rezumatul tezei de doctorat ph.d. thesis summaryold.unitbv.ro/portals/31/sustineri de...

MINISTERUL EDUCAȚIEI, CERCETĂRII, TINERETULUI ȘI SPORTULUI

UNIVERSITATEA „TRANSILVANIA” DIN BRAȘOV

Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere

Ing. Raul Gheorghe RADU

Evaluarea diversității genetice în populații naturale de molid [Picea abies (L.)

Karst.] din România cu ajutorul markerilor biochimici primari

Genetic diversity evaluation in Romanian natural populations of Norway spruce

[Picea abies (L.) Karst] using primary biochemical markers

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Ph.D. THESIS Summary

Conducător științific:

Prof.univ.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA

Brașov, 2013

MINISTERUL EDUCAŢIEI NAȚIONALE

UNIVERSITATEA ”TRANSILVANIA” DIN BRAŞOV

Brașov, b-dul Eroilor 29, 500036, tel. 0040-268-413000, fax 0040-268-410525

RECTORAT

Către…………………………………………………………………………….

Vă aducem la cunoştinţă că în ziua de marţi, 11.10.2013, ora 13.00, la FACULTATEA DE

SILVICULTURĂ ȘI EXPLOATĂRI FORESTIERE, corp S, în sala SI.2, va avea loc susținerea publică a

tezei de doctorat intitulată: EVALUAREA DIVERSITĂȚII GENETICE ÎN POPULAȚII NATURALE DE

MOLID [PICEA ABIES (L.) KARST] DIN ROMÂNIA CU AJUTORUL MARKERILOR BIOCHIMICI

PRIMARI elaborată de ing. RADU Gheorghe Raul, în vederea obținerii titlului de DOCTOR, în domeniul

SILVICULTURĂ.

COMISIA DE DOCTORAT

Numită prin

Ordinul Rectorului Universității ”Transilvania” din Brașov

Nr. 5999 din 10.09.2013

PREȘEDINTE: Prof. univ. dr. ing. Gheorghe SPÂRCHEZ

PRODECAN – Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere

Universitatea ”Transilvania” din Brașov

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC: Prof. univ. dr. ing. Neculae ŞOFLETEA


REFERENȚI: Conf. univ. dr. Liviu FĂRTĂIŞ

Universitatea Ştefan cel Mare Suceava

Cercet. șt. gr. II, dr. ing. Flaviu POPESCU

I.C.A.S. București, Stațiunea Simeria

Conf. univ. dr. ing. Alexandru-Lucian CURTU


Eventualele aprecieri sau observații asupra conținutului lucrării vă rugăm să le transmiteți în timp

util, pe adresa: Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere din Brașov, str. Șirul Beethoven, nr. 1,

500123, la numărul de fax: 0268 475705 sau pe e-mail: [email protected].

Totodată vă invităm să participați la şedinţa publică de susținere a tezei de doctorat.

Vă mulțumesc

Evaluarea diversității genetice în populații naturale de molid [Picea abies (L.) Karst.] din România cu ajutorul

markerilor biochimici primari

1

Cuprins

Cuvânt înainte ...................................................................................................................5.............5

Capitolul 1. Introducere ...................................................................................................6.............6

Capitolul 2. Stadiul actual al cunoștințelor privind evaluarea diversității genetice a molidului

cu ajutorul markerilor genetici primari .........................................................................7.............8

2.1. Aspecte privind originea și evoluția molidului ......................................................7.............8

2.2. Principalele caracteristici ecologice, diversitatea ecotipică și rasială ................8..............9

2.2.1. Morfologia și ecologia .....................................................................................8.............9

2.2.2. Diversitatea ecotipică și rasială .......................................................................9............11

2.3. Conservarea resurselor genetice de molid ............................................................10.........13

2.4. Estimarea variației genetice cu ajutorul markerilor biochimici primari (izoenzimele)11..15

2.5. Evaluarea structurii genetice spațiale a populațiilor ...........................................11..........16

2.6. Rezultate ale studiilor privind evaluarea variabilității genetice a molidului cu ajutorul

markerilor biochimici primari .....................................................................................12..........18

Capitolul 3. Scopul și obiectivele cercetărilor ................................................................13.........27

3.1. Scopul cercetărilor ................................................................................................13..........27

3.2. Obiectivele urmărite .............................................................................................14..........27

Capitolul 4. Materialul și metodele de cercetare ..........................................................14..........28

4.1. Localizarea cercetărilor .......................................................................................14..........28

4.2. Recoltarea materialului de cercetare ...................................................................15..........34

4.3. Metoda de lucru în laborator ...............................................................................16..........35

4.4. Analiza și interpretarea parametrilor diversității genetice ..................................17..........39

4.5. Structura spațială a variației genetice .................................................................18..........44

4.5.1. Metode utilizate pentru analiza spațială a structurii genetice ........................18...........44

4.5.2. Utilizarea sistemelor informatice geografice (GIS) în analiza structurii genetice

spațiale ......................................................................................................................19..........45

Capitolul 5. Rezultatele cercetărilor ..............................................................................20..........46

5.1. Evaluarea diversității genetice în populații autohtone de molid din cuprinsul rețelei

NATURA 2000 cu ajutorul markerilor biochimici primari .........................................20..........46

5.1.1. Lecturarea zimogramelor ................................................................................20.........46

5.1.2. Frecvența și distribuția alelelor în cadrul populațiilor de molid .....................20.........56

5.1.3. Analiza variabilității genetice izoenzimatice ..................................................22.........70

5.1.3.1. Date sintetice genotipice și alelice ........................................................22..........70



2

5.1.3.2. Structura genetică în interiorul populațiilor ..........................................23...........73

5.1.3.3. Structura genetică interpopulațională ...................................................27...........77

5.1.4. Discuții ...........................................................................................................30...........82

5.2. Analize comparative ale diversității genetice între populații individualizate biotipic și/sau

ecotipic ........................................................................................................................33..........86

5.2.1. Studiu comparativ între populația de turbărie, populația biotipului de molid cu coroană

columnară (Picea abies var. columnaris) și populația de molid cu coroană piramidală (Picea

abies var pyramidalis) din metapopulația Apuseni .................................................33............86

5.2.2. Analize genetice comparative între populații aflate la altitudini diferite din aceeași zonă

geografică ................................................................................................................35............90

5.2.3. Discuții ...........................................................................................................37...........94

5.3. Structuri genetice microspațiale pentru locii izoenzimatic .................................38...........96

5.3.1. Structura genetică microspațială în metapopulația Postăvarul ......................39...........96

5.3.2. Structura genetică microspațială în populația Nemira ...................................45.........106

5.3.3. Discuții ...........................................................................................................48.........114

Capitolul 6. Concluzii generale și contribuții personale .............................................51..........117

6.1. Concluzii generale ...............................................................................................51.........117

6.2. Contribuții personale ...........................................................................................54.........122

Diseminarea rezultatelor ................................................................................................55.........124

Bibliografie ......................................................................................................................56.........125

Rezumat ...........................................................................................................................62.........134

Curriculum Vitae ............................................................................................................64.........136

Anexa ................................................................................................................................-...........138



3

Content

Foreword ..…………………………………………………………………...…………5....…...….5

Chapter 1. Introduction ……………………………………………………………….6.….....…..6

Chapter 2. Current state of knowledge of genetic diversity evaluation of Norway spruce by

the means of allozyme genetic markers ………………………………………………7….…......8

2.1. Origin and evolution of Norway spruce ……………………………………….7.………....8

2.2. The main ecological characteristics, ecotype and racial diversity ………........8…...….....9

2.2.1. Morphology and ecology ………………………………………………......8..…......…9

2.2.2. Ecotype and racial diversity ………………………………………………..9....…......11

2.3. Conservation of Norway spruce genetic resources in România ……………….10............13

2.4. Genetic variability of Norway spruce, analyzed with genetic markers ………..11............15

2.5. Spatial genetic structures of populations ……………………………………...11….........16

2.6. Result of genetic variability of Norway spruce, analyzed with genetic markers in others

studies ……………………………………………………………………………….12….......18

Chapter 3. Aim and objectives of the study ………………………………………….13….......27

3.1. Aim of study ………………………………………………………….…………13…....…27

3.2. Objectives ………………………………………………………………………14...........27

Chapter 4. Material and methods …………………………………………………….14…........28

4.1. Site location …………………………………………………....………………14............28

4.2. The collection and preservation of biological samples ………………………..15............34

4.3. Methods used in laboratory …………………………………………..………..16............35

4.4. The analyses and interpretation methodologies of genetic parameters ……….17............39

4.5. Spatial structure of genetic diversity …………………………………………..18............44

4.5.1. Methods of spatial structure analyses ………………………………………18...........44

4.5.2 The use of GIS tehnologyes to determine the spatial genetic structure ……19............45

Chapter 5. Results …………………………………………………………….............20............46

5.1. Genetic diversity of Norway spruce autochthonous populations from NATURA 2000 sites,

analyzed with genetic markers ………………………………………………………20.......…46

5.1.1. Zymograms interpretation …………………………………………………20........…46

5.1.2. Alleles frequencies and distribution of Norway spruce …………………...20............56

5.1.3. Isozyme genetic diversity ………………………………………………….22............70

5.1.3.1. Genotypic and allelic synthetic data …………………………………23........…70

5.1.3.2. Genetic diversity within populations ………………………………..27.….......73



4

5.1.3.3. Genetic diversity between populations ………………………………30.….......77

5.1.4. Discussions …………………………………………………………………33...........82

5.2. Genetic diversity comparative analyses among biotype and/or ecotype individualized33.86

5.2.1. Comparative studies of genetic diversity between peat bog ecotype population, narrow

crown spruce population and pyramidal crown spruce population from Apuseni

metapopulation ……………………………………………………...………...….33.........…86

5.2.2. Comparative studies of genetic diversity between high and low altitudinal populations

from the same geographic area ……………………………….………………......35............90

5.2.3. Discussions …………………………………………………………….......37........…94

5.3. Microspatial genetic structures ……………………………………………......37............96

5.3.1. Microspatial genetic structures in Postăvaru metapopulation ……………..38.….......96

5.3.2. Microspatial genetic structures in Nemira metapopulation …………….....39.…......106

5.3.3. Discussions …………………………………………………………….......45...........114

Chapter 6. General conclusions and personal contributions ………………….........48..........117

6.1. General conclusions ………………………………………………………........51..........117

6.2. Personal contributions ………………………………………………………....51..........122

Results dissemination ……………………………………………………………….....54.........124

References ………………………………………………………………………….......55..........125

Abstract ………………………………………………………..……………….……....56..........134

Curriculum Vitae ………………………………………………………………….......62..........136

Annex ……………………………………………………………………………….......64.........138



5

Cuvânt înainte

Teza de doctorat a fost elaborată sub îndrumarea domnului prof. univ. dr. ing. Neculae

ȘOFLETEA, căruia îi adresez sincere mulțumiri pentru întregul sprijin acordat. Pentru că m-a

acceptat ca doctorand, pentru înțelegerea, încurajarea și susținerea permanentă, îi rămân profund

recunoscător.

De asemenea adresez sincere mulțumiri domnului conf. dr. ing. Alexandru Ioan CURTU

pentru sprijinul acordat, pentru încurajări, pentru punerea la dispoziție a materialelor științifice

pentru analiza izoenzimelor și pentru instruirea și îndrumarea permanentă în laborator asupra

protocoalelor de lucru.

Mulţumesc totodată tuturor membrilor comisiilor şi tuturor profesorilor din cadrul

Departamentului de Silvicultură al Facultăţii de Silvicultură şi Exploatări Forestiere, pentru

amabilitatea de a consulta lucrarea şi de a formula recomandări pentru îmbunătăţirea acesteia.

Adresez mulţumiri tuturor colegilor doctoranzi din cadrul Departamentului de Genetică

forestieră pentru încurajări și sprijin.

Nu în ultimul rând, vreau să îi mulţumesc soţiei mele, Melania, pentru înţelegere,

sprijin şi încurajări.

Evaluarea diversității genetice în populații naturale de molid [Picea abies (L.) Karst.]

6

1. Introducere

Pentru o gestionare sustenabilă a resurselor forestiere, pe lângă o cunoaștere a caracteristicilor

ecologice și silviculturale este absolut necesară și cunoșterea caracteristicilor genetice ale unei

populații. Estimarea variabilității genetice pentru populațiile și speciile reprezentative autohtone

devine o sarcină primordială pentru construirea strategiilor de conservare durabilă în contextul

influențelor antropice în continuă creștere precum și a schimbărilor climatice. Cunoașterea

variabilității genetice reprezintă un important indicator al estimării biodiversității unei populaţii

(Reed and Frankham, 2003; Hughes et al., 2008). Chiar dacă în studiile efectuate în ultimii ani s-au

folosit în special markeri ADN, izoenzimele sunt încă foarte folosite ca markeri genetici în

determinarea variației genetice, aceasta fiind una din cele mai puţin costisitoare metode (Crawford,

1989). Izoenzimele sunt makeri codominanţi ce descriu un nivel relativ ridicat de polimorfism

genetic (Hamrick et al., 1992), fiind folosiți la descrierea modelelor geografice de variaţie a

diversității genetice având aplicabilitate în programele de conservare a resurselor genetice (Vicario

et al., 1995), evaluând impactul managementului forestier asupra diversității genetice (Curtu et al.,

2009 în Hosius, 1993; Hussendӧrfer, 1996).

Molidul este una din cele mai importante specii forestiere la nivel european, în România

afându-se pe locul al doilea după fag. În prezent este considerată principala specie pentru stocarea

carbonului din Carpați (Dutcă et al., 2009). Arealul natural şi de cultură reprezintă circa 24% din

suprafaţa totală a domeniului forestier (Șofletea și Curtu, 2007).

Numeroasele studii referitoare la variația genetică a molidului, realizate în ultimele decade au

contribuit la o sporire a informațiilor asupra structurii genetice a acestuia. Cele mai importante

studii au fost realizate în special în Europa Centrală (Giannini et al., 1991; Muller-Stark, 1995;

Goncharenko et al., 1995; Achere et al., 2005), dar și în statele Baltice (Krutovakii și Bergman,

1995; Kravchenko et al., 2008; Korshikov și Privalikihin, 2007). Studiile privind variația genetică

a molidului realizate în România au indicat un nivel moderat ce pare a fi o caracteristică a

molidului din acestă zonă a Europei. Cele mai recente analize desfășurate în arborete din țara

noastră fiind ale doamnei Ing. Maria Teodosiu în populațiile de molid din Obcinele Bucovinei

(Teodosiu, 2011).

Analizând diversitatea genetică într-un context spaţial putem înțelege mai bine dinamica

populaţiilor iar rezultatele pot avea aplicabilitate în managementul ecologic (Escudero et al.,

2003), dinamica spaţială a genotipurilor fiind influenţată de schimbările de mediu și activităţiile

umane (Knowles et al.,1992). Pentru analiza structurilor genetice la nivel microspațial conceptul

de autocorelaţie spaţială nu este o nou în domeniul cercetării evoluţiei şi ecologiei (Sokal şi Oden,


7

1978), find o metodă din ce în ce mai folosită. Recent, odată cu evoluția tehnicilor de prelucrare a

datelor şi a softurilor spaţiale statistice s-au creat oportunităţi privind evaluarea diversității

genetice la nivel spaţial (Manel et al., 2003; Sheldeman și Zonnevels, 2010). În cadrul acestor

metodologii noi de lucru includem si evaluarea distribuției spațiale a diversității genetice cu

ajutorul Sistemelor Informatice Geografice (GIS), putându-se realiza interpolarea parametrilor

genetici între populaţii precum şi la nivel microspațial între indivizi (Kozack et al., 2008; Hoffman

et al., 2003).

Pornind de la necesitatea descrierii variabilității genetice a molidului din România s-au ales 11

populații autohtone. Acestea sunt localizate în șase zone geografice reprezentative pentru arealul

natural al molidului din România.

2. Stadiul actual al cunoștinţelor privind evaluarea diversităţii genetice a molidului cu

ajutorul markerilor genetici primari

2.1 Aspecte privind originea și evoluția molidului

În Pliocen molidul devine o specie importantă ce domină vegetația Europei alături de Picea

abies ssp. obovata și Picea omorika, ocupând un areal geografic mai răspândit decât cel

contemporan (Oszast, 1973, din Tjoelker et al., 2007). Pe continentul European și Nord American

repetatele cicluri glaciare și interglaciare au condus la ample modificări ale arealului

(Hewitt,1996). Aceste modificări ale arealului au jucat un rol important în modelarea diversității

genetice (Tollefsrud et al., 2008). Caracterul fragmentat de azi al arealului molidului pe continentul

european, mai ales în partea centrală, este o consecință a distribuției acestor refugii glaciare

(Tjoelker et al., 2007).

Distribuția molidului în Europa a variat mult de la ultima etapă a glaciațiunii iar în zilele

noastre molidul poate fi împărțit în trei mari grupe, ce corespund refugiilor de unde a început

recolonizarea: Baltico-Nordică, Alpină și Hercino Carpatică (Lagercrantz și Ryman, 1990). Un

studiu având ca subiect polenul fosil la molid, prin analiza ADN-ului mitocondrial, a indicat cel

puțin șapte zone de refugiu glaciar al molidului în spațiul european în timpul ultimei glaciațiuni: în

câmpiile din Rusia, sud-estul Alpilor, sudul Masivului Boemian, nordul Alpilor Dinarici, nordul

Carpaților, sudul Carpaților și sud-vestul munților Balcani (Tollefsrud et al., 2008). Ca urmare a

diferitelor rute glaciare de colonizare, se constată diferențe ale variației genetice între zonele

arealului molidului. Zona nordică a arealului european, probabil fiind colonizată dintr-un singur

refugiu glaciar, prezintă o diferențiere mai mică genetică între populații, contrar zonei Central

Europene în care recolonizarea s-a realizat din mai multe centre, existând, mai ales în zona Alpilor,


8

diferențe genetice mari între populații. Carpații estici și munții de sud ai Bulgariei au fost probabil

surse adiționale de expansiune în Holocen, identificându-se valori mai scăzute ale variației

genetice (Latalowa și Van der Knaap, 2006; Feurdean et al., 2007).

2.2. Principalele caracteristici ecologice, diversitatea fenotipică și rasială

2.2.1. Morfologia și ecologia

Genul Picea A. Dietr. aparține familiei Pinaceae, o familie ce include și alți taxoni importanți ai

coniferelor cum ar fi cei din genurile Pinus, Abies și Larix. Morfologia molidului este în strânsă

legătură cu sistematica, genetica și ecologia lui. Specia are un polimorfism ridicat corespunzând cu

vasta împrăștiere a arealului natural din Scandinavia si Siberia până în sudul Europei (Przybylski

în Tjoelker et al., 2007). Molidul este una din cele mai răspândite specii din Europa. În coordonate

geografice acesta se întinde de la 41o15’ latitudine N până la 72

o15’ lat. N acoperind 31 de grade.

În longitudine se întinde de la 5o15’ E până la 154

o E (Tjoelker et al., 2007). În altitudine urcă până

la peste 2000m în Alpii Italieni, și coboară până la nivelul mării. Molidul apare în lanțurile

muntoase din centrul și sud-estul Europei, ținuturile joase din estul Europei și Peninsula

Scandinavă (Boratynska în Tjelker et al., 2007).

Figura 2.1 Arealul natural și de cultură al molidului în România (Șofletea și Curtu, 2007)

Natural and artificial distribution of Picea abies in România (Șofletea and Curtu, 2007)


9

Distribuția arealului natural și de cultură al Molidului în România se prezintă în figura 2.1. În

Romania în urma managementului defectuos arealul de cultură s-a extins mult față de arealul

natural, problema extinderii molidului înafara arealului natural se observă și în figura 2.1. În

prezent se estimiază că aproximativ 360000 ha de plantații de molid sunt instalate înafara arealului

(Șofletea și Curtu, 2007) rezultând arborete afectate de doborâturi de vânt, rupturi de zăpadă și

atacuri ale insectelor.

În România, molidul este considerat o specie de bază, ocupând peste 24 % (1.407.000 ha) din

suprafaţa pădurilor şi peste 35 % din volumul total al lemnului pe picior (Şofletea şi Curtu, 2007).

Suprafaţa cea mai mare a molidișurilor este concentrată în Carpaţii Orientali (figura 2.1), mai ales

în bazinele superioare ale Bistriţei, Vişeului, Someşului, Oltului, Trotuşului. În zona Carpaţilor de

Curbură arealul său se îngusteză, iar în Carpaţii Meridionali se fragmenteză considerabil,

concentrându-se în zonele înalte (Şofletea şi Curtu, 2007).

2.2.2. Diversitatea ecotipică și rasială

Molidul prezintă o mare variație intraspecifică. Numărul variantelor intraspecifice morfologice

și fiziologice descrise este cel mai mare dintre speciile genului, existând aproximativ 140 de

varietăți și forme (cultivate) cunoscute (Tjoelker et al., 2007). Cel mai important aspect al

taxonomiei speciei îl reprezintă relația dintre molidul comun (Picea abies) și molidul siberian

(Picea obovata). Studiile privind taxonomia speciei le-au tratat pe de o parte ca specii diferite

(Farjon, 2001), dar și ca subspecie geografică pentru molidul siberian.

Diferite forme ale coroanei sunt deseori întâlnite în populațiile montane. Molidul columnar are

o coroana îngustă și acoperă porțiuni mai mari din trunchi. Aceste exemplare întâlnite în

populațiile de înaltă altitudine sunt presupuse a fi mai eficiente în interceptarea razelor solare la

poziții joase ale soarelui, pentru o mai bună producție de biomasă (Pulkkinen, 1991). Corelațiile

morfo-ecologice-biologice la molid sunt evidente, multe dintre ele fiind foarte expresive. Coroana

piramidală până la columnară, cu vârful ascuțit la vârste înaintate, constituie o bună adaptare

pentru a mări rezistența molidului față de zăpezile abundente din aria sa de răspândire. Excelente

performanțe adaptative a dobândit în acest sens molidul columnar (Picea abies var. columnaris

(Jacques) Rehd.), întâlnit în Apuseni, unde se știe că zăpezile sunt abundente (Pârnuță, 1998).

În funcţie de caracteristicile climatice şi edafice locale se pot diferenţia o serie de populaţii

diferențiate adaptativ sub aspectul climatipului şi edafotipului (Stănescu et al., 1997), cum ar fi:

molidişurile adaptate la cantităţi reduse de precipitaţii, dar rezistent la climat aspru; molidişurile


10

din ţinuturile vestice ale ţării (munţii Poiana Ruscă), adaptate la un climat termic moderat;

molidişurile de mare altitudine; molidişurile de mică altitudine; molidişurile situate pe stâncării (în

special pe cele calcaroase); molidul de luncă, adaptat la un regim pedohidrologic special și

molidişurile de turbărie.

2.3. Conservarea resurselor genetice de molid

Exploatările excesive, poluarea mediului și modificările climatice amenință diversitatea

pădurilor. De-a lungul cursului filogenezei, arborii forestieri au dezvoltat strategii impresionante

pentru supraviețuire. Aceștia sunt caracterizați de o longevitate ridicată, produc o mare cantitate de

progenituri, dar care sunt supuși mai ales în primii ani de viață unei selecții severe. Datorită acestor

aspecte arborii vor putea supraviețui doar printr-o adaptare la schimbările mediului. Evoluția

mediului de azi întinde sistemul genetic la limită, fiind nevoie de o mai mare adaptare genetică a

speciilor pentru supraviețuirea lor, conservarea diversității genetice devine primordială (Hattemer,

1995). Scopul conservării resurselor genetice forestiere este de a asigura adaptabilitatea

populațiilor și speciilor într-un mediu în continuă schimbare, prin menținerea unui nivel

corespunzător de variabilitate genetică (Enescu et al., 1997).

În România în perioada 1993-1996 în cadrul I.C.A.S. s-au desfășurat lucrări pentru identificarea

și descrierea Resurselor Genetice Forestiere prin întocmirea Catalogului Național al Resurselor

Genetice Forestiere, Partea I, ediția 1996 (Lalu, 1996). Mai recent, ca urmare a necesității

revizuirii catalogului elaborat în 1996, pe baza rezultatelor științifice obținute în cadrul proiectului

COREGE FOREST și a datelor de specialitate din literatura autohtonă și internațională s-a elaborat

noua ediție a Catalogului Național al Resurselor Genetice (Pârnuță et al., 2011).

Situația resurselor genetice forestiere la molid din România este prezentată în tabelul 2.1.

Tabelul 2.1. Situația resurselor genetice forestiere la molid pe sectoare ecologice (după Pârnuță, 2011)

Norvay spruce forest genetic resouces by forest formations (after Pârnuță, 2011)

Nr.

crt.

Simbol

sector Denumirea formației forestiere

Numărul

nucleelor de

conservare

Suprafața %

1 10 Molidișuri 31

2514.4 19.46

2 1Be Molidișuri de limită altitudinală superioară, pure

sau în amestec

2

3 1Ce Molidișuri pe soluri mlăștinoase 1

4 1D Laricete și lariceto-molidișuri 3

5 1E Cembrete și cembreto-molidișuri 3

6 20 Păduri de amestec de fag cu rășinoase 48

7 30 Făgete montane 1


11

2.4. Estimarea variaţiei genetice cu ajutorul markerilor biochimici primari

(izoenzimele)

Studiul variabilității genetice cu ajutorul izoenzimelor permite o evaluare indirectă a statutului

resurselor genetice, deoarece izoenzimele reprezintă produși ai funcționării și decodificării genelor.

Acești markeri genetici permit estimarea heterozigoției, rata mutaților, fluxul de gene și

diferențierea genetică, astfel oferindu-se un răspuns mai obiectiv privind numărul optim al unei

populații și distribuția ei. Izoenzimele sunt de obicei rezultatul duplicării genelor. În timpul

evoluției, dacă funcția noii variante rămâne identică față de cea originală, atunci este foarte

probabil ca una sau cealaltă să se piardă prin acumularea mutaților, rezultând o pseudogenă. Dar

dacă mutația nu împiedică imediat enzima să funcționeze, ba chiar îi modifică funcția, atunci

ambele variante pot fi favorizate de selecția naturală și devin specializate în diferite funcții. Totuși

o reală amplitudine a diversității genetice utilizând un număr fix de markeri genetici izoenzimatici

este dificil de cuantificat. În ciuda acestor limitări, markerii izoenzimatici sunt valoroși în studiile

de conservare, ajutând la evaluarea diversității genetice a populațiilor. Ca atare, izoenzimele sunt

indicatori ai diversității genetice ce și-au dovedit valoarea în numeroase studii (Geburek, 1997;

Hamrick et al.,1992; Crawford, 1989). Aceștia se utilizează și în descrierea unor modele de

variație, în monitorizarea schimbărilor genetice din procesul evolutiv (Luo et al., 2005; Vicario et

al., 1995). Evidențierea structurii genetice între indivizi și între populații este esențială pentru

dezvoltarea strategiilor durabile în managementul și conservarea resurselor genetice (Luo et al.,

2005).

2.5. Evaluarea structurii genetice spaţiale a populaţiilor

Analiza diversității genetice într-un context spațial poate oferi o mai bună înțelegere a dinamici

populației iar rezultatele pot fi aplicate și în conservarea genetică (Escudero et al., 2003).

Distribuția spațială a genotipurilor este un produs al influenței mediului, inclusiv a modificărilor

cauzate de activitățile umane (Knowles et al., 1992). Conceptul de autocorelaţie spaţială nu este

unul nou în domeniul cercetării evoluţiei şi ecologiei (Sokal şi Oden, 1978), fiind o metodă din ce

în ce mai folosită în identificarea structurii spaţiale a genotipurilor. Mai nou, odată cu evoluația

tehnicilor de prelucrare a datelor şi a softurilor spaţiale statistice s-au creat oportunităţi pentru

aplicarea analizelor de diversitate genetică la nivel microspațial (Manel et al., 2003; Sheldeman et

al., 2010). Sistemele Informatice Geografice (GIS) oferă noi oportunităţi de calcul și interpretare a


12

variaţiei genetice la nivel spaţial, putându-se realiza o interpolare a parametrilor genetici între

populaţii, precum şi la nivel microspațial între indivizi (Kozack et al., 2008; Hoffman et al., 2003).

O mai bună cuantificare și evidențiere a interacțiunii între genom și mediu, în timp și spațiu, duce

la o mai bună înțelegere a dinamicii și evoluției.

Structura genetică a unei populații a fost în primul rând studiată prin estimarea deviației față de

așteptările panmictice pentru frecvența alelelor sau, testând heterogenitatea frecvențelor alelice

între populații (Heywood, 1991), ceea ce implică faptul că informația genetică la nivel de individ

este grupată în diferite modele spațiale de natură biologică (populații, subpopulații) -Escudero et

al., 2003.

Un important studiu realizat la molid de către Maria Teodosiu (Teodosiu, 2011) a indicat pentru

prima dată existența unei structuri genetice spațiale în populațiile de molid din România.

Autocorelația spațială a fost studiată prin analiza globală, iar rezultatele au fost concretizate într-o

corelogramă. Studiul autocorelației spațiale în populațiile de molid din România a arătat influența

ecosistemului asupra tiparelor de distribuție spațială a genotipurilor (Teodosiu, 2011).

2.6. Rezultate ale studiilor privind evaluarea variabilității genetice a molidului cu

ajutorul markerilor biochimici primari

Pe plan internaţional, studiile genetice asupra molidului sunt foarte numeroase, ele referindu-se

la o serie întreagă de aspecte, cum ar fi: diversitatea genetică, modelele macro şi microspaţiale de

variaţie, sistemul de încrucişare, dezechilibrul genic evaluat pentru perechi de gene etc. (e.g.

Geburek et al.,1998, Perry et al., 1999). La speciile de arbori s-a observat o variație mai mică a

aloenzimelor comparativ cu animalele sau alte tipuri de plante (Hamrick et al., 1992), iar

polimorfismul rezultat în urma cercetărilor este cu preponderență în interiorul populațiilor, între

populații evidențiindu-se o diferențiere foarte slabă (Hamrick et al., 1992, Muller-Starck et al.,

1995, Hamrick 2004).

În țara noastră, contribuţii la studiul variabilităţii genetice a molidului cu ajutorul markerilor

izoenzimatici, în populaţii montane din Masivul Postăvarul, au fost aduse de către Stănescu şi

Şofletea (1992). Analize mai noi au fost desfășurate în Piatra Craiului (Curtu, 2003). De asemenea,

au fost desfășurate importante studii privind variabilitatea genetică a molidului în populații de

molid din Obcinele Bucovinei (Teodosiu, 2011).

Structura genetică a molidului şi variația izoenzimelor a fost studiată de către Lagercrantz şi

Ryman (1990). Aceştia au realizat studiul în 70 de populaţii naturale din cadrul arealului molidului

din Europa. Studiul a vizat 22 de loci izoenzimatici. La fel ca majoritatea rășinoaselor, molidul a


13

arătat o mare variabilitate genetică, dar o mică diferenţiere între populaţii. Media heterozigoției per

populație este de 0.115. Aproximativ 5% din diferenţierile genetice sunt între populaţii iar distanţa

genetică este sub 0.04 în toate cazurile. Se sugerează faptul că structura populaţiilor reflectă

evenimente istorice recente corelate cu ultima glaciaţiune, iar molidul este încă în proces de

adaptare şi diferenţiere. Într-o concluzie, autorii indică o împărţire geografică a variaţiei alelelor,

afimând faptul că peste 80% din variaţia frecvenţei acestora se explică prin poziţia geografică.

În Carpaţii Ucrainieni, Korshikov şi Privalikhin (2007), au studiat structura genetică în

populaţii de Picea abies. S-a studiat diversitatea genetică şi diferențierea a nouă populaţii de molid

cu ajutorul analizei izoenzimelor. S-au analizat 20 de loci la nouă sisteme izoenzimatice şi s-au

identificat 71 de variante ale alelelor.

Variabilitatea genetică a molidului este studiată de Giannini et al. (1991) în populaţiile din

Italia la 21 de loci pentru care s-a calculat un nivel al heterozigoției He=0.165.

În populaţiile naturale din Letonia structura genetică, diversitatea şi diferenţierea molidului au

fost studiate de Goncharenko et al. (2005). Studiul s-a realizat în 5 populaţii naturale și pentru 16

sisteme izoenzimatice ce au codificat 26 de loci.

Muller-Starck (1995) a studiat 20 populaţii autohtone localizate în zone montane şi submontane

ale Elveţiei.

La 15 proveniențe ce fac parte din programul internațional IUFRO 1964/1968, Kannenberg și

Gross, 1999 a studiat variabilitatea genetică. Studiul s-a realizat la 10 enzime având un total de 19

loci. Proveniențele acopereau o largă răspândire a arealului (sudul Franței, nordul Greciei, Carpații,

Slovacia, estul Poloniei, vestul Siberiei și Scandinavia).

3. Scopul și obiectivele cercetărilor

3.1. Scopul cercetărilor

Scopul temei de cercetare îl reprezintă studiul variației genetice a molidului [Picea abies (L.)

Karst] din populații autohtone cuprinse în rețeaua NATURA 2000, cu ajutorul markerilor

biochimici primari (izoenzime). Distribuția geografică a populațiilor/metapopulațiilor eșantionate

permite evaluarea diversitații genetice globale a molidului din Carpații României la nivel

populațional și interpopulațional, în vederea certificării valorii genetice a acestora și a furnizării

datelor genetice care să fie folosite în stabilirea și derularea măsurilor de management pe termen

lung în aceste arii protejate, care să asigure conservarea resurselor genetice forestiere.


14

În evaluarea distribuției variației genetice a molidului la nivel european, pentru zona Carpaților

României nu existau suficiente date genetice, studiul diversității genetice și evaluarea prin markeri

cu putere mare de analiză fiind într-o fază incipientă.

De asemenea, datele obținute privind nivelul diversității intra și intepopulaționale vor putea fi

folosite pentru fundamentarea cercetărilor viitoare de ameliorare genetică a molidului, ori pentru

formularea de recomandări în controlul transferului de materiale forestiere de reproducere în

România.

3.2. Obiectivele urmărite

Pentru atingerea scopului enunțat s-au stabilit patru obiective de cercetare, după cum urmează:

- evaluarea diversității genetice intra și interpopulaționale în populaţii/metapopulații

autohtone reprezentative de molid cu ajutorul markerilor biochimici primari (izoenzime);

- analiza comparativă a structurii genetice a molidului în populații departajate altitudinal,

pentru a cuantifica posibile influențe ale gradientului altitudinal asupra variației genetice

izoenzimatice;

- analiza comparativă a structurii genetice a molidului din metapopulația Apuseni între

populații statistice particularizate sub aspect ecotipic (molidul de turbărie) și biotipic (Picea abies

var. columnaris), în comparație cu molidul cu coroană normală (Picea abies var. pyramidalis);

- analiza structurii genetice la nivel microspațial, prin studiul autocorelației spațiale globale

și locale, respectiv prin implementarea metodelor GIS.

4. Materialul şi metodele de cercetare

4.1. Localizarea cercetărilor

Pentru atingerea obiectivelor propuse s-a recoltat material biologic din 11 populații autohtone

de molid. Acestea sunt repartizate în șase zone geografice de studiu, reprezentative pentru arealul

molidului în România (figura 4.1.)

Pentru studiul variabilității genetice s-a avut în vedere ca arboretele eșantionate să fie mature,

bine conformate și sănătoase. S-au ales populații de altitudine mare pentru arealul natural al

molidului din România, acestea fiind mai puțin influențate de factorul antropic și implicit având un

grad mare de naturalețe. Cele 11 populații selectate pentru studiul variabilității genetice sunt

incluse în ariile protejate din rețeaua NATURA 2000.


15

Populațiile și metapopulațiile eșantionate în cadrul studiului sunt distribuite relativ uniform

după cum urmează: i) două populații în Metapopulația Maramureș; ii) o populație în Munții

Nemira; iii) două populații în metapopulația Postăvarul; iv) două populații în munții Parân; v) o

populație în Munții Poiana Ruscă și vi) trei populații în Munții Apuseni.

Figura 4.1. Distribuția geografică a populațiilor/metapopulațiilor analizate

Geographical distribution for the analyzed populations/metapopulations

Pentru analiza comparativă a variabilității genetice în populații individualizate ecotipic și/sau

biotipic, din interiorul a patru zone de studiu denumite în continuare metapopulații, s-au recoltat

probe dintr-un total de nouă populații. Astfel, în metapopulațiile Maramureș, Postăvarul și Parâng

s-au eșantionat arborii din câte două populații aflate la altitudini diferite. În cea de-a patra

metapopulație (Apuseni) s-au studiat trei populații statistice: i) o populație de molid de turbărie –

APS-1; ii) o populație de molid columnar (Picea abies var. columnaris); iii) o populație de molid

cu coroană normală (Picea abies var pyramidalis). Populațiile din cadrul unei metapopulații se află

la distanțe de aproximativ 2 km una față de alta.

Analiza structurii genetice microspațiale s-a realizat la trei populații: Postăvarul-culme, Poiana

Mică (ambele făcând parte din metapopulația Postăvarul) și populați Nemira.

4.2. Recoltarea materialului de cercetare

Din fiecare populație studiată s-a recoltat material biologic, lujeri de 10-20 cm bogați în

muguri, din arbori bine conformați cu o stare de sănătate bună. Recoltarea probelor s-a realizat în

perioadele de repaus vegetativ din 2009 până în 2011. Probele biologice s-au recoltat cu ajutorul

unei foarfeci telescopice de 7 m. Numărul de arbori din care s-a recoltat material biologic a variat

între 30 de exemplare în populația de molid cu coroana columnară din Munții Apuseni (valoare


16

minimă determinată de raritatea exemplarelor acestui biotip) și 100 exemplare în populația Nemira

(MNR). Un număr de 30 de arbori per populație se consideră suficient pentru surprinderea unui

procent ridicat al variației genetice (Leberg, 2002), dar în cercetările noastre mărimea

eșantionajului a fost în cele mai multe cazuri de 50-60 probe/populație. În total s-au recoltat probe

biologice pentru analize genetice din 695 arbori de molid.

Pentru a evita sau reduce posibilitatea recoltării de probe din arbori proveniți din regenerarea

din sămânță a aceluiași exemplar mamă, s-au ales arbori aflați la distanțe de 30-50 m unii față de

alții sau chiar mai mult. Acest principiu de bază s-a avut în vedere pentru toate populațiile studiate.

Din totalul de 11 populații studiate la trei dintre ele (Nemira - NMR, Postăvarul culme - PST-1 și

Poiana Mică - PST-2) pentru studierea structurii genetice microspațiale arborii au fost cartați cu

ajutorul unui GPS cu o precizie de 3-7 m.

4.3. Metoda de lucru în laborator

Extragerea și evidențierea izoenzimelor are la bază procesul de electroforeză, care reprezintă

metoda de separare și analiză a moleculelor proteice în funcție de mărimea și încărcătura lor

electrică sub influența unui câmp electric uniform. Diferența în mobilitate a enzimelor poate fi

direct legată de modificări, mutația unui locus genic cauzată de schimbări în lanțul aminoacizilor

(Slatkin și Arter, 1991).

Deoarece izoenzimele prezintă sensibilitate pentru mediul de migrare, analiza izoenzimatică

s-a realizat prin procesul de electroforeză în plan orizontal, prin două sisteme de evidenţiere a

izoenzimelor: i)Tris; ii)Ashton. Protocolul de extragere, interpretare și codificare a izoenzimelor

prin metoda de electroforeză orizontală a fost cel standard (Konnert şi Werner, 2004). S-au analizat

în total 12 sisteme izoenzimatice: Phosphoglucozo-izomeraza (PGI) E.C.5.3.1.9.,

Leucinaminopeptidaza (LAP) E.C.3.4.11.1, Aspartataminotransferaza sau

glutamatoxaloacetatranaminaza (AAT, GOT) E.C.2.6.1.1, Glutamatdehidrogenaza (GDH)

E.C.1.4.1.2, Menadionreductaza (MNR) E.C.1.6.99.2, Formiatdehidrogenaza (FDH) E.C.1.2.1.2

pentru sistemul enzimatic Ashton (ph=8,1) și Aconitaza (ACO) E.C.4.2.1.3, Isocitratdehidrogenaza

(IDH) E.C.1.1.1.42, Malatdehidrogenaza (MDH) E.C.1.1.1.37, Phosphogluzomutaza (PGM)

E.C.2.7.5.1, Shikimatdehidrogenaza (SKDH) E.C.1.1.1.25, 6-Phosphogluconatdehidrogenaza (6-

PGDH) E.C.1.1.1.44 pentru sistemul enzimatic Tris (pH=7,0). Ca urmare a analizei și interpretării

zimogramelor a 12 sisteme enzimatice pentru o parte din ele s-au constatat dificultăți de

interpretare a benzilor electroforetice. Astfel pentru analizele și calculul parametrilor diversității

genetice s-au folosit datele din analiza a doar șapte sisteme enzimatice, ce au indicat un nivel


17

ridicat de încredere în interpretarea benzilor electroforetice. Pentru analiza acestor sisteme

enzimatice s-au identificat 12 loci ce sunt codificați de 38 de variante alelice. Aceștia sunt

prezentatați în tabelul 4.1.

Metoda de laborator a electroforezei, colorarea și identificarea izoenzimelor presupune o

metodologie de lucru amplă, realizată pe durata a 6-7 ore pentru un ciclu electroforetic. Întreaga

metodologie și succesiune a etapelor de lucru a fost cea standard (Konnert și Werner, 2004).

Tabelul 4.1. Sistemele enzimatice studiate

Studied enzyme systems

Nr.

Crt. Sistemul enzimatic

Nomenclatura

E.C.

Locusul

genic

Sistemul de

separare

1 Phosphoglucozo-izomeraza (PGI) E.C.5.3.1.9 Pgi-A

Ashton

Pgi-B

2 Glutamatoxaloacetatranaminaza

(GOT) E.C.2.6.1.1

Got-A

Got-B

Got-C

3 Glutamatdehidrogenaza (GDH) E.C.1.4.1.2 Gdh-A

4 Formiatdehidrogenaza (FDH) E.C.1.2.1.2 Fdh-A

5 Isocitratdehidrogenaza (IDH) E.C.1.1.1.42 Idh-A

Tris Idh-B

6 Phosphogluzomutaza (PGM) E.C.2.7.5.1 Pgm-A

Pgm-B

7 Shikimatdehidrogenaza (SKDH) E.C.1.1.1.25 Skdh-A

4.4. Analiza și interpretarea parametrilor variabilității și diversităţii genetice

Studiul diversității genetice pentru populațiile de molid implică descrierea variației genetice

inter și intrapopulaționale, estimarea relațiilor genetice între populații și în final redarea expresiei

acestor relații.

Descrierea variației genetice în interiorul populațiilor s-a realizat prin calcularea

principalilor parametrii ai variației genetice (proporția locilor polimorfi (P), numărul mediu de

alele pe locus (Na), numărul efectiv de alele pe locus (Ne), heterozigoția așteptată (Ho),

heterozigoția observată (He), indicele de fixare, echilibrul Hardy-Weinberg, indicele bogăției

alelelor (A)) pentru fiecare populație în parte. Majoritatea indicilor (frecvența alelelor, P -

proporția locilor polimorfi, Na - numărul mediu de alele per locus, Ne - numărul efectiv de alele

per locus, Ho - heterozigoția observată, He - heterozigoția așteptată și F - indicele de fixare) s-au

calculat cu ajutorul softului GenAlEx 6.2 (Peakall și Smouse, 2006). Indicele bogăției alelelor (A)

s-a determinat cu ajutorul softului FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995). Acesta estimează numărul de


18

alele independent de mărimea populației. Deviația standard de la starea de echilibru Hardy-

Weinberg s-a estimat folosind testul 2 , realizat cu ajutorul softului POPGENE 1.3.1 (Yeh și

Yang, 1999).

Analiza variației genetice între populații s-a realizat prin calcularea unor serii de parametri

genetici (parametrii statistici F (Wright, 1965), analiza moleculară a variației genetice (AMOVA))

care estimează nivelul de variație genetică între populații și în interiorul populațiilor. Cu ajutorul

softului GenAlex 6.2, parametrii statistici F (Wright, 1965) s-au calculat pentru fiecare locus la

fiecare populație. Prin analiza moleculară a varianței (AMOVA) s-a examinat distribuția variației

moleculare în două componente: în interiorul populațiilor și între populații. Valorile indicelui de

diferențiere Fst s-a calculat ca medie totală pentru toate populațiile studiate cu ajutorul softului

Arlequin 3.5.1.2 (Exoffier et al., 2005). Valorile Fst s-au testat prin permutarea genotipurilor

individuale între populații. Valoarea P s-a calculat pentru 10000 de permutări.

Estimarea relațiilor genetice între populații s-a realizat prin calcularea distanțelor genetice

conform Cavalli-Sforza și Edwards.

Distanțele genetice reprezintă gradul deosebirii structurilor genetice a două sau mai multe

populații. Pentru calcularea distanțelor genetice s-a folosit metoda Cavalli-Sforza și Edwards.

Reprezentarea expresiilor relațiilor genetice s-a realizat prin procesul de grupare a

populațiilor în categorii bazate pe relațiile genetice comune. Expresia relațiilor genetice s-a realizat

prin construirea dendrogramei UPGMA folosind POPULATION 1:2.3.2 (Langella, 1999) și

estimarea izolării prin distanță a populațiilor cu ajutorul testului Mantel folosind GenAlEx 6.2

(Peakall și Smouse, 2006).

Dendrograma UPGMA s-a construit prin gruparea ierarhică a populațiilor pe baza distanțelor

genetice Cavalli-Sforza și Edwards.

Testul Mantel evaluează corelația dintre două matrici de distanțe (distanțe genetice și distanțe

geografice). Valoarea nulă indică inexistența unei corelați între cele două matrici. Coeficientul de

corelație Pearson (r) se folosește pentru a estima nivelul de încredere al corelației. Valoarea

coeficientului „r” variază între -1 și 1.

4.5. Structura spaţială a variaţiei genetice

4.5.1. Metode utilizate pentru analiza spațială a structurii genetice

Metoda autocorelaţiei genetice spaţiale analizează gradul de dependenţă între variațiile alelelor

arborilor analizaţi dintr-un spaţiu geografic. Testele de analiză spaţială includ în mod clasic


19

indicele Moran şi Geary. Distribuţia microspaţială a locilor s-a determinat prin metoda

autocorelatiei, prin calcularea coeficientului de autocorelare „r” care este foarte apropiat de

indicele statistic Moran I.

Autocorelaţia spaţială a fost determinată printr-o serie extinsă de analize realizate cu programul

GenAlEx 6.41 (Peakall şi Smouse, 2006). Indicele de corelaţie „r”, care arată legătura dintre

distanțele genetice şi cele geografice a fost calculat prin intermediul a două teste statistice:

autocorelaţia spaţială globală şi analiza locală a autocorelației spaţiale raportată la o suprafaţă

bidimensională (2DLSA).

Autocorelaţia spaţială globală determină apropierea genetică dintre perechi de indivizi separaţi

geografic pe clase de distanţe. Coeficientul de autocorelaţie spațială „r” are valori între -1 şi 1 şi

este asemănător indicelui Moran I. Metoda presupune permutarea aleatorie a tuturor indivizilor

dintr-o clasă geografică sub aspectul inexistenței unei structuri spațiale. Rezultatele obținute sunt

însumate într-o corelogramă.

Analiza locală a autocorelației spaţiale raportată la o suprafaţă bidimensională (2DLSA)

extinde metoda de investigare a autocorelaţiei la nivel local, de individ. Metoda este similară cu

procedurile şi testele statistice introduse de Anselin (Anselin, 1995) şi extinse de Ord şi Getis

(Ord şi Getis, 1995) şi Sokal (Sokal et al., 1998). Aceasta, spre deosebire de autocorelația spațială

globală, se calculează pentru grupuri de indivizi dintr-o populaţie, care se regăsesc în jurul unei

valori pivot. Această metodă poate surprinde grupări ale genotipurilor și în lipsa prezenței unei

autocorelații spațiale semnificative globale.

4.5.2. Utilizarea sistemelor informatice geografice (GIS) în analiza structurii genetice

spaţiale

Analiza structuri genetice spațiale s-a studiat cu ajutorul testului Anselin Local Moran’s I cu

ajutorul softului ArcGis (Mitchell, 2005; Anselin, 1995). Această metodă permite identificarea

unor zone de aglomerare ale indivizilor ce prezintă valori similare. În cazul studiului nostru această

valoare s-a stabilit prin gruparea locilor studiați pentru fiecare exemplar, formându-se un șir

genetic unic format din 24 de caractere. Aceste genotipuri s-au ordonat și li s-a alocat un număr

unic. Pentru fiecare valoare a autocorelației spațiale identificată la nivel de individ s-a calculat

gradul de semnificație statistic (P). Testul autocorelației spațiale Anselin Moran’s I identifică atât

corelațiile pozitive ale autocorelației spațiale cât și cele negative. Valorile negative indică un model

spațial dispersat, pe când cele apropiate de zero sunt specifice unei distribuții genetice spațiale

randomizate.


20

5. Rezultatele cercetărilor

5.1. Evaluarea diversității genetice în populații autohtone de molid din cuprinsul

rețelei NATURA 2000 cu ajutorul markerilor biochimici primari

5.1.1. Lecturarea zimogramelor

Procesul de electroforeză permite diferențierea variantelor izoenzimatice în funcție de distanța

de migrare între cei doi poli ai electrolitului, dependentă de masa moleculară a enzimelor. În acest

mod, lecturarea zimogramelor are ca rezultat realizarea corespondenței exacte dintre izoenzime și

alele. Astfel, prin analiza materialului extras din muguri (2n) arborii vor fi pentru locii genici

codificatori fie homozigoți (A1A1, A2A2), fie heterozigoți (A1A2). Datorită particularităților

sistemelor enzimatice și a structurii enzimelor (monomere, dimere, polimere), calitatea interpretării

datelor a variat de la un sistem la altul. Totuși, cazurile de incertitudine au fost eliminate fie prin

includerea în baza de date doar a sistemelor enzimatice cu lecturare clară, fie prin recalibrarea

datelor efectuată prin utilizarea de probe de referință, ori prin evaluări de intercorelare. Pentru

analiza variabilității izoenzimatice s-au interpretat aproximativ 220 de zimograme.

Figura 5.1. Exemplu de zimogramă la sistemul enzimatic GOT

Zymograme example for GOT enzymatic system

5.1.2. Frecvența și distribuția alelelor în cadrul populațiilor de molid

În urma analizei electroforetice, pentru evaluarea comparativă a diversității genetice între

populațiile studiate, doar șapte sisteme enzimatice au arătat un grad ridicat al calității

interpretării zimogramelor. Acestea vor fi folosite în continuare în calculul parametrilor

genetici: Formiatdehidrogenaza (FDH) E.C.1.2.1.2., Glutamatdehidrogenaza (GDH)

E.C.1.4.1.2., Aspartataminotransferaza (GOT) E.C.2.6.1.1., Isocitratdehidrogenaza (IDH)


21

E.C. 1.1.1.42., Phosphoglucoza-Isomeraza (PGI) E.C.5.3.1.9., Phosphoglucomutaza (PGM)

E.C.2.7.5.1., Shikimatdenidrogenaza (SKDH) E.C.1.1.1.25. (tabelul 5.1).

La nivelul acestor șapte sisteme izoenzimatice s-au interpretat în total 12 loci genici: Fdh-A,

Gdh-A, Goa-A, Got-B, Got-C, Idh-A, Idh-B, Pgi-A, Pgi-B, Pgm-A, Pgm-B, Skdh-A, codificați de

38 de variante alelice. Din acestea, 15 (39.4%) sunt comune la toate populațiile studiate. Locii cu

cele mai multe variante alelice au fost Pgm-A și Pgi- B, cu câte 4 alele iar Skdh-A cu 5 variante

alelice.

Tabelul 5.1. Frecvențele relative ale alelelor pentru fiecare locus la toate populațiile studiate

Alleles relative frequencies for each locus for all studied populations

Locus Alela APS-1 APS-2 APS-3 NMR PRG-1 PRG-2 PRS PST-1 PST-2 MMS-1 MMS-2

Fdh-A 1 0.000 0.000 0.017 0.000 0.017 0.025 0.008 0.000 0.000 0.006 0.000 2 1.000 1.000 0.983 1.000 0.983 0.975 0.992 1.000 1.000 0.994 1.000

Gdh-A

2 0.950 0.933 0.983 0.965 0.950 0.933 0.953 0.951 0.990 0.976 0.987

3 0.050 0.050 0.017 0.035 0.050 0.067 0.047 0.049 0.010 0.024 0.013

4 0.000 0.017 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Got-A

2 0.008 0.033 0.008 0.015 0.000 0.000 0.023 0.020 0.000 0.000 0.006

3 0.983 0.967 0.992 0.985 1.000 1.000 0.961 0.980 1.000 1.000 0.994

4 0.008 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.016 0.000 0.000 0.000 0.000

Got-B

1 0.000 0.000 0.008 0.015 0.017 0.000 0.000 0.000 0.010 0.024 0.026

2 0.992 1.000 0.992 0.950 0.967 1.000 1.000 1.000 0.990 0.976 0.968

3 0.008 0.000 0.000 0.035 0.017 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.006

Got-C

2 0.458 0.433 0.322 0.425 0.367 0.417 0.422 0.431 0.410 0.458 0.474

4 0.517 0.517 0.661 0.570 0.625 0.575 0.578 0.529 0.570 0.542 0.526

5 0.025 0.050 0.017 0.005 0.008 0.008 0.000 0.039 0.020 0.000 0.000

Idh-A

2 0.050 0.017 0.042 0.035 0.000 0.008 0.016 0.029 0.000 0.042 0.038

3 0.950 0.983 0.958 0.965 1.000 0.992 0.977 0.971 1.000 0.958 0.962

4 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.008 0.000 0.000 0.000 0.000

Idh-B

2 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.010 0.000 0.000

3 1.000 1.000 0.992 0.990 1.000 0.992 0.992 0.971 0.960 0.994 1.000

4 0.000 0.000 0.008 0.010 0.000 0.008 0.008 0.029 0.030 0.006 0.000

Pgi-A 2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.990 1.000 1.000 1.000

3 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.010 0.000 0.000 0.000

Pgi-B

1 0.008 0.000 0.000 0.000 0.000 0.008 0.000 0.000 0.030 0.030 0.026

2 0.333 0.483 0.237 0.300 0.367 0.483 0.336 0.206 0.300 0.259 0.321

3 0.658 0.517 0.754 0.690 0.633 0.508 0.648 0.775 0.660 0.699 0.641

4 0.000 0.000 0.008 0.010 0.000 0.000 0.016 0.020 0.010 0.012 0.013

Pgm-A

1 0.042 0.083 0.093 0.015 0.050 0.000 0.000 0.020 0.000 0.006 0.000

2 0.950 0.900 0.890 0.945 0.950 0.992 0.984 0.980 0.990 0.958 0.955

3 0.008 0.017 0.017 0.035 0.000 0.008 0.016 0.000 0.010 0.036 0.026

4 0.000 0.000 0.000 0.005 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.019

Pgm-B

1 0.025 0.000 0.000 0.000 0.000 0.033 0.008 0.000 0.000 0.000 0.000

2 0.975 1.000 1.000 1.000 1.000 0.967 0.992 0.990 0.990 0.988 0.974

3 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.010 0.010 0.012 0.026

Skdh-A

1 0.017 0.033 0.076 0.020 0.000 0.042 0.000 0.029 0.010 0.054 0.064

2 0.008 0.033 0.008 0.010 0.017 0.075 0.023 0.000 0.000 0.000 0.006

3 0.950 0.917 0.907 0.960 0.975 0.875 0.945 0.971 0.990 0.946 0.923

5 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.008 0.000 0.000 0.000 0.000

6 0.025 0.017 0.008 0.010 0.008 0.008 0.023 0.000 0.000 0.000 0.006


22

Per ansamblul celor 11 populații, nici un locus genic dintre cei interpretați nu a fost monomorf,

însă la locusul Pgi-A, alela A4 a prezentat variație doar în populația de culme Postăvarul (PST-1).

Pe de altă parte, separat în cazul populațiilor/metapopulațiilor au fost identificate cazuri de

monomorfism. Astfel, în populațiile APS-2 și PRG-1, a fost găsit cel mai ridicat număr de loci

monomorfi, iar cel mai scăzut număr de loci monomorfi (2) a fost identificat în populațiile APS-3,

PRS, PST-1 și MMS-1.

5.1.3. Analiza variabilității genetice izoenzimatice

5.1.3.1. Date sintetice genotipice și alelice

Ca urmare a adiționării genotipurilor identificate pentru toți locii analizați, pentru fiecare

exemplar a rezultat structura sa genetică de ansamblu, sub forma unui șir de genotipuri specifice

celor șapte sisteme enzimatice evaluate. Analiza acestor genotipuri cumulate la nivel individual a

arătat că pentru cei 695 arbori din eșantionul de studiu, există 116 (16,7%) variante genetice unice

(la nivelul celor 12 loci analizați). Patru combinații de genotipuri au fost cele mai frecvent

identificate la 62% din indivizii analizați. Pe baza numărului de genotipuri unice identificate în

fiecare locație de studiu s-a calculat un indicator ca raport între acest număr și mărimea

eșantionului din populația/metapopulația respectivă, în funcție de care s-a construit distribuția

geografică a acestor genotipuri unice cumulate (figura 5.2). Se constată că frecvența acestora este

mai mare pentru Munții Poiana Ruscă și Munții Apuseni, adică în zonele în care probabil s-a

realizat o izolare reproductivă mai mare față de fluxul genic din alte areale carpatice. Valoarea cea

mai mică a rezultat pentru metapopulația Munții Maramureșului, ceea ce indică o panmixie amplă

în zona respectivă în care este implicat fluxul de gene din zona Carpaților Nordici.

Figura 5.2. Distribuția spațială a

frecvenței genotipurilor unice

Spatial distribution of unique

genotypes frequencies


23

Pe de altă parte, cercetările efectuate au condus la identificarea în patru populații a cinci alele

particulare: alela Gdh-A-4 în populația de molid columnar APS-2; Idh-A-4 și Skdh-A-5 în

populația PRS; Pgi-A-3 în populația de culme PST-1 și Idh-B-2 în populația de joasă altitudine

PST-2.

Valorile parametrilor genetici pentru fiecare locus sunt prezentate în tabelul 5.2. Astfel, numărul

mediu de alele per locus (Na) a variat între 1.091 la locusul Pgi-A și 3.364 la locusul Skdh-A.

Numărul efectiv de alele pe locus (Ne) a înregistrat cea mai mică valoare tot la locusul Pgi-A

(1.002), respectiv valoarea cea mai mare s-a calculat la locusul Got-C (2.008). Valorile

heterozigoției așteptate, echivalentă cu diversitatea genetică, au păstrat același raport, cea mai

scăzută valoare fiind evidențiată la locusul Pgi-A (0.002) iar locusul Got-C a avut cea mai ridicată

valoare (0.501), fiind urmat de locusul Pgi-B (0.451). Indicele de fixare F a fost negativ la toți locii

studiați, indicând un exces de heterozigoți. Cea mai mare valoare a indicelui de fixare (F=-0.070)

s-a identificat la locusul Pgi-B.

Exceptând locusul Pgi-A, care a prezentat doar două variante alelice, din care una a fost

identificată la un singur exemplar, locii studiați au avut un nivel al heterozigoției cuprins între

1.3% (Fdh-A) și 50.0% (Got-C).

Tabelul 5.2. Parametrii diversității genetice calculați la nivelul locusului alelic

Genetic diversity parameters for each alelic locus level

Loci Na Ne Ho He F Fdh-A 1.455 1.013 0.013 0.013 -0.015 Gdh-A 2.091 1.082 0.078 0.074 -0.040 Got-A 1.818 1.026 0.025 0.025 -0.018 Got-B 1.909 1.031 0.030 0.029 -0.021 Got-C 2.727 2.008 0.509 0.501 -0.017 Idh-A 1.909 1.054 0.052 0.050 -0.032 Idh-B 1.727 1.021 0.020 0.020 -0.015 Pgi-A 1.091 1.002 0.002 0.002 -0.010 Pgi-B 3.091 1.834 0.482 0.451 -0.070

Pgm-A 2.636 1.099 0.092 0.087 -0.043 Pgm-B 1.636 1.023 0.022 0.022 -0.018 Skdh-A 3.364 1.128 0.117 0.110 -0.049

Na- numărul de alele per locus; Ne- numărul efectiv de alele per locus; Ho- heterozigoția observată; He-

heterozigoția așteptată; F- indicele de fixare.

5.1.3.2. Structura genetică în interiorul populațiilor

Pentru analiza comparativă a diversității genetice în cele 11 populații de molid, au fost calculați

cei mai importanți parametri ai diversității genetice, prezentați în tabelul 5.3. Cele 11 populații se

grupează în șase locații de studiu (zone geografice din arealul natural al molidului în România),


24

astfel că unele dintre aceste analizele s-au făcut atât la nivelul a 2-3 populații locale, cât și cumulat,

pentru metapopulația respectivă.

În medie, proporția de loci polimorfici pentru cele 11 populații a fost de 74.2% și a variat între

58.3% (APS-2 și PRG-1) și 83.3% (APS-3, PST-1, MMS-1 și PRS). Așa cum era de așteptat, se

constată o creștere a valorilor pentru acest parametru în populațiile formate dintr-un număr mai

mare de exemplare.

Pentru a elimina efectele mărimii diferite a eșantionajului în populațiile analizate, s-a calculat

parametrul statistic bogăția alelică (A). Cele mai mari valori au fost găsite în populația molidului

columnar APS-2 (2.00) și în populația molidului de turbărie APS-1 (1.94), ambele localizate în

metapopulația Apuseni. Cele mai mici valori ale parametrului bogăției alelice au fost identificate în

populațiile PRG-1 (1.67) și PST-2 (1.74).

În ceea ce privește nivelul heterozigoției așteptate (He), care desemnează mărimea diversității

genetice, un parametru foarte important pentru identificarea, conservarea și ameliorarea resurselor

genetice forestiere, rezultatele sunt extrem de interesante. În primul rând pentru faptul că valoarea

cea mai mare (He=0.134) s-a înregistrat în populația statistică de molid columnar din Munții

Apuseni (APS-2), în pofida faptului că acest biotip se regăsește prin exemplare sporadice în masa

cvasicontinuă de molid comun. Nivelul mediu al heterozigoției este de 11.5% în cele 11 populații,

fiind mai redus cu 14.2% față de valoarea cea mai mare înregistrată în populația APS-2. Cea mai

mică valoare a diversității genetice a fost înregistrată în populația de joasă altitudine din Masivul

Postăvarul (PST-2, He=0.096), fiind inferioară cu 16.5% față de media celor 11 populații, respectiv

cu 28.3% față de populația cu valoarea He cea mai mare.

Valoarea medie a indicelui de fixare indică un mic deficit de homozigoți pe ansamblul

populațiilor studiate (F=-0.033), dar și la nivelul fiecăreia dintre ele (tabelul 5.3.). Cea mai mare

deviație de la echilibrul Hardy-Weinberg (8.2% deficit de homozigoți ) a fost înregistrată în

populația de molid columnar din Munții Apuseni (APS-2).

Considerând populațiile dintr-o zonă geografică ca făcând parte dintr-o singură metapopulație,

afirmație plauzibilă datorită continuității arealului molidului în zonele geografice studiate, s-au

calculat parametrii diversității genetice și în cazul acestui sistem de referință. Așa cum era

previzibil, ca efect al colectivităților statistice majorate, în toate cele 4 metapopulații (APS, PRG,

PST și MMS), valorile proporțiilor locilor polimorfi și valoarea numărului de alele per locus a

crescut. Nu s-a modificat însă valoarea indicelui bogăției alelice, ceea ce reconfirmă utilitatea

determinării și interpretării acestuia în cazurile de variație a mărimii eșantionajului de analiză.

Cea mai mare diversitate genetică s-a identificat în metapopulația Apuseni, indicele

heterozigoției având o valoare de 0.125 (figura 5.3). Aceasta fiind urmată de metapopulația Parâng,


25

populația Nemira și metapopulația Maramures. Cele mai mici valori fiind identificate în populația

Poiana Ruscă și metapopulația Postăvarul. Valoarea medie a indicelui heterozigoției (He) calculate

pentru cele 6 regiuni de areal a fost însă identică cu cea determinată pentru ansamblul celor 11

populații, confirmându-se astfel corectitudinea determinărilor parametrilor genetici.

Analiza bogăției alelelor (A), parametru ce nu ține cont de mărimea populației, ne indică cele

mai ridicate valori în metapopulația Apuseni și populația Nemira. Deși nivelul valorii

heterozigoției a fost unul ridicat pentru metapopulația PRG aceasta se alătură metapopulației PST

și împreună indică cea mai scăzută valoare a bogăției alelelor (figura 5.4).

Indicele de fixare (F) calculat ca medie între cele șase zone de studiu a indicat un deficit mai

scăzut al homozigoților (F=-0.026) față de valoarea medie calculată pentru varianta de studiu cu 11

populații. Cea mai mare abatere de la echilibrul Hardy-Weinberg (3.7%) între cele șase locații a

fost înregistrată în cazul molidului din Munții Poiana Ruscă (PRS).

Populația cea mai apropiată de starea de echilibru Hardy-Weinberg a fost APS-2 cu o abatere

de doar 1.6%.

Tabelul 5.3. Parametrii diversității genetice calculați pentru fiecare populație și metapopulație

Genetic diversity parameters for each population and metapopulation

P sau M N P(%) Na Ne A Ho He F

APS-1 60 75.0% 2.250 1.205 1.944 0.126 0.122 -0.036

APS-2 30 58.3% 2.000 1.237 2.000 0.150 0.134 -0.082

APS-3 60 83.3% 2.250 1.176 1.922 0.123 0.117 -0.039

#APS 150 91.6% 2.667 1.205 1.955 0.130 0.125 -0.031

PRG-1 60 58.3% 1.833 1.178 1.665 0.113 0.106 -0.042

PRG-2 60 75.0% 2.083 1.218 1.816 0.133 0.126 -0.039

#PRG 120 83.3% 2.333 1.200 1.740 0.123 0.118 -0.030

PST-1 50 83.3% 2.000 1.175 1.870 0.109 0.106 -0.031

PST-2 50 66.6% 2.000 1.176 1.743 0.098 0.096 -0.016

#PST 100 91.6% 2.333 1.175 1.807 0.104 0.102 -0.017

MMS-1 83 83.3% 2.083 1.185 1.810 0.110 0.112 -0.013

MMS-2 78 75.0% 2.250 1.203 1.912 0.119 0.120 -0.016

#MMS 161 91.6% 2.500 1.194 1.861 0.114 0.116 -0.012

NMR 100 75.0% 2.333 1.187 1.923 0.119 0.116 -0.029

PRS 65 83.3% 2.250 1.188 1.897 0.121 0.112 -0.037

Media 63.2* 74.2%* 2.121* 1.193* 1.864* 0.120* 0.115* -0.033*

115.8** 86.1%** 2.403** 1.192** 1.864** 0.119** 0.115** -0.026*

* media valorilor parametrilor genetici între populații; ** media valorilor parametrilor genetici între

locațiile de studiu; # metapopulații

Na- numărul de alele per locus; Ne- numărul efectiv de alele per locus; Ho- heterozigoția observată; He-

heterozigoția așteptată; F- indicele de fixare.


26

Figura 5.3. Distribuția spațială a marimii heterozigoției (He)

Heterozygosity spatial distribution

Figura 5.4. Distribuția spațială a bogăției alelelor (A)

Allelic richeness spatial distribution


27

5.1.3.3. Structura genetică interpopulațională

Diferențierea genetică a populațiilor s-a studiat prin estimarea indicelui Fst (Weir și Cockerham,

1984). Valoarea medie pentru populațiile de molid la nivelul ansamblului teritoriului Carpațiilor

României a fost foarte redusă (Fst=0.0092), sugerând existența unui nivel apreciabil de

uniformitate genetică la nivelul locilor enzimatici. Dealtfel, această constatare conduce la

concluzia că locii analizați sunt cu un nivel ridicat de neutralitate, conținând ca atare o valoare

selectivă redusă. Valorile indicelui de diferențiere Fst au fost calculate atât între cele 11 populații

statistice de molid, cât și între cele șase zone geografice de areal (tabelul 5.4.). Se observă o

variație a indicelui Fst de la numai 0.002 între populațiile din Munții Maramureș, până la 0.016

între populația de vale din Munții Parâng-PRG-2 și populația molidului cu coroană normală din

Munții Apuseni-APS-3. Valori mai mari ale diferențierii genetice (Fst=0.014 - 0.015) au fost

înregistrate între cele două populații din Masivul Postăvarul și populația molidului columnar din

Munții Apuseni (APS-2). Populația molidului columnar din Munții Apuseni (APS-2) s-a situat cel

mai aproape din punct de vedere genetic față de populația Poiana Ruscă (Fst=0.007).

Valorile recalculate ale indicelui de diferențiere între cele șase zone de studiu au variat numai

între 0.003 și 0.007, indicând un nivel ridicat de uniformitate la nivelul locilor izoenzimatici

analizați. Valorile Fst au indicat cel mai ridicat grad de diferențiere între metapopulațiile PRG și

NMR, PST și MMS (Fst=0.007).

Tabelul 5.4. Valorile indicelui de diferențiere Fst

Parweise Fst values for populations and for regions APS-1 0.000 ***** *APS *NMR *PRG *PRS *PST *MMS

APS-2 0.007 0.000 ***** 0.000 0.003 0.005 0.004 0.005 0.003 *APS

APS-3 0.008 0.013 0.000 ***** 0.000 0.007 0.004 0.004 0.003 *NMR

NMR 0.004 0.010 0.007 0.000 ***** 0.000 0.004 0.007 0.007 *PRG

PRG-1 0.007 0.010 0.010 0.006 0.000 ***** 0.000 0.004 0.005 *PRS

PRG-2 0.009 0.010 0.016 0.012 0.010 0.000 ***** 0.000 0.005 *PST

PRS 0.004 0.007 0.009 0.004 0.006 0.007 0.000 ***** 0.000 *MMS

PST-1 0.006 0.014 0.008 0.005 0.010 0.015 0.005 0.000 *****

PST-2 0.010 0.015 0.012 0.008 0.009 0.013 0.007 0.007 0.000 *****

MMS-1 0.004 0.011 0.006 0.003 0.008 0.012 0.005 0.005 0.007 0.000 *****

MMS-2 0.005 0.011 0.008 0.004 0.010 0.010 0.006 0.008 0.008 0.002 0.000

APS-1 APS-2 APS-3 NMR PRG-1 PRG-2 PRS PST-1 PST-2 MMS-1 MMS-2

*Valori calculate prin gruparea populațiilor pe regiuni geografice din arealul studiat

În tabelul 5.5. sunt prezentate valorile Fst calculate la 10000 de permutări pentru fiecare locus.

Se poate observa la locii Pgi-B, Pgm-A și Skdh-A prezența celor mai mari valori ale indicelui de


28

diferențiere Fst, indicând importanța acestor loci în diferențierea populațiilor. Valoarea medie Fst a

fost de 0.0092, indicând faptul că mai puțin de 1% din variația genetică este datorată diferențierii

între populații.

Structura diversității genetice în interiorul și între

populații a fost estimată cu ajutorul testului AMOVA

(figura 5.5), construit pe baza distanțelor genetice Nei, cu

ajutorul softului GenAlEx. Analiza moleculară a varianței

s-a efectuat atât între cele 11 populații studiate (a), cât și

între cele 6 regiuni geografice de existență a

populațiilor/metapopulațiilor (b). Testul AMOVA confirmă

valorile mici ale diferențierii între populații, de maxim 2%.

Prin luarea în calcul a metapopulațiilor se observă un nivel

chiar mai mic de diferențiere, de numai 1%, valoare

concordantă cu cea determinată pentru Fst.

a b

Figura 5.5. Analiza varianței moleculare (AMOVA)

Analysis of molecular variance (AMOVA)

Chiar dacă Fst și AMOVA au indicat nivele reduse de diferențiere genetică, s-a considerat utilă

o analiză de tip „cluster”, pe baza căreia se pot surprinde afinitățile genetice determinate de istoria

evoluției postglaciare a molidului din Carpații României. Astfel, dendrograma UPGMA (figura

5.6) construită prin calcularea distantelor genetice Cavalli-Sforza arată modul de grupare și

Între populații

2%

În interiorul populațiil

or98%

AMOVA-între populații- Între

regiuni1%

În interior

99%

AMOVA-între regiuni-

Tabelul 5.5. Valorile indicelui de

diferențiere Fst calculate la nivelul

fiecărui locus

Fst values for each locus

Locus Fst P(10000permutări)

Fdh-A 0.0043 0.40

Gdh-A 0.0025 0.60

Got-A 0.0050 0.31

Got-B 0.0089 0.06

Got-C 0.0002 0.90

Idh-A 0.0035 0.48

Idh-B 0.0056 0.25

Pgi-A 0.0021 0.73

Pgi-B 0.0188 0.00

Pgm-A 0.0175 0.00

Pgm-B 0.0079 0.08

Skdh-

A

0.0129 0.00

Media 0.0092 0.00


29

afinitățile genetice dintre populații la nivelul locilor genici studiați. Analiza a fost făcută la 10000

de permutări. Deși indicele de diferențiere a populațiilor Fst a arătat că populațiile sunt

asemănătoare din punct de vedere genetic în proporție de 99%, metoda de grupare ierarhică

(UPGMA) a populațiilor a reușit totuși să surprindă o grupare a populațiilor în trei ramuri. Un prim

grup este format din cinci populații (PRG-1, PRG-2, APS-1, APS-2 și PRS) cu areal în

partea de vest și sud-vest a Carpaților, un altul, excepție făcând populația APS-3, este localizat în

partea de est a Carpaților României,

iar al treilea este format din cele două

populații din Masivul Postăvarul. În

cadrul dendrogramei UPGMA, cu

excepția populațiilor (PRG-2 și PRS)

care s-au grupat împreună, cele mai

mici diferențe genetice au fost arătate

între populații apropiate geografic

(PST-1 și PST-2, MMS-1 și MMS-2,

APS-1 și APS-2). Totuși, doar în cazul

a două ramuri valorile „boostrap” au

depășit pragul statistic de 50% (figura

5.6)

În același context al analizei

structurilor genetice rezultate la nivel

macrospațial, corespondența dintre distanțele geografice și cele genetice a fost verificată prin

efectuarea testului Mantel, realizat la 9999 de permutări. Gradul izolării prin distanță s-a analizat

atât între cele 11 populații (figura 5.7 - a), cât și între cele șase zone geografice (figura 5.7 - b). Din

ecuația dreptei de regresie și a coeficientului R2

se observă că doar 4.6% din distanțele genetice

dintre populații sunt influențate de distanțele geografice (R2

=0.0456, p=0.080), în primul caz,

respectiv în proporție de numai 1,4% în cel de-al doilea caz. Valoarea mai mare a corelației între

distanțele genetice și cele geografice între cele 11 populații pare a fi neașteptată. Totuși, această

situație poate fi determinată de analiza realizată gradiental la nivelul metapopulațiilor PST, MMS

și PRG, între care au rezultat unele mici diferențe, acestea putând fi generate de presiunea selectivă

diferită în populații de mare și de mică altitudine din aceeași metapopulație.

Analizând corespondența distanțelor geografice cu cele genetice între cele patru metapopulații

(APS, PRG, PST, și MMS) și cele două populații (PRS, NMR) se poate observa o corelație mai

scăzută decât în cazul celor 11 populații R2=0.0135 (p=0.280).

Figura 5.6. Dendrograma UPGMA calculată pe baza

distanțelor genetice Cavally-Sforza

Unweighted Pair Group Method whith Arithmetic Mean

(UPGMA) based on Cavally-Sforza genetic distances


30

Valoarea coeficientului de corelație Pearson (R) s-a calculat pentru ambele cazuri între

distanțele genetice Cavalli-Sforza și distanțele geografice, metapopulațiile aflându-se la distanțe

cuprinse între 100 și 300 km.

a) între populații b) între regiuni

Figura 5.7. Corelația dintre distanțele genetice Cavalli-Sforza și distanțele geografice între

populații/metapopulații. Testul Mantel

Corelation between Cavalli-Sforza genetic distances and geographic distances for

populations/metapopulation. Mantel Test

5.1.4 Discuții

Nivelul diversității genetice identificat în populațiile de molid din România este similar cu cel

raportat la conifere (Hamrick et al., 1992). Totuși valorile identificate de noi sunt mai mici decât în

alte populații de molid din România (Teodosiu, 2011; Teodosiu în Mihai, 2009) precum și din

Carpații Ukainieni (Korshikov și Privalikhin, 2007). Comparațiile între rezultatele obținute în

diferite studii trebuie totuși făcute cu reținere deoarece fiecare analiză se bazează pe un set diferit

de markeri genetici și alele, etc. (Lagercrantz și Ryman, 1990). Deși numărul de loci (12) folosit în

cazul de față pentru descrierea variabilității genetice a molidului din România este mai mic

comparativ cu alte studii, cum sunt cele raportate de Lagercrantz și Ryman (1990), Krutovskii și

Bergmann (1995), proporția locilor polimorfi și numărul de alele per locus nu diferă foarte mult.

Ca și în alte studii, nivelul variației genetice s-a observat cu preponderență în interiorul

populațiilor, fiind foarte redus între acestea (Lewandowki și Burczyk, 2002; Korshikov și

Privalikhin, 2007; Goncharenko et al., 1995; Kravchenko et al., 2008).

S-au identificat cinci alele rare în populațiile de molid din România. Două alele (Idh-A-4 și

Skdh-A-5) au fost identificate în populația izolată din Poiana Ruscă, alte două în populațiile din

Masivul Postăvarul și una în populația molidului columnar din munții Apuseni (APS-1). Prezența

y = 1027,9x + 144,88R² = 0,0135

0,000

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

300,000

350,000

0,000 0,050 0,100

Dis

tan

țele

ge

ogr

afic

e

Distanțele genetice Cavalli-Sforza

Y

Linear (Y)

y = 1921,6x + 51,468R² = 0,0456

0,000

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

300,000

350,000

0,000 0,050 0,100

Dis

tan

țele

ge

ogr

afic

e

Distanțele genetice Cavalli-Sforza

Y

Linear (Y)


31

alelelor rare și particularitatea frecvențelor alelice din metapopulația Postăvarul poate explica

poziția separată din dendograma UPGMA a populațiilor din zona respectivă. Ca și în alte populații

din Europa (ex. 20 de populații din Elveția - Muller-Starck, 1995), în special locusul Skdh-A dar și

locii Pgm-B și Fdh-A indică modele de variație geografică. Unele alele rare identificate în urma

analizei frecvențelor alelice au fost găsite și în alte populații de molid, mai ales în cele din Europa

Centrală. Astfel: i) alela rară identificată în metapopulația APS (Gdh-A-4) a fost raportată și în opt

din nouă populații din Carpații Ucrainieni (Korshikov și Privalikhin, 2007); ii) în programul de

testare a 15 proveniențe IUFRO, alela Skdh-A-5 identificată în populația PRS a fost observată în

una din proveniențe și Idh-B-2 la patru proveniențe (Kannenberg și Gross, 1999).

Numărul de alele per locus (Na) a variat de la 1.80 la 2.60. Aceste valori sunt mai ridicate decât

în alte studii ce au analizat populații din România. Astfel, în nouă populații din Obcinele Bucovinei

numărul de alele per locus a variat de la 1.70 la 2.10 (Teodosiu, 2011); aceste valori sunt similare,

totuși, cu cele determinate de noi în populațiile din Maramureș. Valori similare pentru numărul de

alele per locus au fost raportate de Korshikov și Privalikhin (2007) pentru nouă populații din

Carpații Ucrainieni (valoarea Na a variat între 2.10 și 2.65), precum și pentru populații din Munții

Alpi și Alpii Dinarici (Giannini et al., 1991; Ballian et al., 2007). Valori mai ridicate ale

parametrului Na, de până la 2.5, au fost identificate în populații din Elveția, precum și în populații

din nordul Europei, din Ucraina, Suedia și Rusia (Muller-Starck, 1995; Krutovskii si Bergmann,

1995; Goncharenko et al., 1995).

Indicele bogăției alelelor (A) este unul din cel mai folosit indicator al structurii și variației

genetice (Leberg, 2002). Acesta indică un numărul așteptat de alele dintr-un eșantion de o mărime

arbitrară. Calculul indicelui bogăției alelelor s-a efectuat în cazul nostru pentru o populație

standard de 30 de exemplare, valoare impusă de mărimea eșantionului analizat în populația

statistică de molid columnar din Munții Apuseni. Valoarea cea mai ridicată s-a calculat pentru

metapopulația APS, în special la molidul columnar din populația APS-2. În acest context, este

notabil că cea mai mare valoare a indicelui bogăției alelelor (A=2.0) a fost corelată cu cea mai

mare valoare a diversității genetice (He=0.134) identificată în aceeași populație.

Valoarea medie a heterozigoției așteptate (He=0.115) este similară cu cea identificată la 70 de

populații din întregul areal natural al molidului în Europa (Lagercrantz și Ryman, 1990). Aceeași

valoare a diversității genetice a fost găsită și în Carpații din Slovacia, unde valoarea heterozigoției

a variat între 0.09 și 0.111 (Krajmerova și Langauer, 2000), și în Munții Šumava (Mánec, 1999).

Valorile indicelui heterozigoției identificate la populațiile studiate precum și la cele apropiate

geografic din Carpații Ucrainieni indică o variabilitate genetică mai mică a molidului din aceste

zone geografice, comparativ cu alte părți ale Europei (Korshikov și Privalikhin, 2007). Valori mai


32

ridicate ale diversității genetice (He=0.135-0.156) au fost găsite în Serbia de către Milovanovic și

Sijaric-Nikolic (2010) și în Alpii Dinarici din Bosnia, He= 0.127-0.138 (Oršanić et al., 2007).

Valori ridicate au fost de asemenea identificate și în populațiile din Italia, Germania, Suedia, Rusia

și Letonia (Krutovsky și Bergmann, 1995; Goncharenco et al., 1995).

Nivelul heterozigoției identificat în populațiile studiate poate avea legătură cu istoria acestor

populații (ex. recolonizarea postglacială), așa cum a semnalat și Muller-Starck (1995). În studiile

de recolonizare postglaciară a molidului în Europa, bazate pe variația alozimelor și analize de

polen fosil, s-a sugerat ipoteza unei colonizări vestice (europene). Aceasta se pare că s-ar fi realizat

din trei refugii glaciare: unul localizat în zona Moscovei de azi, altul în Munții Carpați (Polonia de

azi) și un al treilea în Alpii Dinarici (Lagercrantz și Rymann, 1990). Existența unui refugiu glaciar

în Munții Carpați a fost evidențiată printr-o răspândire timpurie a molidului în România (11000-

10500 ani BP), din locații situate în nord-vestul și nordul Carpaților, existând posibilitatea

prezenței unui refugiu glaciar în lanțul sudic al Carpaților, în zona Transilvaniei de azi (Feurdean et

al., 2011). În cele șase locații studiate, se poate observa cea mai mare valoare a heterozigoției în

partea de nord-vest a Carpaților, în zona Munților Apuseni, ceea ce ar putea să indice existența

unui refugiu glaciar în zona respectivă. Acest lucru trebuie însă dovedit prin cercetări specifice.

Cea mai mică valoare a heterozigoției a fost identificată în metapopulația PST din Carpații de

Curbură.

Ca și la alte specii de conifere, diversitatea genetică se regăsește preponderent în interiorul

populațiilor. În consecință, valoarea parametrului Fst indică o mică diferențiere între populații. De

asemenea, testul varianței moleculare AMOVA arată că doar 1% din diferențierea genetică la molid

se regăsește între populații. Valori similare au fost identificate în populațiile din Carpații Ucrainieni

- Fst=0.017 (Korshikov și Privalikhin, 2007) și în Letonia, unde Fst a variat între 0.017-0.018

(Goncharenko et al, 1995). O valoare mai mare (Fst=0.018) față de media rezultată din cercetările

noastre (Fst=0.0092) a fost comunicată pentru populațiile naturale din nordul Carpaților României

(Teodosiu, 2011). De asemenea valori mai mari ale diferențierii genetice au fost raportate în

populațiile din Rusia (Fst=0.230), Slovacia (Fst=0.028), Italia (Fst=0.042) și Serbia (Fst=0.050)

(Kravchenko et al., 2008; Krajmerova și Langauer, 2000; Giannini et al., 1991; Milovanovic și

Nikolic, 2010). Cea mai mare contribuție la diferențierea intraspecifică este bazată pe frecvența

alelelor a trei loci Pgi-B, Pgm-A și Skdh-A.

Distanțele genetice descrise în dendrograma UPGMA arată mici diferențe genetice între

populațiile din aceeași metapopulație, ce confirmă un nivel ridicat de schimb de gene între

populațiile din aceeași zonă, fără însă ca acestea să-și piardă total individualitatea. Un nivel ridicat

al schimbului de gene era de așteptat având în vedere distanța relativ mică dintre acestea 2-4 km.


33

Studii ale fluxului de gene la molid confirmă o valoare de 50% a polenului observat într-o

populație ca fiind provenit din populații vecine, și de până la 4 km (Xie și Knowles, 1994). Acest

fapt are implicații practice, justificând și pe această cale necesitatea constituirii regiunilor

ecologice de utilizare în cultură a materialelor forestiere de reproducere. Deși valori mai mari ale

distanțelor genetice s-au întâlnit între populațiile aflate la o distanță mai mare una de cealaltă,

rezultatele testului Mantel nu au confirmat ipoteza izolării totale prin distanță. Situație

asemănătoare a fost arătată pentru 29 de populații din Austria. Valorea indicelui de corelație

(r=0.178) între populații aflate până la 450 km distanță nu a indicat prezența unei corelații pozitive

între distanțele genetice și cele geografice. În cazul populațiilor studiate de noi se poate observa o

mai mare corelație a distanțelor geografice cu cele genetice între populații față de metapopulații.

Analiza distribuției UPGMA între populații a arătat existența unui grup vestic format din

metapopulațiile APS și PRG și populația PRS și un grup estic format din NMR și MMS. O poziție

separată în dendrogramă o ocupă metapopulația PST, probabil ca efect al prezenței alelelor rare cu

frecvență mai mare, ce poate indica o prezență antropică prin plantare de material biologic înrudit.

Lipsa diferențierii spațiale între populații este caracteristică coniferelor (Giannini et al., 1991) și

indică o rată mare de încrucișare, fecundare și flux mare de gene pe tot arealul continu al

molidului. Marea densitate din populațiile de molid acționează ca factor de contracarare a efectelor

driftului genetic (Krutovskii și Bergmann, 1995).

5.2. Analize comparative ale diversității genetice între populații individualizate biotipic

și/sau ecotipic

5.2.1 Studiu comparativ între populația ecotipului de turbărie, populația biotipului

de molid cu coroană columnară (Picea abies var. columnaris) și populația de molid cu

coroană piramidală (Picea abies var. pyramidalis) din metapopulația Apuseni

În urma analizelor de variație a markerilor genetici izoenzimatici s-a realizat un studiu

comparativ între trei populații din Munții Apuseni. Populațiile eșantionate se află la distanțe de

aproximativ 3 km una față de cealaltă și se deosebesc sub aspect biotipic și ecotipic. Astfel în

metapopulația Apuseni (APS) s-a studiat o populație ecotipică de turbărie (APS-1), o populație a

molidului cu coroană columnară (Picea abies var. columnaris) – APS-2 și o populație de molid cu

coroană normală (Picea abies var. pyramidalis) – APS-3. Pentru estimarea parametrilor genetici

s-au studiat 12 loci, la care s-au identificat 32 de variante alelice. Dintre aceștia, cu excepția

locusului Pgi-A care a fost monomorf, restul locilor au prezentat variație alelică. Din studiul


34

frecvenței alelelor se observă o mai mare pondere a frecvențelor alelelor rare în populația

molidului columnar (APS-2). Astfel, alela Gdh-A-4 a fost identificată doar în populația APS-2, iar

frecvențele alelelor Got-A-2, Got-C-5, Pgi-B-2 și Skdh-A-2 sunt vizibil mai mari în această

populație.

Parametrii diversității genetice intrapopulaționale s-au estimat la nivelul fiecărui locus, pentru

fiecare populație în parte. În toate cele trei populații valorile cele mai ridicare ale parametrilor

genetici au fost identificate la locii Got-C și Pgi-B. Deși în populația molidului cu coroană

columnară s-au identificat cinci loci fără variație genetică, față de trei identificați în molidul de

turbărie și respectiv doi în molidul cu coroană piramidală, valorile parametrilor genetici au arătat

preponderent valori mai ridicate la acestă populație. Abaterea cea mai mare față de echilibrul

Hardy-Weinberg (26%) s-a identificat la locusul Pgi-B în populația molidului columnar.

Studiul comparativ al datelor din tabelul 5.6. a indicat valori medii mai mici ale heterozigoției

(He) și ale bogăției alelelor (A) la molidul cu coroana normală (Picea abies var. pyramidalis).

Indicele heterozigoției (He) calculat pentru populația molidului columnar a fost cu 1.7% mai mare

decât cel calculat pentru populația molidului cu coroană normală (APS-3), respectiv cu 1.2% mai

mare față de valoarea heterozigoției identificată în populația molidului de turbărie. Valorile

indicelui bogăției alelelor sunt în corelație cu cele ale heterozigoției (He), identificându-se cea mai

mare valoare în populația de molid columnar - APS-2. De asemenea, valoarea cea mai mare a

indicelui de fixare F s-a înregistrat tot în populația APS-2, indicând un exces de heterozigoți de

8.2% față de starea de echilibru Hardy-Weinberg.

Tabelul 5.6. Media valorilor parametrilor genetici calculați pentru trei populații din metapopulația Apuseni

Mean genetic diversity parameters for three populations from Apuseni metapopulation

P sau M N P(%) Na Ne A Ho He F

APS-1 60 75.00% 2.250 1.205 1.944 0.126 0.122 -0.036

APS-2 30 58.33% 2.000 1.237 2.000 0.150 0.134 -0.082

APS-3 60 83.33% 2.250 1.176 1.922 0.123 0.117 -0.039

APS 150 72.22% 2.167 2.106 1.955 0.133 0.124 -0.049

P sau M - populația/metapopulația; P - proporția locilor polimorfi; Na – numărul mediu de alele per locus;

Ne – numărul efectiv de alele per locus; A – bogăția alelelor; Ho – heterozigoția observată; He –

heterozigoția așteptată; F – indicele de fixare.

Valoarea indicelui de diferențiere mediu calculată între populații dar și pentru fiecare locus în

parte, alături de numărul de migranți (Nm) sunt prezentați în tabelul 5.7. Indicele de diferențiere

Fst a indicat existența unui procent de 98.8% din totalul diversității genetice în interiorul

populațiilor. Dintre locii analizați cea mai mare pondere în diferențierea genetică a populațiilor se


35

constată la locusul Pgi-B (Fst=0.043). Calcularea indicelui nivelului mediu de migranți Nm (27.7)

indică o rată ridicată a fluxului de gene între populațiile studiate, ceea ce este de așteptat în

condițiile de alăturare sau de interferență de habitat dintre colectivitățile statistice studiate.

Calcularea distanțelor genetice Nei la cele

trei populații a indicat un grad mai mare de

diferențiere (DNei=0.008) între populațiile

APS-2 (molidul columnar) și APS-3 (molidul

cu coroană normală). Între populația

molidului de turbărie și cea a molidului cu

coroană normală s-a calculat o distanță

genetică mai mică (0.003), ceea ce conduce la

concluzia că nișa ecologică de turbărie este

explorată și valorificată de anumiți

descendenți ai molidului cu coroană normală,

care prezintă valoare adaptativă față de

condițiile specifice de tinov. Dealtfel,

fenotipic, exemplarele de tinov prezintă coroană după modelul molidului comun.

Ca urmare a indicelui de diferențiere, analiza moleculară a variantei moleculare (AMOVA)

efectuată între cele trei populații a indicat o diferențiere genetică de doar 2% între populații, cea

mai mare cantitate a diversității genetice aflându-se în interiorul populațiilor. Chiar și la acest nivel

redus de repartizare a varianței moleculare, trebuie remarcată existența acesteia între cele trei

populații statistice, validându-se și pe această cale specificitatea biotipică ori adaptativă a acestora.

5.2.2. Analize genetice comparative între populații aflate la altitudini

diferite din aceeași zonă geografică

Unul din obiectivele cercetărilor întreprinse a constat în realizarea unui studiu comparativ între

populații aflate la diferite altitudini din aceeași metapopulație. Și în acest caz analiza a inclus cei

12 loci codificatori de izoenzime, pentru care s-au identificat 34 de variante alelice. Cercetările au

inclus șase populații/metapopulații PRG, PST și MMS.

Din analiza frecvențelor alelice (tabelul 5.1) s-a observat doar la locusul Pgm-A-1 o

diferențiere în funcție de altitudine. Astfel alela A1 a locusului Pgm s-a identificat doar în

populațiile de mare altitudine, denumite în cercetările noaste de culme. În metapopulația Parâng

Tabelul 5.7. Indicele de diferențiere Fst și numărul

mediu de migranți pentru trei populații din

metapopulația Apuseni la fiecare locus

Fst values for three populations from Apuseni

metapopulation for each locus

Locus Fst Nm

Fdh-A 0.011 21.7

Gdh-A 0.009 29.0

Got-A 0.007 36.5

Got-B 0.004 59.0

Got-C 0.016 15.2

Idh-A 0.006 42.8

Idh-B 0.006 43.9

Pgi-A #N/A #N/A

Pgi-B 0.043 5.6

Pgm-A 0.008 33.0

Pgm-B 0.017 14.6

Skdh-A 0.008 30.6

Mean 0.012 27.7


36

s-au identificat doi loci monomorfici (Got-A și Pgi-A), în metapopulația Postăvarul un singur locus

a fost monomorf iar în metapopulația Maramureș monomorfism a prezentat locusul Pgi-A.

Din analiza valorilor diversității genetice a rezultat că nu se poate deduce un model gradiental

general valabil (tabelul 5.8). Astfel, dacă populațiile de vale din două locații (PRG și MMS) au

avut o mai mare valoare a heterozigoției așteptate decât cele de culme, dimpotrivă, în Masivul

Postăvarul, populația de culme a prezentat valori mai ridicate ale acesteia.

În metapopulația Parâng diferența de altitudine dintre cele două populații a fost de 430 m, iar

între acestea a rezultat o diferență a heterozigoției de 2%. Indicele de fixare a indicat în ambele

populații un deficit de homozigoți, o valoare ușor mai ridicată fiind observată în populația de

culme.

Referitor la metapopulația Maramureș, valorile heterozigoției așteptate (He) s-au diferențiat cu

0.8%, diferența de altitudine fiind de aproximativ 530 m. Deși diferența de altitudine este mai mare

cu aproximativ 100 m fată de situația din metapopulația Parâng, diferența dintre valorile

heterozigoției (He) este mai mică.

Contrar situației identificate în metapopulațiile PRG și MMS, în Masivul Postăvarul populația

de culme PST-1 are valori mai ridicate în ce privește nivelul heterozigoției așteptate (He) și a

bogăției alelelor (A) față de populația de vale, populația Poiana Mică (PST-2) având cele mai

scăzute valori ale parametrilor genetici dintre toate populațiile studiate.

Tabelul 5.8. Valori medii ale parametrilor diversității genetice în populații gradientale de molid

Average values of genetic diversity parameters in spruce gradient populations

P or M N P(%) Na Ne A Ho He F

PRG-1 60 58.33% 1.833 1.178 1.665 0.113 0.106 -0.042 PRG-2 60 75.00% 2.083 1.218 1.816 0.133 0.126 -0.039

PRG 120 66.67% 1.958 1.198 1.74 0.123 0.116 -0.04

PST-1 50 83.33% 2 1.175 1.87 0.109 0.106 -0.031 PST-2 50 66.67% 2 1.176 1.743 0.098 0.096 -0.016

PST 100 75.00% 2 1.175 1.807 0.104 0.101 -0.024

MMS-1 83 83.33% 2.083 1.185 1.81 0.11 0.112 -0.013 MMS-2 78 75.00% 2.25 1.203 1.912 0.119 0.12 -0.016

MMS 161 79.17% 2.167 1.194 1.861 0.115 0.116 -0.015

Indicele de diferențiere Fst calculat la nivelul fiecărei metapopulații, pentru fiecare locus, a fost

calculat în tabelul 5.9, rezultând valori medii interpopulaționale mai mici de 1%.


37

Structura variabilității genetice între

populațiile din cele trei metapopulații a

fost analizată efectuând testul AMOVA.

Analizând structura genetica

izeonzimatică în cele trei metapopulații

se observă că cea mai mare parte a

diferențierii genetice se află în

interiorul populațiilor. Cea mai mare

diferențiere genetică (3%) s-a arătat

între cele două populații gradientale din

metapopulația Parâng. În metapopulația

Postăvarul diferența este de 1 % iar

între cele două populații din Maramureș

testul molecular al variantei indică lipsa diferențierii genetice între populații. Testul varianței

moleculare s-a realizat în urma calculării distanțelor genetice Nei cu ajutorul softului GenAlEx.

5.2.3. Discuții

În urma analizei frecvenței alelelor s-a observat apariția alelei Pgm-A-1 doar în populațiile de

culme. Evaluarea exemplarelor din populații aflate la diferite nivele altitudinal, indică o mai mare

heterozigoție și o mai mare bogăție a alelelor în două populații de vale din metapopulațiile MMS și

PRG. În contrast, în metapopulația PST, populația de vale (PST-2) a avut cea mai mică valoare a

diversității genetice dintre cele 11 populații studiate. În toate cele trei metapopulații diferențele

dintre valorile heretozigoției populațiilor gradientale au fost însă foarte mici, de numai 1-2%

(0.009 în MMS, 0.011 în PST și 0.020 în PRG), ceea ce indică un flux de gene ridicat între

populațiile de joasă și mare altitudine din aceeași locație, neindicâand prezenta unei bariere

naturale reproductive. Valorile mai ridicate ale heterozigoției în populațiile de joasă altitudine din

metapopulațiile MMS și PRG ar putea fi explicate și prin posibila introducere de material semincer

din populații cu un nivel scăzut de diversitate genetică (Curtu et al., 2009), dar în același timp

diferențierea genetică mai scăzută în populațiile de mare altitudine se datorează probabil unor

condiții mai limitative având o acțiune selectivă. În studii diferite, realizate în populații de molid

din Europa, variabilitatea genetică la populațiile aflate la altitudini diferite a arătat de asemenea

rezultate contradictorii. În populațiile din Alpii Elveției, un număr mai mare de heterozigoți au

Tabelul 5.9. Indicele de diferențiere Fst între cuplurile de

populații gradientale, pe loci genici analizați

Fst differentiation index between pairs of gradient

populations at each locus

Fst

Locus Parâng Postăvarul Maramureș

Fdh-A 0.001 #N/A 0.003

Gdh-A 0.001 0.013 0.002

Got-A #N/A 0.01 0.003

Got-B 0.013 0.005 0

Got-C 0.003 0.001 0

Idh-A 0.004 0.015 0

Idh-B 0.004 0.001 0.003

Pgi-A #N/A 0.005 #N/A

Pgi-B 0.015 0.014 0.004

Pgm-A 0.019 0.005 0.002

Pgm-B 0.017 0 0.002

Skdh-A 0.027 0.005 0.001

Media 0.01 0.007 0.002


38

apărut în populațiile de mare altitudine (Muller-Starck, 1995). Totuși, în populațiile din Carpații

Ucrainieni diversitatea genetică între două locații a arătat rezultate diferite, și nu s-a putut indica o

legătură între frecvența alelelor și altitudine (Korshikov si Privalikhin, 2007). În cazul a două

metapopulații studiate (MMS și PRG), populațiile aflate la joasă altitudine (denumite de noi- „de

vale”) au înregistrat valori mai mari pentru bogăția alelelor, ceea ce indică o mai mică presiune a

selecției în populațiile de joasă altitudine în comparație cu cele de la limita altitudinală superioară.

În contrast, în metapopulația PST, populația de joasă altitudine a arătat o valoare mai scăzută a

bogăției alelelor, fiind cea mai mică valoare identificată la populațiile studiate. Această situație

poate fi, probabil, generată de originea materialului de plantat, provenit dintr-un număr mic de

arbori seminceri.

Deși numărul de indivizi eșantionat în populația de molid columnar din Munții Apuseni este

mic, nivelul heterozigoției a fost cel mai mare la nivelul populațiilor eșantionate. O posibilă

explicație poate fi legată de o combinație de factori a sistemului de reproducere implicat în geneza

acestui biotip, în combinație cu acțiunea exercitată de selecția naturală, care este posibil să

prezerve un nivel ridicat al heterozigoției. Studii asupra biotipului de molid columnar au arătat o

mai mare rezistență la zăpadă și vânt și o mai mare rată de supraviețuire (Părnuță, 2008). O mai

mare variabilitate genetică a fost dealtfel indicată și prin studiul caracterelor calitative ale hibrizilor

de molid columnar în populații din România (Părnuță, 2008).

5.3. Structuri genetice microspațiale pentru loci izoenzimatici

Structura genetică microspațială, reprezentând modelul de variație genetică observat între

indivizii din aceeași populație, s-a studiat prin mai multe metode la nivelul a trei populații: două

din Masivul Postăvarul (PST-1 și PST-2) și una din Munții Nemira (NMR). La baza calculelor

analizei structurii spațiale a stat comparația dintre matricele distanțelor genetice și cele geografice.

Analiza genotipurilor la nivelul fiecărui individ dintr-o anumită populație a fost posibilă prin

înregistrarea coordonatelor geografice cu ajutorul unui GPS.

Indicele autocorelației spațiale s-a estimat la nivelul întregii populații (numită autocorelația

spațială globală), precum și local, investigând prezența aglomerării genotipurilor autocorelate la

nivel microspațial. Ambele metode au presupus utilizarea softului statistic GenAlEx 6.2., care

adoptă proceduri de investigare dezvoltate de Anselin (1995), extinse de Getis și Ord (1995) și

Sokal et al. (1998). Modelele grafice de variație genetică în interiorul populațiilor au fost elaborate

cu ajutorul tehnologiilor sistemelor informatice geografice (GIS) prin analiza Anselin Moran I, cu

ajutorul softului ArcGis.


39

5.3.1. Structura genetică microspațială în metapopulația Postăvarul

Pentru cele două populații din metapopulația Postăvarul, existența modelelor genetice spațiale

s-a investigat prin realizarea a două corelograme, în urma analizei autocorelației genetice globale.

Această analiză arată variația indicelui autocorelației spațiale față de nivelul unui prag de

încredere, între perechi de indivizi dintr-o clasă geografică.

Pentru populația Postăvarul rezultatul

testului autocorelației spațiale a fost

însumat în corelograma din figura 5.8.

Analiza spațială s-a efectuat la zece clase

de distanțe geografice egale, pe o distanță

totală de 640 m. Indicele autocorelației (r)

variază pe parcursul întregii distanțe,

având două valori de maxim, dar fără să

fie depășit pragul superior de încredere

statistic.

Cea mai ridicată valoare a indicelui de

autocorelație a fost identificată în a opta clasă de distanță (r=0.066). La nivelul întregii populații

indicele autocorelației înregistrează două vârfuri ale valorii negative în jurul claselor 1-2 și

respectiv 5-6, și pozitive în jurul claselor 4 și 8-9. Pe parcursul întregii populații valoarea indicelui

autocorelației este fluctuantă, fiind indicată lipsa unui model de corelație spațială a genotipurilor.

În populația Poiana Mică testul autocorelației spațiale globale s-a realizat la 10 clase de distanță

egale, pe o distanță de 1200 m (figura 5.9). Valoarea cea mai ridicată a indicelui de autocorelație

s-a înregistrat la clasa a zecea de distanță. Variația indicelui „r” a arătat valori negative în jurul

claselor 1-2 și valori pozitive la clasele 3 și 10. La niciuna din clasele de distanță valoarea indicelui

„r” nu depășește intervalul de încredere. Din compararea datelor din cele două populații din

Masivul Postăvarul se poate observa cum amplitudinea variației valorii indicelui „r” este mai mică

în populația de joasă altitudine (PST-2) față de cea de culme (PST-1).

Figura 5.9 Corelograma autocorelației

spațiale globale în populația Poiana Mică

Corelogram of global spațial

autocorrelation in Poiana Mică population

Figura 5.8 Corelograma autocorelației spațiale în populația

Postăvarul

Corelogram of spațial autocorrelation in Potăvarul

population


40

Prin realizarea testului autocorelației spațiale locale analiza s-a îndreptat spre grupuri de

indivizi, și nu pe clase de distanță ca în cazul anterior al analizei autocorelației genetice globale, a

căror frecvență alelică a fost comparată în jurul unei valori pivot. Acestă analiză calculează

valoarea indicelui de autocorelație pentru fiecare individ față de ceilalți, iar rezultatele sunt

prezentate pe un plan 2D. În urma testului autocorelației spațiale locale (2D LSA) valorile

indicelui de autocorelație au fost semnificative din punct de vedere al probabilității la 7 indivizi.

Raportarea lor pe un plan 2D indică prezența a două grupuri de exemplare la care s-au identificat

valori semnificative statistic ale autocorelației spațiale (figura 5.10).

(simbolul "+" reprezintă arborii

la care s-a determinat o valoare

semnificativa din punct de

vedere al probabilității a

indicelui autocorelației spațiale)

(the "+" symbol represents the

trees where significant values

in terms of probability of

spatial autocorrelation index

were determined)

Figura 5.10 Corelograma autocorelației spațiale locale bidimensionale

în metapopulația Postăvarul

Corelogram of local 2D spațial autocorrelation in Postăvarul

metapopulation


41

În populația de culme PST-1, au fost evidențiați patru indivizi marcați cu semnul „+”, la care

indicele autocorelației are valori semnificative. Trei sunt localizați în zona de S-E, la o altitudine

de 1740 m, iar al patrulea la N, la o distanță de 300 m față de celelalte trei, la altitudinea de 1650m.

În populația Poiana Mică (PST-2), indicele autocorelației a avut valori semnificative la trei

indivizi. Aceștia sunt localizați în zona de vest a populației la o altitudine de 930 m. Cele două

grupuri la care s-au identificat valori semnificative ale autocorelației se află la o distanță de

aproximativ 2 km și o diferență de nivel de 800 m.

Analiza structurii spațiale a variației genetice s-a studiat și cu ajutorul unei metode de lucru care

se bazează pe aplicații ale sistemelor geografice informatice (GIS). Este o metodă relativ nouă,

pentru estimarea structurilor genetice spațiale dar întâlnită în studiile internaționale (Kozack et al.,

2008; Hoffman et al., 2003). Prin introducerea acestei metode s-a dorit investigarea structurii

variației genetice în interiorul populației, pentru identificarea modelelor de grupare a exemplarelor

la nivel de microhabitat. Pentru identificarea corelațiilor genetice spațiale, fiecărui arbore i s-a

atribuit o clasă genotipică folosind combinaţiile tuturor perechilor de alele studiate, rezultând un

șir de 24 de caractere (ex. 225522223322243333223312). Acestea au fost sortate în ordine

crescătoare şi numerotate cu cifre de la 1 la 56, întrucât din totalul de 101 arbori s-au identificat 56

de genotipuri unice. Fiecărui genotip identificat i s-a calculat un procent de apariţie în cadrul celor

101 arbori. Metoda folosită este asemănătoare celei utilizate de Ondrej şi Karel, (2009). S-a

calculat indicele Moran I pentru fiecare arbore din interiorul populaţiei, pe baza numărului de

identificare a tipului genetic. În urma analizei s-au identificat trei zone de grupare a arborilor, două

în populaţia Postăvarul-culme şi a treia în populaţia Poiana Mică. Două din modelele de grupare a

arborilor identificate sunt în concordanţă cu rezultatele testului autocorelaţiei spaţiale locale

efectuate cu softul GenAlEx (figura 5.11). În total, de data aceasta, autocorelaţia s-a identificat la

12 exemplare, 8 în populaţia Postăvarul-culme și respectiv 4 în populaţia Poiana Mică. În figură

se observă corelarea pozitivă a arborilor în două zone din populația PST-1, care coincid altitudinii

celei mai ridicate a populaţiei. Corelaţiile pozitive sunt evidenţiate în jurul exemplarelor ce fac

parte din clase de genotipuri apropiate de valoarea 50. Acestea se caracterizează prin alele cu

frecvenţă mare de apariție în populaţie, cu o valoare mai mare a cifrei de notare a tipului genetic

(cum ar fi alelele, Got-C-4 si Pgi-B-3). În acestă populație se pot observa şi corelaţii negative la

trei arbori, evidențiați în figura 5.11 cu culoarea albastră.


42

Figura 5.11 Harta distribuției autocorelației spațiale Anselin Moran I în metapopulația Postăvarul

Anselin Moran I spatial autocorrelation in Postăvarul metapopulation

În populaţia de vale, Poiana Mică, corelaţia pozitivă a genotipurilor a fost identificată în zona de

vest a populaţiei. Indicii de identificare genetici în jurul cărora s-a identificat corelaţia spaţială au

avut valori cuprinse între 2 și 6, fiind caracterizaţi de alele, de asemenea, cu frecvenţă mare de

apariţie în populaţie şi cu o valoare mai mică de notare (cum ar fi Got-C-2, Pgi-B-2).

Distribuția corelată a genotipurilor în cuprinsul populațiilor din masivul Postăvarul a fost

evidențiată, ca atare, la trei loci: Got-C, Pgi-B, Lap-B. Aceștia având cele mai ridicate valori ale

heterozigoției, sunt și cei care influențează distribuția geografică a genotipurilor în cele două


43

populații. La locusul Got-B (figura 5.12) se poate observa o acumulare a genotipului 44 în zonele

de sud și sud-est ale populației de culme. Altitudinea în aceste două zone este mai mare. În

populația Poiana Mica dispersia genotipurilor observate la locusul Got-C este în general mai

uniformă, dar totuși se manifestă tendința de constituire a unor grupuri (familiale).

Figura 5.12 Harta distribuției genotipurilor locusului Got-C în metapopulația Postăvarul

Genotips distributions map of Got-C locus in Postăvarul Metapopulation


44

Distribuția alelelor locusului Pgi-B (figura 5.13) este mai omogenă, neputând fi observate

grupări ale unei alele doar în anumite zone din arealul cercetat. Totuși, se poate observa prezența

mai mare a genotipurilor 13 și 22 în populația din Poiana Mică. Alela B1 este întâlnita la trei

indivizi doar în populația de joasă altitudine. Pe de altă parte, și de această dată se constată tendința

de constituire de microgrupuri care includ arbori cu aceeași structură alelică (de exemplu, cele ale

homozigoților 33 din populația de culme), a căror existență ar putea fi pusă în legătură cu structuri

de tip familial.

Figura 5.13 Harta distribuției genotipurilor locusului Pgi-B în metapopulația Postăvarul

Genotips distributions map of Pgi-B locus in Postăvarul Metapopulation


45

++

+

+

+

.

.

..

..

.

.

.

..

.

.

... ..

.

.

.

.

.

..

.

.

.

. .

.

.

.

.

.

.

..

.

.

.

.

. .

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

..

.

.

..

.

.

.. .

.

.

.

.

.

..

.

.

.

.

..

.

.

.

. .

.

.

.

.

.

.

..

.

.

.

516600

516800

517000

517200

517400

517600

517800

518000

518200

603800 604000 604200 604400 604600

Y

X

2D LSA (+ P<=0.05)

Y

5.3.2. Structura genetică microspațială în populaţia Nemira

Având ca puncte de plecare alelele

identificate și combinațiile genotipice

generate, precum și coordonatele geografice

înregistrate pentru fiecare individ, s-a

analizat și în acest caz distribuția genetică

spațială pentru cei 100 de arbori din

populația Nemira.

Distribuția spațială a locilor a fost

studiată mai întâi prin analiza

autocorelației spațiale globale, ale cărei

rezultate sunt prezentate în corelograma

din figura 5.14. Autocorelația spațială

globală s-a studiat la 10 clase egale departajate pe distanța a 1300 m. Valoarea indicelui „r”

(simbolizată cu linie albastră) indică două zone de maxim ale abaterii de la valoarea nulă, în jurul

claselor de distanță 3-4 și 7-8. Distribuția valorii indicelui r nu a indicat o abatere semnificativă de

la valoarea nulă, astfel încât nu a rezultat existența autocorelației spațiale la niciuna din clasele de

distanță. Cea mai mare valoare a indicelui autocorelației a fost de 0.010, în intervalul claselor 7-8.

Valoarea cea mai mică a indicelui „r” s-a calculat pentru clasa a 10-a de distanță.

(simbolul „+” reprezintă arborii la care s-a

determinat o valoare semnificativa din punct

de vedere al probabilității indicelui

autocorelației spațiale);

(the "+" symbol represents the trees where

significant values in terms of probability of

spatial autocorrelation index were

determined)

Figura 5.15 Corelograma autocorelației

spațiale locale bidimensionale în populația

Nemira

Corelogram of local 2D spațial

autocorrelation in Nemira population

Figura 5.14. Corelograma autocorelației spațiale globale

în populația Nemira

Corelogram of global spațial autocorrelation in Nemira

population


46

Luând în considerare poziția geografică a fiecărui individ din populația Nemira, în studiul

autocorelației spațiale locale a rezultat corelograma din figura 5.15. Această analiză denumită 2D

LSA (Analiza Spațială Locală 2D) a arătat prezența autocorelației spațiale la cinci arbori. Trei

dintre aceștia sunt distribuiți în zona de nord-vest, ceilalți doi fiind localizați în zona centrală a

populației. Topografia terenului în populația Nemira indică o variație a altitudinii de la sud la nord.

Studiul autocorelației spațiale în

populația Nemira s-a realizat și prin

analiza Anselin Moran I cu ajutorul

softului ArcGis. Harta autocorelației

spațiale (figura 5.16) s-a realizat pe

baza unui șir unic la fiecare arbore,

format din combinațiile genotipice ale

locilor studiați. Din harta tematică se

poate observa că acesta nu mai

surprinde aceeași situație ca în cazul

analizei 2D LSA. De această dată,

valori semnificative ale autocorelației

au rezultat pentru 6 arbori. Dintre

aceștia, doar doi coincid cu cei la care

s-a semnalat prezența autocorelației

spațiale locale (2D LSA). Analiza

Cluster Outliner indică prezența

autocorelației spațiale în zona centrală

a populației la două grupuri și la un

arbore din partea de sud a populației.

Figura 5.16 Harta distribuției autocorelației spațiale Anselin

Moran I în populația Nemira

Anselin Moran I spațial autocorrelation in Nemira

population


47

Din analiza autocorelației spațiale

la fiecare locus se observă, totuși,

structuri genetice spațiale în

interiorul populației. Astfel, rezultatul

cel mai concludent se constată la

locusul Pgi-B, pentru care prezența

autocorelației spațiale este

caracteristică exemplarelor situate în

partea de nord-vest a populației

(figura 5.17). Aceste structuri

genetice spațiale coincid celor

rezultate în urma analizei 2D LSA.

Cea mai mare influență asupra distribuției spațiale în interiorul populației o au locii cu un nivel

ridicat al heterozigoției, ca și în cazul metapopulației Postăvarul.

La locusul Pgi-B (figura 5.18) se poate observa o aglomerare a genotipurilor 33 în zona de

nord-vest a populației, ce coincide unei altitudini de aproximativ 1300 m.

În ceea ce privește locusul Got-C (figura 5.19), distribuția genotipurilor acestuia are un caracter

mai dispersat, mai ales pentru homozigoții 44 și heterozigoții 24. În cazul homozigoților 22 se

constată o slabă tendință de grupare în zona de nord.

Figura 5.17 Harta distribuției autocorelației spațiale Anselin

Moran I în populația Nemira la locusul Pgi-B

Anselin Moran I spațial autocorrelation in Nemira population

for Pgi-B locus


48

Figura 5.18. Harta distribuției genotipurilor

locusului Pgi-B în populația Nemira

Genotips distributions map of Pgi-B locus in Nemira

population

Figura 5.19 Harta distribuției genotipurilor locusului

Got-C în populația Nemira

Genotips distributions map of Got-C locus in

Nemira population

5.3.3. Discuții

Analiza structurii genetice într-un context spațial poate aduce noi informații pentru a înțelege

mai bine dinamica populațiilor iar rezultatele pot avea aplicabilitate în managementul ecologic

(Escudero et al., 2003). Distribuția spațială a genotipurilor poate fi influențată de schimbările de

mediu și activitățile umane (Knowles et al., 1992). Totuși, în populațiile naturale aceasta este

preponderent influențată de sistemul de reproducere al speciei, însușirii biologice specifice (ca de

exemplu dispersia semințelor), și nu în ultimul rând de valoarea adaptativă a genotipurilor. Acest

ultim aspect se consideră că are o influență mică în cazul genotipurilor corespondente locilor

izoenzimatici, ca urmare a caracterului preponderent neutral al acestora.


49

Prin studiul autocorelației spațiale în interiorul unei populații se surprinde modul de organizare

al pădurii naturale și dinamica temporală a structurii genetice (Teodosiu, 2011). La speciile de

arbori cu areal continuu, așa cum este cel al molidului în România, autocorelația spațială în

interiorul populației apare atunci când fluxul de gene și metoda de propagare a semințelor este

restricționată. În realitate, la populațiile arborilor se poate observa o structură genetică spațială

slabă, fapt ce poate fi întărit chiar și de limitele modelelor statistice de a evidenția autocorelația

spațială (Peakal și Smouse, 2006).

La populațiile studiate în urma analizei structurii genetice spațiale, s-a evidențiat o slabă

grupare a genotipurilor în interiorul populațiilor, rezultate ce sunt descrise în literatură în studii ale

autocorelației spațiale la molid (Leonardi et al., 1996; Teodosiu., 2011). Structura genetică spațială

s-a studiat pentru fiecare populație prin trei metode. Indicele autocorelației spațiale globale calculat

cu ajutorul softului GenAlEx nu a avut valori semnificative la nici una din populațiile studiate.

Acesta, în cadrul fiecărei populații, la primele clase de distanțe a avut valori negative, indicând o

distribuție randomizată a genotipurilor mai accentuată la arborii aflați la distanțe mai mici. Totuși,

această valoare negativă nu este semnificativă din punct de vedere statistic, iar o valoare pozitivă

ar evidenția o structură familială, care este caracteristică mai ales la speciile cu reproducere

vegetativă (Hamrick și Nason, 1996).

Prin analiza autocorelației spațiale globale, la nici una din populații corelograma nu a indicat un

model clar conturat de distribuție a genotipurilor. Totuși, în metapopulația Postăvarul, corelograma

a indicat o fluctuație a valorilor pozitive și negative față de valorarea nulă în mai multe cazuri, pe

distanța de 640 m. Același traseu se poate observa și în populațiile Poiana Mică din Masivul

Postăvarul și în populația din Munții Nemira. O posibilă explicație pentru rezultatele obținute ar

putea fi caracterul global al testului, la nivelul întregii suprafețe de studiu, acesta neputând

surprinde aglomerările mici de genotipuri din interiorul populațiilor (Anselin., 1995; Sokal et al.,

1998). Această metodă compară grupuri de indivizi a căror diferențiere geografică se integrează

într-o anume clasă de distanță. Aglomerările de genotipuri la nivel microspațial pot apărea sau nu

și în lipsa autocorelației spațiale globale (Anselin, 1995; Sokal et al., 1998).

Dacă prin analiza autocorelației spațiale globale efectuate cu ajutorul softului GenAlEx nu s-a

identificat nici o structură spațială, la nivel local, prin analiza 2D LSA efectuată cu același soft,

s-au identificat arbori cu valori pozitive din punct de vedere statistic specifice conturării unor

situați de autocorelație spațială, în fiecare populație studiată. Această metodologie a avut în vedere

compararea unor grupuri de arbori din jurul unei valori pivot. Astfel, în metapopulația Postăvarul

autocorelația spațială a fost identificată la șapte arbori, care s-au împărțit în două grupuri, unul în

câte fiecare populație. Dacă în zona de culme grupul se delimitează față de ceilalți arbori, aflându-


50

se la o altitudine mai mare cu aproximativ 100 m, apariția grupului din cea de-a doua populație

(Poiana Mică) pare a fi întâmplătoare. Totuși, o influență o poate avea metoda de recoltare a

arborilor studiați, putând fi observat faptul că indivizi din populația Poiana Mică la care s-au

identificat valori pozitive ale autocorelației spațiale fac parte dintr-un trup de pădure separat, aflat

la mică distanță de ceilalți indivizi. O altă explicație a apariției autocorelației spațiale în acest caz

poate fi și influența factorului antropic, prin plantarea de material semincer înrudit. Această

afirmație poate fi susținută și de valorile mici ale parametrilor diversității genetice identificate în

populația Poiana Mică din Masivul Postăvarul.

În populația Nemira s-a identificat prezența autocorelației spațiale la cinci indivizi, din care se

observă un grup situat în zona de nord a populației la altitudinea cea mai mare. Și în populația

Nemira se observă prezența autocorelației spațiale la indivizii aflații la altitudinea cea mai ridicată.

Deși schimbul de gene și rata de încrucișare este mare la molid, în populațiile artificiale s-a

observat că dispersia medie a polenului este de numai 6.8 m față de arborele mamă (Burczyk et al.,

2004).

Folosirea hărților tematice GIS pentru analiza distribuției spațiale a genotipurilor poate fi

folositoare, creând un cadru mai larg de analiză și corelare a diferiților parametri ce influențează

populația. Astfel, Sistemele Informatice Geografice (GIS) pot oferi posibilități noi de calcul a

variației genetice la nivel spațial (Kozack et al., 2008; Hoffman et al., 2003). Studiul autocorelației

spațiale prin analiza Anselin Moran I cu ajutorul softului ArcGis indică rezultate asemănătoare

testelor realizate cu GenAlEx. În special în metapopulația Postăvarul rezultatele au fost în cea mai

mare parte identice. Diferențe mai mari s-au arătat în studiul populației Nemira, unde analiza GIS a

coincis pentru o singură zonă, identificată prin testul 2D LSA și nu a reușit să arate o corelație

pozitivă pentru grupul de la limita altitudinală. Totuși, hărțile de distribuție geografică a

genotipurilor identifică ușoare tendințe de grupare a acestora în funcție de altitudine.

Având în vedere puterea relativ scăzută de diferențiere a markerilor izoenzimatici la nivel

microspațial, prezența autocorelației spațiale a fost totuși semnalată în fiecare populație studiată,

dar la un nivel discret de exprimare. Se știe că majoritatea markerilor genetici nu sunt influențați

de factorii ecologici, izoenzimele având caracter de markeri neutrali. De aceea, o posibilă

explicație pentru prezența autocorelației spațiale este influența topografiei terenului asupra

dispersiei semințelor și a polenului, rezultând astfel un model de distribuție a genotipurilor în

interiorul unei populații. De asemenea, pe lângă aceste aspecte dependente de biologia speciei mai

trebuie avute în vedere și cele legate de managementul silvic. Totuși, o determinare exactă a

procesului ce stă la baza existenței structurilor spațiale este foarte dificilă. Dacă influența selecției


51

sau a izolării prin distanță este cauza prezenței autocorelației spațiale și dacă autocorelația spațială

este capabilă să distingă între cele două, este discutabil (Sokal și Oden, 1998).

6. Concluzii generale și contribuții personale

6.1. Concluzii generale

Acestă lucrare și-a propus studiul variabilității și structurii genetice spațiale în populații naturale

de molid distribuite dea lungul lanțului Carpatic, cu ajutorul markerilor genetici izoenzimatici și

studiul comparativ al unor populații individualizate biotipic și/sau ecotipic. Din analizele efectuate

s-au desprins următoarele concluzii grupate după direcțiile pentru care s-au desfășurat cercetările:

A. Concluzii rezultate din analiza diversității genetice izoenzimatice în populații autohtone de

molid

Cu privire la structura genotipică și frecvențele alelice:

1. Valorile frecvențelor alelice în populațiile studiate se înscriu în limitele comunicate în

studii efectuate în alte zone geografice, comunicate în literatura de specialitate.

2. În cadrul populațiilor studiate s-au identificat cinci alele rare (câte două în metapopulațiile

PRS și PST), acestea fiind identificate pentru prima dată în populațiile din România: Gdh-

A-4, Idh-A-4, Skdh-A-5, Pgi-A-3, Idh-B-2.

3. În studiul comparativ al populațiilor diferențiate în funcție de altitudine din aceeași locație,

alela Pgm-A-1 a fost identificată doar în populațiile de culme, ceea ce poate indica o

implicare a acesteia în adaptarea la condițiile particulare de mediu din zonele respective.

4. În studiul comparativ al populațiilor din metapopulația Apuseni se remarcă prezența alelei

Got-A-2 și o frecvență vizibil mai ridicată a alelelor Got-A-2, Got-C-5, Pgi-B-2 și Skdh-A-

2 în populația de molid columnar (Picea abies var. columnaris), față de celelalte două

populații.

Cu privire la diversitatea genetică intrapopulațională:

5. Deși numărul de loci analizați (12) a fost mai mic decât în unele studii din Europa, valorile

proporției locilor polimorfi și numărul de alele per locus au avut valori similare, ceea ce

indică un nivel ridicat al variabilității la nivelul locilor genici considerați individual.

6. Nivelul valorilor frecvențelor alelelor la molidul carpatic este, totuși, unul moderat,

comparabil cu valorile identificate în studii similare realizate în alte zone din Europa.


52

7. Valoarea medie a heterozigoției calculată la cele 11 populații este identică cu cea calculată

de Lagercrantz și Ryman pentru 70 de populații de molid distribuite în tot arealul european.

8. Considerând populațiile din aceeași zonă de studiu ca fiind o singură populație, valorile

medii ale heterozigoției (He) și bogăției alelelor (A) clasează metapopulația Apuseni pe

prima poziție în ceea privește nivelul diversității genetice între cele șase zone de studiu.

9. Valorile ridicate ale variației genetice din metapopulația APS indică prezența unui nucleu

cu valori mai ridicate ale diversității genetice în Munții Apuseni.

10. Cea mai mică valoare a diversității genetice a fost înregistrată în populația de joasă

altitudine din Masivul Postăvarul (PST-2, He=0.096), fiind inferioară cu 16.5% față de

media celor 11 populații, respectiv cu 28.3% față de populația cu valoarea indicelui He cea

mai mare.

11. Valoarea mică a diversității genetice în populația de mică altitudine (Poiana Mică) din

Postăvarul pune în discuție caracterul natural al acesteia; este posibil ca structura genetică

actuală a acestei populații să fie influențată de intervenții antropice anterioare cu acțiune

erozivă, ori prin transfer de materiale de reproducere recoltate de la un număr redus de

genitori.

12. Calculul parametrilor genetici la nivel de populație ne indică populația de molid columnar

Picea abies var. columnaris ca având cel mai ridicat nivel al variabilității genetice între cele

11 populații studiate.

13. Structura genetică a fiecărui locus din fiecare populație, investigată prin testarea deviației

de la structura Hardy-Weinberg, nu a indicat abateri semnificative de la starea de echilibru.

Cu privire la structura genetică interpopulațională:

14. Indicele de diferențiere Fst, calculat la fiecare locus cât și ca medie între populații, a indicat

o valoare mai mică (0,0092) decât în alte studii realizate în Europa, indicând probabil

originea comună a molidului din Carpații românești din aceeași locație de refugiu glaciar.

15. Valorile indicelui de diferențiere cele mai apropiate față de cea calculată în acest studiu

s-au identificat în populațiile din Carpații Ucrainieni și din Obcinele Bucovinei.

16. Nivelul diferențierii genetice între populații este confirmat prin testul AMOVA, care a

indicat existența a mai puțin de 1% din variația genetică observată între populații, restul de

99% fiind identificat în interiorul populațiilor, indicând pe termen lung un flux ridicat de

gene între populațiile studiate.

17. Prezența preponderentă în interiorul populațiilor a variabilității genetice scoate în evidență

importanța deosebită a cunoașterii acesteia pentru identificarea populațiilor valoroase, dar


53

și a exemplarelor valoroase, cu implicații în derularea programelor de ameliorare și

conservarea resurselor genetice de molid.

18. Dendrograma UPGMA construită pe baza distanțelor genetice Cavalli-Sforza a indicat o

separare a populațiilor în trei grupuri: unul în partea de vest a Carpațiilor, altul în partea de

est iar populațiile din Masivul Postăvarul s-au grupat separat. Totuși, rezultatele nu sunt

semnificative din punct de vedere statistic. Dealtfel, nici testul Mantel nu a indicat existența

unui model geografic de repartizare a diversității genetice.

19. Analiza UPGMA a indicat gruparea separată a populațiilor din Masivul Postăvarul de restul

populațiilor, probabil ca urmare a influenței antropice în această metapopulație.

20. Distanțele genetice ce au stat la baza calculării dendrogramei UPGMA au indicat valori mai

mici între populațiile apropiate geografic, ceea ce indică intensitatea mai mare a schimbului

de gene dintre acestea pe termen lung.

21. În urma analizei testului Mantel nu s-a confirmat ipoteza izolării prin distanță a

populațiilor, valoarea indicelui de corelație Pearson având valori nesemnificative din punct

de vedere statistic.

B. Concluzii rezultate din analiza comparativă a diversității genetice între populații

particularizate sub aspect ecotipic și /sau biotipic

22. În urma analizei comparative a populațiilor din Munții Apuseni sub aspectul valorii

heterozigoției (He) și bogăției alelelor (A), populația de molid cu coroană normală (Picea

abies var. pyramidalis) a avut cele mai mici valori, indicând existența unui plus de

variabilitate genetică a populațiilor particularizate sub aspect ecotipic (molidul de turbărie)

și sub aspect biotipic (molidul cu coroana columnară).

23. Valorile mari ale variabilității genetice evidențiate la molidul cu coroană columnară sunt

confirmate și din studii anterioare privind caracterele calitative ale hibrizilor de molid

columnar.

24. Prin studiul comparativ al parametrilor genetici în populațiile aflate la diferite altitudini din

aceeași zonă geografică, nu s-a putut deduce un model gradiental general valabil, deși

nivelul polimorfismului înregistrează o anumită creștere la nivelul metapopulației, față de

populațiile luate individual.

25. Valorile mai ridicate ale heterozigoției în populațiile de joasă altitudine din metapopulațiile

MMS și PRG ar putea fi explicate și prin posibila introducere de material semincer din

populații cu un nivel scăzut de diversitate genetică, dar în același timp diferențierea


54

genetică mai scăzută în populațiile de mare altitudine se datorează probabil unor condiții

mai limitative cu acțiune selectivă.

26. Între populațiile diferite sub gradient altitudinal s-a indicat un flux ridicat de gene. Cu toate

acestea, nu poate fi acceptată existența și funcționarea unei bariere reproductive de mare

anvergură, deoarece datele din literatură au evidențiat existența unor decalaje fenologice

importante cauzate de diferențele climatice, așa cu sunt cele determinate pe clina nordică a

Postăvarului (Stănescu și Șofletea, 1992).

C. Concluzii rezultate din analiza distribuției microspațiale a structurilor genetice identificate

27. Prin calcularea indicelui autocorelației spațiale globale, indicator raportat la întreaga

populație studiată, nu s-a evidențiat prezența unei corelații semnificative din punct de

vedere statistic a distribuției genotipurilor în niciuna din populațiile studiate.

28. Prin efectuarea testului autocorelației spațiale locale (2D LSA), indicator ce se raportează

la structuri microspațiale, s-au identificat mici grupuri de arbori cu valori pozitive ale

indicelui autocorelației spațiale, semnificative din punct de vedere statistic.

29. Valorile semnificative din punct de vedere statistic ale autocorelației spațiale locale indică

la nivelul populațiilor Postăvarul culme și Nemira o influență a topografiei terenului în

distribuția spațială a genotipurilor.

30. Valorile semnificative ale autocorelației spațiale locale în populația Poiana Mică

(metapopulația Postăvarul) indică probabil efectul antropic asupra distribuției genotipurilor

în populația eșantionată.

31. Analiza autocorelației spațiale efectuate la nivelul fiecărui locus a indicat o prezență sporită

a grupării genotipurilor la locii Pgi-B, Got-C și Lap-B.

32. S-a realizat o analiză spațială cu ajutorul sistemelor geografice GIS, rezultatele confirmând

în cea mai mare parte distribuția genotipurilor conform testului 2D LSA realizat cu ajutorul

GenAlEx.

6.2 Contribuții personale

1. Cercetările efectuate aduc un important aport în studiul variabilității genetice izoenzimatice

a molidului din România, prin extinderea cercetării în cele mai reprezentative zone ale

arealului natural.

2. Prin realizarea unui amplu studiu la nivelul a 24 de loci izoenzimatici s-au identificat cei

mai eficienți loci care influențează diversitatea genetică a molidului carpatic.


55

3. S-a realizat pentru prima dată o dendrogramă ierarhică a populațiilor de molid din Carpații

României, bazată pe markeri genetici izoenzimatici, pe baza căreia s-au identificat unele

specificități genetice pentru grupurile rezultate.

4. Pentru prima dată s-a realizat un studiu de markeri biochimici primari în populații

particularizate sub aspect ecotipic (molidul de turbărie) și sub aspect biotipic (molidul cu

coroană columnară - Picea abies var. columnaris versus molidul cu coroană piramidală -

Picea abies var. pyramidalis) .

5. Prin analiza comparativă a populațiilor aflate la diferite altitudini din aceeași zonă

geografică s-a studiat efectul altitudinii asupra variabilității genetice izoenzimatice.

6. S-au extins studiile structurii genetice la nivel microspațial, prin efectuarea unor noi tipuri

de analize spațiale, care au evidențiat grupări ale genotipurilor identificabile la nivel de

exemplar.

7. S-au realizat hărți ale distribuției spațiale a genotipurilor cu ajutorul Sistemelor Informatice

Geografice GIS.

Diseminarea rezultatelor

Lucrari ISI:

Curtu A. L., Șofletea N. Radu G. R., Bacea A. Abrudan I. V., Keul B. A., Farcaș S.,

2009 – Allozyme variation of coniferous tree species from Maramureș Mountains,

România. În: Not. Bot. Hotr. Abrobot. Cluj 37 (2), p.245-251.

Lucrari BDI

Radu G. R., Șofletea N., Curtu A. L., 2011 – Allozyme genetic variation in high

elevated population of Norway Spruce ( Picea abies L. (Karst)) from Nemira

Mountains. În: Proceedings of Biennal International Symposium Forest and Sustainable

Development, Editura Universității Transilvania din Brașov, p. 93-98.

Șofletea N., Curtu A. L., Toader V. A., Pricopie I., Radu G. R., 2009 – Utilizarea

analizelor de izoenzime în genetica forestieră: un studiu de caz pentru molidul din

Munții Poiana Ruscă. În: Revista Pădurilor nr. 5, 17-21.

Radu G. R., Șofletea N., Curtu A. L., 2012 – Allozyme genetic variation and spatial

genetic structure in two populations of Norway spruce (Picea abies L. (Karst)) from

different levels of altitude from Postăvarul Mountain. În : Revista Pădurilor nr. 5, 3-8.


56

Bibliografie

Acheré V., Favre M., Besnard G., Jeandroz S., 2005. Genomic organization of molecular

differentiation in Norway spruce (Picea abies). Molecular Ecology 14: p. (3191-3201).

Anselin L., 1995. Local indicators of Spatial Association-LISA.geographical Analysis 27 (2):p.

(93-115).

Ballian D., Bogunić F., Božič G.,2007. Genetic Variability of Norway Spruce (Picea abies /L./

H. Karst.) in the Bosnian Part of the Dinaric Mountain Range. Journal of Forestry Society of

Croatia 5-6: p. (237-247).

Burczyk J, DiFazio SP, Adams WT (2004) Gene flow in forest trees:How far do genes really

travel? Forest Genetics, 11, 179–192

Crawford Dj., 1989. Enzyme electrophoresis and plant systematic. Allozymes and plant

biology,Oregon:p. (146-164).

Curtu A. L., 2003. Cercetări privind variabilitatea genetică a molidului (Picea abies (L.)

Karst.) realizate cu ajutorul markerilor ADN. Revista Pădurilor 118(3): p. (10-15).

Curtu L. A., Sofletea N., Radu R., Bacea A., Abrudan I. V., Butiuk-Keul A., Farcas S.,2009.

Allozyme Variation of Coniferous Tree Species from Maramures Mountains, România.

Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 37(2): p. (245-251).

Dutcă , Abudan I., Stăncioiu P.T. 2010. Biomass Conversion and Expansion Factors for Young

Norway Spruce (Picea abies (L.) Karst.) Trees Planted on Non-Forest Lands in România.

Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 38 (2): p. (286-292).

Enescu, V., Cherecheș, D., Bânciu, C., 1997. Conservarea biodiversității și a resurselor

genetice forestiere. S.C. Agris-Redacția Revistelor Agricole, București p. 439

Escudero, A., Iriondo, J.,M., Torres, M.E., 2003. Spatial analysis of genetic diversity as a tool

for plant conservation. Biological Conservation 113: p.(351-365).

Excoffier L, Laval G, Schneider S., 2005. Arlequin version 3.0. An integrated software package

for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: p. (47-50).

Falk D. A., Holsinger K., 1991. Genetics and conservation of rare plants.Oxford University

Press, New York.

Farjon A. 2001. World checklist and bibliography of conifers. Kew: Royal Botanic Gardens.

Feurdean, A.,Wohlfarth, B., Björkman, L., I., Bennike, O., Willis, K.J., Farcas, S.,Robertsson,

A.M., 2007a. The influence of refugial population on Lateglacial and early Holocene

vegetational changes in Romania. Review of Palaeobotany and Palynology 145, p. (305-

320).


57

Feurdean A., Tanțău I., Fărcaș S., 2011. Holocene variability in the range distribution and

abundance of Pinus, Picea abies, and Quercus in România; implications for their current

status. Quaternary Science Reviews Volume 30 (21-22): p. (3060-3075).

Geburek, Th., 1997: Isozymes and ADN markers in gene conservation on forest trees.

Biodiversity and Consevation 6: p. (1639-1654).

Geburek, Th., Mottinger-Kroupa S.,Morgante, M., burg, M., 1998: Genetic variation of

Norway spruce (Picea abies (L.) Karst) populations in Austria. II-Microspatial patterns

derived from nuclear derived from nuclear sequence tagged microsatellite sires. Forest

Genetics 5Ș p. (231-237).

Giannini R., Morgante M., Vendramin G.G., 1991. Allozyme Variation in Italian Populations of

Picea abies (L.) Karst. Silvae genetica 40,3/4: p. (160-166).

Goncharenko G., Kurm M., Birgelis J., Maaten T., Tamm Ü., Shevchenko L., 2005. Isoenzymes

structure of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.) in natural populations in Estonia,

Latvia and Byelorussia. Baltic Forestry, 11 (2): p. (9–19).

Goncharenko G.G., Zadeika I.V., Birgelis J.J., 1995. Genetic structure, diversity and

differentiation of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.) in natural populatins of

Latvia.Forest Ecology and Management 72 (1): p. (31-38).

Goudet J., 1995. FSTAT Version 1.2. A Computer Program to Calculate F-Statistics. Journal of

Heredity 86(6): p. (485-486).

Hamrick J.L, Godt M.J.V., Sherman-Broyles S.L., 1992. Factors influencing levels of genetic

diversity in woody plant species . New forest 6 (1-4): p. (95-124).

Hamrick J.L., Nason, J.D., 1996. Consequences of dispersal in plants. Population Dynamics in

Space and Time (ed. Rhones, O. E., Chesser, R.K., Smith, M.H.,)p. 203-236. University of

Chicago Press, Chicago.

Hamrick J.L., 2004. Responsev of forest trees to global envoromental changes. Forest Ecology

and Management 197 (1-3): p. (323-335).

Hattemer, H.H., 1995. Concepts and requirements in the conservation of forest genetic

resources.Forest Genetics 2 (3):p. (125-134).

Hewitt GM (1996) Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and

speciation. Biological Journal of theLinnean Society, 58, 247–276

Heywood, J.S., 1991. Spatial analysis of genetic variation in plant populations. Annual

Review of Ecology and Systematics 22, 335–355.

Hosius, B. (1993). Wird die genetische Struktur eines Fichtenbestandes von

Durchforstungseingriffen beeinflußt? Forst und Holz. 48(11):306-308.


58

Hoffman JI, Boyd ILB, Amos W (2003) Male reproductive strategy and the importance of

maternal status in the ntarctic fur seal Arctocephalus gazella.Evolution, 57, p. (1917–1930).

Hussendörfer, E. (1996). Wird “Biodiversität” durch eine künstliche Bestandesbegründung

beeinflußt? p. 160-176. In: Biodiversität und nachhaltige Forstwirtschaft (Eds.). Müller-

Starck G, Ecomed, Landsberg.

Hughes A. R., Inouye B. D., Johnson M. T. J., Underwood N., Vellend M., 2008. Ecological

consequences of genetic diversity. Ecology Letters 11:p. (609–623).

Kannenberg N., Gross K., 1999. Allozymic Variation in Some Norway Spruce Populations of

the International IUFRO Provenance-testing Programe of 1964/1968. Silvae Genetica 48,5:

p. (209-217).

Knowles, P., Perry, D.J., Foster, H.A., 1992. Spatial genetic structure in two tamarack (Larix

laricina Du Roi K.Koch) populations with different establishment histories. Evolution 46,

p.(572–576).

Konnert M.,Werner M., 2004. Isoenzymuntersuchungen bei Fichte (Picea abies). Anleitungen

zur Trennmethodik und Auswertung der Zymogramme. [Instructions for separation

methodology and analysis of the zimograms for Picea abies] Bayerrisches Amt fur forstiche

Saat- und Pflanzenzucht: p. (1-22).

Korshikov I.I., Privalikhin S.N., 2007. Genetic Structure of Populations of Norway Spruce

(Picea abies (L.) Karst. from Ukrainian Carpathians. Russian Journal of Generics vol. 43 no.

12.: p. (1364-1372).

Kozak, K. H., Graham C. H., Wiens J. J.. 2008. Integrating GIS data into evolutionary studies.

Trends in Ecology and Evolution 23:p. (141–148).

Krajmerová D.; Longauer R., 2000. Genetická diverzita smreka obyčajného na

Slovensku[Genetic diversity of Norway spruce in Slovakia]. Lesnícky Časopis 2000 46 (3):

page (273-286).

Kravchenko A.N., Larionova A.Ya., Milyutin L.I., 2008. Genetic Polymorphism of Siberian

Spruce (Picea obovata Ledeb.) in middle Siberia. Russian Journal of Genetics 44,1: p. (35-

43).

Krutovskii K.V., Bergmann F., 1995. Introgressive hybridization and phylogenetic relationship

between Norway, Picea abies (L.) Karst., and Siberian, P.obovata Ledeb., spruce species

studied by isozyme loci. The Genetical Society of Great Britain, Heredity, 74: p. (464-480).

Lalu, I., 1996. Catalogul național al resurselor genetice forestiere. Manusris Icas Bucuresti.

Lagercrantz U., Ryman N., 1990. Genetic structure of Norway spruce (Picea abies):

Concordance of Morphological and Allozymic Variation. Evolition 44,1: p. (38-53).


59

Langella O., 1999. Population Genetic Software 1.2.31. Free Software Foundation, Boston.

Avaible on http//bioinformatics.org

Latalowa, M., van der Knaap, W.O., 2006. Late Quaternary expansion of Norway spruce (L.)

Karst. in Europe according to pollen data. Quaternary Science Reviews 25,p. (2780-2805).

Leberg P.L., 2002. Estimating allelic richness: Effects of sample size and bottlenecks.

Molecular Ecology 11:p. (2445–2449).

Lewandowski A., Burczyk J., 2002. Allozyme Variation of Picea abies in Poland. Scandinavian

Journal of Forest Research 17 (6): p. (487-494).

Leonardi S., Raddi, S., Borghetti, M., 1996: Spatial autocorrelation of of allozyme traits in a

Norway spruce(Picea abies) population. Can J For Res 26:p.(63–71).

Luo J., Wang Y., Karpelainen H., Li C., 2005. Allozyme Variation in Natural Populations of

Picea asperata. Silva Fennica 39(2): p. (167-176).

Mánek J., 1999. Genetic structure of three natural Norway spruce populations in the Sumava

mountains determined by isoenzyme analysis. Silva Gabreta vol.3: p. (173-182).

Manel. S., Schwartz K. M., Luikart, G., Taberlet, B., 2003. Landscape genetics: Combining

landscape ecology and population genetics.Trends in Ecology and Evolution 18 (4): p. (189-

197).

Mihai G., 2009. Surse de seminţe testate pentru principalele specii de arbori forestieri din

România. [Seed sources tested for mains species of forest trees in România]. Editura Silvică:

p. (281).

Milovanovic J., Sijaric-Nikolic M., 2010. Characterization of Serbian spruce Variability

applying Isoenzyme Markers. Biotehnol & Biotechnol Eq. (1): p. (1600-1605).

Mitchell, A., 2005: The ESRI Guide to GIS Analysis, Volume 2: Spatial Mesurements and

Statistics, ESRI Press.

Muller-Starck G., 1995. Genetic variation in Hight Elevated Populations of Norway Spruce

(Picea abies (L.) Karst.) in Switzerland. Silvae genetica 44, 5-6: p. (356-362).

Ord, J.K., Getis A., 1995. Local Spatial Autocorrelation Statistics: Distributional issues an

Aplication. Geographical analysis 27 (4): p. (286-306).

Oršanić, M., D. Drvodelić, I. Kovačević, 2007. Genetic Variability of Norway Spruce (Picea

abies /L./ H. Karst.) in the Bosnian Part of the Dinaric Mountain Range. Journal of Forestry

Society of Croația.p. (237-247).

Ondrej, I., și Karel, M., 2009. Genetic diversity and spatial structure of the selected young

Norway spruce (Picea abies)population in the Giant Mts. Management biodiversity. Ed. K.

Metejka, Praha.


60

Pârnuţă GH., 2008. Variabilitatea genetică şi ameliorarea arborilor de molid cu coroană

îngustă în România [Genetic variability and tree impruvment of Norway spruce narrow tree

in România]. Editura Silvică, Bucureşti: p. 181.

Pârnuţă, Ghe., Stuparu, E., Budeanu, M., Scărlătescu, V., Marica, Fl.M., Lalu,I., Filat, M.,

Tudoroiu, M., Lorent, A., Nica, M., Teodosiu, M., Chesnoiu, E.N., Pârnuţă,P., Mirancea, I.,

Marcu, C., 2011: Catalogul Naţional al Resurselor Genetice Forestiere . Editura

Silvică.526p

Peakall R., Smouse P.E.,2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic

software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6(1): p. (288-295).

Perry, D.J., Bousquet, M., Bousquet, J., 1999. Sequence-tagged-site (STS) markers of

arbitrary genes: the amount and nature of variation revealed in Norway spruce. Heredity

83: p. (239-248).

Peakall, R., and Beattie, A.J. (1995) Does ant dispersal of seeds in Sclerolaena diacantha

(Chenopodiaceae)generate local spatial genetic structure? Heredity 75, 351-361.

Pulkkinen, P., 1991. Crown form and harvest in pendulos Noeway spruce. Silvae Fennica 25: p.

(207-214).

Reed D. H., Frankham R., 2003. Correlation between Fitness and Genetic Diversity.

Conservation Biology 17:p. (230–237).

Scheldeman, X., and Zonneveld, M., 2010: Training manual on analysis of plant diversity and

distribution. Biodiversity International Rome Italy

Slatkin, M., și Arter, H., 1991, Spatial autocorelation methods in population genetics Am Nat.,

1998, 499-517.

Sofletea N., Curtu L., 2007.Dendrologie[Dendrology]. Ed. Universitatii Transilvania Brasov: p.

304.

Sokal, R. și Oden, N.,(1978) Spatial autocorrelation in biology, 2.Some implications and four

applications of volutionary interest. Biol.J. Linn. Soc. 10, 229–249

Sokal, R., Oden, N.., Thomson, Ba., 1998: Local spatial autocorrelation in biological

variables. Biological Journal of the Linnean Society, 65, p. (41-62).

Stănescu, V., Şofletea, N., 1992: Cercetări de genetică ecologică în molidişuri montane.

Revista Pădurilor 107 (1): 2-5, 51.

Stănescu, V., Șofletea, N.,Popescu, O., 1997. Circumstanțe fenotipice interesând genomul

molidului. Revista de silvicultură. Nr. 2:3-5.

Stănescu V., Şofletea N., 1992. Cercetări de genetică ecologică în molidişuri montane (II).

[Ecological genetics research in mountains spruce stands] Revista Pădurilor 1: p. (2-5).


61

Teodosiu M., 2011. Cercetari Privind Variabilitatea Genetica in Arboretele de Molid din

Obcinele Bucovinei [Resarch regarding genetic variability in Norway spruce stands from

Obcinele Bucovinei]. Ph. D. Thesis, Department of Forest Sciences, Transylvania University

Brasov: p. (164)

Tjoelker M.G., Boratynski A., Bugala W., 2007. Biology and Ecology of Norway Spruce.

Forestry Sciences 78: p. (469)

Tollefsrud M. M., Kissling R.,Gugerli F., Johnsen Ø., Skroppa T., Cheddadi., Van Der Knaap

W. O., Lataaowa M., Terhurne-Berson R., Litt T., Geburek T., Brochmann C., Sperisen C.,

2008. Genetic consequences of glacial survival and postglacial colonization in Norway

spruce: combined analysis of mitochondrial DNA and fossil polllen. Molecular Ecology 17:

p. (4134-4150).

Vicario F., Vendramin GG., Rossi P., Liò P., Giannini R., 1995. Allozyme, chloroplast DNA and

RAPD markers for determining genetic relationships between Abies alba and the relic

populationof Abies nebrodensis. Theor Appl Genet 90:p. (1012–1018).

Weir, B. S. și Cockerham, C. C., 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population

structure. Evolution 38: 1358{1370.

Wright, S., 1965. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard

to system of mating. Evolution 19: p. (395-420).

Yeh F.C., Yang R., 1999. Popgene Version 1.31. Department of Renewable

ResourcesUniversity of Alberta: p. (29).

Zubizarreta G. A., Peltola H., Pulkkinen P., 2009. Growth and wood property traits in narrow

crowned Norway spruce (Picea abies f. pendula) clones grown in southern Finland. Silva

Fennica 43 (3): p.(369-382).

Xie, C.Y., Knowles, P., 1994: Mating System and Effective Pollen Immigration in a Norway

Spruce (Picea abies (L.) Karst) Plantation. Silvae Genetica: 43(1): 48-52.


62

Rezumat

Prin analizele și cercetările efectuate s-a urmărit evaluarea diversității genetice a celei mai

importante specii de conifere [Picea abies L. (Karst)] în populații reprezentative pentru arealul său

natural din România. Distribuția geografică a populațiilor în siturile NATURA 2000 permite

certificarea valorii genetice a acestora și a furnizării de date genetice care să fie folosite în

stabilirea și derularea măsurilor de management forestiere sustenabil.

Diversitatea genetică s-a studiat cu ajutorul markerilor genetici izoenzimatici. Un total de 11

populații din șase regiuni, reprezentative pentru arealul natural al molidului din România au fost

studiate. Pentru toate populațiile analizate s-au studiat 695 de arbori cu ajutorul a 12 loci

izoenzimatici, pentru care s-au identificat 38 de variante alelice. Media proporției locilor polimorfi

a fost de 86.11%, cu valori cuprinse între 75% și 91.67%. Valoarea medie a heterozigoției a fost de

0.115. Cea mai mare valoare a diversității genetice (He=0.125) și bogăției alelelor (A=1.995) au

fost identificate în metapopulația din Munții Apuseni. Din analiza comparativă a populațiilor cele

mai ridicate valori ale indicilor genetici (în special He și A) s-au calculat pentru populația de molid

columnar (APS-2) din Munții Apuseni. Nivelul diferențierii genetice între populații a fost unul

foarte scăzut (Fst=0,009), indicând o diferențiere din punct de vedere genetic de doar 0.9% între

populații. Testul AMOVA a confirmat valoarea mare a prezenței diversității genetice în interiorul

populațiilor de 99%. Testul Mantel nu a indicat o tendință de grupare geografică bazată pe

frecvența alelelor. Totuși dendrograma UPGMA, de grupare ierarhică a populațiilor analizate în

funcție de distanțele genetice Cavalli-Sforza a indicat prezența a trei grupuri la nivelul populațiilor

studiate.

În trei situri (Parâng, Nemira și Postăvarul) prin studiul diversității genetice a populațiilor

gradientale nu s-a indicat o influnță a altitudinii. În metapopulația Apuseni studiul populațiilor

particularizate sub aspect ecotipic și biotipic a indicat o diversitate genetică mai ridicată pentru

populația de molid columnar (Picea abies var. columnaris) și populația molidului de turbărie față

de molidul cu coroană normală (Picea abies var pyramidalis).


63

Abstract

The aim of the extensive researches and investigations of allozyme variations was to determine

the genetic diversity of the most important coniferous tree species from România [Picea abies L.

(Karst.)], in representatives populations of its natural range. The studies of populations located in

NATURA 2000 sites are allowing a certification of genetic values of these sites and provides

genetic data usable in sustainable genetic forestry plans.

Genetic diversity was studied by means of allozyme markers. Eleven populations grouped in six

representative sites across Carpathian Mountains were analyzed. Across all eleven populations,

695 adult trees were studied at 12 enzyme coding loci, and for them 38 alleles variants were

revealed. The mean of polymorphic loci was 86.11%, ranging between 75.00% and 91.67%. The

mean expected heterozygosity was 0.115. The highest values for genetic diversity (He=0.125) and

allelic richness (A=1.995) have been scored in the Apuseni Mountains metapopulation. By

comparative analyses of populations, the highest genetic diversity has been found in the narrow

crown spruce population from Apuseni Mountains. The genetic diversity among populations

estimated by Fst value, was 0.9%. As consequence, AMOVA test revealed a very high value of

genetic diversity at intrapopulational level (99%) and the Mantel test did not indicate a

geographical pattern of allele frequencies. Nevertheless, the UPGMA cluster analysis based on the

Cavalli-Sforza genetic distances indicates a small clustering tendency in three groups.

In three sites (Parâng, Nemira and Postăvar) the study of genetic differences between low and

high altitude populations did not showed the influence of altitude gradient in the alleles diversity.

Higher genetic diversity values were found in narrow-crown biotype (Picea abies var columnaris)

and in the peat bog ecotype then in the typical crown spruce (Picea abies var pyramidalis), in three

populations from Apuseni Mountains.


64

Curriculum vitae

Informaţii personale

Nume / Prenume RADU GHEORGHE RAUL

Naţionalitate Română

Data naşterii și locul nasterii 04.04.1984; Brașov

Starea civilă Căsătorit

Experienţa profesională

Perioada 2008 – prezent

Funcţia sau postul ocupa Expert cartografiere, fotointerpretare, digitizare, studii statistice

Activităţi şi responsabilităţi principale

Realizarea proiectelor de cartografiere, GIS, fotointerpretare, digitizare,

teledetecţie, analiză, procesare si transformare date

Numele şi adresa angajatorului

S.C. Geodis România S.R.L., Braşov

Perioada 2008

Funcţia sau postul ocupat Inginer amenajist

Activităţi şi responsabilităţi principale

Proiecte de amenajament silvic

Numele şi adresa angajatorului

I.C.A.S. Braşov

Educaţie şi formare

Perioada 2003 – 2008

Calificarea / diploma obţinută

Diplomă de Inginer silvic

Disciplinele principale studiate

Silvicultură, cadastru

Numele şi tipul instituţiei de învăţământ

Universitatea „Transilvania” Braşov, Facultatea de Silvicultură şi Exploatări Forestiere

Perioada 1999-2003

Calificarea / diploma obţinută

Tehnician silvic

Disciplinele principale studiate

Silvicultură

Numele şi tipul instituţiei de învăţământ

Liceul silvic Nicolae Rucăreanu Brașov

Limbi străine cunoscute Engleză; Franceză

Activitatea ștințifică Lucrări publicate: 4; Comunicări ștințifice: 1


65

Curriculum vitae

Personal information

First name / Surname RADU GHEORGHE RAUL

Nationality Romanian

Date of birti 04.04.1984; Brașov

Marital status Married

Work experiance

Dates 2008 – present

Occupation or position held Cartography expert, photointerpretation, digitization, statistic studies

Main activities and responsabilities

Buiding of GIS and carthographic maps based on surveys,

photointerpretation; analize and data precessing and transformation

Name and adress of employer

S.C. Geodis România S.R.L., Braşov

Dates 2008

Occupation or position held Forestry engineer

Main activities and responsabilities

Forestry planning projects

Name and adress of employer

I.C.A.S. Braşov

Education and training

Dates 2003 – 2008

Title of qualification awarded Forestry engineer diploma

Main study Silviculture and forestry

Name and type of organisation providing education and training

Transilvania University Braşov, Faculty of Forestry Brașov

Dates 1999-2003

Title of qualification awarded Forestry tehnician

Main study Silviculture

Name and type of organisation providing education and training

Nicolae Rucăreanu High School Brașov

Foreign languages English and French

Scientific activity Published articles: 4; Scientific conferences: 1

rezumatul tezei de doctorat ph.d. thesis summaryold.unitbv.ro/portals/31/sustineri de...

Documents