrării acesteia. În cazul pastelor făinoase LOX sunt

implicate în pierderea culorii, demonstrată şi prin corelaŃia pozitivă între scăderea

conŃinutului în β-caroten după pastificare şi activitatea lipoxigenazelor. În plus,

hidroperoxidarea şi reacŃiile de decolorare a LOX sunt corelate, demonstrând că

decolorarea poate fi datorată unei acŃiuni co-oxidative a LOX.

S-a demonstrat în literatura de specialitate că lipazele deŃin un loc secundar

în formarea de molecule cu potenŃial toxic şi au mecanisme mai puŃin interesante

legate de stresul oxidativ, şi prin urmare experienŃele ce fac obiectul acestei teze

au fost dezvoltate în direcŃia inhibării lipoxigenazelor vegetale. Scopul prezentei

teze este cel de a contribui la dezvoltarea cunoştin Ńelor legate de activitatea

lipoxigenazelor de origine vegetală (utilizând boabele de soia ca matrice şi

sursă de enzime şi lipide), de implicarea acestor enzime în producerea de

molecule toxice, oxidate şi mirosuri neplăcute precum şi de mecanismele

inhibării acestora de către compuşi antioxidanŃi naturali.

Cum deja a fost propus în urma cercetărilor anterioare, efectul inhibitor al

antioxidanŃilor asupra lipoxigenazei depinde de starea fizico-chimică a substratului

şi de tipul de lipoxigenază, şi se poate schimba complet în funcŃie de condiŃii.

Stresul oxidativ, consecinŃa dezechilibrului dintre prooxidanŃi şi

antioxidanŃi la nivelul organismului, ducând la formarea de hidroperoxizi toxici, a

câştigat rapid atenŃia cuvenită ca un fenomen cheie în bolile cronice: boli

cardiovasculare, hipertensiune, diabet şi cancer.

Complexe ale radicalilor peroxil se formează în tipul ciclului catalitic al

LOX, complexe ce pot servi ca sursă de radicali liberi. Din această direcŃie

lipoxigenazele pot fi văzute ca un inductor de stres oxidativ, stres oxidativ ce

favorizează la rândul lui un întreg set de procese co-oxidative şi peroxidări

lipidice, mediate sau nu enzimatic de LOX. Având în vedere efectele distructive la

nivelul organismului ale dezechilibrului cauzat de oxidarea acizilor graşi, există un

interes considerabil în găsirea şi caracterizarea de noi inhibitori ai LOX.

Efectele distructive ale poceselor oxidative pot fi reduse printr-o dietă

bogată în flavonoide şi carotenoide, compuşi care se găsesc în fructe, legume şi

anumite băuturi. AntioxidanŃi ca flavonoidele şi carotenoidele care acŃioneaza

împotriva radicalilor liberi pot acŃiona şi ca inhibitori de LOX.

Principalele obiective experimentale ale tezei sunt:

1. Studiul activităŃii lipoxigenazei, pure sau în extract în diferite condiŃii de

reacŃie. Lipoxigenazele folosite au fost: lipoxigenaza pură, standard din

boabele de soia, lipoxigenazele din extractul nepurificat din boabele de soia

şi lipoxigenaza recombinată din porumb. A fost studiat modul în care

cineticile diferitelor lipoxigenaze din soia sunt influentate de pH,

disponibilitatea substratului şi diferitele proceduri de extracŃie folosite.

2. Studiul activitaŃii lipoxigenazei prin inhibiŃia specifică de către două clase

de inhibitori naturali : polifenolii (quercetina- inhibitor generic din clasa

flavonoidelor, izoflavone, catechina şi alŃi flavan-3-oli, procianidine) şi

carotenoide. Aceste studii au avut ca scop explicarea activităŃii enzimatice

în relaŃie cu interacŃiunea moleculară directă sau indirectă a lipoxigenazei

cu moleculele inhibitoare.

Structura tezei. Prima parte a tezei reprezintă studiul de literatură iar

partea a doua conŃine procedurile experimentale: materiale şi metode, rezultate şi

discuŃii, concluzii.

Prima parte include două capitole (I-II):

• Capitolul I - Lipoxigenaze: caracterizare generală şi mecanismele

biochimice specifice

• Capitolul II - Lipaze: caracterizare generală

Partea a Doua (Contribu Ńii originale) este organizată în două capitole:

• Capitolul III – Studii ale activităŃii lipoxigenazice. În prima parte a

acestui capitol s-a studiat comportamentul cinetic a diferitelor lipoxigenaze

extrase din boabele de soia şi s-a arătat că acesta este influenŃat de pH,

disponibilitatea substratului şi procedurile de extracŃie. În partea a doua

sunt prezentate rezultatele legate de cinetica oxidării sn1-palmitoil, sn2-

linoleoil fosfatidil colinei ca substrat al 9-lipoxygenazei din porumb

recombinate. În partea a treia a acestui capitol o evaluare comparativă a

activităŃii lipoxigenazei în diferite condiŃii de reacŃie este prezentată: mediu

de reacŃie saturat cu oxigen, prezenŃa clorurii de sodiu sau a diverşilor

detergenŃi în mediul de reacŃie.

• Capitolul IV – Studii privind inhibi Ńia lipoxigenazei. În prima parte sunt

prezentate importanŃa şi mecanismele de inhibiŃie a lipoxigenazei.

Capitolul continuă cu partea a doua, tratând influenŃa quercetinei pure

asupra oxidării linoleatului de sodiu de către lipoxigenaza pură din boabele

de soia. Partea a treia este dedicată interacŃiunilor intermoleculare dintre

lipoxigenază şi quercetină şi cum acestea sunt influenŃate de pH şi timpul

de incubare. În partea a patra este prezentat efectul inhibitor al

izoflavonelor din soia asupra lipoxigenazelor din soia. Activitatea

lipoxigenazei în prezenŃa catechinei, epicatechinei şi a procianidinelor în

mediu abiotic şi biotic este prezentată în partea a cincea. În partea a şasea

unele carotenoide sunt evaluate ca inhibitori de lipoxigenază.

Experimentele ce alcătuiesc această teză au fost efectuate în laboratoarele

Departamentului de Chimie şi Biochimie a UniversităŃii de ŞtiinŃe Agricole şi

Medicină Veterinară Cluj-Napoca sub coordonarea Prof. Carmen Socaciu, în

cadrul Departamentului de Oxilipine, Institutul de Biochimie şi Biofizică din

Kazan, filială a Academiei de ŞtiinŃe Ruse şi în Departamentul de Biochimie a

UniversitaŃii din Kazan, FederaŃia Rusă sub coordonarea Prof. Alexander

Grechkin şi în Departamentul de Chimie Organică, Facultatea de Inginerie în

BioştiinŃe, Universitatea din Ghent, Belgium, sub coordonarea Prof. Roland

Verhe. Activiatea desfăşurată în cadrul acestei teze a fost în parte finanŃată de un

proiect CNCSIS, PNII, proiectul TD 392/2007.

I. STUDII ALE ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZICE

I.1. CINETICA DIVERSELOR LIPOXIGENAZE DIN BOABELE DE SOIA ESTE INFLUENłATĂ DE pH, DISPONIBILTATEA SUBSTRATULUI ŞI

PROCEDURA DE EXTRACłIE

Scop şi obiective

Enzimele LOX s (MW≈ 95 kDa) sunt active în diferite condiŃii, fiecare

enzimă din familia LOX având un pH optim specific, acest fapt explicând

diferenŃele de comportament kinetic.

Scopul experimentelor efectuate în cadrul acestui capitol a fost evaluarea

comportamentului cinetic a trei lipoxigenaze din extractul primar din boabele de

soia. Aceste enzime catalizează formarea mirosurilor neplăcute în timpul

procesării boabelor de soia în vederea obŃinerii de produse alimentare. Studiul de

faŃă se doreşte a fi o etapă premergatoare celei reprezentate de inhibiŃia

lipoxigenazelor de către compuşi naturali cu potenŃial antioxidant.

Experimentele au avut următoarele obiective:

1. Determinarea parametrilor cinetici a LOX-1 din soia pură, la diferite pH-uri.

2. Determinarea comparativă a parametrilor cinetici a diverselor extracte din

boabele de soia, extracte ce conŃin enzime LOX, în funcŃie de procedura de

extracŃie şi testare.

3. Evaluarea parametrilor care influenŃează activitatea LOX: pH-ul şi raportul

enzimă substrat, ca indicatori ai afinităŃii enzimatice în diferite medii de reacŃie.

Rezultate

Curbele cinetice la diferite pHm (6.1, 7.1 şi 9) prezintă activitatea specifică

a LOX-1, LOX-2 şi LOX-3.

Am confirmat date din literatura de specialitate legate de dependenŃa

enzimelor LOX de pHm (Siedow, 1991; Loiseau şi col, 2001; Kosary şi col,

2004). InfluenŃa pH-ului asupra activităŃii SLOX (LOX-1 din boabele de soia),

poate fi explicată prin faptul că la diferite pHm situsul catalitic al enzimelor de

LOX are conformaŃii şi stări oxidative ale ionului de fier diferite. (Gardner, 1989).

Considerând rezultatele noastre obŃinute prin testul T0 (enzima pură) putem

afirma că cele mai bune condiŃii de evaluare a activităŃii LOX este să se aleagă un

pHdil şi un pHm de 9.0 (în tampon borat 0.2M) la E/LS = 0.095·10-3. Când

raportul E/LS a crescut de 2 ori, activitatea LOX-1 a scăzut cu aproximativ 40%,

E/LS optim fiind observat între 0.05 şi 0.1·10-3 mg protein/nmol substrat. Pentru

studiile de inhibare a LOX asemenea observaŃii pot fi utile, indicând cel mai

potrivit pH şi raport E/LS pentru măsurători cinetice.

Testele T1-T3 pentru extractul primar (E1) au evaluat activitatea LOX-1 la

pH=9 (T1), activitatea LOX-2 la pHm=6.1 (T2) şi LOX-3 la pH=7.1 (T3).

Fig.I.1. Curbele cinetice ale activităŃii lipoxigenazei LOX-1, din diferite extracte din făina de soia (E1-E4), măsurate la pHm =9.0. Extractele au fost preparate la diverse pHdil, folosindu-se diferite rapoarte de concentraŃie enzimă-substrat, exprimate ca mg proteină·10-3/nmol substrate. Creşterea în absorbanŃă (Abs) (0-300 sec) la 234 nm indică în fiecare caz formarea de 13-HPOD. A. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 1.44 ; B. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 11.56; C. pHdil= 6.1 şi E2/LS = 6.12; D. pHdil= 6.8 şi E3/LS = 2.52; E. pHdil= 7.1 şi E4/LS = 2.64.

Fig.I.2. Curbele cinetice ale LOX-2 din extractele bogate în lipoxigenază (E1-E4), măsurate la pHm =6.1. Extractele au fost obŃinute la diferite pHdil folosindu-se diferite rapoarte (E/LS), exprimate ca mg protein·10-3/nmol substrate. Creşterea în absorbŃie (0-300 sec) la 234 nm indică, în fiecare caz, formarea unui amestec de 13- şi 9-HPOD. A. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 2.88; B. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 2.32; C. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 1.44; D. pHdil= 6.1 şi E2/LS = 1.52; E. pHdil= 6.8 şi E3/LS = 1.24; pHdil=7.1 şi E4/LS = 1.64.

Fig.I.3. Curbele cinetice suprapuse ale activităŃii LOX-3, din extractele bogate în lipoxigenază (E1-E4), măsurate la pHm =7.1. Extractele au fost obŃinute la diferite pHdil folosindu-se diferite rapoarte (E/LS), exprimate ca mg proteină·10-3/nmol substrat. Creşterea în absorbŃie (0-300 sec) la 280 nm indică, în fiecare caz,

0.6

1.5

0.8

1

1.2

1.4

0 300100 200

Abs

Time [sec]

ab

c

formarea de cetodiene; a-E1, pHdil=6.1 şi E1/LS = 0.36; b-E2, pHdil=6.1 şi E2/LS = 0.38, şi E3 pHdil=6.8, E3/LS = 0.155; c-E4, pHdil=7.1 şi E4/LS = 0.205. În cazul testului T1, la pHm=9, extractele E2 şi E3, dar nu E1 au avut o fază

de lag corespunzătoare unei viteze de reacŃie scăzute. A fost demonstrate că faza

de lag creşte la concentraŃii mari ale acidului linoleic şi descreşte cu creşterea

concentraŃie de produs de reacŃie, respectiv HPOD (Wang et al, 1993). Faze de lag

au fost de asemenea observate pentru pHm=6.1 pentru toate extractele E1-E4.

T1 indică o mai bună extracŃie a LOX-1 în E1 şi E3, T2 indică activitatea

scăzută a LOX-2 în extractele din boabele de soia, în timp ce T3 indică faptul că

extractele degresate E3 şi E4 au avut o activitate mai bună a LOX-3 decât extractul

primar sau E2. Rezultatele măsurătorilor efectuate prin testul T3 pentru cinetica

LOX-3 sunt mai dificil de interpretat deoarece produsul de hidroperoxidare este

parŃial transformat în cetodiene care absorb la 280nm (Axelrod et al, 1981).

I.2. CINETICA OXIDĂRII SN1-PALMITOIL, SN2-LINOLEOIL FOSFATIDIL COLINEI (PC) CA SUBSTRAT PENTRU LIPOXIGENAZA RECOMBINATĂ

DIN PORUMB (RM9-LOX)

Scop şi obiective

Scopul acestui experiment (efectuat la Universitatea din Kazan, FederaŃia

Rusă, Departmentul de Biochimie şi la Institutul de Biochimie şi Biofizică din

Kazan, filială a Academiei de ŞtiinŃe Ruse, Departamentul de Oxilipine sub

coordonarea Prof. Alexander Grechkin) a fost elucidarea supoziŃiei că 9-LOX

catalizează dioxigenarea lipidelor complexe cum ar fi PC în poziŃia 9 a lanŃului de

carbon. Am luat în studiu 9-lipoxigenaza din porumb recombinată (RM9-LOX),

care adaugă oxigen la carbonul 9 a acidului linoleic şi prezintă activitate de

hidroperoxidare la pH cuprins între 6.5 şi 7.5-activitatea maximă a fost observată

la pH 7.0 (Wilson et al, 2001).

Rezultate

Fig.I.4. prezintă cromatograma produşilor de oxidare a 1- palmitoil, 2-

linoleoil fosfatidil colina catalizată de 9-LOX din porumb recombinată. Au fost

identificate 6 semnale, patru dintre ele fiind identificate pe baza cromatogramelor

standard din baza de date lipidice (http://lipidbank.jp/image/DFA0014SP0001.gif)

pusă la dispoziŃie de dr. T. Kasama. Semnalele 5 şi 6 au fost identificate ca fiind

trimetilsilil eterii a 9-HPOD (semnalul 5) şi a13-HPOD (semnalul 6).

Fig.I.4. Gaz cromatograma produşilor de reacŃie în cazul oxidării 1- palmitoil, 2-

linoleoil fosfatidil colina în prezenŃa lipoxigenazei recombinate din porumb, 9-

LOX. 6 semnale au fost identificate ca fiind: 1-acidul miristic, 2- acidul palmitic,

3- acidul heptadecenoic (margaric, daturic), 4-acidul stearic, 5-, 9-OTMS-stearat,

6-, 13-OTMS-stearat.

Identificarea semnalelor este prezentată în Tabelul I.1.

Tabel I.1. Identificarea celor mai importanŃi produşi de reacŃie obtinuŃi prin oxidarea 1- palmitoil, 2-linoleoil phosphatidil colinei de către 9-LOX din porumb în concordanŃă cu timpii de retenŃie şi raporturile m/z

Peak No.

Semnal nr.

Retention time/min Timpul de

retenŃie/min

Identification

Identificarea

m/z ratio for the base

peaks [M-H]- raportul m/z

pentru semnalele de bază [M-H] -

Chemical structure

Structura chimică

1. 8.74 Acid Miristic C14:0

211, 242

2. 11.05 Acid Palmitic C16:0

239, 270

3. 12.11 Acid Margaric C17:0

241, 284

4. 13.28 Acid Stearic C16:0

255, 298

5. 16.02 9-HPOD* 229, 259

6. 16.30 13-HPOD* 173, 315

* Compuşii identificaŃi au fost prezenŃi în cromatogramă ca trimetilsilil eteri.

I.3. EVALUAREA COMPARATIVĂ A ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI ÎN DIFERITE CONDIłII DE REACłIE, UTILIZÂND PARAMETRII SĂI

CINETICI

I.3.1. Determinarea parametrilor cinetici KM şi Vmax pentru LOX-1 standard având ca substrat acidul linoleic în absenŃa şi prezenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de reacŃie

Scop şi obiective

Folosind LOX-1 standard şi acidul linoleic ca substrat am determinat

parametrii cinetici KM şi Vmax, şi curba Michaelis-Menten ca date de referinŃă

pentru studii viitoare în condiŃiile noastre experimentale. Pornind de la această

ideie am evaluat şi influenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD asupra oxidării acidului

linoleic de către LOX-1 std.

Rezultate

În cazul activităŃii LOX în absenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de

reacŃie (considerate condiŃii standard de reacŃie), curba Michaelis-Menten arată că

la concentraŃii mai mari de 100 µM avem o inhibiŃie generată de substrat pentru

concentraŃia de enzimă luată în studiu de această dată. Pentru a obŃine graficul

Lineweaver-Burke, 1/[S] şi 1/v au fost calculate pentru concentraŃii diferite de

substrat (5-100µM).

Valorile KM şi Vmax calculate au fost:

KM=20 µM, vmax=40 µM* s-1*mg.enz.-1în cazul activităŃii enzimatice în absenŃa

Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de reacŃie

şi

KM=25 µM, vmax=48 µM* s-1*mg.enz.-1 în cazul activităŃii enzimatice în prezenŃa

Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de reacŃie

I.3.2. Cinetica oxidării acidului linoleic de către LOX-1 din soia într-un mediu de reacŃie saturat în oxigen Scop şi obiective

Acest experiment a avut ca obiect de studiu oxidarea acidului linoleic de

către LOX-1 când mediul de reacŃie a fost saturat cu oxigen.

Rezultate

Tabelul I.2 prezintă viteza oxidării acidului linoleic de către LOX-1 în

absenŃa şi în prezenŃa oxigenului adăugat în amestecul de reacŃie.

Tabel I.2. Vitezele de reacŃie pentru oxidarea acidului linoleic în prezenŃa sau absenŃa O2

adăugat în amestecul de reacŃie.

Substr. conc. (µM)

Conc.substr.

Reaction velocity for the oxidation of linoleic acid in oxygen

saturated medium Viteza de reacŃie pentru oxidarea acidului linoleic

în mediu saturat în oxigen

Reaction velocity for the oxidation of linoleic acid in medium

unsaturated in O2 Viteza de reacŃie pentru oxidarea

acidului linoleic în mediu nesaturat în oxigen

5 0,0005 0,0005 6,25 0,0005 0,0005 10 0,0004 0,0003 20 0,0019 0,0027

Oxigenul influenŃează viteza de reacŃie proporŃional cu creşterea concentraŃiei de substrat.

Influen Ńa sării (NaCl) asupra comportamentului cinetic al oxidării acidului

linoleic de către LOX-1

În acord cu experimente cinetice efectuate de alte grupuri de cercetare

(Coffa şi col, 2005), a fost de asemenea evaluată oxidarea acidului linoleic de

către LOX-1 în prezenŃa sării în amestecul de reacŃie.

AbsorbanŃele înregistrate pentru vitezele maxime de reacŃie au fost 0,015

AU în absenŃa sării şi 0,015 AU în prezenŃa acesteia.

I.3.3. InfluenŃa unor detergenŃi asupra oxidării acidului linoleic şi a 1-linolenoil-ras-glicerol de către LOX-1 standard şi RZM9-LOX

Scop şi obiective

Lipoxigenazele catalizează oxidarea acidului linoleic în mediu apos doar

dacă substratul este disponibil pentru enzimă în special ca emulsie. Starea instabilă

de agregare a emulsiilor acizilor graşi polinesaturaŃi în faza apoasă au dus la

concluzia că ar trebui utilizaŃi detergenŃi pentru a stabiliza emulsiile substratului.

Datele de literatură relevă faptul că cele mai multe rezultate au fost obŃinute pentru

acil gliceroli şi fosfolipide care sunt substrat pentru lipaze şi fosfolipaze însă puŃin

s-a lucrat în acest sens pe lipoxigenază.

DetergenŃii utilizaŃi în urmatoarele experimente sunt: Tween 20, SDS,

zwittergent şi deoxicolat şi influenŃa acestora asupra oxidării 1-Linolenoil-ras-

glicerolului (18:3-G) de către LOX-1 standard şi RZM9-LOX a fost evaluată.

Rezultate

Într-un experiment precedent (Capitolul III.3.1.) s-a arătat că Tween 20 a

crescut viteza de reactie a acidului linoleic de către LOX-1. Acest set de

experimente au urmărit influenŃa anumitor detergenŃi asupra oxidării lipidului

complex 1-Linolenoil-ras-glicerol de către RMZ-9LOX. Oxidarea acidului linoleic

de către LOX-1 şi RMZ-9LOX au fost luate ca situaŃii control.

Adăugând SDS în amestecul iniŃial de reacŃie viteza acesteia nu a fost

modificată însă este nevoie de un timp mai îndelungat pentru a obŃine maximul de

produşi de reacŃie. 13-HPOD adăugat amestecului de reacŃie a dus la creşterea

vitezei de reacŃie. Dublând cantitatea de Tween 20 în prezenŃa SDS-ului şi a 13-

HPOD, 18:3-G a fost oxidat mai rapid rezultând o mai mare cantitate de produs de

reacŃie. Acest fapt sugerează că raportul dintre cei doi detergenŃi influenŃează de

asemenea disponibilitatea substratului pentru LOX-1. O foarte slabă oxidare s-a

înregistrat în cazul RZM-9LOX având ca substrat 18:3-G fără a adăuga SDS în

amestecul de reacŃie. În prezenŃa SDS, enzima recombinată a fost inactivată , în

aceleaşi condiŃii în care 18:3-G a fost oxidat de către LOX-1 cu viteza maximă.

� Este posibil că SDS afectează enzima recombinată deci detergentul ar

trebui înlocuit cu un altul, pentru a avea o mai bună oxidare a 18:3-G de

către RZM-9LOX

� Adăugând SDS, 13-HPOD şi dublând volumul iniŃial de Tween 20, s-a

obŃinut o rată de oxidare a 18:3-G de către LOX-1 în comparaŃie cu situaŃia

când aceşti compuşi nu au fost folosiŃi.

� Raportul Tween 20:SDS influenŃează disponibilitatea substratului în

vederea oxidării lui de către LOX-1.

Din experimentul anterior a rezultat faptul că lipoxigenaza recombinată a

fost inactivată de SDS, şi în consecinŃă acesta a fost înlocuit cu zwittergent

(detergent zwitterionic) (3-dodecildimetilamoniu-1-propansulfonate) şi deoxicolat.

Şi de această dată cea mai înaltă rată de oxidare s-a înregistrat pentru

reacŃia acidului linoleic în prezenŃa LOX-1 şi a Tween 20. Adăugând SDS în

amestecul iniŃial de reacŃie (soluŃie tampon+substr.+ enz.+Tween 20) viteza

reacŃiei a scăzut la aproape jumătate (de la 0.00805, la 0.00383). Dacă în

amestecul iniŃial de reacŃie am adăugat 5 µl ZW viteza a scăzut de 8 ori iar prin

adăugarea a 40 µl DOX. La 1/5 din volumul iniŃial de DOX viteza de reacŃie a

înregistrat o creştere remarcabilă, de la 0.00080 la 0.0062. Aceeaşi situaŃie s-a

înregistrat în cazul folosirii a 1/5 din volumul iniŃial de ZW când creşterea a fost

de la 0.00111 la 0.00668-de 6 ori mai mare. Un raport adecvat Tween 20:ZW şi

Tween 20:DOX duce la creşterea vitezei de oxidare a acidului linoleic de către

LOX-1.

Dacă SDS nu a influenŃat oxidarea acidului linoleic de către LOX-1 prin

creşterea vitezei de reacŃie, pentru 18:3-G, cea mai bună rată de formare a

hidroperoxizilor s-a realizat când 5 µl SDS au fost adăugaŃi amestecului de reacŃie

(0.00748 când 18:3-G a fost oxidat de LOX-1 în prezenŃa SDS 0.00383 în

prezenŃa ZW). 1/5 din volumul iniŃial de ZW a influenŃat diferit oxidarea celor

două substraturi având o mai bună acŃiune în cazul acidului linoleic, viteza de

reacŃie crescând de două ori în comparaŃie cu 1-linolenoil-ras-glicerolul (0.00668

şi 0.00368).

O proporŃie de 1/5 din volumul iniŃial de DOX a avut aceeaşi influenŃă în

cazul 18:3-G şi a 18:2 oxidaŃi de către LOX-1 (0.00625 şi respectiv 0.00662).

Împreună cu sonicarea SDS a avut de asemenea o influenŃă pozitivă asupra vitezei

de oxidare (0.00748) a 1-Linolenoil-ras-glicerolului–cea mai bună pentru acest

substrat oxidat de LOX-1-în comparaŃie cu cea a acidului linoleic.

� Zwittergent a avut o influenŃă pozitivă asupra oxidării acidului linoleic de

către LOX-1 la 1/5 din volumul iniŃial (1 µl 0.1%)

� SDS are o influenŃă mult mai bună asupra oxidării 1-Linolenoil-ras-

glicerolului decât asupra celei a acidului linoleic implicând LOX-1

� DOX a avut aceeaşi influenŃă asupra oxidării 1-Linolenoil-ras-glicerolului

şi a acidului linoleic de către LOX-1 la 1/5 din volumul iniŃial (5 µl DOX

10mM)

În cazul folosirii 1-Linolenoil-ras-glicerolului ca substrat şi RM9-LOX ca

enzima ce-i catalizează oxidarea, în prezenŃa DOX viteza de reacŃie a fost

0.00227, aproape de 3 ori mai mică decât atunci când oxidarea a fost catalizată de

Tween 20. Adăugând mai mult Tween 20–dublându-i volumul-viteza de reacŃie nu

a suferit nici o modificare. În ceea ce priveşte volumul de DOX adăugat, s-a

observat că dublând volumul iniŃial sau scăzându-l la jumătate nu a dus la

creşterea vitezei de reacŃie ci la scăderea acesteia. Adăugând 13-HPOD la volum

dublu de DOX, a menŃinut viteza de reacŃie la un nivel inferior celui iniŃial.

Interesantă a fost observaŃia ca scăzând concentraŃia substratului la jumătate, fără

13-HPOD şi la jumătate volum de DOX viteza de reacŃie a crescut fiind

înregistrată cea mai mare valoare a acesteia pentru acest experiment. În aceleaşi

condiŃii dar scăzând concentraŃia substratului la 1/5 din cea iniŃială a fost

înregistrată o bună viteză de reacŃie, aproape 75% din cea prezentată mai sus, când

½ din cantitatea iniŃială de 18:3-G a fost utilizată. Cu 4µl DOX 1.750µl 1-

Linolenoil-ras-glicerol au fost oxidaŃi de către RMZ-9LOX cu o viteză de reacŃie

de 0.00294 iar în prezenŃa a 4µl DOX, 0.5 µl de 1-Linolenoil-ras-glicerol au fost

oxidaŃi cu o viteză de 0.00193, aceasta demonstrând faptul că viteza oxidării

depinde de raportul 1-Linolenoil-ras-glicerol:DOX .

� Viteza de oxidare a 1-Linolenoil-ras-glicerolului de către RMZ-9LOX este

influenŃată de raportul substrat:DOX

I.3.4. Determinarea parametrilor cinetici (KM, Vmax) a LOX pure folosind ca substrat acidul docosadienoic acid (acid brasic) (22:2)

Scop şi obiective

Modelarea moleculară (Gillmor şi col, 1997; Browner şi col, 1998) a

sugerat că volumul situsului catalitic poate fi important pentru specificitatea

poziŃională a reacŃiei lipoxigenazei, respectiv formarea hidroperoxizilor. Această

ipoteză legată de volumul situsului catalitic a fost la început contrazisă de teoria

bazată pe orientarea substratului care sugerează posibilitatea alinierii substratului

în interiorul situsului cu gruparea carboxil întâi şi nu cu cea metil cum ar fi în mod

obişnuit (Gardner, 1989; Prigge şi col, 1998). Date experimentale recente

sugerează că ambele teorii ar fi corecte (Meruvu şi col, 2005). Experimentul de

faŃă a evaluat posibilitatea oxidării substratului prin alinierea în situsul catalitic cu

gruparea carboxil la început.

Rezultate

Reprezentând [A]/t unde [A] este absorbŃia iar t reprezintă timpul de reacŃie

la care absorbŃia a fost determinată, în funcŃie de concentraŃia de substrat [S], s-a

observat că, la concentraŃii ale substratului mai mari de 200µM, enzima a fost

inhibată de către substrat.

Din graficul Linewaver-Burke parametrii cinetici au fost determinaŃi ca

fiind KM=27.8 µM iar vmax=12.8 µM* s-1*mg.enz.-1

II. STUDII PRIVIND INHIBI łIA LIPOXIGENAZEI

II.1. INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI DE CĂTRE QUERCETINĂ

II.1.1. Influen Ńa quercetinei pure asupra oxidării linoleatului de sodiu de către lipoxigenaza pură din boabele de soia LOX-1

Scop şi obiective

Pentru a studia modul în care quercetina inhibă reacŃia de oxidare a acidului

linoleic de către LOX-1, trei protocoale experimentale au fost folosite. DiferenŃele

între acestea este dată de ordinea în care reactanŃii (enzima, substratul, inhibitorul)

au fost amestecaŃi, şi de timpul de incubare a acestora. Parametrii cinetici au fost

de asemenea determinaŃi.

Fig.II.5. Reprezentarea schematică a protocoalelor experimentale (1,2,3).

Rezultate

Parametrii cinetici pentru oxidarea linoleatului de sodiu de către LOX-1

Parametrii cinetici calculaŃi pentru LOX-1 oxidând linoleatul de sodiu au

arătat că enzima are o afinitate mare faŃă de substrat (KM=0.13mM) şi că oxidarea

este rapidă (vmax= 30.7 mM/s* µg enzimă).

Parametrii cinetici pentru oxidarea linoleatului de sodiu de către LOX-1 în

prezenŃa quercetinei în diferite concentraŃii

Fig.II.6 prezintă reprezentarea Lineweaver-Burk pentru LOX-1 oxidând

linoleatul de sodiu în prezenŃa quercetinei în următoarele concentraŃii: 100 µM,

50µM, 25µM (A) şi 10µM (B).

A.

y = 1.3058x + 11.256

R2 = 0.9866

y = 3.5445x + 17.774

R2 = 0.956

y = 7.8125x + 22.177

R2 = 0.7861

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4

1/[s]

1/v

100 uM

50 uM

25 uM

trendline (100 uM)

trendline (50 uM)

trendline (25 uM)

B.

y = 2413.6x - 59.178R2 = 0.878

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

500

600

-0.1 0 0.1 0.2 0.3

10uM

trendline (10 uM)

Fig.II.6. Reprezentarea Lineweaver-Burke pentru lipoxigenaza-1 oxidând linoleatul de sodiu în prezenŃa quercetinei la concentraŃii de 100 µM, 50µM, 25µM (A) and 10µM (B); reprezentarea a fost realizată folosind programul Excel.

Pentru calcularea lui KM şi a vmax ecuaŃiile liniilor de tendinŃă au fost

folosite. În urma calculelor am obŃinut valorile prezentate în tabelul II.3. Din

Fig.II.6.(B) s-a constatat că la concentraŃia de 10 µM quercetina nu are un efect

inhibitor ci mai degrabă acŃionează ca un activator (existând posibilitatea să fie şi

ea oxidată alături de substrat). După cum arată Fig. II.6.A inhibiŃia quercetinei este

una mixtă.

Tabel II.3. KM, KMapp şi vmax calculate folosind ecuaŃiile liniilor de tendinŃă a reprezentarilor grafice Linewaver-Burk (Fig.II.6.), în cazul LOX-1 oxidând linoleatul de sodiu în absenŃa şi în prezenŃa quercetinei în concentraŃii de 10 µM, 25µM, 50µM şi 100µM.

Quercetin

conc.

µM

KM (mM)

vmax

(nM/s* µg enzyme)

100 0.12 0.40 50 0.20 0.28 25 0.35 0.20

10 40.80 0.085*10-3

0 0.13 0.30

Influen Ńa quercetinei 100 µµµµM asupra oxidării linoleatului de sodiu de către

LOX-1 pentru diferite protocoale experimentale (Protocol 1, 2 şi 3)

Din Fig.II.7. se poate observa că cea mai puternică inhibiŃie se realizează în

cazul protocolului 1 când inhibitorul a fost amestecat 5 min cu enzima. O formă

diferită se observă pentru protocolul 2 când quercetina a fost adăugată după 15

minute în amestecul de reacŃie (soluŃia tampon+enzimă+substrat).

inhibition of LOX reaction by Q100 microM

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0,055

0,06

0,065

0 5 10 15 20 25

substr.conc.

v

protocol 1

protocol 2

protocol 3

without inhibitor

Fig.II.7. Efectul inhibitor al quercetinei 100 µM asupra reacŃiei lipoxigenazei în concordanŃă cu Protocol 3, cu Protocol 2 şi cu Protocol 1. Curba de cinetică, superioară reprezintă formarea produsului de reacŃie în absenŃa quercetinei

Pentru protocolul 1 am obŃinut o curbă Michaelis-Menten tipică. La

concentraŃii de substrat scăzute pentru protocoalele 2 şi 3 (Fig.II.7.), curbele

cinetice încep cu o fază de creştere rapidă a vitezei de reacŃie. Urmează o scădere a

vitezei de reacŃie, care este rapidă, în cazul protocolului 3 şi mai înceată în cazul

protocolului 2. Pentru protocolul 2 graficul continuă cu o uşoară creştere, care în

cazul nostru nu a atins faza de platou, de echilibru. În cazul protocolului 3 o nouă

creştere –nu aşa de mare comparată cu prima fază-urmează pentru concentraŃii ale

substratului cuprinse între 5mM şi 7.5 mM, urmată de o uşoară descreştere pentru

concentraŃii ale substratului mai mari de 7.5mM.

Când substratul a fost amestecat cu inhibitorul pentru câteva secunde, iar

apoi enzima a fost adăugată (Fig.II.7. protocol 3), curba cinetică prezentând o

primă fază de creştere rapidă, arată că hidroperoxizii se formează în cazul

concentraŃiilor mici de substrat chiar dacă este prezentă şi quercetina în amestecul

de reacŃie iniŃial. LOX este parŃial inhibată de quercetină pentru concentraŃia

substratului de 5mM, dar apoi la concentraŃii mai mari ale acestuia enzima devine

activă din nou, nu în aceeaşi proporŃie însă ca atunci când concentraŃia de substrat

este mică.

Dacă LOX a fost incubată cu substratul pentru 15 secunde şi apoi

quercetina adăugată-protocolul 2-, curba cinetică arată că LOX oxidează substratul

producând cea mai mare cantitate de hidroperoxizi pentru concentraŃii foarte mici

de substrat oxidate. Quercetina inhibă parŃial reacŃia la concentraŃii ale substratului

cuprinse între 5mM şi 7.5mM.

\

II.1.2. InteracŃiunea intermoleculară între lipoxigenază şi quercetină este influenŃată de pH şi timpul de incubare

Scop şi obiective

Aceste experimente au avut ca scop studiul interacŃiunilor intermoleculare

dintre LOX-1 pură şi quercetină prin spectroscopie UV-Vis, precum şi studiul

influenŃei pH-ului şi a timpului de incubare asupra acestei interacŃiuni.

Rezultate

Influen Ńa pH-ului asupra interacŃiunii dintre lipoxigenază şi quercetină

În figura II.8 sunt prezentate spectrele amestecului LOX+quercetină. Trei

maxime de absorbŃie (1, 2, 3) se înregistrează la momentul t=0 şi la t=60 min de

incubare. Maximul 1 corespunde Benzii II, maximul 3 Benzii I, ambele

caracteristice spectrului UV-Vis characteristic flavonoidelor, în timp ce maximul 2

indică formarea unui nou compus ca rezultat al reacŃiei dintre lipoxigenază şi

quercetină.

Fig.II.8. Spectrele de absorbŃie ale amestecului LOX (S1)+quercetină (50µM) la momentul iniŃial (min 0) (A), şi după 60 min de incubare(B).

Analizând maximul de absorbŃie pentru semnalele 1 şi 3 după 60 min de

incubare a LOX cu quercetină se poate vedea că efectul batocromic este menŃinut

şi chiar accentuat (392 nm pentru pH=9 şi 394,2 pentru pH=6.1) pentru semnalul 3

dar nu pentru 1. Această observaŃie indică faptul că pH-ul alcalin favorizează

structura mezomerică I a quercetinei. Structura mezomerică I este dată de tranziŃia

electronilor în cadrul sistemului cinamoil (nucleele benzenice B+C), sistem care în

continuare constituie baza de formare a acidului protocatecuic. Acidul

protocatecuic reprezintă produsul de degradare a quercetinei sub acŃiunea

lipoxigenazei (Borbulevych et al, 2004).

După 60 min de incubare, (Fig.II.8) se observă pe lângă deplasarea

batocromică şi o dscădere a intensităŃii de absorbŃiepentru ambele benzi I şi II.

Zsila şi col (2003) studiind interacŃiunea intermoleculară dintre quercetină şi

albumină, au observat ca o deplasare batocromică a maximului şi descreşterea

intensităŃii de absorbŃie indică legarea quercetinei în formă anionică şi în

conformaŃie ne-planară. În cazul nostru ruperea nucleului cinamoil este favorizată

la pH=9, şi de asemenea de prezenŃa quercetinei în formă anionică. La pH alcalin

structura mezomerică I a quercetinei pierde protonul de la C4’ şi forma anionică

dată de atomul de oxigen legat de C4 devine preponderentă. De asemenea după 60

min se inregistrează un nou semnal; semnalul 2 (λ~321nm), apare indicând că un

nou compus s-a format în amestecul de reacŃie după 60 min.

InteracŃiunea lipoxigenază - quercetină pentru concentraŃii diferite de

quercetină

Reprezentând absorbŃia în funcŃia de lungimea de undă se poate observa

(Fig.II.9) că absorbanŃa creşte proporŃional cu concentraŃia de quercetină.

DependenŃa interacŃiunii lipoxigenază-quercetină ,de concentraŃia quercetinei este

ilustrată în Fig.II.9.

Fig.II.9. Spectrele suprapuse a lipoxigenazei diluată în tampon borat şi a amestecului lipoxigenază-quercetină la diferite concentraŃii a acesteia din urmă

II. 2. EFECTUL INHIBITOR AL IZOFLAVONELOR DIN SOIA ASUPRA ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI DIN BOABELE DE SOIA

Scop şi obiective

Scopul acestui experiment este evaluarea spectroscopică a inhibiŃiei

lipoxigenazei pure din boabele de soia (sLOX-1) de către un extract bogat în

genisteină şi daidzeină (SIE), prin determinarea parametrilor cinetici.

Rezultate Caracterizarea SIE prin analiza HPLC

Izoflavonele agliconice majoritare din extractul din boabele de soia, au fost

daidzeina şi genisteina (Fig.II.10).

Fig.II.10. Cromatograma HPLC a extractului de izoflavone din soia (SIE). Genisteina şi daidzeina au fost identificate. SIE a fost analizat prin HPLC folosind un sistem Hewlett-Packard cu detector PDA şi coloană Eclipse XDB-C18 (25cm x 4.6mm, 5µm). Faza mobilă izocratică a fost metanol: acid orto-fosforic (50:50, v/v). Rata de injecŃie a fost ml/min. Volumul de injecŃie a fost de 10 µl, iar cromatogramele au fost înregistrate la 280 nm.

Inhibi Ńia lipoxigenazei standard de către SIE

Curbele cinetice Michaelis-Menten ale reacŃiei de oxidare a lipoxigenazei

în prezenŃa şi absenŃa quercetinei şi a izoflavonelor standard şi în extract la o

concentraŃie a acestora de 0.5 µM (pentru inhibitorii standard nu şi pentru extract)

sunt prezentate în Fig.II.11.

0 5 10 15 20 25 30

0

5

10

15

20

mAU

Retention time

Daidzein

Genistein

Fig.II.11. Curbele de cinetică Michaelis-Menten pentru inhibiŃia lipoxigenazei-1 de către quercetină, b, (-■-), genisteină, c, (-▲-), daidzeină, d, (-●-), şi extractul izoflavonic, e, (-♦-) la aceeaşi concentraŃie (0.5 µM) suprapuse cu curba cinetică a reacŃiei lipoxigenazei fără inhibitor, a (…♦…).

Rata reacŃiei lipoxigenazei în absenŃa şi în prezenŃa extractului izoflavonic

SIE este prezentat în Fig.II.12.

Fig.II.12. Rata reacŃiei lipoxigenazei în absenŃa (A) sau prezenŃa extractului SIE (B) (ce conŃine 2 mM genisteină şi 1.8 mM daidzeină).

Ca şi în cazul inhibitorilor standard, SIE a inhibit activitatea LOX. Trebuie

menŃionat faptul ca în extract concentraŃia izoflavonelor (2mM pentru daidzeină şi

1.8 mM pentru genisteină) decât cea a standardelor luate în lucru. Rezultatele arată

ca extractul are o activitate inhibitorie crescută la concentraŃii mici de substrat

(2.5-5 mM), comparativ cu standardele. În cazul concentraŃiilor mai mari de

substrat (33-40 mM), SIE prezintă o activitate inhibitorie slabă raportata la

standarde, quercetină şi izoflavone. EficienŃa inhibitorie a izoflavonelor depinde

atât de concentraŃia lor cât şi de cea a substratului. Spre exemplu genisteina la

concentraŃiile de 0.5 şi 2.5 µM prezintă cea mai bună activitate inhibitorie la

concentraŃii ale substratului între 5 şi 10 mM.

Izoflavonele din boabele de soia inhibă LOX fie ca agliconi fie în formă

glucozilată. Izoflavonele acŃionează ca inhibitori în două moduri: alterând

formarea hidroperoxizilor şi astfel prevenind generarea de enzimă activă în stare

ferică, activă (1) şi reducând enzima ferică la starea sa inactivă, feroasă (2)

(Mahesha şi col, 2007). Mahesha şi col, (2007) propun următorul mecanism prin

care izoflavonele inhibă lipoxigenaza: un electron donat de izoflavone este

acceptat de forma ferică (Fe3+) a LOX, care este redusă astfel la forma sa inactivă,

feroasă (Fe2+). Genisteina nu este nici consumată, nici nu suferă schimbări

structurale în timpul acestui proces (Mahesha şi col 2007), în timp ce quercetina

intrând în situsul catalitic al lipoxigenazei este degradată la acid protocatecuic

(Borbulevych şi col, 2004) poziŃionat în vecinătatea ionului de fier, centrul

catalitic al lipoxigenazei.

II.3. ACTIVITATEA LIPOXIGENAZEI ÎN PREZENłA CATECHINEI, EPICATECHINEI ŞI A UNOR PROCIANIDINE ÎN MEDIU BIOTIC ŞI

ABIOTIC

Experimentele prezentate în acest capitol au avut ca scop evaluarea

inhibiŃiei lipoxigenazei standard (LS)şi în extract (LE) de către catechina pură

(CS) şi un extract polifenolic(PE) din sâmburi de struguri, ce are în compoziŃie

catechină, epicatechină şi procianidine. Evaluarea s-a făcut atât în mediu abiotic

cât şi în mediu biotic-cultură de leucocite. Ambele extracte au fost analizate prin

LC-MS.

II.3.1. CompoziŃia în polifenoli şi stabilitatea extractului apos din sâmburi de struguri din soiul Merlot Recaş

Aceste experimente au fost parŃial finanŃate de proiectul TD 392/2007 şi a

fost realizat în colaborare cu Departmentul de Chimie Organică a FacultăŃii de

Inginerie în BioştiinŃe a UniversităŃii din Ghent, Belgia.

Având în vedere acŃiunile benefice asupra sănătăŃii ale extractului apos din

sâmburii de struguri precum şi potenŃiala exploatare a resturilor rămase de la

fabricarea vinului, compoziŃia extractului a fost determinată calitativ şi cantitativ

prin LC-UV-DAD şi LC-ESI -MS

Cum polifenolii sunt sensibili la oxygen, lumină şi mediu alcalin, dar mai

puŃin la temperatură, respectiv căldură, stabilitatea flavan-3-olilor şi a

procianidinelor din extract a fost evaluată după 6 luni de păstrare la 4ºC.

Rezultate

Caracterizarea prin HPLC-MS a flavan-3-olilor şi a procianidinelor din extractul proaspăt (PE)

Determinarea compuşilor fenolici a fost făcută la 220, 280 şi 320 nm.

Pentru a verifica prezenŃa sau absenŃa antocianilor analiza a fost făcută şi la 520

nm. Cromatogramele prezentate în Fig.II.13 (A şi B) au fost obŃinute la 280 nm,

lungimea de undă specifică pentru absorbŃia catechinelor. La 520 nm, nu s-a

observat nici un semnal şi în consecinŃa s-a dovedit absenŃa antocianilor atât în

extractul proaspăt cât şi în cel păstrat.

A.

B.

Fig.II.13. (A and B). Cromatograma extractului PE înregistrată la 280 nm, obŃinută prin analiza LC-MS (A). Valorile m/z ale semnalelor indică prezenŃa compuşilor de tip catechinic. Aceşti compuşi sunt prezenŃi ca monomeri, dimeri şi trimeri după cum sunt prezentaŃi în Tabelul II.4. Cromatograma extractului PES înregistrată la 280 nm, obŃinută prin analiza LC-MS (B). Valorile m/z ale semnalelor indică prezenta compuşilor de tip catechinic.

Aceşti compuşi sunt prezenŃi ca monomeri, dimeri şi trimeri după cum sunt prezentaŃi în Tabelul II.5.

Prin analiza HPLC a PE (Fig.II.13.A) s-a obŃinut cromatograma cu semnale

intense de-a lungul a mai mult de 16 min de eluŃie.Aceste semnale corespund

flavan-3 olilor monomerici şi proantocianidinelor dimerice şi trimerice. Acest

fingerprint cromatografic este datorat complexităŃii proantocianidinelor ce au o

masă moleculară mare.

Compuşii au fost identificaŃi pe baza timpilor de retenŃie (tR), spectrul UV

(obŃinut cu DAD) şi spectrul MS (obŃinut cu detectorul ESI). Structura compuşilor

identificaŃi a fost desemnată pe baza datelor de literatură (Pati şi col, 2006; Amico

şi col, 2004). Pentru catechină şi epicatechină identificarea a fost făcută de

asemenea prin compararea cu tR, spectrele UV şi MS obŃinute prin analiza HPLC-

MS a standardelor respective.

Compuşii identificaŃi asociaŃi valorilor m/z obŃinute, precum şi cantitatea în

care sunt prezenŃi în extract sunt prezentaŃi în Tabelul II.4. Fragmentarea MS a

fost luată în considerare pentru elucidarea structurilor prezentate după cum se

arată în Tabelul II.4.

Tabel II.4.

Timpii de retenŃie ai compuşilor identificaŃi în extractul PE în concordanŃă cu Fig. II.13.(A), asociaŃi cu valorile m/z a semnalelor din cromatogramă, precum şi cuantificarea acestor compuşi determinată prin LC-MS.

Peak label Numărul

semnalului

Retention time (tR) (min) Timpul de

retenŃie

Attribution Atribuirea

m/z ratio for the base peak [M-H] - and other fragmentation [M-

H]- ions raportul m/z pentru semnalul de bază [M-H] - precum şi a altor ioni [M-H] - obŃinuŃi prin fragmentare

Concentration (mg(CE)/kg aliquotsa)

ConcentraŃia (mg(CE)/kg

probăa) 1 6.7 Gallic acid 169 74±0.200 2 8.03 Galloyl glucose 331 26±0.200 3 9.3 Non identified 203, 365, 857, 905 86±0.200 4 9.8 Procyanidine

dimmer 577 94±0.200

5 10.3 Procyanidine dimer

331,432, 577 89±0.200

6 10.5 Trimer 274, 483, 577, 865 87±0.300 7 11.3 Catechin 289 397±0.300 8 11.7 Procyanidine

dimmer 577 193±0.300

9 12.2 Trimer (E)C coelutes with

12.33

289,577, 865 149±0.300

10 12.33 (E)C-(E)CG dimer coelutes

with 12.2

289,443,577,729,865 173±0.300

11 12.7 Trimer (E)C coelutes with (E)C-(E)CG

dimer

865, 729

171±0.300

12 13.1 Epicatechin 289 581±0.300 13 14.02 Procyanidine

dimmer 577 234±1.000

14 14.7 Trimer 865 193±1.100 15 15.7 (E)CG 441 120 ±1.100 IS 22.5 IS Coumaric acid 163

aBazată pe determinarea spectrofotometrică (UV-DAD) şi raportată la catechină. Valorile sunt exprimate în mg/Kg extract din sâmburi de struguri uscaŃi

Caracterizarea prin HPLC-MS a flavan-3-olilor şi a procianidinelor din extractul păstrat (PES )

Fig.II.13.B prezintă cromatograma extractului PES păstrat timp de 6 luni la

4ºC. Comparată cu Fig.II.13.A, mai puŃine semnale se identifică şi cel mai

puternic dintre ele are tR=6.7 min.

Identificarea compuşilor din PES s-a făcut, ca în cazul extractului proaspăt,

prin corelarea cu caracteristicile (timpul de retenŃie LC-MS, spectrul UV-Vis şi

tipul de fragmentare) compuşilor standard pentru catechină şi epicatechină, şi cu

datele din literatură pentru ceilalŃi compuşi. Tabelul II.5. prezintă compuşii

corespunzători semnalelor obŃinute, împreună cu fragmentele ionice, spectrul UV-

Vis şi analiza cantitativă pentru extractul păstrat.

Tabel II.5 Timpii de retenŃie a compuşilor din extractul PES, după cum se prezintă în Fig.II.13(B), identificaŃi pe baza maximelor de absorbŃie a spectrelor UV-Vis şi a valorilor m/z; cuantificarea acestor compuşi a fost făcută prin LC-MC.

Peak label Numărul

semnalului

Retention time (tR)

(min) Timpul de

retenŃie

Attribution Atribuirea

m/z ratio for the base peak [M-H] - and other fragmentation [M-H]-

ions raportul m/z pentru

semnalul de bază [M-

UV-Vis absorption maxima

Maximele de absorbŃie în UV-Vis

Concentration (mg(CE)/kg aliquotsa)

ConcentraŃia (mg(CE)/kg

probăa)

H] - precum şi a altor ioni [M-H] - obŃinuŃi

prin fragmentare 16 6.7 Gallic acid

oxidation product

189 217, 272 52±0.200

17 9.2 Non identified oxidation products

203, 351, 365, 723 220, 278

13±0.200

18 10.3 Oxidation products of

procyanidine dimers

139,419, 577, 940 280

13±0.200

19 10.5 Oxidation products of

procyanidine trimer

249, 609, 915 280

15±0.300

7 11.3 Catechin 289 280 14±0.300 12 13.1 Epicatechin 289 280 28±0.300 20 16.1 Non

identified oxidation products

197, 808 220, 272

17±0.300

IS 22.5 IS Cumaric acid

163

aBazată pe determinarea spectrofotometrică (UV-DAD) şi raportată la catechină. Valorile sunt exprimate în mg/Kg extract din sâmburi de struguri uscaŃi

II.3.2.CompoziŃia în polifenoli a extractului enzimatic LE

Aceste experimente au fost parŃial finanŃate de proiectul TD 392/2007 şi a

fost realizat în colaborare cu Departmentul de Chimie Organică a FacultăŃii de

Inginerie în BioştiinŃe a UniversităŃii din Ghent, Belgia.

Scop şi obiective

S-a demonstrat deja că boabele de soia sunt bogate în izoflavone şi pentru

acest experiment a fost făcută analiza LC-UV-DAD şi LC-ESI -MS unui extract

metanolic (LE). Compuşii separaŃi au fost analizaŃi şi cantitativ.

Rezultate

Fig.II.14. prezintă cromatograma LC-MS a extractului LE înregistrată la

280 nm. Compuşii au fost identificaŃi pe baza timpului de retenŃie (tR), spectrul

UV şi spectrul MS (obŃinut cu detectorul ESI). Structura compuşilor identificaŃi a

fost determinată pe baza literaturii de specialitate (Klejdus şi col, 2004; Otieno şi

Shah, 2007; Deavours şi Dixon, 2005).

Fig.II.14. Cromatograma extractului LE la 280 nm obŃinută prin analiză LC-MS, arătând prezenŃa daidzeinei (D) şi genisteinei (G), cei mai semnificativi compuşi identificaŃi în acest extract.

Compuşii majori identificaŃi au fost daidzeina (tR=28,16) şi genisteina

(tR=34,81), izoflavone cunoscute a fi importanŃi compuşi bioactivi în boabele de

soia. Maximele de absorbŃie pentru daidzeină au fost la 248 nm şi 308 nm iar

pentru genisteină la 260 nm.

Raportul m/z pentru fragmentul de bază [M-H] -, a fost 253 pentru daidzeină

şi 269 pentru genisteină. Analiza cantitativă pe baza determinării UV-DAD a

arătat că LE conŃine 4 mg/kg probă pentru daidzeină şi.10 mg/kg probă pentru

genisteină.

II.3.3. InteracŃiunea dintre lipoxigenaza pură şi din extract şi catechina pură şi dintr-un extract polifenolic ca model de studiu al modulării echilibrului oxidant/antioxidant în condiŃii abiotice şi biotice

Scop şi obiective

Efectul inhibitor al antioxidanŃilor asupra lipoxigenazei, depinde de starea

fizico-chimică a substratului şi de tipul de lipoxigenază, şi se schimbă complet în

funcŃie de condiŃiile de reacŃie (Noguchi şi col, 2002). Prin spectroscopie UV-Vis

am evaluat interacŃiunea dintre extractul de lipoxigenaze LE şi compuşii de tip

catechinic din extractul apos din sâmburii de struguri atât în condiŃii abiotice, cât

şi în condiŃii biotice-cultură de leucocite. Deşi condiŃiile in vitro nu reprezintă în

proporŃie de 100% condiŃiile in vivo, acest studiu îşi propune evaluarea proceselor

oxidative ce au loc prin interacŃiunea celulelor cu molecule cu valoare nutriŃională

nu doar în stare pură dar şi ca extracte primare. DependenŃa de doză şi de timpul

de incubare a oxidării catechinelor la chinone este implicată în modificarea

echilibrului antioxidant/prooxidant determinat de aceşt flavan-3-oli. Rezultatele

prezentate aici coroborate cu cele ale altor grupuri de cercetare, pot oferi

informaŃii utile pentru găsirea de antioxidanŃi ce se pot adăuga în produsele

alimentare, şi pot constitui de asemenea o bază pentru studiul inhibiŃiei

lipoxigenazei de către compuşii de tip catechinic.

Rezultate

Datele prezentate dovedesc prin spectroscopie UV-Vis, formarea

chinonelor ca produşi de oxidare a extractelor bogate în compuşi catechinici.

Starea acestor compuşi a fost evaluată în condiŃii abiotice şi în mediul biotic extra-

şi intracelular. Ca prooxidant s-a folosit lipoxigenaza standard din boabele de soia

precum şi un extract primar bogat în aceste enzime (Chedea şi col, 2008), din

cauza interesului manifestat pentru inhibarea acestei enzime de diferite clase de

polifenoli.

Literatura de specialitate prezintă o multitudine de date evidenŃiind

capacitatea antioxidantă a catechinelor ca o însuşire esenŃială a utilizării acestora

în prevenirea unor boli. Cu toate acestea alte studii au demonstrat că şi ca

prooxidant aceste flavonoide ar putea contribui la efectele benefice asupra

sănătăŃii, prin faptul că se activează enzimele detoxifiante (Azam şi col, 2004;

Lee-Hilz şi col, 2006).

Diferite tipuri de oxidare au fost determinate, în cazul nostru, prin obŃinerea

de maxime de absorbŃie UV-Vis diferite pentru produşii de reacŃie. Am arătat

astfel că modelul de oxidare este diferit în cazul moleculelor standard comparativ

cu cel al extractelor.

Produşii de oxidare a catechinei atât ca moleculă pură (CS), cât şi ca extract

(PE) s-au format în mediul extracelular şi în cel intracelular.

• În condiŃii abiotice lipoxigenaza (pură) prezintă un puternic efect

prooxidant asupra cetechinei pure şi a polifenolilor din extract. Oxidarea

enzimatică a catechinei şi a polifenolilor ia loc cu formare de dimeri.

• SituaŃia este diferită în cazul culturii celulare. În mediul extracelular

catechina şi polifenolii sunt oxidaŃi în prezenŃa lipoxigenazei standard pure

dar nu se mai formează dimeri. Aceasta demonstrează faptul că reactivitatea

polifenolilor şi a lipoxigenazei este modulată de celule prin aparatul

enzimatic. Hong şi col (2002) au arătat că stabilitatea EGCG a crescut în

pezenŃa celulelor, acest efect putând fi cauzat de proteine şi alte molecule

antioxidante prezente în celulă. În cazul nostru autooxidarea catechinelor şi

a polifenolilor din extract are loc în mediul extracelular. Autooxidarea

flavonoidelor are loc de obicei în soluŃii alcaline apoase şi este însoŃită de

producerea de radicali anionici, superoxidul şi peroxidul de hidrogen

(Dangles şi col, 2000). In condiŃii tipice de culturi celulare la pH 7.2–7.4,

EGCG se autooxidează rapid ducând la formarea a doi compuşi cu structură

dimerică (Hong si col, 2002). În matricea intracelulară s-a observat

formarea chinonelor ca rezultat al interacŃiunii dintre catechine şi

lipoxigenază (Table II.6). Studiul de faŃă arată că chinonele formate prin

oxidarea catechinelor sunt implicate în modularea echilibrului

antioxidant/prooxidant la nivel celular în prezenŃa sau absenŃa lipoxigenazei

ca inductor de stres oxidativ.

Table II.6. Formarea chinonelor (exprimată prin maximele de absorbŃie UV-Vis) în cultura celulară prin oxidarea polifenolilior determinată prin spectroscopie UV-Vis şi stres mitochondrial (testul MTT). Creşterea (↑), scăderea (↓) sau condiŃiile neschimbate (NC) sunt comparate cu celulele netratate, (% of control)

3hrs 24hrs Exp.variant Quinone

formation MTT assay

Effect Quinone formation

MTT assay

Effect

CS ↑* ↓ AOX + Hq ↑* ↑ ProOX + Hq CS+LS ↑* ↑ ProOX + Hq ↓* ↓(very

little) AOX + Lq

CS+LE ↑* ↑* ProOX + Hq ↓ ↑ ProOX + Lq 1/2CS ↑* ≅ with

the control

NE+ Hq ↓* ↓ AOX + Lq

1/2CS+LS NC ↑ ProOX + Lq ↓* ↑ ProOX + Lq 1/2CS+LE ↑* ↑ ProOX + Hq ↓* ↑* ProOX + Lq

PE ↑ ↑* ProOX + Hq ↓ ↑* ProOX + Lq PE+LS NC ↑* ProOX + Lq ↓* ↓ AOX + Lq PE+LE ↑* ≅ with

the control

NE+ Hq ↓* ↑* ProOX + Lq

1/2PE ↑* ↑* ProOX + Hq NC ↓* AOX + Lq

1/2PE+LS ↑* ↑ ProOX + Hq ↓* ↓ AOX + Lq 1/2PE+LE ↓* ↑ ProOX + Lq ↑* ↓ AOX + Hq

* semnificativ statistic pentru p<0.05 . Hq- High quinone; Lq- Low quinone; AOX- Antioxidant; ProOX-Prooxidant, NE – No effect, NC- non-changed

Alături de activitatea lor antioxidantă catechinele prezintă şi efect prooxidant

având potenŃial de oxidare la chinone şi semichinone ceea ce duce la alte cicluri

redox şi producerea de specii reactive de oxigen precum şi la alchilarea tiolior,

ADN-ului şi a proteinelor (Galati şi O’Brien, 2004; van der Woude şi col, 2006).

Deoarece flavonoidele au tendinŃa de a acŃiona mai degrabă ca antioxidanŃi decât

ca prooxidanŃi, un stres oxidativ generat de producerea de chinone, la o primă

privire nu ar putea explica proprietăŃile curative a acestor compuşi. În cazul nostru

în principiu, cantitatea mare de chinone generează un efect prooxidant, însă

această situaŃie s-a constatat şi atunci când cantitatea de chinone a fost scăzută.

Interesant este faptul că în stare pură catechina este oxidată intracelular producând

o cantitate însemnată de chinone şi care generează un efect antioxidant. Această

situaŃie a fost observată şi când pentru 24 de ore la jumătate de doză PE a fost

incubat cu leucocitele iar apoi LE a fost adăugat pentru încă 1 oră. Extractul PE a

avut o mai bună acŃiune asupra activităŃii prooxidante a LE, când a fost incubat

pentru o perioadă mai lungă (24 de ore versus 3ore) şi la jumătate de doză.

Am demonstrat prin spectroscopie UV-Vis, că chinonele sunt implicate în

modularea activităŃii lipoxigenazei în celule ca rezultat al oxidării catechinelor.

Această concluzie este în acord cu cele ale lui Sadik şi col. (2003) şi Banerjee

(2006). O modificare covalentă ireversibilă a LOX din soia generată de flavonoide

a fost sugerată de Sadik şi col. (2003), când în timpul formării radicalilor peroxil a

acizilor graşi polinesaturaŃi prin acŃiunea lipoxigenazei, flavonoidele sunt co-

oxidate la semi-chinone sau chinone, care la rândul lor se leagă la grupările

sufhidril şi amino ale enzimei cauzând inhibarea acesteia (Banerjee, 2006).

II.4. EVALUAREA UNOR CAROTENOIDE CA INHIBITORI DE LIPOXIGENAZĂ

Scop şi obiective

Este cunoscut că anumiŃi compuşi care sunt antioxidanŃi, cum ar fi β-

carotenul (Lomnitski şi col, 1993), în adiŃie la α-tocopherol şi L-ascorbat (Packer,

1992; Buettner, 1993), sunt capabili să inhibe LOX din diverse sisteme.

Scopul acestui studiu a fost evaluarea efectului unor carotenoide, standard

şi în extract asupra activităŃii lipoxigenazei standard oxidând acidul linoleic.

Rezultate

Figura II.15 prezintă curba de cinetică Michaelis-Menten considerată

standard pentru formarea hidroperoxizilor (HPOD) prin reacŃia lipoxigenazei de

oxidare a acidului linoleic. Graficul prezintă o fază exponenŃială urmată de

atingerea echilibrului în faza de platou. Calcularea activităŃii enzimatice specifice

(ESA) a fost făcută pentru faza de creştere exponenŃială (I).

0.3

0.9

0.4

0.6

0.8

0 600200 400

Abs

Time [sec] Fig.II.15. Curba cinetică pentru LOX-1 pură inregistrată la 234 nm.

În primele secunde ale reacŃiei ESA a fost de 5819*10-3 AU/mg*s şi

362*10-3 AU/mg*s după 200 s când formarea de HPOD este terminată.

A

B

C

Fig.II.16. Curba cinetică pentru activitatea LOX-1-pură înregistrată la 234 nm în prezenŃa carotenoidelor pure: luteina + formula chimică a luteinei (A), β-carotene + formula chimică a β-carotenului (B) şi zeaxantina+ formula chimică a zeaxantinei (C).

Adăugând β-caroten, luteină şi zeaxantină în amestecul de reacŃie (Fig.

II.16. A, B şi C) forma curbei cinetice se modifică. Trei tipuri de grafice, fiecare

dintre ele specific unui carotenoid, au fost inregistrate. Fiecare reprezentare poate

fi împărŃită în două faze: una corespunzătoare primelor 30 de secunde de reacŃie şi

a doua pentru intervalul de timp 30 sec - 600 sec.

Pentru luteină (Fig.II.16A) şi β-caroten (Fig.II.16B) prima etapă a reacŃiei

este caracterizată printr-o creştere foarte rapidă a vitezei de reacŃie urmată de o

scădere la fel de rapidă. A doua etapă este reprezentată de o uşoară scădere a

vitezei pentru β-caroten (Fig.II.16B) şi de o uşoară creştere pentru luteină

(Fig.II.16A). În cazul zeaxantinei pentru faza întâi a curbei cinetice se observă tot

o creştere foarte rapidă dar pentru primele 5 sec, apoi o descreştere rapidă pentru

următoarele 6 sec urmată de o nouă uşoară creştere şi o scadere rapidă a vitezei de

reacŃie. În decursul fazei a 2-a nu se observă activitate enzimatică (Fig.II.16C).

Deşi luteina şi zeaxantina sunt izomeri nu prezintă acelaşi comportament

inhibitor în cazul oxidării acidului linoleic de către LOX (Fig.II.16A şi II.16C). În

primele secunde ale reacŃiei, cinetica în prezenŃa luteinei este identică cu cea în

prezenŃa β-carotenului (Fig.II.16A şi II.16B).

0.63

0.75

0.65

0.7

0 600200 400

Abs

Time [sec]

Fig.II.17. Curba cinetică a activităŃii LOX-1 înregistrate la 234 nm în prezenŃa extractului din Physalis alkekengi.

Fig.II.17 prezintă cinetica LOX-1 în prezenŃa extractului de Physalis. Faza I

este identică cu cea a zeaxantinei (Fig. II.17 şi Fig.II.16 C).

Datorită faptului că luteina şi β-carotenul au aceeaşi formă a curbei cinetice

pentru prima fază a reacŃiei LOX-1, am asociat această asemănare cu cea a

structurii lor chimice. Comparând structurile luteinei şi a β-carotenului poate

fi remarcat faptul că lanŃul polienic de 9 legături conjugate este elementul comun

ambelor molecule. CorelaŃia acestor însuşiri comune ale curbelor cinetice şi ale

structurilor chimice ne-a dus la concluzia că în primele secunde ale oxidării

acidului linoleic de către LOX-1 se produce o modificare a structurii

carotenoidelor la nivelul sistemului polienic cum a fost arătat şi de Kennedy şi

Liebler (1991). Rezultatele obŃinute de Serpen şi Gökmen (2005) sugerează că β-

carotenul reacŃionează cu radicalul linoleil (L) la începutul lanŃului de reacŃii

prevenind formarea de diene conjugate (LOO, LOO- and LOOH). Din timp ce L

revine la forma iniŃială LH, enzima nu poate completa ciclul de reacŃie şi astfel

rămâne în stare inactivă Fe(II) (Serpen şi Gökmen, 2005).

AbsorbŃia la 234 nm înregistrează formarea de duble legături conjugate prin

producerea de hidroperoxizi prin oxidarea acidului linoleic de către LOX-1 şi de

asemenea cele date de lanŃul polienic al carotenoidelor, deci ESA este influenŃată

de aceste două elemente.

În timpul fazei I a reacŃiei ESA pentru carotenoidele saponificate descreşte

în ordinea descreşterii numărului de duble legături în lanŃul polienic după cum

urmează Zeaxantină, P.A., β-caroten şi Luteină.

CONCLUZII GENERALE

În concordanŃă cu scopul şi obiectivele acestui studiu, am folosit sisteme

experimentale diverse pentru a demonstra comportamentul catalitic al

lipoxigenazei pure şi a extractului îmbogăŃit în lipoxigenze în condiŃii abiotice şi

biotice, influenŃa diverşilor parametrii de reacŃie asupra activităŃii enzimatice,

considerând de asemenea interacŃiunile dintre enzimă şi diferitele clase de

inhibitori luate în lucru.

Concluziile principale ale acestor variante experimentale pot fi enumerate

după cum urmează:

1. Fiecare lipoxigenază preferă un anumit pH pentru a avea o activitate

optimă, dependent de stadiul de extracŃie, diluŃie şi raportul enzimă/substrat, când

acidul linoleic a fost utilizat ca unic substrat. Am găsit că LOX-1 are activitate

maximă la pHm= 9.0, LOX-2 la pHm=6.8 şi LOX-3 la pHm=7.1 DependenŃa

bilaterală a activităŃii LOX-1 de pHm şi E/LS sugerează posibilitatea de modulare

a activităŃii acestor enzime prin modificarea parametrilor menŃionaŃi. Pentru a

inhiba activitatea LOX este recomandat un nivel ridicat al raportului

enzimă/substrat şi un pHm scăzut.

2. Experimentele cu lipoxigenaza pură din boabele de soia LOX-1 şi din

extractele din boabe de soia (cu sau fără degresare) au avut ca rezultat diferite

tipuri de curbe cinetice: de tip “convenŃional” corespunzând la LOX-1 pură şi

extractelor primare din boabele de soia, prezentând o fază exponenŃială urmată de

o fază de platou (1). Pentru extractele degresate (2) graficele au prezentat 3 faze

distincte incluzând o fază rapidă exponenŃială (15 sec), urmată de o perioadă de

“lag” pentru ca în final să aibă o nouă creştere până la atingerea fazei de echilibru

(platou).

3. Extractul primar conŃine în principal LOX-1, dar şi LOX-3, într-un raport

aproximativ de 3:1. LOX-2 în acest extract se găseşte în cantităŃi foarte mici.

Degresarea inhibă aproape complet activitatea LOX-1 la pH acid. Presupunem că

degresarea elimină substratul (acidul linoleic) ce se găseşte în extractul primar şi

acesta este un mecanism simplu de inhibare a LOX-1. Prin restabilirea pH-ului la

neutru sau alcalin, o parte din activitatea enzimatică a fost restabilită, fapt ce poate

fi explicat prin conversia oxidativă a Fe2+ la Fe3+, ce se găseşte în LOX-1 activă.

Cele trei extracte degresate (E2, E3 şi E4) aduse la pH 6.8 şi 7.1 au avut, în general

o imagine asemănătoare a activităŃii lor lipoxigenazice: activitate scazută a LOX-1

şi LOX-2, dar crescută pentru LOX-3, pentru E3 chiar mult mai intensă decât

pentru E1.

4. Am analizat prin GC-MS produşii de reacŃie în cazul LOX din porumb

recombinată. Acidul linoleic luat ca substrat dă doar doi produşi de reacŃie formaŃi

prin autooxidare, în cantităŃi echivalente, în timp ce foto-oxidarea generează un

amestec de patru derivaŃi cu radicalul OOH la atomii de carbon 9, 10, 12 sau 13.

Folosind fosfolipide (lecitina) ca substrat pentru RM9-LOX, am identificat produşi

ca 9- şi 13-hidroperoxizi. Rezultatele GC-MS au arătat de asemenea că

hidroperoxizii rezultaŃi au fost în cantitate mai mică de 1% din totalul produşilor

de reacŃie în cazul oxidării PC şi prin urmare această reacŃie nu este specifică,

enzima noastră recombinată neavând în acest caz activitate oxidantă faŃă de PC.

5. Parametrii cinetici ai, KM şi vmax au fost calculaŃi pentru LOX-1 din

boabele de soia pură, oxidând acidul linoleic la două intervale ale concentraŃiei (5-

100 µM şi 10-200 µM) fie în etanol fie în prezenŃa 13-HPOD şi a Tween 20.

În prima situaŃie vmax=40µM/s*mg enz. şi KM=20 µmol iar pentru al doilea

caz vmax=48µM/s*mg enz. şi KM=25 µmol. AdiŃia lui Tween 20 şi a HPOD-ului au

crescut viteza de reacŃie dar şi KM. Creşterea KM poate fi explicată atât prin

formarea unui complex LOX-HPOD cât şi prin formarea unui acid linoleic micelar

prin adăugarea Tween-ului, substratul fiind mult mai disponibil pentru reacŃie,

detergentul având un rol important în acest caz.

6. Saturând mediul de reacŃie a LOX cu O2 sau adăugând clorură de sodium

nu s-a îmbunătăŃit viteza de reacŃie. La concentraŃii de substrat scăzute, adăugarea

O2 în mediul de reacŃie a scăzut viteza oxidării, conversia substratului la produsul

de reacŃie fiind încetinită prin saturarea cu oxigen.

7. Studiind influenŃa quercetinei pure asupra oxidării linoleatului de sodium

de către LOX-1 pură s-a arătat că viteza reacŃiei scade când concentraŃia de

inhibitor descreşte (de la 100 la 10 µM) şi KM creşte în aceleaşi condiŃii. Valoarea

mai ridicată a constantei de inhibiŃie indică o bună corelaŃie între afinitatea scăzută

a inhibitorului faŃă de enzimă şi viteza de reacŃie. Cel mai bun protocol

experimental pentru inhibarea lipoxigenazei a fost acela când inhibitorul a fost

adăugat înaintea substratului în amestecul de reacŃie.

8. Aceste studii au demonstrat că LOX poate fi inhibată de quercetină în

funcŃie de diverşi factori, cum ar fi, pH-ul şi concentraŃia de quercetină. Valorile

pH-ului pot influenŃa interacŃiunile moleculare dintre LOX-1 pură şi quercetină,

pH-ul alcalin favorizând forma ionică a quercetinei ce interacŃionează cel mai bine

cu lipoxigenaza. InhibiŃia lipoxigenazei, ca rezultat al interacŃiunii intermoleculare

dintre enzimă şi quercetină, este dependentă de concentraŃia inhibitorului. Această

interacŃiune a fost demonstrată prin semnalul spectrului UV-Vis având absorbŃia

specifică la at λ=321 nm după 60 min de reacŃie dintre lipoxigenază şi quercetină,

indicând formarea unui complex intermolecular LOX-quercetină. Când

concentraŃia de inhibitor creşte, formarea acestui nou compus este stimulată; cel

mai puternic semnal înregistrându-se în cazul quercetinei 100µM urmată de

50µM.

9. Efectul inhibitor al izoflavonelor din soia asupra activităŃii lipoxigenazei

a fost confirmat. Cinetica lor specifică şi caracteristicile de inhibiŃie sunt diferite,

genisteina fiind mult mai activă decât daidzeina (ca şi compuşi puri). Extractul

izoflavonic din boabele de soia, cu concentraŃie controlată de genisteină şi

daidzeină (mai mare decât a standardelor) a arătat un potenŃial inhibitor similar

standardelor. Rezultatele noastre indică o acŃiune sinergică a acestor două

componente ale extractului.

10. Activitatea lipoxigenazei în prezenŃa catechinei, epicatechinei şi a

procianidinelor în mediu abiotic şi biotic a fost de asemenea studiată. Un mediu

prooxidant în exteriorul şi interiorul celulei a fost indus de LOX şi a fost observată

oxidarea polifenolilor cu formare de quinone şi dimeri. Catechina este mult mai

oxidată ca moleculă pură decât în extractul polifenolic. Am observat o perturbare a

echilibrului prooxidant/antioxidant indusă diferit de lipoxigenaza pură şi de

extractul lipoxigenazic şi dependentă de timpul de incubare a polifenolilor.

RelaŃiile doză-efect şi timp-efect a fost observată.

11. Evaluarea acŃiunii inhibitorii a carotenoidelor asupra lipoxigenazei

standard a fost făcută în sistem abiotic. Extractul carotenoidic (conŃinând luteină şi

ß-caroten) are o acŃiune inhibitorie asupra LOX-1 similară cu cea a compuşilor

standard. Structura carotenoidică ce prezintă un lanŃ polienic mai lung induce o

activitate enzimatică mai intensă în primele secunde ale reacŃiei. Această situaŃie

nu este valabilă după 600s de reacŃie, cauza putând fi distrugerea structurii prin

cooxidarea carotenoidelor alături de reacŃia clasică a LOX.

Parte din rezultatele prezentate au fost publicate în revista de

specialitate cotată ISI, Journal of Food Biochemistry, sau au fost acceptate

spre publicare (2 articole în Journal of Food Biochemistry). Parte din

rezultate au fost de asemenea prezentate în cadrul unor conferinŃe şi

simpozioane naŃionale şi internaŃionale.