DETERMINANȚI FIZICI AI

ACTIVITĂȚII PEPTIDELOR

CITOTOXICE ÎN SISTEME

LIPIDICE RECONSTITUITE

Coordonator, Doctorand,

Prof. Dr. Tudor LUCHIAN Sorana Elena IFTEMI

- 2015 –

UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA” din IAŞI

ŞCOALA DOCTORALĂ A FACULTĂŢII DE FIZICĂ

UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA” DIN IAȘI

Școala Doctorală a Facultății de Fizică

Vă facem cunoscut că în data de 30 septembrie 2015, ora

10:00, în sala de conferințe „FERDINAND”, domna Sorana IFTEMI,

va susține în ședință publică teza de doctorat:

„Determinanți fizici ai activității peptidelor citotoxice în sisteme

lipidice reconstituite”

în vederea obținerii titlului științific de doctor în domeniul fundamental

Științe Exacte, domeniul Fizică.

Comisia de examinare a tezei:

Prof. Dr. Diana MARDARE Preşedinte

Directorul Şcolii Doctorale de

Fizică

Universitatea “Alexandru Ioan

Cuza”, Iaşi

Prof. Dr. Tudor LUCHIAN Coordonator ştiinţific

Facultatea de Fizică

Universitatea “Alexandru Ioan

Cuza”, Iaşi

Prof. Dr. Nicoleta DUMITRAŞCU Referent

Facultatea de Fizică

Universitatea “Alexandru Ioan

Cuza”, Iaşi

Prof. Univ. Dr. Leontin DAVID Referent

Universitatea Babeș Bolyai,

Facultatea de Fizică, Cluj-

Napoca

Conf. Dr. Dragoş GRIGORIU Referent

Universitatea de Medicină şi

Farmacie

„Gr. T. Popa”, Iaşi

Vă invităm pe această cale să participați la ședința publică a tezei.

1

CUPRINS

I. Motivaţia studiului interacţiunii dintre peptide

membranar active și sisteme

lipo-proteice....................................................................3

II. Peptidele membranar active și interacțiunea lor cu

membranele lipidice artificiale

1. Caracteristici structurale și funcționale ale membranelor

lipidice artificiale.............................................................5

2. Caracteristici generale ale peptidelor membranar

active................................................................................9

3. Mecanismele de destabilizare a membranelor lipidice

artificiale de către peptidele membranar active

....................................................................................... 13

4. Influența nepotrivirii hidrofobe dintre peptide și

bistraturi lipidice planare asupra formării porilor

transmembranari.............................................................16

III. Rolul peptidelor amiloid β în neurofiziologia

sistemului nervos uman

1. Caracteristici generale ale peptidelor amiloid

β.....................................................................................18

2. Implicarea peptidelor amiloid β în apariția și progresul

bolilor

neurodegenerative..........................................................20

3. Efectul metalelor de tranziție asupra conformației

peptidelor amiloidice......................................................23

2

IV. Detalii structurale și funcționale ale peptidelor

utilizate în cadrul studiilor experimentale desfășurate

1. Particularități ale peptidei antimicrobiene trichogin

GAIV.............................................................................35

2. Particularități ale fragmentului 1-16 al peptidei amiloid β

secretată de organismul uman și

murin............................................................................. 40

3. Particularități ale mutanților Aβ1, Aβ4H13dH

,

Aβ5H6dH

..........................................................................43

V. Tehnici și metode de investigație a interacțiunilor

dintre peptide membranar active și sisteme lipo-

proteice

1. Metoda Montal-Mueller de realizare a membranelor

lipidice artificiale...........................................................46

2. Înregistrări electrofiziologice la nivel de “singură

moleculă” ale curentului ionic mediat de pori

membranari……………………………………………48

3. Utilizarea porului proteic de α-hemolizină ca nanosenzor

în studiul interacțiunilor peptide – substrat

metalic…………………………………………………50

4. Analiza statistică a cineticii de interacțiune dintre peptide

și un singur por proteic de α-

hemolizină......................................................................52

VI. Rezultate experimentale și concluzii

VI.1. Studiul activității membranare a peptidei

antimicrobiene trichogin GAIV....................................57

3

1.1. Nepotrivirea hidrofobă dintre peptida trichogin

GAIV și bistraturi lipidice

planare..................................................................57

1.2. Modelul matematic utilizat pentru determinarea

numarului minim de monomeri necesari formării

unui por

transmembranar....................................................66

VI.2. Investigații la nivel de “singură moleculă” ale

interacțiunii dintre peptida Aβ(1-16) de origine umană și

metale de tranziție …………………………………….70

1.3. Utilizarea nanoporului de α-hemolizină ca detector

molecular al modificărilor induse de ionii metalici

(Cu2+

, Fe2+

, Zn3+

, Al3+

) în conformația peptidei

Aβ(1-16) de origine

umană................................................................... 71

1.4. Studiu comparativ al peptidelor Aβ(1-16) de origine

umană și Aβ(1-16) de origine murină în interacțiunea

cu ionii de

Cu2+

.......................................................................83

VI.3. Utilizarea porului proteic de α-hemolizină în

detecția interacțiunilor stereoselective dintre Cu2+

și

enantiomerul aminoacidului histidină........................105

1.5. Investigarea la nivel de “singură moleculă” a

schimbărilor conformaționale ale mutanților Aβ1,

Aβ4H13dH

, Aβ5H6dH

în urma interacțiunii cu ionii de

Cu2+

.....................................................................105

1.6. Determinarea constantelor de reacție și a

constantelor de disociere ...................................118

Referințe.............................................................................130

4

I. Motivaţia studiului interacţiunii dintre peptide

membranar active și sisteme lipo-proteice

Peptidele membranar active sunt implicate în apărarea

imună împotriva infecţiilor microbiene, acestea fiind prezente de

la plante şi insecte până la vertebratele superioare. Aceste

peptide naturale conţin în structura bazică 12-50 de aminoacizi,

existând astăzi în bazele de date peste 800 de asemenea

compuşi. Aceste peptide se pot ataşa şi insera în membranele

lipidice formând pori, datorită compoziţiei lor în aminoacizi,

amfipaticităţii, încărcărcării cationice şi dimensiunii lor1,2

.

II. Peptidele membranar active și interacțiunea lor cu

membranele lipidice artificiale

II.1. Caracteristici structurale și funcționale ale

membranelor lipidice artificiale

Membranele celulelor biologice sunt structuri cu rolul de

izolare a celulei de către mediul înconjurător, menţinând

diferenţe esenţiale între compoziţia mediului intracelular şi cel

extracelular. Membrana celulară controlează procesele de intrare

a nutrienţilor în celulă precum şi cele de eliminare a produşilor

neutilizabili, generează diferenţe de concentraţii ionice între

mediul extern şi intern al celulei şi participă în procesele de

comunicare celulară acţionând ca un senzor al semnalelor

celulare externe3.

5

II.2. Caracteristici generale ale peptidelor membranar

active

Peptidele membranar active sunt structuri bazice compuse

din 12-50 de aminoacizi.

Caracteristicile structurale importante ale peptidelor

membranar active sunt: sarcina electrică netă, helicitatea,

hidrofobicitatea intrinsecă, momentul hidrofob şi mărimea

domeniilor polare respectiv hidrofobe asupra efectului de

permeabilizare a membranelor.

II.3. Mecanismele de destabilizare a membranelor lipidice

artificiale de către peptidele membranar active

Peptidele prezente în soluţie sunt în general împachetate

aleatoriu, acestea se absorb la interfaţa lipide/mediu apos formând

structuri de α-helix. În momentul în care se atinge o concentraţie

critică a peptidelor absorbite, acestea se inseră în bistrat formând

pori tranzienţi care conduc la scurgerea materialului intracelular şi

în final la moartea celulei4. Figura II.3.1 redă o reprezentare

schematică a acestui mecanism.

Figura II.3.1. Reprezentare schematică a etapelor de interacţiune dintre

peptide şi bistratul lipidic membranar. Cu roşu sunt reprezentate peptidele cu

structură secundară de α-helix (adaptare după [5]).

6

Până în prezent s-au descoperit şi caracterizat două tipuri

de pori transmembranari: porii clasici şi porii toroidali. Porii

clasici denumiţi şi „barrel-stave” au interiorul constituit doar din

părţile polare ale peptidelor, iar în cazul porilor toroidali, structura

interioară conţine şi capete polare ale lipidelor ce intră în

compoziţia membranei lipidice.

Figura II.3.2. Schema reprezentativă a modelelor de pori

transmembranari, modelul porilor clasici (A) şi modelul porilor toroidali (B)

(adaptare după http://hwhuang.rice.edu/).

III. Rolul peptidelor amiloid β în neurofiziologia

sistemului nervos uman

III.2. Implicarea peptidelor amiloid β în apariția și

progresul bolilor neurodegenerative

Împachetarea greşită a peptidelor amiloid-β conduce la

alterarea funcţiilor, astfel acestea interacţionează între ele sau cu

alţi compuşi formând structuri insolubile cu aspect fibrilar. Astfel

de structuri au fost asociate cu patologia a mai multor afecţiuni

umane. Acumulările în cantităţi anormale ale peptidelor

amiloidice sub formă fibrilară conduc la amiloidoză.

7

Aceste acumulări fibrilare de proteine amiloidice joacă un rol

important în apariţia bolilor neurdegenerative cum ar fi boala

Alzheimer, Parkinson, diabetul de tipul II ş.a.m.d.

În boala Alzheimer, proteinele tau sunt anormale,

microtubulii fiind afectaţi, astfel neuronii nu mai pot funcționa

normal (figura III.2.2).

Figura III.2.2. Reprezentarea schematică a neuronului sănătos (stânga sus) şi a

neuronului afectat de boala Alzeimer (stânga jos) [adaptare după

https://arcpointelkgrovevillage.wordpress.com].

8

III.3. Efectul metalelor de tranziție asupra conformației

peptidelor amiloidice

Studiile anterioare au arătat faptul că inducerea bolilor

neurodegenerative de către peptidele amiloid-β constă în formarea

de canale ionice de către oligomerii amiloidici5.

Una dintre ipotezele existente care încearcă să explice

apariţia bolilor neurodegenerative, pune accent pe acumulările

anormale de metale cum ar fi Cu2+

, Zn2+

, Fe3+

, Al3+

la nivel

neuronal, care conduc la apariţia agregatelor proteice toxice6,7

.

IV. Detalii structurale și funcționale ale peptidelor

utilizate în cadrul studiilor experimentale

desfășurate

IV.1. Particularități ale peptidei antimicrobiene trichogin

GAIV

Trichogin GAIV reprezintă componenta principală a

familiei lipopetaibol și a fost izolată din Trichoderma

longibrachiatum.

Peptida trichogin GA IV are în structura sa 11 aminoacizi,

secvența primară fiind următoarea: Oct-Aib1-Gly

2-Leu

3-Aib

4-

Gly5-Gly

6-Leu

7-Aib

8-Gly

9-Ile

10-Lol

11, unde Oct este n-octanoil și

Lol este leucinol.

Studii anterioare au arătat că peptida trichogin GAIV, la

fel ca și peptida alameticină (Alm) care face parte din aceeași

familie, formează pori clasici („barrel-stave”)8.

Se presupune că prezența lanțului acil la capătul N-terminal

joacă un rol esențial în activitatea sa9.

9

IV.2. Particularități ale fragmentului 1-16 al peptidei

amiloid β secretată de organismul uman

În experimentele efectuate în cadrul acestui studiu, am

utilizat fragmentul peptidic Aβ(1-16) de origine umană, a cărei

secvență de aminoacizi este următoarea:

Asp1-Ala

2-Glu

3-Phe

4-Arg

5-His

6-Asp

7-Ser

8-Gly

9-Tyr

10-Glu

11-

Val12

-His13

-His14

-Gln15

-Lys16

Figura IV.2.1. Structura secundară idealizată a fragmentului peptidic Aβ(1-16)

de origine umană [modelat în programul HyperChem].

V. Tehnici și metode de investigație a interacțiunilor

dintre peptide membranar active și sisteme lipo-

proteice

V.1. Metoda Montal-Mueller de realizare a membranelor

lipidice artificiale

Pentru realizarea bistraturilor lipidice artificiale în cadrul

experimentelor, am utilizat metoda Montal-Mueller3.

În figura V.1.1 Este reprezentată metoda Montal-Mueller

de realizare a bistraturilor lipidice.

10

Figura V.1.1. Metoda Montal-Mueller de realizare a bistraturilor lipidice

artificiale. (a) se adaugă soluție electrofiziologică, nivelul acesteia fiind sub

orificiul foliei de teflon ce desparte cele două cavități ale cuvei; (b) se adaugă

lipide în ambele cavități ale cuvei și se așteaptă câteva minute; (c) și (d) se

adaugă soluție electrofiziologică astfel încât se ridică nivelul soluției în cuvă;

(e) se formează bistratul lipidic artificial la nivelul aperturii foliei de teflon care

a fost tratată anterior cu o soluție de hexadecan-pentan (10%, v/v) pentru a

mări gradul de hidrofobicitate a foliei de teflon [10].

VI. Rezultate experimentale

VI.1. Studiul activității membranare a peptidei

antimicrobiene trichogin GAIV

În cadrul acestor experimente am utilizat tehnici de

electrofiziologie la nivel de „singură moleculă” pentru a elucida

mecanismul de interacțiune a peptidei trichogin GAIV cu

membrana lipidică planară formată din lipide zwitterionice.

VI.1.1. Nepotrivirea hidrofobă dintre peptida trichogin

GAIV și bistraturi lipidice planare

În figura VI.1.1.1 sunt reprezentate fluctuațiile de curent

ionic datorate activității peptidei trichogin GAIV în bistratul

lipidic, la variații de diferențe de potențial, arătându-se

schimbările reversibile ale conductanței membranei din starea

11

„închis”, notată cu C (closed) în diferite stări conductive notate cu

O1 și O2 (O - open).

Figura VI.1.1.1. (a) Fluctuații de curent ionic înregistrate în urma adăugării a 5

µM de peptidă trichogin GAIV în partea cis a membranei lipidice. Diagrame a

dependenței de diferența de potențial a curentului ionic pentru prima stare

conductivă O1 (b) și a doua stare conductivă O2 (c) arătând comportamentul

ohmic a astfel de canale [11].

12

Concluzii

În urma analizelor uni-moleculare a înregistrărilor

electrice asociate activității membranare a peptidei trichogin GA

IV, am observat existența unei prime stări conductive, notată cu

O1, valoarea dublă a amplitudinii pentru cea de a doua stare

conductivă O2, reflectă apariţia concomitentă a doi pori formaţi de

peptida trichogin GA IV.

Numărul minim de monomeri de trichogin GA IV necesari

formării unui singur canal ionic este N=3.

Spre deosebire de alte peptide (spre exemplu alameticina),

activitatea peptidei trichogin GA IV este vizibilă atât la aplicarea

de potenţial pozitiv cât şi la aplicarea de potenţial negativ.

Activitatea electrică a porilor formați de către peptida

trichogin Ga IV este dependentă de diferența de potențial, în

sensul că densitatea de putere a fluctuaţiilor de curent electric

induse în membrana reconstituită este corelată cantitativ cu

valoarea tensiunii aplicate.

VI.2. Investigații la nivel de “singură moleculă” ale

interacțiunii dintre peptida Aβ(1-16) de origine

umană și metale de tranziție

VI.2.1. Utilizarea nanoporului de α-hemolizină ca detector

molecular al modificărilor induse de ionii metalici

(Cu2+

, Fe2+

, Zn3+

, Al3+

) în conformația peptidei Aβ(1-16)

de origine umană.

În cadrul acestui experiment, am utilizat porul proteic de α-

HL ca detector molecular pentru a investiga modificările

13

conformaționale ale fragmentului peptidic Aβ(1-16) de origine

umană, în urma interacțiunii acestuia cu diferiți ioni metalici:

Cu2+

, Fe2+

, Zn3+

, Al3+

.

Rezultate experimentale și discuții

În primul set de experimente am investigat la nivel

unimolecular interacțiunile dintre peptida Aβ(1-16) de origine

umană și porul proteic de α-HL, în absența si în prezenta ionilor

metalici.

După inserția unui singur por de α-HL, aplicând mai apoi o

diferențe de potențial negativă, este facilitat transportul

electroforetic al peptidei Aβ(1-16) prin porul proteic, interacțiunile

dintre peptidă și por fiind observate prin fluctuațiile de curent

ionic induse de blocajul porului proteic de către peptidă.

Adăugarea în sistem a ionilor de Cu2+

, Zn2+

, Fe3+

și Al3+

,

conduce la modificări ale cineticii evenimentelor de blocaj ale

porului de către peptidă, în comparație cu cinetica evenimentelor

de blocaj ale porului în absența ionilor metalici (figura VI.2.1.2,

panelul b-d).

Am observat că intervalul de timp corespunzător

evenimentelor de blocaj al porului de către o singură peptidă (τoff)

(figura VI.2.1.4, panelul a) și valorile timpilor dintre două

evenimente consecutive de blocaj al porului de către peptidă (τon)

(figura VI.2.1.4, panelul b), cresc odată cu creșterea concentrației

de ioni metalici în cazul ionilor Cu2+

și Zn2+

. În schimb, în cazul

ionilor de Fe3+

și Al3+

nu se observă schimbări relevante ai acestor

timpi.

14

Figura VI.2.1.2. Reprezentări ale fluctuațiilor de curent ionic datorate

interacțiunii reversibile a peptidei Aβ(1-16) cu porul de α-HL în absența de ioni

metalici (a) și prezența de ioni de Cu2+

(b), Zn2+

(c), Fe3+

(d) și Al3+

(e) [12].

Figura VI.2.1.4. Reprezentarea timpilor τoff și τon funcție de concentrația de

metale adăugată în sistem. [13].

Concluzii

Rezultatele obținute în cadrul acestor experimente,

demonstrează potențialul analizei cinetice la nivel de „singură

moleculă” a interacțiunilor dintre peptida Aβ și ionii metalici,

15

bazate pe analiza curentului ionic prin porul proteic de α-HL

inserat în bistratul lipidic, datorat interacțiunii dintre peptida

liberă sau peptida complexată cu porul proteic. Din analiza timpilor de blocaj al porului de către peptidă

(τoff) și a intervalelor de timp dintre evenimentele consecutive de

blocaj (τon), în prezența ionilor metalici (Cu2+

și Zn2+

) care au o

afinitate ridicată pentru peptide, a fost posibilă cuantificarea

constantelor de disociere corespunzătoare interacțiunii dintre

peptide și ionii de Cu2+

, respectiv ionii de Zn2+

.

VI.2.2. Studiu comparativ al peptidelor Aβ(1-16) de origine

umană și Aβ(1-16) de origine murină în interacțiunea

cu ionii de Cu2+

În acest studiu am învestigat interacțiunile la nivel de

„singură moleculă” între fragmentul peptidic Aβ(1-16) de origine

umană (Aβ(1-16)uman) și Aβ(1-16) de origine murină (Aβ(1-16)murin) cu

ionii de Cu2+

, prin intermediul unui singur por proteic de α-HL,

inserat în bistratul lipidic artificial, despre care se știe că

facilitează transportul controlat al peptidelor și ionilor de-a lungul

membranei lipidice.

Rezultate experimentale

La adăugarea de peptidă în partea trans a membranei

lipidice, în care a fost inserat anterior un por proteic de α-HL și la

aplicarea unei diferențe de potențial, aceasta se deplasează

electroforetic prin porul proteic inducând blocaje reversibile ale

porului, a căror fluctuații de curent ionic au anumite valori ale

amplitudinii.

16

Analiza cinetică a evenimentelor de blocaj al porului de

către peptidă, a arătat că intervalul de timp mediu dintre două

evenimente de blocaj consecutive (τon) corespunzătoare

interacțiunilor dintre peptida liberă cu porul de α-HL sau peptida

complexată cu porul proteic (figura VI.2.2.1), precum și timpul

mediu de rezidență a peptidei în porul proteic (τoff), cresc odată cu

creșterea concentrației de ioni de Cu2+ adăugată în sistem (în

partea trans a membranei lipidice).

Figura VI.2.2.1. Fluctuații de curent ionic datorate interacțiunii dintre peptida

Aβ(1-16)uman și porul proteic de α-HL în absența (panelul a) și în prezența ionilor

de Cu2+

(panelul b-d) [13].

Din datele obținute din experimentele de control, în care s-

au urmărit interacțiunile dintre peptida liberă și porul proteic, a

fost posibilă reprezentarea timpilor (τon) și (τoff) în funcție de

diferența de potențial aplicată.

17

Figura VI.2.2.4. Reprezentarea ratelor rateon și rateoff funcție de concentrația

de peptidă Aβ(1-16) de origine umană și murină[13].

În contrast cu datele experimentale obținute în

experimentele cu peptida Aβ(1-16)uman (figura VI.2.2.1), o creștere a

concentrației de ioni de Cu2+

adăugată în partea trans a bistratului

lipidic, conduce la o frecvență mai mare a evenimentelor de

blocaj, asociate cu interacțiunea peptidei Aβ(1-16) de origine

murină cu lumenul porului proteic.

Concluzii

Constanta ratei de asociere pentru peptida Aβ(1-16)murin

necomplexată are o valoare aproape dublă în comparație cu

peptida Aβ(1-16)uman necomplexată, această diferență fiind datorată

18

orientării preferențiale ale peptidelor de origine murină și umană

în interacțiunea cu porul proteic de α-HL.

Din datele experimentale obținute aici este clar faptul că

ionii de Cu2+

influențează mai mult interacțiunile dintre peptida

Aβ(1-16)uman cu porul proteic de α-HL, în comparație cu peptida

Aβ(1-16)murin.

În studiile de față am pus în evidență potențialul utilizării

porului proteic de α-HL ca detector molecular al modificărilor

induse de către diferiți ioni metalici în conformația fragmentelor

amiloidice.

Folosind astfel de peptide specifice, rezultatele din aceste

experimente pot contribui la dezvoltarea unei metode ușoare de

detecție și recunoaștere a ionilor sau ale moleculelor de

dimensiune mică (spre exemplu inhibitori ai oligomerizării

peptidei Aβ) utilizând nanopori proteici.

VI.3. Utilizarea porului proteic de α-hemolizină în

detecția interacțiunilor stereoselective dintre Cu2+

și enantiomerul aminoacidului histidină

VI.3.1. Investigarea la nivel de “singură moleculă” a

schimbărilor conformaționale ale mutanților Aβ1,

Aβ4H13dH

, Aβ5H6dH

în urma interacțiunii cu ionii de

Cu2+

În cadrul acestor experimente am utilizat porul proteic de

α-HL ca nanosenzor în detecția interacțiunii dintre mutanții

peptidelor amiloidice și ionii de Cu2+

, pentru a investiga efectul

pe care il au ionii de Cu2+

în urma formării situsurilor de legătură

cu aminoacizii de L,D-histidină din secvența peptidelor.

19

Adăugarea de peptide în sistem conduce la blocaje de

curent ionic ale porului proteic, determinarea valorilor curentului

ionic fiind posibilă în urma analizei amplitudinii curenului ionic

datorat interacțiunii peptidelor cu porul proteic.

Prin analiza valorilor medii ale timpului τon (care

reprezintă intervalul de timp dintre două evenimente consecutive

de blocaj al curentului ionic, datorat interacțiunii peptidei cu porul

proteic) și τoff (care este timpul de rezidență a peptidei în porul

proteic), se pot determina valorile ratei de asociere (rateON) și a

ratei de disociere (rateOFF) (figura VI.3.2) care descriu

interacțiunile reversibile dintre peptide și porul proteic.

Figura VI.3.1 Fluctuații de curent ionic datorate interacțiunii peptidelor Aβ1,

Aβ4H13dH

și Aβ5H6dH

în absența (panelul a,e,i) și în prezența ionilor de Cu2+

la

diferite concentrații adăugate în partea trans a membranei lipidice, la o

diferență de potențial aplicată de -70 mV [14].

20

Modificările induse de către ionii de Cu2+

asupra activității

peptidei sunt reversibile, acest fapt fiind observat din activitatea

peptidei care, la adăugarea de EDTA în partea trans a membranei

lipidice, în prezența ionilor de cupru, este similară cu activitatea

în cazul în care evenimentele erau datorate interacțiunii peptidei

cu porul proteic, în lipsa ionilor de cupru.

Figura VI.3.2. Reprezentarea dependenței ratei de asociere rateON și a ratei de

disociere rateOFF funcție de concentrația de peptidă utilizată (Aβ1, Aβ4H13dH

,

Aβ5H6dH

) [14].

Concluzii

Acest studiu este primul raport în care s-a demonstrat

faptul că nanoporul proteic servește drept senzor la nivel de

„singură moleculă” ce detectează afinitatea metalelor la diferite

medii chirale, date de enantiomerii aminoacizilor.

Orientarea inelelor de L,D-imidazol și coordonarea

legăturilor de către metale induc o schimbare conformațională a

21

peptidelor în urma interacțiunii cu metalele, fiind alterată

afinitatea peptidelor pentru porul de α-HL.

Afinitatea ionilor de Cu2+

pentru peptidele testate, este mai

mare atunci când enantionerul L-His este înlocuit cu D-His, acest

efect fiind mai mare atunci când modificările au loc la

aminoacidul His din poziția 6.

Datele prezentate subliniază potențialul porului de α-HL

de a diferenția peptide cu compoziție chimică identică, a căror

situsuri de legături conțin enantiomeri de aminoacizi în diferite

poziții în structura primară, prin analiza cinetică a evenimentelor

de blocaj a peptidelor cu porul de α-HL.

Prezența ionilor metalici se poate observa prin detecția

schimbărilor conformaționale ale peptidelor induse de către

metale, în interacțiunea cu porul de α-HL.

22

Bibliografie selectivă

[1] J. I. Kourie et al, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000, 278,

1063-1087.

[2] M. S. P. Sansom et al., Eur. Biophys. J. 1991, 20, 229-240.

[3] T. Luchian, Electrofiziologie moleculară. Teorie și

aplicații, Ed. Sedcom Libris, 2006, Iași.

[4] S. K. Kandasamy et al., Chemistry and Physics of Lipids.

2004, 132, 113-132.

[5] R. Capone et al., Neurotox Res. 2009, 16, 1-13.

[6] D. H. O'Day, M. A. Myre, Biochem Biophys Res Commun.

2004, 320, 1051-1054.

[7] A. I. Bush, R.E. Tanzi, Neurotherapeutics 2008, 5, 421-

432.

[8] M. S. P. Sansom, Eur. Biophys. J. 1993, 22, 105-124.

[9] C. Toniolo et al., Cell. Mol. Life Sci. 2001, 58, 1179-1188. [10] T. Gutsmann, et al., Nature Protocols. 2015, 10, 188–198. [11] S. Iftemi et al., Chemistry&Biodiversity, 2014, 11, 1069-

1077. [12] A. Asandei et al., J. Membrane Biol. 2014, 247, 523-530. [13] A. Asandei et al., Langmuir 2013, 29, 15634–15642. [14] I. Schiopu et al., Langmuir. 2015, 31, 387-396.