TESTELE DE HISTOCOMPATIBILITATE

TRANSPLANTUL= Actul de a transfera celule, tesuturi sau organe dintr-o parte in alta, fie de la acelasi individ, fie intre indivizi diferitiTipuri:Autogrefa= transplantul de tesuturi proprii dintr-o parte in alta a aceluiasi individAlogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor genetic diferit de acceptor, dar care apartine aceleiasi speciiXenogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor care apartine unei alte specii

ISTORICSecolul II: India, autogrefa, piele, rinoplastieSecolul III (??):Inlocuirea membrului inferior gangrenos al imparatului Iustinian cu cel al unui cadavru1959:Boston, rinichi, gemeni bizigoti1967:Denver, ficat1968:Cape Town, inima; Minneapolis, maduva hematopoetica

CONDITII TRANSPLANTCompatibilitate AB0Identitate HLA cat mai mareAbsenta in serul pacientului a unor Ac anti-donorStimulare slaba la reactia mixta limfocitara

COMPATIBILITATE AB0Incompatibilitate minora:Donorul are Ac (aglutinine)Exemplu: donor 0 si primitor A/B/ABIncompatibilitate majora:Donorul are AgExemplu: donor A/B/AB si primitor 0Incompatibilitate minora si majoraExemplu: donor A/B si primitor B/ANu este esentialaObiectiv: prevenirea hemolizei post-transplant

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE= MHCLa om HLA (human leucocyte antigen)Grup inrudit de gene pe cromozomul 6Roluri:Imunitate celularaImunitate umoralaMecanisme de recunoastere intercelularaDiscriminare self / nonself

ORGANIZAREA HLA3 clase HLA:Clasa I: Glicoproteine membranare~ Celule nucleatePrezentarea Ag peptidice endogene LT citotoxiceClasa II:Glicoproteine membranareCPAPrezentarea Ag exogene LT helperClasa III:Proteine cu functie in imunitate

GENELE HLA

POLIMORFISM GENICClasa I:HLA A 451 aleleHLA B 782 aleleHLA C 238 aleleClasa II:HLA DR 525 aleleHLA DQ 105 aleleHLA DP 147 alele(HLA DM 11 alele)(HLA DO 21 alele)

CONDITII PENTRU COMPATIBILITATESe testeaza cel putin 3 locusuri: HLA-AHLA-BHLA-DRB16 Ag4 identice

CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE

TESTE DE HISTOCOMPATIBILITATEMoleculare

Serologice

Celulare

METODE MOLECULARELeucocite din sangeExtractia ADN-ului Amplificarea genelor HLA:PCR-SSPPCR-SSOPSBTInterpretarea rezultatelor

PCR-SSPPCR-SSP (Sequence Specific Primers)Pentru HLA clasa I si IIAmplificarea genelor HLA utilizand primeri:Rezolutie mica se amplifica grupuri de aleleRezolutie inalta se amplifica alele specificeElectroforeza pe gel de agaroza a produsilor de amplificare:Deplasare in functie de dimensiuniComparare cu markerCitirea si interpretarea rezultatelor:Apare banda specifica doar daca exista alela

PCR-SSP

PCR-SSOPPCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes)Amplificarea intregului exonHibridizarea produsului de amplificare cu secventa complementaraVizualizarea strip-urilor cu benziInterpretarea computerizataRezolutie scazuta

PCR-SSOP

SBTSBT (Sequence Based Typing)Rezolutie maximaAmplificarea genei de interesSecventializareConfruntare cu baza de date alele compatibileDetectarea unor alele noi

SBT

METODE SEROLOGICEUtilizeaza seruri cu concentratii mari de Ac anti-HLA specificiFemei multipareLichid placentarPacienti cu transplante de organ sau transfuzii multipleAc monoclonali

METODA DE LUCRUSepararea limfocitelor prin centrifugare in gradient de densitateSer cu Ac anti-HLA in godeuriSe adauga suspensie limfocitara in fiecare godeu (complexe Ag-Ac)Se adauga complement (ser de iepure)Daca s-au format complexe se activeaza complementul liza osmotica a celulelorSe adauga colorant vital (eozina)Se citeste la microscop cu contrast de faza

INTERPRETAREA REZULTATELORLimfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractileLimfocite moarte: umflate, rosu inchisPentru fiecare godeu: % limfocite moarteMartor negativ:

INTERPRETAREA REZULTATELORIdentificarea serurilor care au reactionat cu suspensia limfocitaraToate serurile cu specificitatea respectiva trebuie sa dea reactie pozitiva (>50% limfocite moarte)

TIPIZARE HLA-AInterpretare: fenotip HLA A28, A3

TIPIZARE HLA-B

SCREENING PENTRU ANTICORPI ANTI-HLADetectarea Ac anti-HLA din sangele primitoruluiMetoda de lucru:Suspensie de leucocite cu HLA cunoscut in godeuriSe adauga ser de la primitor (complexe Ag-Ac)Se adauga Ac anti-FcSe adauga complement (ser de iepure)Daca s-au format complexe se activeaza complementul liza osmotica a celulelorSe adauga eozina si se citeste la microscop

INTERPRETAREA REZULTATELORLimfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractileLimfocite moarte: umflate, rosu inchisPentru fiecare godeu: % limfocite moarteAc anti-HLA probabilitatea de a gasi un donator compatibil

REACTIA MIXTA LIMFOCITARAMLR (Mixed Lymphocyte Reaction)LT ale unei persoane (P1) raspund la Ag HLA de pe limfocitele unei alte persoane (P2)Stimulare Ag proliferare limfocitara (sinteza crescuta de ADN)Unidirectionala: se blocheaza proliferarea limfocitelor P2 si se analizeaza proliferarea limfocitelor P1Bidirectionala: P1 si P2 se stimuleaza reciproc si se insumeaza raspunsurile

TESTUL DE LIMFOTOXICITATE MEDIATA CELULARSe realizeaza o reactie mixta unidirectionala populatie de limfocite citotoxice activate (P1) impotriva limfocitelor P2P1 se pune in contact cu limfocite P2 marcate cu 51CrSe masoara 51Cr eliberat (comparativ cu celule 51Cr nespecifice de la o alta persoana)~Simulare transplant

PROBLEME LEGATE DE HLARejetul transplantului din cauza LT ale primitorului care recunosc HLA necompatibileFactori care influenteaza rejetul:Sarcina, transfuziiIncompatibilitate HLATerapie pre-transplant mai putin agresivaTerapie imunosupresoare post-transplant suboptimalaDepletia LT din grefele de maduva osoasaClasa I tolerarea grefeiClasa II GVHD

REACTIA GREFA CONTRA GAZDAGVHD (Graft Versus Host Disease)= transplantarea de tesuturi imunocompetente (celule stem hematopoetice), necompatibile cu tesuturile primitorului in gazde imunodeprimate patologic sau farmacologic (medicatie imunosupresoare)Celulele imune din grefa recunosc moleculele HLA ale gazdei ca fiind straine raspuns imun impotriva celulelor gazdei

REACTIA GREFA CONTRA GAZDAGVHD acut:100 zile post-transplantPiele, mucoase, plamani, ficat, tract gastro-intestinal, glande exocrine, tesut conjunctivCorticoterapie

GVHD ACUTEritem palmar

GVHD ACUTUlceratii ale mucoasei bucale

GVHD ACUTDegenarea stratului bazal, keratinocite necrozate

GVHD CRONICPapule confluente hiperpigmentate

GVHD CRONICPlaci sclerotice hiperpigmentate

GVHD CRONICModificari lichenoide difuze ale buzelor

GVHD CRONICHiperkeratoza, hipergranuloza, acantoza, degenerarea stratului bazal