UNIVERSITATEA DE ŞTIIN ŢE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă

VETERINAR Ă FACULTATEA DE MEDICIN Ă VETERINAR

RAOUAD MOUSSA

MARKERI DE MALIGNITATE ÎN TUMORILE MELANICE LA ANIMALE

Rezumatul tezei de doctorat

CONDUCĂTOR ŞProf. Dr. CĂ

Cluj-Napoca

2011

VETERINAR Ă

MALIGNITATE ÎN TUMORILE

ĂTOR ŞTIINŢIFIC ĂTOI CORNEL

INTRODUCERE : Melanomul este o boală foarte gravă întâlnită frecvent atât în medicina veterinară cât şi cea umană. Modificările de natură moleculară corelate cu neoplasmele melanice includ mutaţii ale unor gene care codifică proteine intrinseci mecanismelor reglatoare a 2 proteine cu rol în supresia tumotală (proteina retinoblastinică şi proteina p53), mutaţii ale oncogenelor (proto-oncogene), modificarea expresiei caderinelor epiteliale şi a moleculelor de adeziune CD44, şi intensificarea factorilor angiogenetici şi a altor factori de creştere. Cea mai utilizată tehnică de diagnostic este examenul histologic al tumorii primare, împreună cu examenul citologic utilizat pentru diagnosticul posibilelor metastaze. În cazul melanoamelor, atât aspectele histologice cât şi cele citologice variază foarte mult, diagnosticul acestora, prin cele 2 metode, este extrem de greu. Structurile epiteloide aderente, care includ celule cu aspect de “inel cu pecete” şi structurile neaderente care includ celule rotunde şi fusiforme, sau prezenţa pigmentului melanic, sunt elemente utilizate ca şi diagnostic, dar sunt inconstante şi nespecifice. În interpretarea histologică şi pentru a prezice evoluţia unei tumori, sunt luate în calcul localizarea tumorii primare, dimensiunea, gradul de invazivitate a acesteia, numărul de mitoze per câmp microscopic sau per milimetru, în timp ce în preparatele citologice aprecierea pleiomorfismului celular este cea mai utilizată tehnică. Pentru diagnosticul melanoamelor amelanotice sunt utilizate tehnici auxiliare. Tehnicile de imunohistochimie şi imunoflorescenţă sunt foarte importante în identificarea şi în stabilirea evoluţiei tumorilor melanice, în special a melanomelor amelanotice, prin utilizarea a 2 grupe de markeri: 1. Markeri de identificare si 2. Markeri de malignitate. Scopul lucrării: În această lucrare s-a încercat studiul evoluţiei tumorilor melanice la cal şi câine prin utilizarea de tehnici epidemiologice, macroscopice, histologice, citologice, imunohistochimice şi imunoflorescenţă, în scopul identificării şi diferenţierii acestor tumori, şi mai ales pentru diferenţierea între tumorile maligne şi cele benigne.

STUDIUL EPIDEMIOLOGIC AL TUMORILOR MELANICE LA CAL ŞI CÂINE

Introducere: Neoplasmele melanice au o incidenţă ridicatî la cai şi câini, şi au originea în melanocite (Hsu et al., 1981). Studiul epidemiologic al acestor tumori a luat amploare, în SUA la inceputul anilor ’90. Conform datelor obţinute în urma studiilor din mai multe state din SUA, cele mai afectate specii au fost câinele, cu localizarea cea mai frecventa la nivelul cavităţii bucale (Bergman et al., 2007-Oyamada et al.,

2007), şi caii vineţi, cu localizarea pe faţa internă a cozii şi la nivelul perineului (Baba et al., 1981- Durand et al., 1927). Scopul lucrării: Acest studiu vizează completarea informaţiilor epidemiologice cu privire la neoplasmele melanocitare la câini şi cai. Întrucât principalele date epidemiologice extrase din registre oferă informaţii cu privire doar la populaţiile afectate (vârstă, sex şi rasă) şi la caracteristicile tumorii (localizare şi aspecte macroscopice). Materiale şi metode: Sursa materialului biologic a reprezentat-o baza de date a disciplinei de Anatomie patologică din cadrul Facultăţii de Medicină Veterinară, din Cluj-Napoca, din aprilie 2001 până în octombrie 2010, perioadă în care au fost prelucrate 2857 de probe provenite de la câini, dintre care 630 au fost tumori (510 maligne, 120 benigne), iar dintre acestea 46 au fost tumori melanice (43 maligne, 3 benigne), pe lângă acestea, în perioada 1992-1998 au fost diagnosticate 2 cazuri de tumori melanice la cabaline. O altă bază de date a fost constituită din 9 probe prelevate de la cai cu melanoame, abatorizaţi în perioada 5-7 mai 2010, în cadrul abatorului din Alexandria. Rezultate: Din totalitatea tumorilor diagnosticate 7.30% au fost reprezentate de tumori melanice, dar din totalitatea tumorilor cutanate, tumorile melanice au reprezentat 45.54%. Cele mai frecvente tumori au fost tumorile mamare reprezentând 27%, urmate de tumorile cutanate, dar fără tumorile melanice 8.7%, melanoame 7.3%, hemangioame 6,34%, osteaosarcoame 2.7%, limfoame 2.5% şi alte tumori 43.96%. Melanoamele au reprezentat 6.66% din toate tumorile şi 8.23% dintre toate tumorile maligne. Melanocitoamele au reprezentat 0.635% din totalul de tumori diagnosticate si 3.33% din totalul tumorilor benigne. În cazul tumorilor maligne cele mai frecvente tumori au fost tumorile mamare, urmate în ordine descrescătoare de melanoame, hemangiosarcoame, tumori cutanate fără melanoame şi osteaosarcoame. În cazul tumorilor benigne cele mai frecvente au foat tumorile cutanate, fara melanocitoame, urmate, în ordine descrescătoare, de tumori mamare, hemangioame, melanocitoame, osteoame. Principalele tumori cutanate au fost reprezentate de: melanoame, carcinoame spino-celulare, papiloame, carcinoame bazo-celular. Localizarea cea mai frecventă a fost: cutanată (80,5%), la nivelul cavităţii bucale (6.5%), falange (6.5%), la nivelul buzelor (4.4%) şi ocular (2.1%). În funcţie de regiunile corporale, cea mai frecventă localizare a fost la nivelul capului cu 15 cazuri, urmată de regiunea ventro-abdominală cu 8 cazuri şi la nivelul scrotumului 3 cazuri. În cazul tumorilor melanice recoltate de la cai, 4 au fost localizate la baza cozii, 5 cazuri în regiunea anală şi genitală, 1 caz a avut localizare atât la baza cozii cât şi în regiunea genitală şi un melanom metastazat.

La câine cele mai frecvente cazuri au fost diagnosticate la metişi (5 cazuri), brac german cu păr scurt (2 cazuri), cocker spaniel (3 cazuri), vizsla maghiară (1 caz), boxer (4 cazuri), airedale terrier (2 cazuri), Tekel (3 cazuri), Schnauzer uriaş (2 cazuri), Schnauzer pitic (4 cazuri), Tosa Inu (3 cazuri), Dobermann (2 cazuri), Dog de bordeaux (2 caz), Bulldog englez (1 caz), Setter irlandez (1 caz), Rottweiler (2 cazuri) şi Ciobănesc German (2 cazuri). În urma acestui studiu s-a observat că melanomul cu localizare la nivelul buzelor a fost mai frecvent întâlnit la rasele: Ciobănesc German şi Schnauzer. În cazul raselor Cocker Spaniel, Schnauzer şi Airedale Terrier melanoamele s-au localizat sublingual. La Setter Irlandez şi Dobermann cea mai frecventă localizare a fost în cavitatea bucală, iar la cabaline toate cazurile de melanoame au fost la cai vineţi. Melanocitoamele au fost diagnosticate la câini cu vârste cuprinsă între 6 şi 9 ani, în timp ce melanoamele au fost diagnosticate la căini cu vârste între 2 şi 13 ani, dintre care 27 de cazuri au fost la câini cu vârstă de peste 7 ani, iar 11 cazuri la câini sub 7 ani. La cabaline melanoamele au fost întâlnite la indivizi cu vârstă cuprinsă între 8 şi 13 ani, iar melanocitoamele între 10 şi 15 ani. În urma acestui studiu s-a constatat că, în cazul câinilor, cele mai multe cazuri de melanoame au fost la masculi (25 de cazuri), spre deosebire de femele unde au fost doar 19 cazuri, în timp ce la cabaline, 6 cazuri au fost întâlnite la femele şi 5 la masculi. Toate melanocitoamele diagosticate la cal au fost la masculi. Concluzii:

1. Procentual tumorile melanice au reprezentat 7,30% din totalul tumorilor, respectiv 45,54% din totalul tumorilor cutanate.

2. Cea mai frecventa localizare a tumorilor melanice la caine a fost la nivelul pielii.

3. Toate tumorile localizate la nivelul jonctiunilor muco-cutanate (buze, pleoape, zona sublinguala) au fost tumori melanice maligne.

4. Rasele de caini la care s-a diagnosticat cel mai frecvent melanoame sunt: Boxer, Schnauzer, Tosa Inu, Teckel, metisi si Cocker Spaniel.

5. Toate tumorile melanice diagnosticate la cai au provenit de la cai vineti.

STUDIUL MACROSCOPIC ŞI HISTOLOGIC AL TUMORILOR MELANICE LA CÂINE

Introducere: Tumorile melanice sunt frecvent diagnosticate la câine, reprezentând 7% din totalul tumorilor întâlnite la această specie (Cotchin et al., 1955). Este cea mai frecventă tumoră malignă cu localizare în cavitatea bucală şi al doilea neoplasm cu localizare sublinguală (Marino et al., 1995). În cazul animalelor domestice este foarte târziu

diagnosticat iar şansele de supravieţuire sunt doar de 5 ani pentru 5% dintre indivizi (Rogers et al.,1997). Scopul lucrării: Prin această lucrarea s-a încercat un studiu cât mai extins al tumorilor melanice la câine, atât din punct de vedere macroscopic cât şi microscopic, prin aprecierea localizării şi aspectului tumorilor, stabilirea tipurilor celulare, identificarea şi cuantificarea mitozelor, etc. şi utilizarea acestor aspecte pentru compararea tumorilor maligne cu cele benigne. Materiale şi metode: În perioada iulie 1998-octombrie 2010, la disciplina de Anatomie patologică din cadrul Facultăţii de Medicină Veterinară din Cluj-Napoca, au fost diagnosticate, 33 de tumori melanice la câine şi 1 melanom metastazat (melanom care este localizat in limfonoduri sau organe interne, dar nu se cunoaşte localizarea tumorii primare). Examenul macroscopic a inclus: studiul epidemilogic (vârstă, sex, rasă), aprecierea diametrului tumoral, aspectul suprafeţei tumorale şi a tumorii pe secţiune, perioada de creştere a tumorii. Examenul microscopic a fost efectuat pe probe care după prelevare au fost fixate într-o soluţie de formol 10%, timp de 24 de ore, iar după aceea încorporate în blocuri de parafină după tehnici standard. Probele încoporate în parafină au fost secţionate la 4-5 microni cu ajutorul microtomului Leica RM2125 RT, după care au fost colorate Hematoxilină & Eosină, şi examinate cu microscopul Olympus SP 350. De asemenea s-au efectuat poze ale acestor preparate cu microscopul Olympus SP 350 şi analizate cu program adecvat Olympus DO soft. Rezultate: Culoarea tumorilor melanice a variat de la alb, roz până la roşu închis sau chiar negru. Diametrul acestora a fost cuprins între 0.5 şi 6 cm, dar majoritatea neoplasmelor au avut între 0.5-4 cm. Din punct de vedere al aspectului, majoritatea tumorilor au prezentat un aspect dens, câteva neoplasme au fost friabile şi o singură tumoră a fost pediculată. În majoritatea cazurilor a fost vorba de tumori unice cu o singură excepţie când tumora a prezentat trei noduli. Melanomul metastatazat cu dimensiuni multiple (1-13) cm (Fig 1.A). Dintre melanoamele diagnosticate 30 au fost formate din celule epiteloide, 11 tumori din celule fusiforme, 7 tumori au fost mixte, prezentând atât celule epiteloide cât şi fusiforme, 8 au fost cu celule dendritice, 2 cazuri au prezentat atât celule dendritice cât şi fusiforme iar o tumoră a avut doar celule vacuolizate (Fig 1.C). Dintre tumorile melanice, doar 4 au fost diagnosticate ca fiind melanocitoame, dintre care 3 tumori au fost cu celule fusiforme şi o tumoră cu celule dendritice. La toate cele 30 de melanoame a fost evaluat indicele mitotic şi s-au constatat următoarele: 5 tumori au prezentat un indice mitotic foarte ridicat, în 4 cazuri s-au

obţinut rezultate peste valorile medii, în 14 cazuri valorile obţinute s-au încadrat in limitele parametrilor medii, iar în alte 7 cazuri şi în cele 4 melanocitoame diagnosticate, indicele mitotic a fost foarte scăzut. Celulele epiteloide au avut următorii indici mitotici: 3,11,14,17,40. Celulele fusiforme au avut următorii indici mitotici: 4,5,5,8,34. Tumorile mixte cu celule epiteloide şi fusiforme au avut urmatorii indici mitotici: 1,6,18, 41, 53. Celulele dendritice au prezentat următoarele valori ale indicelui mitotic: 3,18. Tumora mixtă cu celule dendritice şi cu celule fusiforme a avut o valoare a indicelui mitotic in valoare de 15, iar celulele vacuolizate au avut un indice mitotic de 3. Dimensiunea zonelor de necroză din melanoamele identificate a variat de la caz la caz astfel: în 9 cazuri zonele au fost extinse, în 2 cazuri dimensiunea acestora a fost moderată, redusă în 12 cazuri şi absentă în alte 7 cazuri. S-a mai aboservat că infiltratul limfocitar din aceste melanoame a fost intens în 9 cazuri, moderat în 14 cazuri şi absent în 7 cazuri. Dimensiunea şi numărul zonelor de necroză cresc direct proporţional cu indicele mitotic, în timp ce agresivitatea tumorilor creşte direct proporţional cu dimensiunea zonelor de necroză. Conform sistemului Clark de clasificare, 28 de tumori au avut grad 4, 2 melanoame grad 5, 3 melanocitoame au fost de grad 4 şi 1 melanocitom de grad 1. Activitatea juncţională a fost prezentă în 24 de melanoame şi absentă în celelalte 6 tumori, iar în cazul melanocitoamelor doar 3 au prezentat activitate juncţională. Concluzii:

1. Celulele din melanoamele diagnosticate la caine au avut aspectul celulelor epiteloide sau fusiforme, celule epiteloide impreuna cu celule dendritice, iar aspectul celulelor provenite din melanocitoame a fost asemanator cu cel al celulelor fusiforme sau dendritice.

2. Cresterea agresivitatii tumorilor s-a corelat cu reducerea infiltratului limfocitar si cu extinderea zonelor de necroza.

3. Indicele mitotic determinat in cazul melanoamelor este mult mai crescut decat cel al melanocitoamelor la caine.

ASPECTE MACROSCOPICE ȘI HISTOLOGICE ALE MELANOAMELOR LA CAL

Introducere: La cai, melanoamele reprezintă 6-15% din tumorile cutanate. S-a stabilit o relaţie între culoarea vânătă de la cal şi incidenţa acestor tumori, deşi au fost citate cazuri şi la cabaline de alte culori. De asemenea s-a mai descoperit o creştere a incidenţei tumorilor melanice la cai odatş cu înaintarea în vârstă, astfel aproximativ 80% din caii vineţi cu vârstă de peste 15 ani prezintă tumori melanice depistabile în umra examenului clinic ( Simth et al., 2002).

Scopul lucrării: Scopul acestei lucrări a fost de a extinde studiul macroscopic şi histologic al tumorilor melanice la cal prin cercetarea aspectelor tumorale şi a localizării acestora, studierea tipurilor celulare, a mitozelor etc., şi utilizarea acestor aspecte pentru a compara tumorile maligne cu cele benigne. Materiale şi metode: Materialul biologic utilizat a fost reprezentat de un număr de 11 probe prelevate de la cai abatorizaţi în perioada 5-7 mai 2010 în cadrul abatorului din Alexandria, la care s-au adăugat cele primite in cadrul disciplinei de Anatomie patologică în perioada 1992-1998 Examenul macroscopic a inclus: studiul epidemilogic (vârstă, sex, rasă), aprecierea diametrului tumoral, aspectul suprafeţei tumorale şi a tumorii pe secţiune, perioada de creştere a tumorii. După prelecare probele au fost fixate într-o soluţie de formol 10%, timp de 24 de ore, iar după aceea încorporate în blocuri de parafină după tehnici standard. Probele încoporate au fost secţionate la 4-5 microni cu ajutorul microtomului Leica RM2125 RT, după care au fost colorate Hematoxilină & Eosină, şi examinate cu microscopul Olympus SP 350. De asemenea s-au efectuat poze ale acestor preparate cu microscopul Olympus SP 350 şi analizate cu program adecvat Olympus DO soft. Rezultate: Neoplasmele melanice diagnosticate în acest studiu au fost formaţiuni tumorale cu aspect nodular, unice sau duble, dintre care 6 tumori au fost de dimensiuni mici (1-2 cm) iar restul de 5 au fost de dimensiuni mai mari (2-15 cm) (Fig 1.B). Melanomul metastatic a avut un aspect multinodular, cu noduli cu dimensiune de la 3-4 mm până la 20-30 de cm, de culoare neagră şi localizati în parenchimul hepatic, splenic, ovarian, pulmonar şi splenic. Dintre cele 8 melanoame diagnosticate 5 dintre acestea au fost formate din celule fusiforme şi 3 din celule dendritice (Fig 1.D). Dintre cele 3 melanocitoame diagnosticate la cai un caz a prezentat celule fusiforme iar 2, celule dendritice. În cazul melanoamelor, indicele mitotic a fost crescut, în timp ce în cazul melanocitoamelor, acesta a fost extrem de redus. Dimensiunea zonelor de necroză din melanoamele identificate la cai, au variat de la caz la caz astfel: 1 caz a prezentat zone extinse de necroză, în 2 cazuri au prezentat zone moderate de necroza, in 4 cazuri acestea au fost reduse iar într-un caz acestea au fost absente, în timp ce, în cazul melanocitoamelor aceste zone au fost extrem de reduse. Celulele dendritice au prezentat urmatoarele valori ale indicelui mitotic: 11,1,3,7,2. Celulele fusiforme au avut următorii indici mitotici: 1,10,7,4,3,5. S-a mai aboservat că infiltratul limfocitar a fost intens la 1 caz, moderat în 3 cazuri şi absent în

4 cazuri, în timp ce în cazul melanocitoamelor infiltratul limfocitar a fost absent. Indicele mitotic a fost moderat cu valori cuprinse între 3-14, în timp ce zonele de necroza au variat: in primul caz fiind extinse, în 2 cazuri a fost moderat, redus în 4 şi în ultimul a fost absent. Pe lângă acestea, infiltratul limfocitar a fost intens într-un caz, moderat în 3 cazuri şi absent în 4 cazuri. Activitatea juncţională a fost prezenta în toate melanoamele şi melanocitoamele diagnosticate la cai, iar după sistemul Clark, 5 melanoame au fost de nivel 4 Clark, şi 3 melanoame au avut grad 5 Clark. Concluzii:

1. Tumorile melanice la cal au avut un aspect multinodular cu dimensiuni variabile de la 1 la 15 cm.

2. Melanomul metastazat a avut apectul unei formatiuni cu noduli multipli de dimensiuni variabile.

3. La cal majoritatea melanoamelor au fost alcatuite din celule fusiforme, in timp ce majoritatea melanocitoamelor din celule dendritice.

4. Indicele mitotic determinat in cazul melanoamelor este mult mai crescut decat cel al melanocitoamelor la cal.

5. Relatia dintre infiltratul limfocitar si zonele de necoza a fost invers proportional cu indicele mitotic.

ASPECTE CITOLOGICE ÎN TUMORILE MELANICE LA CAL Introducere: Examenul citopatologic este mult mai frecvent utilizat decât biopsiile, pentru monitorizarea metastazelor atât în cazul pacienţilor umani cât şi în cazul animalelor ( Basler GC et al., 1997-Wilcock BP et al.,1986). Aspectele citopatologice ale melanoamelor sunt extrem de variabile şi se pot asemăna cu cele întâlnite în neoplasmele cu celule rotunde, epiteliale sau fusiforme (Fournel-Fleury et al., 1994). La cai toate celulele prezintă pigment melanic, şi sunt fie fusiforme, fie dendritice şi au un diametru de aproximtiv 30 de microni (Levene et al., 1970). Scopul lucrării: Scopul acestei lucrări este studiul citologic al celulelor melanice (citoplasmă, nuclei, nucleoli, cromatină, pigment melanic) şi importanţa acestor aspecte pentru diferenţierea neoplasmelor maligne de cele benigne.

Materiale şi metode: Probele au fost recoltate de la cai sacrificaţi în perioada 5-7 mai la abatorul din Alexandria. Acestea au fost localizate fie la baza cozii, fie la nivelul perineului. Tehnica de lucru a fost constituita din 2 metode: 1. îndepartarea melaninei prin utilizarea unor soluţii speciale de decolorare şi 2. colorarea celulelor prin metoda Diff Quick. Preparatele au fost examinate cu microscopul Olympus SP 350. De asemenea s-au efectuat poze ale acestor preparate cu microscopul Olympus SP 350 şi analizate cu program adecvat Olympus DO soft.

Rezultate: În toate cazurile, nucleii au fost rotunzi spre ovali, cu un polimorfism mult mai pronunţat în cazul melanoamelor (Fig 1.E), şi uniformi în cazul melanocitoamelor, cromatina dispersată, cu 1-3 nucleoli evidenţi, în unele cazuri s-a observat un singur nucleol de dimensiuni mari, situat excentric, raportul nucleu/citoplasmă fiind mai mare decât în cazul celulelor normale. În 2 cazuri s-au observat zone ulcerate pe suprafaţa tumorii, iar microscopic în aceste zone s-a identificat un infiltrat compus din neutrofile şi câteva macrofage. S-au identificat 4 melanoame cu celule fusiforme, 5 cazuri cu celule rotunde sau chiar poligonale, doar un singur melanocitom cu celule fusiforme şi 2 cu celule rotunde. În toate aceste celule pigmentul melanic a fost prezent, având aspectul unor granule rotunde sau uşor alungite, în unele cazuri. Aspectele citologice de malignitate în cazul melanoamelor au fost: anizocitoza, anizocarioaza, cu nuclei giganti, iar în cazul melanocitoamelor s-au observat puţine diferenţe, atât la nivel molecular cât şi citoplasmatic. Concluzii:

1. In cazul melanoamelor s-a observant un polimorfism nuclear, spre deosebire de nuclei observati in cazul melanocitoamelor, care au avut un aspect uniform.

2. In cazul melanoamelor si melanocitoamelor aspectul celulelor variaza de la fusiforme pana la rotunde cu granule de melanina evidente.

3. Aspectele citologice intalnite in melanoame sunt: anizocitoza, anizocarioaza, nuclei giganti, in timp ce melanocitoamele se caractrerizeaza prin aspectul uniform al nucleilor si citoplasmei.

Fig.1 A. melanom metastatic în plămâni (câine). B. aspect microscopic(câine) cu celule gigantice (săgeata neagră) 400x. D. noduri muliple de de cal. C. aspect microscopic de melanom (cal) cu celule gigantice (săgeata neagrE. aspect citologic de melanom (cal) cu anizocitoză şi anisokaryosis. 1000x

Fig.1 A. metastatic melanoma in lung (dog). B. microscopic aspect of dog melanoma with gigantic cell (black arrow) 400x. D. muliply melanoma nodes in the tail of horse. C. microscopic aspect of horse melanoma with gigantic cell (black arrow) 400x. E.aspect of horse melanoma with Anisocytosis and anisokaryosis. 1000x.

B A

D C

E

microscopic de melanom de melanom in coada ăgeata neagră) 400x. 1000x.

microscopic aspect of dog melanoma muliply melanoma nodes in the tail of horse. C.

melanoma with gigantic cell (black arrow) 400x. E. cytologic

EXPRESIA IMUNOHISTOCHIMIC Ă A MELAN-A ÎN TUMORILE MELANICE LA CÂINE

Introducere: MART-1/Melan A este un antigen proteic din structura melanocitelor. Anticorpii împotriva acestui antigen sunt utilizaţi în medicină pentru a identifica celulele diferenţiate din melanocite, fiind astfel foarte utili în diagnosticul melanoamelor (Kawakami, et al., 1994). În urma unor studii efectuate pe tumorile melanice, s-a ajuns la concluzia că Melan A este un marker specific şi sensibil pentru melanoamele de la câine (Ramos-Vara, et al., 2000). Este o proteină a cărei funcţii nu este cunsocută dar este exprimată, în special, de melanocite ( Chen, et al., 1996). Scopul lucrării: Scopul acestui studiu a fost de a utiliza analiza imagistică computerizată pentru a măsura anticorpii Melan A din tumorile melanice de la câine, de a aprecia densitatea celulelor marcate de aceşti anticorpi, şi de a corela procentul celulor marcate cu aspectele microscopice şi macroscopice, pentru a evalua importanţa acestui marker în identificarea tumorilor melanice. Materiale şi metode: În perioada 2001-2010 în cadrul disciplinei de Anatomie patologică a Facultăţii de Medicină Veterinară Cluj, au fost diagnosticaţi, prin expresia Melan A, 12 câini cu melanom cutanat, 1 câine cu melanocitom cutanat şi un melanom metastazat în intestin. Aspectele macroscopice luate în calcul au fost: rasă, vârstă, sex şi localizarea tumorii. Probele au fost mai întâi fixate în soluţie de formol 10%, încorporate în parafină, după care s-au efectuat secţiuni de 4 µm care au fost colorate Hematoxilină eozină. Tehnicile de imunohistochimie au constat în: aplicarea anticorpului primar Melan-A şi vizualizarea acestei reacţii prin utilizarea cromogenului DAB şi a fosfatazei alcaline marcată cu un cromogen. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microsopului (Olympus BX51). Rezultate: Procentul celulelor marcate a fost între 40.43%-97.89% (Fig 2.B). Reactivitatea marker-ului Melan-A a fost demonstrate în 83.3% din cele 10 melanoame, în melanomul metastazat şi în melancitom. În toate cele 12 cazuri s-a apreciat procentul de celule marcate de către Melan-A, iar rezultatele sunt: 2 cazuri negative (14.28%), 3 cazuri (21,42%) au prezentat între 11-50% pozitive, şi 6 cazuri (50%) au avut peste 80% dintre celule marcate. În melanoamele cutanate de la câine intensitatea colorării cu Melan-A a fost foarte mare în 6 cazuri (50%), mare într-un sigur caz (8.3%), moderată în 3 cazuri (25%) şi absentă în celelalte 2 cazuri (16.6%), iar în cazul melanomului metastazat (59.27%) şi a melanocitomului (67.49%) s-a obţinut o intensitatea mare. Capacitatea marker-ului Melan-A de a colora nucleul celulor tumorale este foarte redusă în cazul tumorilor melanice de la câine. În toate celulele

tumorale s-a demonstrat sensibilitate pentru Melan-A. În 5 melanoame, în melanomul metastatic şi în melanocitom marcarea celulelor cu Melan-A a fost heterogenă, cu prezenţa unor zone tumorale care nu s-au colorat de loc, în timp ce în celelelate 5 melanoame, marcarea şi implicit colorarea a fost omogenă. Nu a fost obseravată nici o relaţie între rasă, sex, vârstă, localizarea tumorii, diametrul tumorii şi reactivitatea marker-ului Melan-A. Marcarea celulelor epiteloide a fost intensă în 3 melanoame şi moderată în celelalte 2 cazuri. Dintre tumorile mixte cu celule epiteloide şi fusiforme, doar 2 au fost marcate intens de către Melan-A, în timp ce una dintre tumori a fost marcată moderat. Toate melanoamele cu celule fusiforme şi melanocitomul au fost colorate moderat, în timp ce melanomul cu celule vacuolizate a avut o senesibilitate foarte mare pentru Melan-A. În toate celulele tumorale Melan-A a difuzat în toată citoplasma, astfel nu au fost observate formaţiuni punctate sau polare. Nu s-a observat nici o relaţie directă între tipul tumoral (malign sau benign) şi Melan-A. Tumorile melanotice s-au colorat intens în 3 cazuri, moderat într-un singur caz şi o tumora nu s-a colorat deloc, în timp ce tumorile amelanotice s-au colorat foarte intens în 3 cazuri, intens într-un singur caz, moderat tot un caz şi o singură tumoră nu a prezentat nici un fel de reacţie. Concluzii:

1. In majoritatea cazurilor coloratia cu Melan-A a fost heterogena. 2. Capacitatea marker-ului Melan-A de a colora nucleul celulor tumorale este

foarte redusa in cazul tumorilor melanice de la caine. 3. Intensitatea colorarii celulelor cu marker-ul Melan-A a fost diferita in functie

de tipul celular astfel: cea mai mare intensitate a foat observata in cazul celulelor epiteloide si in cazul tumorilor mixte cu celule epiteloide si fusiforme; intensitatea culorii, doar in cazul celulelor fusiforme, a fost mai redusa decat in cazul celulelor vacuolizate.

EXPRESIA IMUNOHSITOCHIMIC Ă A MARKER-ULUI S100 ÎN TUMORILE MELANICE LA CÂINE

Introducere: Marker-ul S100 este o proteină care se localizeză doar în celulele neuroectodermice. S100 este prezentă, în mod normal în celulele derivate din crestele neurale (Celule Schwann, melanocite, celule gliale, etc) ( Donato et al,2003). Familia de proteine din care face parte şi marker-ul S100 este extrem de utilă pentru identificarea unor tumori şi a diferenţierii epidermului. De asemenea poate fii întâlnit şi în cazul melanoamelor (Nonaka et al,2008), fiind demonstrat în peste 50% din melanoamele studiate (Chenier et al., 1999- Rabanal et al., 1989). Scopul studiului: Scopul acestui studiu a fost de a utiliza analiza imagistică computerizată pentru a măsura anticorpii S100 din tumorile melanice de la câine, pentru a aprecia densitatea

celulelor marcate de aceşti anticorpi, şi de a corela procentul celulelor marcate cu modificările microscopice şi macroscopice, pentru a evalua importanţa acestui marker în identificarea tumorilor melanice. Materiale şi metode: În perioada 2001-2010 în cadrul disciplinei de Anatomie patologică a Facultăţii de Medicină Veterinară Cluj, au fost diagnosticaţi, prin expresia S100, 11 câini cu melanom cutanat, 1 câine cu melanocitom cutanat şi un melanom metastazat la nivel intestinal. Aspectele macroscopice studiate au fost: rasa, vârsta, sexul şi localizarea tumorii. Probele au fost mai întâi fixate în soluţie de formol 10%, încorporate în parafină, după care s-au efectuat secţiuni de 4 µm care au fost colorate Hematoxilină eozină. Tehnicile de imunohistochimie au constat în: aplicarea anticorpului primar Melan-A şi vizualizarea acestei reacţii prin utilizarea cromogenului DAB şi a fosfatazei alcaline marcată cu un cromogen. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microsopului (Olympus BX51). Rezultate: Reactivitatea marker-ului S100 a fost demonstrată în toate tumorile studiate (Fig 2.A). Pentru toate tumorile s-a apreciat procentul de celule marcate, iar razultatele au fost : 10 dintre tumori (76.92%) au prezentat între 51-80% celule pozitive, şi 3 cazuri au avut peste 80% celule pozitive. În melanoamele cutanate studiate la câine gradul de colorare a fost : intens în 3 cazuri (25%) şi 9 cazuri (75%) au fost putin peste valorile medii, iar în ceea ce priveşte intensitatea coloraţiei în cazul melanomului metastazat şi a melanocitomului, aceasta a fost moderată. Capacitatea marker-ului S100 de a colora nucleul celulor tumorale este foarte redusa în cazul tumorilor melanice de la câine. Sensibilitatae pentru marker-ul S100 a fost demonstrată în cazul tuturor celulelor tumorale. În 9 melenoame şi în melanocitom coloraţia a fost heterogenă cu prezenţa unor zone tumorale care nu s-au colorat de loc, în timp ce în celelate 3 melanoame s-a observat o coloraţie omogenă. Nu a existat nici o relaţie evidentă între rasă, sex, vârstă, localizarea tumorii, diametrul acesteia şi reactivitatea S100. Marcarea celulelor epiteloide a fost intensă în 3 melanoame şi moderată în celelalte 2 cazuri. Tumorile mixte cu celule epiteloide şi fusiforme şi tumorile cu celule fusiforme au fost colorate intens în timp ce, în cazul celulelor vacuolizate s-a observat o afinitate moderată pentru S100. Tumorile melanotice s-au colorat intens în 6 cazuri, în timp ce tumorile amelanotice s-au colorat foarte intens în 3 cazuri şi intens în 4 cazuri. În toate celulele tumorale S100 a difuzat în toata citoplasma, astfel nu au fost observate formatiuni punctate sau polare. Nu s-a observat nici o relaţie directă între tipul tumoral (malign sau benign) şi S100. Concluzii:

1. Capacitatea marker-ului S100 de a colora nucleul celulelor tumorale, este moderata in cazul tumorilor melanice de la caine.

2. In majoritatea cazurilor coloratie cu S100 a fost heterogena. 3. Intensitatea colorarii celulelor cu marker-ul S100 a fost diferita in functie de

tipul celular astfel: in cazul celulelor epiteloide a fost observata o intensitate moderata spre intensa iar in cazul tumorilor mixte cu celule epiteloide si fusiforme si in cazul celulelor vacuolizate, s-a observat o intensitate moderata.

EXPRESIA IMUNOHISTOCHIMIC Ă A VIMENTINEI ÎN TUMORILE MELANICE DE LA CÂINE

Introducere: Vimentina este proteina filamentoasă intermediară cea mai frecvent întâlnită şi prima exprimată în timpul diferenţierii celulare. Este o proteină identificată în numeroase celule menzenchimale: fibroblaste, celule endoteliale etc (Katsumoto et al., 1990), de asemenea acesta este prezentă în multe tipuri tumorale, dar cel frecvent în noeplasmele mezenchimale: sarcoame, fibrosarcoame, histiocitom malign fibros, angiosarcome, leio- si rabdomiosarcome, limfoame, melanoame si schwannoame ( Lang et al., 2002- Niveditha et al.,2003- Ramos-Vara et al., 2000). Prin utilizarea acestui marker se pot deosebi melanoamele de carcinoamele slab diferenţiate, dar nu şi de limfoame sau sarcoame (Koenig et al., 2001). Scopul lucrării: Scopul acestui studiu a fost de a utiliza analiza imagistică computerizată pentru a măsura anticorpii vimentină în tumorile melanice de la câine, de a aprecia densitatea celulelor marcate de aceşti anticorpi, şi de a corela procentele celulelor marcate cu modificările microscopice şi macroscopic, pentru a stabili importanţa acestui marker în identificarea tumorilor melanice. Materiale şi metode: În perioada 2001-2010 în cadrul disciplinei de Anatomie patologică a USAMV-Cluj, au fost diagnosticaţi 12 câini cu melanom cutanat, 2 melanocitoame cutanate şi un melanom metastazat la nivel intestinal, în urma expresiei S100. Aspectele macroscopice studiate au fost: rasa, vârsta, sexul şi localizarea tumorii. Probele au fost mai întâi fixate în soluţie de formol 10%, încorporate în parafină, după care s-au efectuat secţiuni de 4 µm care au fost colorate Hematoxilină eozină. Tehnicile de imunohistochimie au constat în: aplicarea anticorpului primar Vimentină şi vizualizarea acestei reacţii prin utilizarea cromogenului DAB şi a fosfatazei alcaline marcată cu un cromogen. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microsopului (Olympus BX51). Rezultate: Imunoreactivitatea Vimentinei a fost pozitivă în 14 din cele 15 cazuri studiate (93.33%) (Fig 2.C), astfel doar un singur melanom a fost negativ. Procentul celulelor marcate a variat în funcţie de tipul tumoral (de la 58.95% la 97.40%), astfel: 1 caz a

fost negativ (6.66%), 6 cazuri (40%) au avut un număr de celule marcate cuprins între 51-80% iar 8 (53.33%) cazuri au prezentat mai mult de 80% din celule positive. În melanoamele cutanate studiate la câine gradul de colorare a fost : foarte intens în 7 cazuri (58.33%), intens în 4 cazuri (33.33%), iar intensitatea melanocitoamelor moderată. Capacitatea Vimentinei de a colora nucleul celulor tumorale este foarte redusă în cazul tumorilor melanice de la câine. Sensibilitatea Vimnetinei a fost demonstrată în cazul tuturor celulelor tumorale. În cazul a 8 melenoame şi a unui melanocitom distribuţia intracitoplasmatică a vimentinei a fost heterogenă, în timp ce în celelate 3 melanoame şi în celălalt melanocitom s-a observat o distributie omogenă. Nu a existat nici o relaţie evidentă între rasă, sex, vârstă, localizarea tumorii, diametru acesteia şi reacitivitatea Vimentinei. Marcarea celulelor epiteloide a fost intensă în 3 melanoame şi moderată în cazul unui melanom şi a unui melanocitom. Marcarea celulară în melanoamele mixte, cu celule epiteloide şi fusiforme a fost diferită, astfel: 2 melanoame au prezentat o intensitate ridicată în timp ce un alt melanom a prezentat o intensitate foarte ridicată. În cazul celulelor fusiforme 3 melanoame şi un melanocitom au avut o coloraţie intensă în timp ce celălalt melanocitom a prezentat o coloraţie moderată. Melanomul cu celule vacuolizate s-a colorat intens în cazul Vimentinei, în timp ce în cazul celulelor vacuolizate s-a observat o afinitate moderată pentru S100. Tumorile melanotice s-au colorat intens în 6 cazuri, în timp ce tumorile amelanotice s-au colorat foarte intens în 3 cazuri şi intens în 4 cazuri. În toate celulele tumorale Vimentina a difuzat în toată citoplasma, astfel nu au fost observate formatiuni punctate sau polare. În cazul tumorilor amelanotice s-a observat cel mai mare procent de celule marcate, astfel 6 tumori au prezentat o intensitate foarte mare în timp ce 2 tumori a prezentat o afinitate moderată, spre deosebire de tumorile melanotice, în care 4 cazuri au prezentat o intensitate moderată, în timp ce doar 2 au prezentat o intensitate crescută. Nu s-a observat nici o relaţie directă între tipul tumoral (malign sau benign) şi Vimentină. Concluzii:

1. Vimentina are o capacitate foarte redusa de a colora nucleii. 2. In cazul vimentinei, s-a observat o colorare mai intensa a celulelor fusiforme

si vacuolizate decat o tumora mixta cu celule fusiforme si epiteloide.

STUDIU COMPARATIV PENTRU IDENTFICAREA MARKER-ILOR MELAN-A, S100 ŞI VIMENTIN Ă ÎN TUMORILE MELANICE LA

CÂINE Introducere: Melan-A, S100 şi Vimentina sunt foarte importante în diagnosticul morfo-patologic şi în identificarea tumorilor melanice. Vimentina este exprimată de celulele mezenchimale, fibroblaste, celule endoteliale etc. (Katsumoto et al., 1990), S100 este

o proteină isoformă întâlnită doar în celulele derivate din neuroectoderm ( Donato et al,2003), iar MART-1/Melan-A este un antigen proteic întâlnit în melanocite. Anticorpii împotriva acestor antigene sunt utilizaţi în medicină pentru recunoaşterea celulelor din seria melanocitară, tehnică foarte utilă în diagnosticul melanoamelor (Kawakami, et al., 1994). Scopul lucrării: Obiectivele tezei s-au axat pe un studiu comparativ al diferitilor markeri melanici : Melan-A, Vimentină şi S100, urmărindu-se localizarea culorii în celule şi secţiuni tisulare, sensibilitatea culorii şi compararea acestora cu diferite aspecte histologice precum tipul histologic de tumoră în funcţie de tipul celular. Materiale şi metode: În perioada 2001-2010 în cadrul disciplinei de Anatomie patologică a Facultăţii de Medicină Veterinară Cluj, au fost diagnosticaţi, prin expresia Melan-A, Vimetină şi S100, 10 câini cu melanom cutanat, un câine cu melanocitom cutanat şi un melanom metastazat la nivel intestinal. Aspectele macroscopice studiate au fost: rasă, vârstă, sex şi localizarea tumorii. Probele au fost mai întâi fixate în soluţie de formol 10%, încorporate în parafină, după care s-au efectuat secţiuni de 4 µm care au fost colorate Hematoxilină eozină. Tehnicile de imunohistochimie au constat în: aplicarea anticorpului primar Melan-A, S100 şi Vimentină, şi vizualizarea acestei reacţii prin utilizarea cromogenului DAB şi a fosfatazei alcaline marcată cu un cromogen. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microsopului (Olympus BX51). Rezultate : Toate tumorile melanice (100%) au fost pozitive cu S100, doar 11 din 12 (91.6%) cazuri au fost pozitive cu Vimentină şi 10 din 12 (83.3%) au reacţionat cu Melan-A. Un caz din 12 a fost negativ atât pentru Melan-A cât şi pentru Vimentină, şi un caz a fost pozitiv pentru Vimentină dar negativ pentru Melan-A. De asemenea a mai fost indentificat un caz care a fost pozitiv pentru S100 şi negativ pentru Melan-A. Corelarea imunohsitochimică a rezultatelor pozitive la Melan-A cu Vimentină respectiv S100 a fost de 90.1%, respectiv 83.3. Capacitatea de marcare a celulelor de către cei trei markeri, a fost diferită, astfel, în cazul Melan-A procentele au fost cuprinse între 40.43% şi 97.98%, în cazul S100 între 54.06% şi 98.1% iar valorile cele mai mici au fost în cazul Vimentinei: 58.95% şi 96.04%. Intensitatea culorii obţinută pentru Melan-A a fost moderată pentru 2 cazuri, intensă în 3 cazuri şi foarte intensă în 5 cazuri, dar au exzistat şi 2 tumori în care acestea au lipsit, în timp ce pentru S100, au fost pozitive toate tumorile, dintre care 9 cazuri au prezentat o colorare moderată iar 3 cazuri au fost intense. Ultimul marker studiat, Vimentina a prezentat o coloraţie moderată în 5 cazuri, intensă în 6 cazuri şi a fost absentă într-un singur caz. Marcarea celulelor epiteloide a fost diferită în funcţie de marker-ul utilizat astfel, în cazul vimentinei: un caz a fost intens colorat, 3 cazuri au fost moderate şi un singur caz a

fost negativ; în ceea ce priveşte marker-ul Melan-A, 2 probe au fost intens pozitive, o probă a fost moderat pozitivă şi 2 tumori au fost negative. Cel de-al treilea marker proteina S100 a prezentat: 2 cazuri intens pozitive şi 3 moderate. Reacţia tumorilor mixte, cu celule epiteloide şi fusiforme a fost diferită, astfel Vimentina a prezentat un caz intens pozitiv şi 2 moderate, cu Melan-A au fost identificate 2 cazuri intens pozitive şi unul moderat pozitiv iar în final, cu S100 au fost doar 3 cazuri cu intensitate medie. Celulelele fusiforme au reacţionat intens pozitiv în 3 cazuri cu Vimentina, 2 cazuri moderat pozitive şi 2 cazuri intens pozitive cu Melan-A, şi un caz intens pozitiv şi 2 cazuri moderat pozitive cu S100. Singura tumora cu celule vacuolizate a prezentat o reacţie intensă cu markerii Melan-A şi Vimentină şi moderată cu S100. În funcţie de încărcătura cu pigment melanic a celulelor tumorale a variat şi reactia acestora cu markerii tumorali, astfel în cazul tumorilor melanoctice au fost observat 3 cazuri foarte intens pozitive, 2 cazuri intens pozitive, un caz moderat pozitiv si unul negativ cu Melan-A, 2 cazuri foarte intens pozitive, 5 cazuri intens pozitive cu S100, iar in cazul vimentinei s-au observat 2 cazuri intens pozitive, 4 cazuri moderat pozitive si unul negativ. In cazul tumorilor amelanotice au fost 2 probe foarte intens pozitive, o proba intens pozitiva si o proba moderat pozitiva si un singur caz negativ pentru marker-ul Melan-A, s-a mai observat un caz intens pozitiv si 4 cazuri moderat pozitive pentru S 100. In cazul vimentinei reactia imunohistochimica obtinuta in cazul Vimentinei a fost intens pozitiva pentru 4 cazuri si moderata pentru un singur caz. Distributia markerilor tumorali in sectiunile histologice a fost diferita in functie de tipul marker-ului utilizat, astfel Melan-A a avut o distributie omogena in 5 cazuri si o distributie heterogena in celelelate 5 cazuri, in timp ce Vimentina s-a dispersat omeogen in 7 cazuri si heterogen in 4 cazuri, iar pentru S100 s0au observat 3 cazuri cu o distributie omogena si 9 cu o distributie heterogena. The staining was cytoplasmic and nuclear in some cases for S100,melan-A and Vimentin protein whereas the nuclear was positive in areas and negative in others in Melan-A (7/10) , S100 (6/11) and Vimentin (6/12). There weren't any relationship between these markers and tumoural types (malign & benign). Concluzii:

1. Celulele tumorilor melanice sunt mai intens colorate de marker-ul Vimentina in comparatie ci S100 si Melan-A.

2. In cazul tumorilor melanotice s-a observat o colorare mai intensa cu marker-ul Melan-A in comparatie cu markerii S100 si Vimentina, iar in cazul melanoamelor amelanotice colorarea a fost mai intensa in cazul Vimentinei in comparatie cu Melan-A si S 100; s-a mai observat o sensibilitate mult mai crescuta a marker-ului S100 in cazul tumorilor melanotice decat in cazul celor amelanotice; in cazul Vimentinei s-a observat o sensibilitate mai mare a acesteia pentru tumorile amelanotice, in timp ce sensibilitatea marker-ului Melan-A a fost aproximativ egala pentru cele 2 tipuri de tumori.

3. Distribuirea marker-ilor tumorali a fost difuza.

EXPRESIA IHC A MARKER-ULUI VASCULAR CD31 IN MELANOAMELE CUTANATA LA CAINE

Introducere: Angiogeneza este un proces complex caracterizat prin formarea de noi capilarea din reteaua vasculara pre-existenta. Acest proces este foarte important in cresterea tumorala si in aparitia metastazelor .(Blood et al.,1990) . Celulele endoteliale prolifereaza de 30-40 de ori mai repede in vasele de neo-formatie dintr-un proces tumoral,decat in vasele normale (Hobson et al.,1984). Mai mult, exista o multitudine de studii care demonstreaza o relatie foarte importanta intre angiogeneza intensa ( exprimata printr-o densitate foarte mare a microvaselor = numar de microvase/milimetru patrat), procesul de metastazare si prognosticul grav, in cazul mai multor tipuri tumorale de la om, inclusiv cancerul de san (Fox et al.,1993). CD31 este o proteian transmembranara cu o greutate moleculara de aproximativ 135kDa, care face parte din familia imunoglobulinelor si care are un rol important in adeziunea dintre celulele endoteliale si dintre celulele endoteliale si leucocite (Graham et al., 1999). Scopul lucrarii: Scopul acestui studiu a fost de a utiliza analiza imagistica computerizata pentru a masura angiogenaza dintr-o serie de tumori melanice de la caine, de a aprecia densitatea microvascularizatiei, si in completare, de a aprecia diametrul si perimetrul fiecarui vas, si de a corela acesti parametrii cu examenul histologic si cu gradul de malignitate a tumorilor melanice. Materiale si metode: In perioada 2001-2010 in cadrul disciplinei de Anatomie patologica a Facultatii de Medincina Veterinara Cluj, au fost diagnosticati 10 caini cu melanom cutanat, 4 caini cu melanocitom cutanat si un melanom metastazat la nivel intesinal, in urma expresiei CD31. Aspectele macroscopice studiate au fost: rasa, varsta, sex si localizarea tumorii. Probele au fost mai intai fixate in solutie de formol 10%, incorporate in parafina, dupa care s-au efectuat sectiuni de 4 µm care au fost colorate Hematoxilina eozina. Tehnicile de imunohistochimie au constat in: aplicarea anticorpului primar CD31 si vizualizarea acestei reactii prin utilizarea cromogenului DAB si a fosfatazei alcaline marcata cu un cromogen. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microsopului (Olympus BX51). Rezultate: Densitatea microvasculara din structura tumorilor a fost cuprinsa intre 3.33 si 11.6 (Fig 2.D). In cazul a 11 melanoame densitatea microvaselor a fost intre 3.33 si 7.2, iar in cazul melanomului metastatazat densitatea obtinuta a fost de 5.6 vase/camp microscopic, in timp ce in cazul melanocitoamelor a fost un caz negative, 2 cazuri cu diamtre cuprinse intre 5 si 5.66, si un caz cu diametrul de 11.6. Procentual raportul

suprafata vasculara/camp microscopic a fost cuprins intre 1.37% si 8.7% pentru melanoame, 9.61% pentru melanomul metastazat si intre 0% si 4.98% pentru melanocitoame. Toate melanoamele diagnosticate au avut un grad Clack cuprins intre 4-5 si au fost CD31 pozitive. Toate tumorile care au prezentat zone cu ulcaratii au fost pozitive pentru CD31. In cazul melanoamelor care au avut in indice mitotic redus au prezentat o densitate vascula cuprinsa intre 3.66 si 5.6 procentul raportului suprafata vasculara/suprafata totala a fost cuprins intre 2.18% si 9.61%, dar melanoamele cu un indice mitotic foarte ridicat au prezentat un diametrul al vaselor cuprins intre 3.33 si 7.2 si procentul raportului suprafata vasculara/suprafata totala de 1.37% pana la 8.7%. In melanocitoame procetele raportului suprafata vasculara/suprafata totala este intre 0% si 4.98%. Suprafata medie in melanoame a fost intre 94.52 µm² si 769.56 µm² si 608 µm² in melanomul metastatic, dar in cazul melanocitoamelor suprafata medie a fost intre 0 si 335.04 µm². Perimetrul mediu in melanoame a fost cuprins intre 56.7 µm² si 118.08 µm, egal cu 117.82 µm in melanomul metastatic, si intre 0 si 90.16 µm² in melanocitoame. Concluzii:

1. Toate melanoamele au fost positive pentru CD31 iar procentul microvaselor intratumorale si raportul suprafata/camp microscopic a foat asemanator.

2. S-a mai observat o crestere a densitatii microvaselor intratumorale in tumorile maligne fata de cele benigne.

3. Melanoamele maligne au prezentat un raport suprafata vasculara/suprafata totala mai mare decat melanocitoamele.

4. Suprafata medie a microvaselor/camp microscopic a fost corelata cu gradul de malignitate.

5. Perimetrul mediu al raportului microvase/camp microscopic a fost corelat cu gradul de malignitate.

EXPRIMAREA IMUNOFLORESCENTA A MARKER-ULUI PCNA IN TUMORILE MELANICE LA CAINE

Introducere: PCNA este sintetizata in fazele initiale G1 si faza S ale ciclului celular (Takahashi et al., 1993). Relatia sa strans cu proliferarea celulara a condus la investigarea rolului sau in evaluarea prognostica a tumorilor. Takahashi a observant o crestere a sensibilitatii celulelor din melanoame pentru marker-ul PCNA direct proportional cu cresterea in grosime a tumorii, dar nu a demonstrate nici o corelatie intre aceasta sensibilitate si evolutia clinica a tumorii. (Takahashi et al., 1991). Scopul lucarii: Scopul acestui studiu a fost de a utiliza analiza imagistica computerizata pentru a masura anticorpii PCNA si CD31 in tumorile melanice de la caine, de a aprecia

densitatea celulelor marcate de acesti anticorpi cu gradul de malignitate a acestori tumori, prin studiul comparativ dintre CD31, PCNA si aspectele microscopice. Materiale si metode: In perioada 2001-2010 in cadrul disciplinei de Anatomie patologica a USAMV-Cluj, au fost diagnosticati 9 caini cu melanom cutanat, 2 caini cu melanocitom cutanat si un melanom metastazat la nivel intesinal, in urma expresiei PCNA, si 10 din aceste probe au fost ulterior tratate cu marker-ul CD31 pentru studiul IHC comparativ. Probele au fost mai intai fixate in solutie de formol 10%, incorporate in parafina, dupa care s-au efectuat sectiuni de 4 µm care au fost colorate Hematoxilina eozina. Tehnicile de imunohistochimie au constat in: aplicarea anticorpului primar CD31 si vizualizarea acestei reactii prin utilizarea cromogenului DAB si a fosfatazei alcaline marcata cu un cromogen. Tehica de imunoflorescenta a inclus : aplicarea anticorpilor primari PCNA si vizualizarea reactiei cu ajutorul anticorpului secundar Rhodamine, conjugat cu fluorocrom. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microsopului (Olympus BX51). Rezultate : Studiul expresiei PCNA: Toate tumorile melanice de la caine au fost pozitive cu PCNA (Fig 2.E). Dupa clasificarea luiJohn toate cazurile au prezentat un grad redus al PCNA, iar 7 cazuri din 12 (58%) au fost pozitive dupa sistemul de calsificare al Proniewska. Melanoamele au avut nivele cuprinse intre 4.6% si 21.88%, in timp ce melanocitoamele au prezentat nivele cuprinse intre 9.8% si 10.5%. Valorile mari ale indicelui mitotic au corespuns unor procente mari de PCNA, astfel la un indice mitotic de 14, 53,14 au corespuns urmatoarele procente ale PCNAŞ 21.88%, 13.60%, 17.93%. Celulele fusiforme au prezentat indici mitotici cuprinsi intre 4.6% si 16.31 % (4.6%, 9.8%,10.5%, 16.31%), iar dupa sistemul lui Proniewska procentul de celule marcate pozitiv a fost de 50%.Celulele epiteloide au avut indici mitotici cuprinsi intre 8.5% si 21.88% (8.5%, 12.05%, 17.93%, 21.88%) , un procent de 75% din celule marcate pozitiv, dupa sistemul Proniewska. In cazul tumorilor mixte s-au obtinuti ndic mitotici cuprinsi intre 5.05% si 13.6% (5.05%, 6.7%, 13.6%), si un procent de 33.3% celule positive. Toate tumorile au fost incadrateca nivel 4 Clack. Nu s-a observant nici o relatie intre zonele de necroza, infiltratul limfocitar si PCNA. Studiul relatiei dintre PCNA si CD31: Toate cazurileau fost positive cu PCNA dar , doar 9 din 12 cazuri au fost positive cu marker-ul CD31. Procentul celulelor marcate de PCNA in cazul melanoamelor a fost de 4-6% pana la 21.88%, in timp ce numarul vaselor/camp microscopic a fost cuprins intre 2.8 si 7.2. Un melanocitom a prezentat 9.8% celule marcat cu PCNA si 5 vase/camp microscopic, in timp ce melanomul metastatic a prezentat 5.6% celule positive pentru PCNA si 12.05 vase/ camp microscopic. In amjoritatea cazurilor un rpocent ridicat de celule positive cu PCNA a fost corelat cu un numar mare de microvase/camp microspoci, astfel valorior de PCNA: 16.31%, 21.88%, 13.6%, 12.05%, 17.93% le-au corespuns urmatoarele valori

ale raportului microvase/camp microscopic: 4.2, 7.2, 6, 6.5, 5.66. Nu a existat nici o relatie intre PCNA, procentul suprafetei vasculare/suprafat totala, perimetrul si suprafata vasculara medie. Concluzii:

1. In majoritatea cazurilor un indice mitotic crescut a fost corelat cu valori mari ale PCNA.

2. Melanoamele au avut procente PCNA mult mai mari decat melaocitoamele. 3. Procente ridicate de PCNA au fost corelate cu un numar mare de

microvase/camp microscopic marcate de CD31. 4. Melanoamele au avut un numar mai mare de microvase/camp microscopic

decat melanocitoamele. 5. Markerii PCNA si CD31 au avut un rol foarte important in evaluarea

gradului de agresivitate a tumorilor. Concluzii generale:

1. Cresterea agresivitatii tumorilor s-a corelat cu reducerea infiltratului limfocitar si cu extinderea zonelor de necroza.

2. Indicele mitotic determinat in cazul melanoamelor este mult mai crescut decat cel al melanocitoamelor la caine si cal.

3. Celulele tumorilor melanice sunt mai intens colorate de marker-ul Vimentina in comparatie ci S100 si Melan-A.

4. S-a mai observat o crestere a densitatii microvaselor intratumorale in tumorile

maligne fata de cele benigne. 5. Melanoamele au avut procente PCNA mult mai mari decat melaocitoamele. 6. Procente ridicate de PCNA au fost corelate cu un numar mare de

microvase/camp microscopic marcate de CD31. 7. Markerii PCNA si CD31 au avut un rol foarte important in evaluarea gradului

de agresivitate a tumorilor.

B A

C D

E

Figura 2. Câine. Melanom. Imunohistochimia. Numeroase celule pozitive pentru S100 (A), Melan-A (săgeată neagră). (B), Vimentină (C), coloraţie difuză, nuclei parCelule endoteliale pozitive pentru CD31(săgeată neagră). Coloraţie DAB, fosfatazşi Hematoxilină Mayer’s. (400X). E. imunofluorescenţă. Nuclee de celulepentru PCNA (săgeată albă) Rhodamine 600x.

Figure 2. Dog. Melanoma. Immunohistochemistry. Numerous melanoma cells are positive for S100 (A), Melan-A (black arrow) (B), Vimentin (C), with a diffusion pattern of staining, mixed visible and invisible stain of nuclei with these markers. D. Endothelial cells of vessels are positive for CD31 (Black arrow). DAB stain and Alkaline phosphatase stain with Mayer’s Hematoxylin counterstain. (400x) E. Immunofluorescence. Nuclei of cells are positive for PCNA, (white arrow), Rhodamine 600x.

Numeroase celule pozitive pentru S100 (A), ă, nuclei parţial marcaţi. D. ţie DAB, fosfatază alcalină

. Nuclee de celule sunt pozitive

Dog. Melanoma. Immunohistochemistry. Numerous melanoma cells are positive Vimentin (C), with a diffusion pattern of staining,

D. Endothelial cells of positive for CD31 (Black arrow). DAB stain and Alkaline phosphatase stain

terstain. (400x) E. Immunofluorescence. Nuclei of cells are