TESTE CARE UTILIZEAZA TESTE CARE UTILIZEAZA VIZUALIZAREA VIZUALIZAREA

COMPLEXELOR ANTIGEN-COMPLEXELOR ANTIGEN-ANTICORP PRIN ARTIFICII ANTICORP PRIN ARTIFICII

TEHNICETEHNICE

Marirea sensibilitatii reactiei Ag-Ac se Marirea sensibilitatii reactiei Ag-Ac se poate face prin legarea unui marker poate face prin legarea unui marker usor de identificat de complexul Ag-usor de identificat de complexul Ag-

Ac format, marker care nu Ac format, marker care nu interfereaza cu proprietatile interfereaza cu proprietatile imunologice ale reactantilor.imunologice ale reactantilor.

TESTE CARE UTILIZEAZA VIZUALIZAREA COMPLEXELOR TESTE CARE UTILIZEAZA VIZUALIZAREA COMPLEXELOR ANTIGEN-ANTICORP PRIN ARTIFICII TEHNICEANTIGEN-ANTICORP PRIN ARTIFICII TEHNICE

Markeri pot fi:Markeri pot fi: -o substanta fluorescenta ( izotiocianat de -o substanta fluorescenta ( izotiocianat de

fluoresceina, rodamina) in tehnica de fluoresceina, rodamina) in tehnica de imunofluorescenta IFimunofluorescenta IF

- un izotop radioactiv ( I125 ) in tehnica - un izotop radioactiv ( I125 ) in tehnica radioimunotestarii RIAradioimunotestarii RIA

-o enzima ( peroxidaza din hrean, beta--o enzima ( peroxidaza din hrean, beta-galactozidaza, fosfataza alcalina) in testele galactozidaza, fosfataza alcalina) in testele imunoenzimatice ELISA.imunoenzimatice ELISA.

-teste imunochimice cu detectie prin -teste imunochimice cu detectie prin chemiluminiscenta (CLIAchemiluminiscenta (CLIA

REACTIA DE REACTIA DE IMUNOFLUORESCENTAIMUNOFLUORESCENTA

Prin cuplarea unei substante Prin cuplarea unei substante fluorescente cu anticorpii se obtin fluorescente cu anticorpii se obtin anticorpi fluorescenti, care se fixeaza anticorpi fluorescenti, care se fixeaza pe antigenul omolog si formeaza pe antigenul omolog si formeaza complexe imune fluorescente, complexe imune fluorescente, vizibile in ultraviolet la examinarea vizibile in ultraviolet la examinarea cu microscopul special.cu microscopul special.

REACTIA DE IMUNOFLUORESCENTAREACTIA DE IMUNOFLUORESCENTA

Metoda indirectaMetoda indirecta Se realizeaza in doi timpi.Se realizeaza in doi timpi. Produsul patologic se incubeaza cu Produsul patologic se incubeaza cu

anticorpii specifici, nemarcati. Pentru anticorpii specifici, nemarcati. Pentru vizualizarea complexului imun format se vizualizarea complexului imun format se adauga ser antiimunglobulina marcat.adauga ser antiimunglobulina marcat.( antiimunglobuline fata de ( antiimunglobuline fata de imunglobulinele speciei animale pe care s-imunglobulinele speciei animale pe care s-au obtinut anticorpii nemarcati.au obtinut anticorpii nemarcati.

Un singur ser marcat poate fi utilizat la Un singur ser marcat poate fi utilizat la detectarea comlpexelor Ag-Ac, anticorpii detectarea comlpexelor Ag-Ac, anticorpii fiind obtinuti pe aceeasi specie animala ca fiind obtinuti pe aceeasi specie animala ca serul antiglobulinic marcat.serul antiglobulinic marcat.

REACTIA DE IMUNOFLUORESCENTAREACTIA DE IMUNOFLUORESCENTA

Metoda directaMetoda directa Anicorpi monospecifici sunt conjugati cu Anicorpi monospecifici sunt conjugati cu

substanta fluorescenta. Produsul substanta fluorescenta. Produsul patologic care urmeaza a fi testat se patologic care urmeaza a fi testat se etaleaza pe lama dupa care se etaleaza pe lama dupa care se incubeaza cu anticorpii fluorescenti.incubeaza cu anticorpii fluorescenti.

Examinarea se face in lumina UV, Examinarea se face in lumina UV, complexele formate fiind flurescente. complexele formate fiind flurescente. Pentru aceasta metoda trebuie sa avem Pentru aceasta metoda trebuie sa avem serurile fluorescente specifice fiecarui serurile fluorescente specifice fiecarui atigen cautat.atigen cautat.

REACTIA DE IMUNOFLUORESCENTAREACTIA DE IMUNOFLUORESCENTA

Aplicatii:- evid Antigenelor dintr-un produs Aplicatii:- evid Antigenelor dintr-un produs patologicpatologic

Detectarea Anicorpilor dint-un ser , Detectarea Anicorpilor dint-un ser , folosind Ag cunoscut folosind Ag cunoscut

Diagnostic in bacteriologie : mycoplasama, Diagnostic in bacteriologie : mycoplasama, sifilis, Haemophilus,sifilis, Haemophilus,

Diagnostic in infectiile virale: in rabie este Diagnostic in infectiile virale: in rabie este metoda de electiemetoda de electie

Diagnostic in infectiile parazitare: Diagnostic in infectiile parazitare: toxoplasma gondi, pneumocystis carini, toxoplasma gondi, pneumocystis carini,

Diagnostic in infectiile fungiceDiagnostic in infectiile fungice

TESTE TESTE IMUNOENZIMATICEIMUNOENZIMATICE

Antigenul sau anticorpul se cupleaza Antigenul sau anticorpul se cupleaza cu enzime cu o mare activitate cu enzime cu o mare activitate ( peroxidaza din hrean, fosfataza ( peroxidaza din hrean, fosfataza alcalina, ureaza). Complexul imun alcalina, ureaza). Complexul imun format este apreciat prin format este apreciat prin cuantificarea activitatii enzimatice cuantificarea activitatii enzimatice fata de un substrat specific.fata de un substrat specific.

Tehnici ELISA (enzime-linked-Tehnici ELISA (enzime-linked-imunosorben-assay)imunosorben-assay)

1.Tehnica indirecta1.Tehnica indirecta Antigenul cunoscut este adsorbit pe suport Antigenul cunoscut este adsorbit pe suport

de polistirende polistiren Se pune serul cu anticorpii de identificat, Se pune serul cu anticorpii de identificat,

se incubeaza, se spala,se incubeaza, se spala, Se adauga serul antiimunglobulina marcat Se adauga serul antiimunglobulina marcat

enzimatic, se incubeaza enzimatic, se incubeaza Se adauga substratul.Se adauga substratul. Se masoara intensitatea reactiei de Se masoara intensitatea reactiei de

culoare prin spectrofotometrie.culoare prin spectrofotometrie.

Tehnici ELISA (enzime-linked-Tehnici ELISA (enzime-linked-imunosorben-assay)imunosorben-assay)

2. Tehnica sandwich 2. Tehnica sandwich Ac cunoscuti sunt fixati pe suport solidAc cunoscuti sunt fixati pe suport solid Se adauga proba cu antigen, se Se adauga proba cu antigen, se

incubeaza, se spalaincubeaza, se spala Se adauga anticorpi specifici marcati Se adauga anticorpi specifici marcati

enzimatic, incubare, spalareenzimatic, incubare, spalare Se adauga substratul pentru enzimaSe adauga substratul pentru enzima Se citeste intensitatea culorii prin Se citeste intensitatea culorii prin

spectrofotometriespectrofotometrie

Elisa de tip sandwichElisa de tip sandwich

Elisa de tip competitivElisa de tip competitiv

Tehnici ELISA (enzime-linked-Tehnici ELISA (enzime-linked-imunosorben-assay)imunosorben-assay)

Aplicatii;Aplicatii; detectarea anticorpilor bacterieni, detectarea anticorpilor bacterieni,

virali, parazitari, fungicivirali, parazitari, fungici detectarea Ag. Virale, parazitare, detectarea Ag. Virale, parazitare,

bacteriene, a toxinelor bacteriene.bacteriene, a toxinelor bacteriene.

RADIOIMUNOTESTAREA RADIOIMUNOTESTAREA (RIA)(RIA)

Se face prin marcare cu Iod 125, rar Se face prin marcare cu Iod 125, rar cu C14, H3, a unuia dintre reactanti cu C14, H3, a unuia dintre reactanti Ac, Ag, sau a serului antiglobulinic Ac, Ag, sau a serului antiglobulinic care reactioneaza cu complexul imun care reactioneaza cu complexul imun format, masurandu-se format, masurandu-se radioactivitatea complexului imun radioactivitatea complexului imun format.format.

Reactiile se pot lucra fie in faza Reactiile se pot lucra fie in faza solida fie in faza lichida.solida fie in faza lichida.

RADIOIMUNOTESTAREA RADIOIMUNOTESTAREA (RIA)(RIA)

Aplicatii:Aplicatii: Decelarea toxinei stafilococice, Decelarea toxinei stafilococice,

botulinice, det. polizaharidelor botulinice, det. polizaharidelor capsulare, dg. gripei, herpes, capsulare, dg. gripei, herpes, hepatitelorhepatitelor

TESTE IMUNOCHIMICE CU TESTE IMUNOCHIMICE CU DETECTIE PRIN DETECTIE PRIN

CHEMILUMINISCENTA (CLIA):CHEMILUMINISCENTA (CLIA): Utilizeaza pentru marcare molecule care Utilizeaza pentru marcare molecule care

genereaza chemiluminiscenta, cum ar fi genereaza chemiluminiscenta, cum ar fi derivati de luminol, esteri acridinici, derivati derivati de luminol, esteri acridinici, derivati de oxalat de nitrofenil. O varianta a de oxalat de nitrofenil. O varianta a acestora o constituie testele imunochimice acestora o constituie testele imunochimice cu detectie prin electrochemiluminiscenta cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA) care utilizeaza pentru marcare (ECLIA) care utilizeaza pentru marcare anumiti compusi organici (complexe de anumiti compusi organici (complexe de ruteniu, osmiu, etc.) care genereaza lumina ruteniu, osmiu, etc.) care genereaza lumina electrochimic.electrochimic.