P a g |1

CUPRINS PRELUCRAREA ESUTURILOR PENTRU OBINEREA I COLORAREA SECIUNILOR FINE LA PARAFINA. ................................................................................................................... 21. RECOLTAREA PROBELOR TISULARE............................................................................. 3

1.1. Ce reprezint recoltarea probelor biologice? ....................................................................... 31.2. Cine efectueaz recoltarea? .................................................................................................. 31.3. Care sunt tehnicile de recoltare? .......................................................................................... 3

1.3.1. Metode invazive ............................................................................................................ 31.3.2. Metode minim invazive ................................................................................................. 41.3.3. Detalii privind puncia-biopsie: ..................................................................................... 4

2. FIXAREA ................................................................................................................................... 83. SPLAREA .............................................................................................................................. 114. PROCESAREA ESUTURILOR ............................................................................................ 115. SECIONAREA LA MICROTOM ......................................................................................... 156. COLORAREA I MONTAREA SECIUNILOR LA PARAFIN ....................................... 21

6.1. Principiu ............................................................................................................................. 216.2. Tehnica de colorare i montare .......................................................................................... 22

6.2.1. Pre-colorarea ................................................................................................................ 226.2.2. Colorarea ..................................................................................................................... 236.2.3. Post-colorarea .............................................................................................................. 236.2.4. Montarea ...................................................................................................................... 236.2.5. Rezultatele colorrii H&E ........................................................................................... 23

7. ETICHETAREA ....................................................................................................................... 24

P a g |2

PRELUCRAREA ESUTURILOR PENTRU OBINEREA I COLORAREA SECIUNILOR FINE LA PARAFINA. Metoda prezint urmtoarele etape:

1. RECOLTARE 2. FIXARE 3. SPLARE 4. PROCESAREA PROBELOR

a. Deshidratare b. Impregnare c. Includere la parafin

5. SECIONARE 6. COLORARE I MONTARE 7. ETICHETARE

P a g |3

1. RECOLTAREA PROBELOR TISULARE

1.1. Ce reprezint recoltarea probelor biologice? Recoltarea include o serie de metode prin care se obin mostre de esut de diferite consistene (esuturi solide os, muchi, piele sau fluide din caviti reale sau virtuale pleura, pericard, peritoneu) n vederea investigrii lor morfologice.

1.2. Cine efectueaz recoltarea? Biopsiile, puncia biopsie percutanat, punciile aspirative, sunt efectuate de obicei de medicul primar specialist, sub control imagistic. Biopsia se efectueaz de obicei n condiii de ambulator fr a fi necesar internarea.

1.3. Care sunt tehnicile de recoltare? 1.3.1. Metode invazive

Biopsia reprezint decuparea unui fragment de esut de la un subiect viu; accesul la esutul respectiv se poate realiza direct din exterior sau indirect, de obicei prin tehnici de explorare endoscopic sau intervenii minim invazive. Sunt recunoscute mai multe tipuri de biopsii:

- Biopsia excizional se adreseaz unor leziuni accesibile direct sau indirect, care sunt ndeprtate complet, n cadrul unei intervenii chirurgicale. Din piesa excizat, chirurgul prelev pentru anatomopatolog fragmente relevante pentru diagnosticul ipotetic.

- Biopsia incizional se adreseaz unor leziuni care nu sunt ndeprtate complet ci numai explorate chirurgical dup reguli precise. Chirurgul prelev probe bioptice din diferite regiuni de interes ale leziunii investigate.

- Biopsia de raclare se adreseaz n special leziunilor cutanate

P a g |4

Alte variante de biopsie sunt discutate la metode minim invazive de explorare. Avantajele biopsiei chirurgicale:

- Ofer siguran diagnosticului n aproape 100% din cazuri fiind "standardul de aur" n acest sens

- Pentru tumorile mici poate reprezenta tehnica terapeutic definitiv dac piesa bioptic a prezentat margini de rezecie negative histopatologic

Dezavantaje: - Necesit incizii mai mult sau mai puin extinse ce pot lsa cicatrici tegumentare - Recuperarea dureaz mai mult dect n cazul punciilor percutane - Riscul mai mare pentru hemoragii, hematoame, supuraii i vicii de vindecare ale plgii

1.3.2. Metode minim invazive

Se adreseaz esuturilor care nu sunt n mod direct i convenabil accesibile unui act bioptic. Putem distinge astfel:

- esuturi accesibile prin explorare datorat orificiilor naturale (investigaii endoscopice i explorarea direct a mucoaselor accesibile, prin raclare sau citologie exfoliativ); explorarea prin metode endoscopice se poate asocia cu variate tehnici de recoltare, inclusiv biopsie, puncie, citologie exfoliativ)

- esuturi accesibile prin explorare laparoscopic; i aceast explorare permite recoltarea prin toate tehnicile enumerate la explorarea endoscopic

- esuturi accesibile prin puncionare explorare percutanat. De obicei, aceast abordare realizeaz recoltare prin aspiraie ca urmare a unei puncii percutanate sau prin puncie-biopsie.

1.3.3. Detalii privind puncia-biopsie: Biopsia aspirativ cu ac fin (FNAB fine needle aspiration biopsy) Este o metod de biopsie percutanat, utilizat pentru extracia unui fragment mic dintr-o leziune pentru a fi examinat la microscop de ctre anatomopatolog.

Poate avea o rat mare de acuratee dac este realizat de un specialist cu experien n acest domeniu i dac rezultatele obinute sunt corelate cu cele ale examenului clinic i ale altor investigaii paraclinice.

P a g |5

Indicaii: - Formaiuni tumorale care apar chistice la examenul ecografic; - Pentru unele formaiuni cu coninut solid;

Contraindicaii: - Nu se vor explora formaiuni mai mici de 1 cm.

n situaia n care formaiunea tumoral nu poate fi detectat prin palpare, biopsia se poate efectua sub ghidaj ecografic. Avantaje:

- rapid i facil - nu necesit anestezie, fiind uor suportat de subiect - este metoda cea mai puin invaziv - cost redus

Dezavantaje: - indicaii reduse n tumorile solide - celularitatea redus a materialului recoltat, ceea ce face imposibil diferenierea ntre o

leziune malign in situ i una invaziv. Biopsia cu ac gros (core needle tru-cut) Biopsia cu ac gros este de asemenea o biopsie percutan.

Etapele realizrii piesei bioptice prin aceast metod sunt ilustrate mai jos.

P a g |6

Deosebirile eseniale fa de biopsia prin aspiraie cu ac fin sunt urmtoarele: - este utilizat un ac de puncie mai gros, special, prevzut cu un sistem de tiere - piesa de biopsie nu este obinut prin aspiraie ci prin tierea esutului - se obine un cilindru de esut, suficient pentru diferenierea ntre tipul invaziv i neinvaziv

de leziune - biopsia cu ac gros este util pentru leziuni solide nu chistice.

Complicaii posibile ar fi apariia unor hematoame local i rareori persistena unei cicatrici tegumentare. Avantaje:

- Se obin fragmente tisulare cu suficient de mult celularitate pentru a detecta o leziune malign

- Fragmentele tisulare recoltate pot demonstra relaia esutului tumoral cu cele normale nconjurtoare putnd face diferena ntre un cancer n situ i unul invaziv.

Dezavantaje: - Fiind o biopsie, recolteaz doar fragmente de esut, nu ntreaga formaiune tumoral,

astfel nct poate s nu includ tocmai esutul canceros. Chiar dac fragmentul de esut recoltat nu conine celule canceroase nu este o garanie absolut a negativitii probei

P a g |7

RECOLTAREA 1. esutul recoltat este splat cu PBS (tampon fosfat salin) pentru ndeprtarea sngelui sau altor secreii 2. Cu ajutorul unor lame tioase umectate n PBS se taie fragmente din esutul recoltat dimensiunile recomandate sunt 10103 mm (3 mm grosimea maxim). Tot instrumentarul ce va fi utilizat n aceste manevre, pense, ace, va fi umectat n PBS. 3. Pregtirea casetelor de plastic pentru fixare

casete pentru probe

lateral se noteaz numele investigatorului

frontal se noteaz numrul probei i data curent NOTE SPECIALE

Probele se orienteaz n casete n aceeai direcie cu cea utilizat pentru includere (ex. faa probei care trebuie secionat prima se amplaseaz n jos, n caset)

Probele nu trebuie s se usuce O caset poate conine mai multe probe esuturile nu trebuie strivite, se aleg casete potrivite pe dimensiunea esuturilor. Fragmentele tisulare foarte mici < 1-2mm trebuie plasate pe bureei mici care se gsesc

de obicei n casete.

Casetele sunt apoi amplasate n soluia de fixare (vezi etapa de fixare)

P a g |8

2. FIXAREA Fixarea reprezint un proces chimic prin care se evit degradarea autolitic sau putrefacia esuturilor biologice. Fixarea este o procedur comun n domeniile histologie, patologie sau biologie celular. Pentru a realiza fixarea, fragmentele tisulare, seciunile sau frotiurile trebuie imersate n fixator. Pentru frotiuri se practic desicarea (uscarea) prin agitare la temperatura laboratorului. Prin procedura de fixare se realizeaz blocarea oricrei reacii biochimice iar simultan se obine rigidizarea i stabilizarea mecanic a esutului n cauz. Etapa de fixare este folosit pentru a conserva piesele de esut ntr-o stare ct mai apropiat de starea vie. Un fixator prezint unele proprieti particulare:

- Trebuie s poat inactiva moleculele intrinseci celulare, n special enzimele proteolitice; aceste enzime care se regsesc n special n lizozomi, sunt de obicei capabile s digere sau s distrug elementele celulare sau tisulare. Fixarea are rolul de a stabiliza structura intim att intra- ct i extracelular, prin insolubilizarea unor macromolecule intracelulare.

- Protejeaz proba de o afectare extrinsec. Fixatorii sunt toxici pentru majoritatea microorganismelor (ex. bacterii, fungi) evitnd astfel colonizarea esutului fixat;

- Crete rezistena mecanic a celulelor/esuturilor fixate, cu o alterare minimal la nivel celular i molecular. Cu toate acestea, chiar i cea mai bun i atent realizat fixare afecteaz proba i induce prezena unor artefacte care pot interfera cu vizualizarea i interpretarea rezultatelor.

Tipuri de fixatori Prin definiie, agenii fixatori au capacitatea de a modifica organizarea fizico-chimic a componentelor celulare din esuturi. Fixatorii acioneaz nu numai asupra unor componente celulare (proteine i acizi nucleici) ci i asupra macromoleculelor de la suprafaa celulelor sau din spaiile extracelulare. n mediul extracelular, fixatorii acioneaz asupra glicoproteinelor i proteoglicanilor. Celulele vii prezint plasmaleme impermeabile pentru macromoleculele hidrofile. Fixarea n ageni organici care dizolv sau distrug lipidele membranar, permite moleculelor mari s ptrund n celul sau s scape din aceasta. Citoplasma devine i ea permeabil pentru anumite macromolecule, formnd o reea proteinacee suficient de poroas pentru ptrunderea moleculelor de mari dimensiuni. Astfel de structuri includ amestecul de parafin cu cear, anticorpi utilizai n imunomarcare sau colorani cu molecul mare. Gradul de porozitate obinut depinde de tipul de fixator utilizat. Agenii fixatori coagulani, precum clorura de mercur, acidul picric, sulfatul de zinc determin apariia de pori de dimensiuni mai mari dect agenii necoagulani (formaldehida, glioxal sau glurataldehida). Unii fixatori au proprieti mixte, coagulante i non-coagulante. De exemplu, acidul acetic coaguleaz cromatina nuclear dar nu i proteinele.

P a g |9

Clasificarea fixatorilor n funcie de mecanismul de aciune 1. Fixatori coagulani (alcooli, acid clorhidric, acid cromic) utilizai mai ales pentru

preparatele care vor fi examinate n microscopia fotonic deoarece precipit (coaguleaz)i denatureaz proteinele care nu sunt n mod normal vizibile n microscopia fotonic. Nu sunt utilizabili pentru microscopia electronic.

Exemple: - Alcoolii, inclusiv alcoolul metilic (metanol), i etilic (etanol), vor denatura proteinele i

nu sunt utilizai de rutin pentru fixarea tisular deoarece determin friabilizarea acestora. Sunt ns buni fixatori pentru frotiuri, deoarece au o aciune rapid i determin evidenierea bun a detaliilor nucleare;

2. Fixatori non-coagulani (aldehide, acroleine, ageni oxidani) formeaz puni intra i

intermoleculare determinnd o tranziie de faz a citoplasmei de la starea lichid la starea de gel transparent i pentru electroni. Aceste tipuri de fixatori includ formaldehida, formalina i glutaraldehida.

Exemple: - Formaldehida este util n tehnicile de imunohistochimie peroxidazic. Formalina

ptrunde bine la nivel tisular, dar cu o vitez redus. Formalina este un produs comercial care conine 40% volum/volum formaldehid (normal un gaz) n ap.

Formula formaldehidei - Soluia standard de fixare este formalina neutr tamponat, concentraie 10%. Este un fixator non-coagulant care ptrunde rapid n esuturi dar care poate fi extras prin splare repetat. Cel mai utilizat fixator pentru investigaii anatomo-patologice sau histologice este reprezentat de o soluie apoas 4% de formaldehid, numit adesea i formalin 10%, deoarece este o diluie de 10 ori a formalinei. De obicei aceast soluie este neutralizat cu sruri anorganice.

- Glutaraldehida induce deformarea structurii -helicale a proteinelor i implicit nu este util n tehnica de imunohistochimie cu peroxidaz. Cu toate acestea, fixarea cu glutaraldehid este foarte util pentru preparatele de microscopie electronic. Penetrarea esutului este destul de slab, de aceea piesele trebuie s fie de mici dimensiuni, dar determin o bun fixare citoplasmatic global i detalii nucleare de calitate. Soluia standard este cea de glutaraldehid tamponat 2%

- Agenii oxidani includ permanganaii (permanganat de potasiu), dicromaii (tot de potasiu) i tetraoxidul de osmiu. Realizeaz legarea ncruciat a proteinelor dar i o denaturare extensiv a acestora. Unii dintre aceti fixatori sunt supraspecifici pe anumite aplicaii (ex. tetraoxidul de osmiu n microscopia electronic). Tetraoxidul de osmiu este cel mai bun fixator chimic simplu dar este scump i foarte toxic.

3. Mecanism necunoscut (organo-mercurice, picrai) Exemple:

- Fixatorii pe baz de mercur acioneaz asupra esuturilor printr-un mecanism incomplet elucidat. Ptrund destul de greu n esuturi i produc rigidizare dar dau detalii nucleare foarte bune. Sunt utilizai pentru fixarea esuturilor hematopoietice i reticulo-endotelial. Datorit faptului c au un coninut ridicat n mercur, sunt foarte toxici;

P a g |10

- Picraii includ fixatori pe baz de acid picric. Cel mai cunoscut este soluia Bouin, al crei mecanism de aciune este necunoscut. Fixeaz la fel de bine ca i fixatorii mercurici dar produc o rigidizare mai redus. n form uscat, acidul picric este exploziv. n soluie coloreaz toate suprafeele n galben (inclusiv pielea).

Metode utilizate pentru fixare Fixarea prin cldur: se aplic de obicei pentru frotiuri microbiologice. Dup uscarea la temperatura camerei, frotiul este flambat prin trecerea peste un bec Bunsen aprins, de cteva ori, pentru a ucide microorganismele i a le facilita aderena la lama de sticl. Fixarea prin cldur conserv morfologia dar nu i structura intern. Cldura denatureaz enzimele proteolitice i previne autoliza. Perfuzia: Fixarea intracirculatorie. Fixatorul este injectat intracardiac, volumul injectat fiind proporional cu volumul de ejecie cardiac. Fixatorul se distribuie n ntregul organism iar esutul este fixat progresiv. Avantajul acestei tehnici este conservarea perfect a morfologiei n timp ce dezavantajul major este reprezentat de costurile ridicate i de decesul animalului de experien utilizat. Imersia: fragmentul de esut este imersat ntr-un volum de fixator de cel puin 20 de ori mai mare dect volumul esutului de fixat. Fixatorul trebuie s difuzeze prin esut pentru a realiza fixarea, astfel nct densitatea tisular, dimensiunea probei precum i tipul de fixator utilizat reprezint factori importani care pot influena acurateea acestui proces. Un fragment tisular mai mare va necesita o perioad mai lung de fixare. Fixarea sub vid d rezultatele cele mai bune. Factori care pot afecta procesul de fixare pH trebuie meninut n limite fiziologice, cu valori ntre 4-9. Pentru conservarea ultrastructurii probelor de fixat, soluiile fixatoare utilizate trebuie tamponate la un pH de 7,2-7,4. Osmolaritatea

- Soluiile de fixare hipertone determin ratatinarea celular - Soluiile hipotone pot determina edem celular i o slab fixare

Dimensiunea probei - de obicei probele trebuie s aib o grosime de 1-4mm Volumul fixatorului s fie de cel puin 15-20 de ori mai mare dect volumul tisular Temperatura Creterea temperaturii crete i viteza de fixare. Sunt necesare unele precauii pentru a evita coagularea proteinelor prin fierbere. De obicei, fixarea se face la temperatura laboratorului. Durata fixrii Ca i regul general, fixarea se realizeaz cu viteza de 1 mm pe or. Timpul necesar fixrii variaz dar nu poate fi nelimitat. Pentru formalina 10%, n funcie de volumul tisular, avem urmtoarele limite:

- 12-24 h (piese mici cu dimensiuni de 10103 mm) cu o conservare bun a constituenilor citoplasmatici i a detaliilor nucleare. Fixarea cu formaldehid este complet la 24 de ore dar reaciile de cuplare ncruciat a proteinelor continu pentru cel puin 2 sptmni.

- 2-6 sptmni pentru piesele mari, de consisten moale (creier uman integral de exemplu); aceste piese capt o consisten suficient pentru a fi secionate n vederea prelevrii unor fragmente cu utilitate histologic.

Fixarea este un proces chimic i necesit un timp anume pentru a fi complet. Att suprafixarea ct i subfixarea pot fi responsabile de eecul realizrii unor probe histologice.

P a g |11

3. SPLAREA - De obicei se realizeaz n ap curent, peste noapte. - Nu se aplic pentru esuturile fixate care rmn deshidratate i nici pentru frotiuri

4. PROCESAREA ESUTURILOR Scopul acestei etape este de a ndeprta apa din esutul fixat i splat i de a o nlocui cu un mediu care se solidific la temperatura camerei i care permite realizarea unor seciuni fine, cu grosimea de 3-15m. Cel mai folosit mediu pentru procesarea tisular este parafina, un amestec de hidrocarburi alifatice, nemiscibil cu apa dar solubil n solveni organici. esuturile biologice trebuie incluse ntr-o matrice dur care permite realizarea unor seciuni destul de fine:

- 3-5 m (micrometri; 1000 m = 1 mm) grosime pentru microscopia fotonic - 80-100 nm (nanometri; 1.000.000 nanometri = 1 mm) grosime, pentru microscopia

electronic. Pentru microscopia fotonic, mediul uzual este parafina mbogit cu cear de albine.

Deoarece parafina este nemiscibil cu apa, aceasta din urm trebuie extras n cadrul unui proces de deshidratare. Probele sunt transferate ulterior prin bi succesive de alcool etilic n concentraii cresctoare, pentru a ndeprta treptat apa. Apoi probele sunt trecute prin bi succesive de solvent organic (de exemplu xilol) n scopul ndeprtrii alcoolului, i apoi prin bi succesive de parafin topit (agentul uzual de includere), care va nlocui xilenul n structura intim a esutului.

Procesarea tisular cuprinde toate etapele necesare obinerii de seciuni fine. - Cuprinde 4 etape deshidratarea, ndeprtarea alcoolului, clarificare, impregnare i

includere Deshidratare

Reactiv Timp (min) Alcool 50% 15 Alcool 70% 15 Alcool 90% 15 Alcool 100% 15 Alcool 100% 15 Alcool 100% 15

ndeprtarea alcoolului 3 bi de aceton, 5 min fiecare Clarificare 3 bi de xilol, 15 min fiecare Impregnare -

Reactiv Timp (min) Parafin topit 15 Parafin topit 15 Parafin topit 15

n timpul acestui proces, fragmentele de esut sunt amplasate n forme n care se toarn i parafina topit, care apoi se solidific la temperatura camerei. La parafina topit se adaug cear de albine care crete densitatea amestecului de includere. Dac se lucreaz pe un sistem de distribuie a parafinei, acesta posed o plac de rcire pe care parafina din form se poate ntri mult mai repede. Odat incluse, fragmentele de esut pot fi conservate n blocuri de parafin pe termen nedefinit.

P a g |12

Etape 1. Se deschide caseta n care s-a realizat fixarea, se vizualizeaz fragmentul de esut i se

alege o form corespunztoare dimensiunii acestui fragment. ntre pies i marginile formei trebuie s rmn un spaiu de 2 mm pentru asigurarea unui bun suport n timpul secionrii.

Se deschide caseta n care s-a realizat fixarea

P a g |13

se alege o form corespunztoare dimensiunii acestui fragment (mold = form)

2. Se adaug parafin topit din dispenserul automat sau din alt recipient cu parafin topit

P a g |14

3. Cu o pens cald se amplaseaz fragmentul de esut n form, n aceeai poziie cu cea

din caseta de fixare

4. Se transfer forma cu parafina i cu fragmentul de esut pe placa rcit, apsnd uor pe

fragmentul de esut. Parafina se solidific intr-un strat subire care menine esutul n poziia n care a fost amplasat.

5. Cnd esutul este amplasat n orientarea dorit, se preia caseta n care s-a fcut fixarea i

se amplaseaz peste form, ca n imaginea de mai jos. Se apas capacul cu pensa.

6. Ulterior se adaug parafin topit peste form, turnnd prin capacul de plastic. Parafina trebuie s depeasc nivelul capacului de plastic (galben), acesta urmnd s reprezinte baza de fixare a viitorului bloc de parafin.

7. Parafina se solidific n circa 30 minute. Blocul de parafin rezultat se desprinde uor din

form. Dac blocul prezint fisuri sau daca piesa nu este aliniat convenabil, parafina se poate retopi i procesul se poate relua.

P a g |15

5. SECIONAREA LA MICROTOM Microtomul este un instrument de secionare care este utilizat pentru realizarea seciunilor fine din blocurile de esut incluse n parafin.

P a g |16

P a g |17

Separarea seciunilor

P a g |18

Prelevarea seciunilor

Amplasarea seciunilor pe ap pentru ntindere

P a g |19

Seciunile sunt preluate cu o lam

Apoi seciunile sunt transferate ntr-o baie de ap nclzit la o temperatur inferioar celei de topire a parafinei (44C)

P a g |20

n final, seciunile sunt preluate din baia de ap cu alt lam, pe care se realizeaz i etalarea.

P a g |21

6. COLORAREA I MONTAREA SECIUNILOR LA PARAFIN Coloraia H&E sau hematoxilin-eozin este uzual n tehnici histologice i anatomo-patologice. 6.1. Principiu Hematoxilina nu este un colorant real, deoarece aceast molecul nu posed un cromofor. Colorantul propriu-zis (activ) va fi reprezentat astfel de un produs de oxidare al hematoxilinei, numit hematin. Oxidarea in situ a hematoxilinei este realizat cu un agent oxidant puternic, n acest caz iodura de sodiu. Hematina are i proprieti de indicator, fiind mai puin solubil i albstruie n soluii alcaline i mai solubil i roiatic n soluii acide/alcoolice. n mediu acid (cum este i nucleul celular) hematina cupleaz reziduurile lisinice de la nivelul histonelor nucleare. Pentru aceast cuplare este necesar i prezena unui ion metalic cu rol de mordant (de exemplu aluminiu). Not! MORDNT s.m. Substan cu ajutorul creia se fixeaz vopseaua pe esturi. [< fr. mordant].(DEX) HISTN s.f. (Biol.) Protein cu proprieti bazice, care se gsete n nucleul celulelor. [< fr. histone].(DEX) HISTONA, s. f. / histone, s. f. / histone. [Cjr. histos = esut]. Termen generic care desemneaz o protein dintr-un grup de proteine mici, ncrcate pozitiv la pH fiziologic, ca urmare a prezenei aminoacizilor lizin i arginin (ntr-un procent ridicat). Ca urmare a sarcinii lor pozitive, histonele formeaz legturi ionice cu regiuni ncrcate negativ, la nivelul ADN. Histonele particip la formarea nucleozomilor (cte dou molecule) asociate cu un segment al dublului helix ADN. Mordantul de aluminiu, mpreun cu hematina (forma oxidat a hematoxilinei) formeaz hemalumul. Pentru dezambiguizare cu noiunea de hemalaun, mai des folosit, trebuie menionat c alaunul de potasiu este sarea utilizat ca i mordant. Piatra de alaun sau alaunul de potasiu mai este numit tiinific potassium alum, compusul fiind folosit ca deodorant bio. Obinuim a folosi termenul de hematoxilin pentru colorantul nuclear descris mai sus. Colorarea nucleilor de ctre hematoxilin nu necesit prezena ADN, deoarece acest colorant se fixeaz direct de histone. Pentru a asigura cuplarea colorantului la situsurile tisulare specifice, acesta este aplicat pentru o perioad mai lung, determinnd o supracolorare a esuturilor i o colorare nespecific de fond. Aceast coloraie de fond poate fi ndeprtat selectiv prin aplicarea unei soluii de acid picric (sau un amestec acid-alcool), procedeul fiind numit difereniere. Diferenierea este oprit prin imersia n ap curent. Hematina d o nuan albstruie, colornd nucleii i unele granule, n nuane de albastru. Splarea cu ap curent este obligatorie dup terminarea colorrii nucleare i de asemenea dup o eventual etap de difereniere. Colorarea nuclear este urmat de contracolorarea cu o soluie apoas sau alcoolic de eozin Y. Aceast soluie va colora structurile eozinofilice n nuane de rou, roz sau portocaliu. Structurile eozinofilice sunt reprezentate n general de proteine intracelulare sau din mediul extracelular. Cea mai mare parte din citoplasm este eozinofil. La fel i hemoglobina din hematii. Pe seciuni pot aprea i alte culori, determinate de prezena pigmenilor (ex. melanina). Unele structuri nu se pot colora bine cu aceast compoziie. Membranele bazale ca i fibrele de reticulin trebuie colorate cu sistemul de coloraie PAS sau cu amestecuri pe baz de sruri de argint. Structurile hidrofobe tind s rmn transparente.

P a g |22

6.2. Tehnica de colorare i montare Se reiau n lucru seciunile fine la parafin etalate pe lam n etapele precedente.

6.2.1. Pre-colorarea (vezi http://www.youtube.com/watch?v=2D0rj0m6dVs) 1. Se ndeprteaz parafina din seciuni prin 3 bi succesive de xilol, 10 minute fiecare. (3x 10 minute = 30 minute)

P a g |23

2. Rehidratarea n - 3 bi de alcool absolut, 5 minute fiecare, urmat de - 1 baie de alcool 95% timp de 5 minute - 1 baie de alcool 70% timp de 5 minute. - 1 baie de alcool 50% timp de 5 minute (alcoolul 30% nu este neaprat necesar) 3. Se spal rapid (scufundri succesive 10 sec) n ap distilat 6.2.2. Colorarea 4. Colorarea cu soluie de hematoxilin timp de 10 minute. 5. Splarea n ap curent, timp de 5 minute. 6. Diferenierea n soluie de acid-alcool 1% timp de 30 secunde. 7. Splarea n ap curent timp de 1 minut. 8. Contracolorarea cu soluie de eozin, timp de 2-5 minute. 6.2.3. Post-colorarea 9. Deshidratarea n soluie de alcool 70%, 10. Deshidratarea n soluie de alcool 95%, 11. 3 bi de alcool absolut, 5 minute fiecare. 12. Clarificare n 3 bi de xilol, 5 minute fiecare. 6.2.4. Montarea (http://www.youtube.com/watch?v=VH1vx8XY1ig&feature=related) 13. Montarea se face cu o pictur de mediu specific, solubil n xilol.

6.2.5. Rezultatele colorrii H&E colagen............................................roz palid muchi.............................................roz intens citoplasm acidofil........................rou citoplasm bazofilic......................violet nuclei...............................................albastru eritrocite..........................................rou deschis

P a g |24

7. ETICHETAREA

Etichetarea se poate face cu etichete preformate, imprimate sau cu coduri de bare.