1

Raport ştiin ţific

privind implementarea proiectului cu titlul “Diversitatea procariotelor aparținând Domeniului Archaea din

lacurile sărate din Depresiunea Transilvaniei (Centrul României)”,

cod PN-II-PCE-2011-3-0546, nr. contract 186/2011.

CUPRINS:

I. Raport știin țific sintetic pentru întreaga perioadă de derulare a proiectului (2011-2016);

II. Raport știin țific pentru activit ățile derulate în perioada ianuarie 2016 – septembrie 2016.

I. Raport științific sintetic pentru întreaga perioadă de derulare a

proiectului (2011/2016).

In perioada octombrie 2011 - septembrie 2016, activităţile desfăşurate în cadrul proiectului nostru au urmărit

atingerea următoarelor trei obiective științifice:

O.1. Caracterizarea distribuţiei pe verticală a diversităţii microorganismelor din Domeniul Archaea în

gradientul de salinitate şi temperatură din lacurile saline eşantionate.

O.2. Evaluarea dinamicii temporale (sezoniere) a diversităţii procariotelor din Domeniul Archaea in

lacurile saline eşantionate.

O.3. Estimarea impactului activităţii umane asupra diversităţii spaţiale şi temporale a procariotelor din

Domeniul Archaea în lacuri sărate eşantionate.

În paralel, a fost urmărită atingerea unui obiectiv managerial (O.4.) și care a cuprins planificarea

experimentelor, derularea achizițiilor, dezvoltarea unei resurse umane și diseminarea rezultatelor.

Mai jos, descriem succint principalele repere științifice ale celor șase etape corespunzătoare anilor de derulare a

proiectului. O sinteză a activităților manageriale este, de asemenea, prezentată ca un subcapitol distinct (O.4., pag. 3-5).

Etapa 1 (octombrie 2011 – februarie 2012). S-au efectuat deplasări pe teren in scopul monitorizării in situ a

parametrilor fizici şi chimici pentru sezonul de iarnă pentru următoarele lacuri: Ocnei, Rotund şi Tarzan (Turda,

Jud. Cluj); Brâncoveanu, Fără Fund şi Mâţelor (Ocna Sibiului, jud. Sibiu) şi Ursu, Negru (Sovata, jud. Mureş).

Etapa 2 (2012). S-a continuat monitorizarea parametrilor fizico-chimici și biologici în lacurile menţionate pentru

a colecta date şi probe multi-sezoniere. În paralel, s-au efectuat analize chimice de mediu ale compoziţiei de

compuşi organici şi minerali din apele eşantionate (conţinutul total de carbon dizolvat, ionii amoniu, nitriţi, nitraţi,

cloruri, sulfuri, sulfaţi, fosfati, ioni de sodiu, potasiu, magneziu etc.). Analizele chimice s-au efectuat pe nivele de

apă, pe lacuri şi în sezoane diferite pentru a evidenţia eventualele variaţii sezoniere şi pe verticală. În majoritatea

lacurilor investigate s-a putut constata o evuidentă stratificare fizică şi chimică a apei, rezultând în categorizarea

acestor lacuri ca fiind drept meromictice. Lacurile meromictice investigate au un strat superior de apă (de la

2

suprafaţă și până la aproximativ 2 m adâncime), numit epilimnion, cu variaţii sezoniere evidente ale temperaturii

şi oxigenului dizolvat şi cu salinitate moderată (3-9%). Un strat intermediar de apă (între 2,5 și 4 m adâncime),

denumit chemoclină, este locul unde se înregistrează o schimbare abruptă de concentraţie a sărurilor totale

(haloclină, cu o creştere de la 9-10% la 25 sau 30% a salinităţii), a oxigenului dizolvat (oxiclină, de la 3-4 %

oxigen dizolvat la mai puţin de 0,2%). Sub acest strat de tranziţie există un strat de apă cu caracteristici fizice

(temperatură, circa 14oC pe toată durata anului) şi chimice (salinitate - 32-34%, oxigen dizolvat - < 0,2 %,

concentraţii de ioni amoniu etc) cvasiconstante. Acest strat hipersalin şi microoxic/anoxic, denumit

monimolimnion, este habitatul archeelor extrem halofile, fapt demonstrat atât prin analiza moleculară a ADN

genomic total extras din probele de apă și sediment, cât şi de izolatele obţinute în laboratorul nostru (și aparținând

genurilor Halobacterium spp., Halorubrum spp., Halovenus spp., Natrinema spp.). Am demonstrat și raportat,

prin cele două lucrări trimise spre publicat (descrise succint mai jos, în cadrul raportului științific pe anul 2013),

că chemoclina acţionează ca un filtru sau barieră ecologică pentru separarea comunităţilor de archaea în două

populaţii oarecum distincte ca structură şi compoziţie. Acest fapt a fost evidenţiat pe două lacuri: Ocnei şi

Brâncoveanu, luate ca modele datorită caracteristicilor lor oarecum deosebite.

Etapa 3 (2013). Pe parcursul anilor 2012-2013 s-a reuşit izolarea a peste 250 de tulpini de Archaea din toate

lacurile eşantionate. Cea mai mare rată de succes (cel mai mare număr de izolate) a fost obținută cu mediul

selectiv, sărac în nutrienți, R2A (17-25% salinitate totală), în lacurile Brâncoveanu și Ocnei. S-au testat

caracteristicile fenotipice ale izolatelor de Archaea. Merită menţionat efortul nostru de a identifica pe cale

moleculară toate tulpinile isolate (Activitate în cadrul O.2.). În paralel, s-a continuat monitorizarea in situ de

caracterizare fizico-chimică și biologică multianuală a lacurilor sărate studiate (activitate prevăzută în cadrul

obiectivului O.1.). S-a constata că impactul activității umane (O.3.) poate fi investigat doar comparând

modificările pe termen mediu (2-3 ani) a factorilor abiotici și a celor biotici, în lacuri destinate balneației (în

sezonul estival, respectiv în lacurile Ocnei, Rotund și Ursu), fie direct afectate de poluare menajeră (lacul

Mâțelor), și în lacuri strict protejate (rezervația Lacului Fără Fund, Ocna Sibiului).

Etapa 4. (2014). In urma parcurgerii activităților de cercetare propuse s-a reușit izolarea a peste 200 de tulpini de

Archaea aerobe (Clasa Halobacteria) din lacurile Ocnei, Brâncoveanu, Fără Fund și Ursu. Analiza statistică și

bioinformatică a datelor obținute a permis identificarea moleculară a acestor tulpini. Majoritatea (ca. 40%) aparțin

genului Haloferax (Hfx. volcanii și Hfx. prahovense fiind dominante), urmate de cele afiliate genurilor

Halorubrum, Halobacterium și Halopelagius. În total, 18 genuri au fost izolate, unele dintre ele fiind raportate

pentru prima oară în lacuri din Europa. La momentul anului 2014, monitorizarea de trei ani a indicat caracterul

stabil, permanent stratificat și hipersalin al lacurilor testate. Ele se constituie, astfel, in mod cert, in situri-model

pentru experimentarea dinamicii și diversității comunităților microbiene ca rezultat al diferențierii unor micronișe

ecologice distincte de-a lungul coloanei de apă.

3

Etapa 5 (2015). În cadrul acestei etape au fost efectuate deplasări pe teren la lacurile Ursu şi Fără Fund pentru

investigarea fluctuaţiilor sezoniere a parametrilor menţionaţi. Drept rezultat s-a reuşit caracterizarea profilului

vertical al acestor parametri cu confirmarea datelor obţinute şi în anii anteriori (2012-2014). Per ansamblu, atât

lacul Ursu, cât şi lacul Fără Fund au fost încadrate în categoria lacurilor sărate (cu salinitate peste 60 g/L),

stratificate permanent. În ambele ecosisteme s-a putut o stratificare în special a salinităţii, cu o haloclină

poziţionată la circa 3,5 m adâncime (Lacul Ursu), respectiv, circa 2,5 m adâncime (Lacul Fără Fund). Stratul

superficial de apă (mixolimnion) s-a caracterizat prin concentraţii ridicate de oxigen dizolvat (4-9 mg O2 /L),

fiind, aşadar zone oxice. Oxiclina a fost poziţionată la aceleaşi adâncimi cu haloclina, în ambele lacuri. Demn de

remarcat este faptul că mixolimnionul lacului Ursu a fost caracterizată de o salinitate moderată (60-100 g/L) în

timp ce stratul analog din lacul Fără Fund a avut caracter hipersalin (> 190 g/L, cu uşoare variaţii sezoniere). Zona

de adâncime a ambelor lacuri a fost marcată de hipoxie, hipersalinitate, iar în cazul Lacului Ursu, de un potenţial

redox extrem de ridicat datorat foarte probabil concentraţiilor ridicate de hidrogen sulfurat. Ambele lacuri au

prezentat, de asemenea, o stratificare a temperaturii, parametru care a variat cel mai mult în stratul mixolimnetic

pe durata celor patru sezoane urmărite. În timpul sezonului de vară, efectul heliotermic, caracteristic acestor

lacuri, a fost evident. În urma aplicării de tehnici şi metode specifice biologiei moleculare ambientale, inclusiv a

analizelor biostatistice şi bioinformatice, s-a reuşit elucidarea structurii şi compoziţiei comunităţilor microbiene

care habitează coloana de apă a lacurilor Ursu şi Fără Fund. Archaea are o contribuţie importantă în cadrul

comunităţilor de procariote din Lacul Fără Fund, în timp ce ambele lacuri au stratul monimolimnetic dominat de

reprezentanţi ai domeniului Bacteria. Totodată, în premieră ştiinţifică a fost demonstrată posibilitatea vieţuirii

unor reprezentanţi ai unor grupe de Archaea descrise recent: Nanohaloarchaea şi Parvarcheota.

Etapa 6 (ianuarie - septembrie 2016). Principalele rezultate obținute în cadrul acestei etape sunt descrise în a

doua parte a prezentului raport (pag. 6-10). Totuși, subliniem câ eforturile noastre s-au axat pe o abordare

multidisciplinară, fără precedent în literatura de specialitate pentru acest tip de habitat acvatic, prin monitorizarea

dinamicii sezoniere a factorilor abiotici și biologici dublată de eșantionarea de probe de apă timp de patru

sezoane, de la 9 puncte de adâncime diferite, extracția de ADN genomic ambiental și aplicarea tehnicii de

metabarcoding pentru toate probele eșantionate. Datele sunt încă în faza de prelucrare și ne așteptăm la rezultate

de înalt impact științific.

O.4. Obiectivul managerial

Gestionarea resurselor umane și financiare ale prezentului proiect a fost o sarcină ușurată de plăcerea și

entuziasmul cu care toți membrii echipei de cercetare s-au implicat pe parcusrul întregului interval evaluat (2011-

2016). În plus, instituția contractoare, Universitatea ”Babeș-Bolyai” din Cluj-Napoca, prin serviciile specializate

din cadrul Direcției General Administrativă și cele subordonate Rectoratului (Centrul de Managementul Cercetării

Științifice a U.B.B.), a facilitat extrem de mult derularea achizițiilor și procedurilor aferente raportărilor

4

intermediare, fapt pentru care directorul prezentului proiect le este recunoscător. Considerăm că proiectul de

cercetare s-a desfășurat cu succes, lucru demonstrat atât de producția științifică (Tabelul 1), cât și de succesul

privind educația și dezvoltarea resursei umane (Tabelul 2).

Tabel 1. Producția științifică generată ca urmare a finanțării prezentului proiect.

Anul Titlul articolului* 2012 Andrei A.Ş., Banciu H.L., Oren A. (2012) Living with salt: metabolic and phylogenetic diversity of

archaea inhabiting saline ecosystems. FEMS Microbiol Lett. 330 (1), 1-9. 2014 Baricz, A, Coman, C., Andrei, A.Ş., Muntean, V., Keresztes, Z.G., Păusan, M., Alexe, M., Banciu, H.L.

(2014), Spatial and temporal distribution of archaeal diversity in meromictic, hypersaline Ocnei Lake (Transylvanian Basin, Romania). Extremophiles, 18 (2): 399-413.

2015 Baricz, A., Cristea, A., Muntean, V., Teodosiu, G., Andrei, A.-Ş., Molnar, I., Alexe, M., Rakosy-Tican, E., Banciu, H.L. (2015) Culturable diversity of aerobic halophilic archaea (Fam. Halobacteriaceae) from hypersaline, meromictic Transylvanian lakes. Extremophiles, 19 (2): 525-537

2015 Coman, C., Chiriac, C.M., Robeson, M.S., Ionescu, C., Dragos, N., Barbu-Tudoran, L., Andrei, A.-S., Banciu, H.L., Sicora, C., Podar, M. (2015) Structure, mineralogy and microbial diversity of geothermal spring microbialites associated with a deep oil drilling in Romania. Front Microbiol, 6: 253.

2015 Andrei, A.-Ş., Robeson, M.S., Baricz, A., Coman, C., Muntean, V., Ionescu, A., Etiope, G., Alexe, M., Sicora, C.I., Podar, M., Banciu, H.L. (2015). Contrasting taxonomic stratification of microbial communities in two hypersaline meromictic lakes. ISME J., 9 (12): 2642-2456.

2015 Banciu, H.L., Muntyan, M.S. (2015). Adaptive strategies in the double-extremophilic prokaryotes inhabiting soda lakes. Curr Opin Microbiol, 25: 73-79.

2015 Sorokin, D.Y., Banciu, H.L., Muyzer, G. (2015). Functional microbiology of soda lakes. Curr Opin Microbiol, 25: 88-96.

2016 Andrei, A.-Ş., Baricz, A., Păuşan, M., Muntean, V., Sicora, C.I., Alexe, M., Rakosy-Tican, E., Banciu, H.L. (2016) Spatial distribution and molecular diversity of archaeal communities in the extreme hypersaline meromictic Brâncoveanu Lake (Transylvanian Basin, Romania). Geomicrobiol J. DOI: 10.1080/01490451.2016.1149527

2016 Voica, D.M., Bartha, L., Banciu, H.L ., Oren, A. (2016) Heavy metal resistance in halophilic Bacteria and Archaea. FEMS MIcrobiol. Lett. 363 (4): fnw146. DOI: 10.1093/femsle/fnw146.

Anul Titlul conferin ței/rezumatului** 2012 11th International Conference EXTREMOPHILES 2012, 10-13 Septembrie, Sevilla, Spania. Baricz, A.,

Andrei, A.,-S., Muntean, V., Coman, C., Keresztes, Z.G., Alexe, M., Banciu, H., Spatial distribution of microbial communities along salinity gradient in six saline and hypersaline lakes from Transylvania (Central Romania). Abstracts Book, p. 143.

2013 5th International Conference and 31st Annual Session of Romanian Society for Cell Biology (RSCB), 5-9 Iunie 2013, Timişoara, Romania. Păuşan, M.-R., Andrei, Ş.-A., Baricz, A., Coman, C., Muntean, V., Keresztes, Zs. G., Alexe, M., Banciu,

H., Seasonal diversity and vertical distribution of archaea inhabiting Brâncoveanu Lake (Sibiu County, Romania);

Baricz, A., Păuşan, M.-R., Andrei, Ş.-A., Coman, C., Muntean, V., Keresztes, Zs. G., Alexe, M., Banciu, H., Diversity of archaea in meromictic saline lake Ocnei (Turda, Romania).

2014 Annual International Conference of Romanian Society for Biochemistry and Molecular Biology (RSBMB), 5-6 Iunie 2014, Băile Felix (Oradea), Romania. Andrei, A.-Ș., Robeson II, M.S., Podar, M., Baricz, A., Coman, C., Sicora, C.I., Muntean, V., Banciu, H.L., Taxonomic profiling of prokaryotic comunities from an extreme hypersalinne meromictic lake using a next-generation sequencing approach”. Romanian J. Biochem., 51 (Suppl.), 2014, p. 16-17.

2014 International Symposium “Young Researchears in BioSciences”, 23-27 Iulie 2014, „Babes-Bolyai” University of Cluj-Napoca, Romania. Cristea, A., Baricz, A., Andrei, A.-Ș., Muntean, V., Banciu, H.L., Isolation and phenotypic characterization of Haloferax sp. strains isolated from Transylvanian salt lakes.

2015 8th International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy (ICAVS 8), 12-17 Iulie 2015, Viena, Austria. Leș, A., Dina, N.E., Baricz, A., Banciu, H.L., Leopold, N. Discrimination of haloarchaeal genera using Raman spectroscopy and PCA. Second EMBO Conference on Aquatic Microbial Ecology (SAME-14), 23-28 August, 2015, Uppsala,

5

Suedia. Andrei, A.-Ş., Baricz, A., Chiriac, C., Szekeres, E., Coman, C., Banciu, H.L., Composition and diversity of microbial communities in hypersaline sapropels.

2016 Invitat cu prezentare orală la 11th International Congress HALOPHILES 2016, 22-27 Mai 2016, San Juan, Puerto Rico: Andrei, A.-S., Baricz, A., Muntean, V., Alexe, M., Podar, M., Banciu, H.L., Microbial diversity in permanently stratified hypersaline lakes of the Transylvanian Basin, central Romania.

* Sunt cuprinse doar lucrările publicate/acceptate in extenso în reviste cu factor de impact ISI, cu menționarea codului și numărului de contract al proiectului de față.

** Sunt menționate doar conferințele internaționale sau naționale cu participare internațională relevante pentru anul respectiv.

Tabel 2. Dezvoltarea resursei umane prin susținerea de lucrări de absolvire de specialitate.

Nivel de studiu Număr Nume, Prenume, An Licență 17 4 lucrări în 2013; 5 lucrări în 2014;

4 lucrări în 2015; 4 lucrări în 2016. Master 2 PĂUȘAN Manuela (2015)

CRISTEA Adorján (2016) Doctorat 1 ANDREI Adrian/Ștefan (2015) Abilitare 1 BANCIU Horia Leonard (2015)

Proiectul are pagină de prezentare pe internet la https://banciuhoria.wordpress.com/ unde pot fi consultate mai

multe detalii legate de derularea acestuia.

CONCLUZII FINALE

O.1. În lacurile sărate investigate s-a putut evidenția o distribuție pe verticală a diversității procariotelor din

Domeniul Archaea, distribuție care reflectă stratificarea fizico-chimică (meromixia) a acestor lacuri. Genurile

de haloarchaea aerobe au fost izolate și identificate preponderent în straturile superficiale, oxice ale unor

lacuri cu caracter hipersalin începând de la suprafață (Ocnei, Brâncoveanu, Fără Fund). Genuri de Archaea

anaerobe sau microaerofile au fost observate predominant în monimolimnion și nămolurile sapropelice de pe

fundul lacurilor (Ocnei, Rotund, Brâncoveanu, Fără Fund, Ursu).

O.2. Acolo unde au fost observate ca având o abundență semnificativă, comunitățile de Archaea (dominate de

reprezentanți ai Clasei Halobacteria) parcurg fluctuații sezoniere ale compoziției dar numai în stratul

epilimnetic (superficial, până la circa 3 m adâncime) , în timp ce comunitățile de profunzime sunt relativ

stabile (L. Ocnei, L. Ursu).

O.3. Investigarea rolului comunităților acvatice de Archaea s-a făcut și în contextul mai general al studierii

comunităților microbiene, cu precădere în două lacuri-model: Ursu și Fără Fund, ambele situri naturale aflate

în regim de protecție. Perioadele în care lacurile sunt utilizate în scopuri recreaționale (de exemplu, L. Ursu,

dar și L. Ocnei) au drept consecință o alterare temporară a stratificării lacurilor și, implicit, modificări ale

distribuției și compoziției comunităților microbiene din orizontul superficial de apă. Chiar și în condițiile

acestui tip de impact antropic, monitorizarea multianuală a lacurilor a indicat o relativă stabilitate a

stratificării fizico-chimice, fapt care ne permite să concluzionăm că pe termen mediu (ani de zile),

comunitățile de Archaea din aceste lacuri nu suferă schimbări semnificative de structură și compoziție.

6

Această observație este importantă din două puncte de vedere: i) monitorizarea multi-sezonieră și

multianuală a parametrilor fizico-chimici cu ajutorul unui echipament relativ puțin costisitor poate oferi

indicii prețioase, chiar dacă indirecte, cu privire la potențialul de schimbare a compoziției comunităților

microbiene halofile din lacurile sărate; ii) lacurile sărate precum Lacul Ursu (și nu numai), sunt un rezervor

natural de nămol cu valoare terapeutică (nămolul sapropelic), sediment care se formează în condiții

cvasistaționare, sub acțiunea concertată a unor factori abiotici și biotici (implicit microbiologici), iar

monitorizarea fizico-chimică și biologică este esențială pentru a proiecta o strategie eficientă de conservare a

acestor lacuri.

Prin rezultatele științifice obținute și validate prin publicații cu vizibilitate internațională, considerăm că actualul

proiect a răspuns adecvat scopului general al Programului Național CDI II (Obținerea unor rezultate știin țifice

si tehnologice de vârf, compatibile cu cele de nivel european reflectate prin creșterea vizibilității și

recunoașterea internațională a cercetării românești.)

O.4. (Obiectiv managerial) Prin dezvoltarea resursei umane și crearea premiselor unor noi perspective de

investigare a habitatelor naturale sau antropice cu condiții extreme de mediu, considerăm că proiectul de

cercetare prezent și-a atins nu doar obiectivele științifice, dar a și valorificat eficient potențialul material și

uman susținut prin finanțare de către autoritatea contractantă, UEFISCDI.

II. Raport științific pentru activitățile derulate in perioada ianuarie 2016 –

septembrie 2016

In perioada ianuarie 2016 - septembrie 2016, activităţile desfăşurate în cadrul proiectului nostru au urmărit

atingerea următoarelor obiective stabilite prin Planul de Realizare (Anexa IV la Actul aditional nr. 2/2015).

Obiectiv 1. Determinarea sezonieră a parametrilor fizici şi chimici ai unor lacuri sarate din Depresiunea

Transilvaniei. Pentru atingerea acestui obiectiv activităţi au fost efectuate deplasări pe teren la lacurile Ursu şi

Fără Fund (Activitatea 1.1.) pentru investigarea fluctuaţiilor sezoniere a parametrilor menţionaţi. Drept rezultat s-

a reuşit caracterizarea profilului vertical al acestor parametri (pentru Lacul Ursu vezi Fig. 1) cu confirmarea

datelor obţinute şi în anii anteriori (2012-2015). Analizele chimice ale probelor de apă eșantionate (Activitatea

1.2.) s-au axat, în cazul Lacului Ursu, pe conținutul de carbon, azot și sulf sub forma carbonului total (TC),

carbonului organic și anorganic total (TOC, TIC), dizolvat (DC, DOC, DIC) si particulat (POC), a azotului total

(TN), dizolvat (DTN) si particulat (PTN) (vezi Fig. 1) , a sulfatilor și sulfurilor totale.

7

Figura 1. Profilul vertical sezonier al parametrilor fizico-chimici si a nutrientilor determinati în coloana de apă a

Lacului Ursu (Sovata, jud. Mureş). Masuratorile si analizele au fost efectuate pe probe colectate in perioada 2015-

2016 si acopera patru sezoane.

În ansamblu, s-a putut constata o acumulare a conținutului organic al lacului Ursu sub zona de tranziție dintre

stratul oxic și cel anoxic, respectiv sub 3-3,5 m (chemoclină). Această acumulare de materie organică este

explicabilă prin prisma faptului că în lipsa oxigenului, degradarea ei este încetinită. Această tendință de acumulare

a materiei organice favorizează depunerea materiei organice sub forma nămolului sapropelic, resursa economică

8

cea mai valoroasă a Lacului Ursu și, implicit a localității Sovata. Fenomenul descris mai sus este tipic pentru un

bazin de apă stagnantă, de adâncime considerabilă, cu un orizont de apă înalt productiv (prin dispunerea unei

comunități fotosintetizante în stratul superficial, fotic ;i cu salinitate redusă) dispus peste un orizont de apă anoxic.

Stratificarea fizico-chimică a lacului Ursu a condus, în timp, la o stratificare ”metabolică” fapt care a contribuit la

amplificarea fenomenului de generare a nămolului sapropelic.

În concluzie, obiectivul propus 1 a fost atins în proporţie de 100%.

Obiectivul 2: Analiza diversităţii moleculare a procariotelor din lacurile sărate din Depresiunea

Transilvaniei) a fost atins după cum urmează.

Metode: Probele de apă colectate sezonier (lunile februarie, aprilie, iulie și noiembrie) și pe adâncime (8

adâncimi, de la 0,5 m până la 9 m), au fost filtrate pe membrane MCE (Fioroni, Franța) cu pori de 0,2 µm pentru

concentrarea biomasei microbiene. Filtrele au fost folosite ulterior pentru extracția ADN genomic, cu kitul ZR

Soil Microbe DNA (Zymo Research, USA), conform indicațiilor producătorului. Înainte de extracție membranele

au fost mărunțite cu ajutorul unor pense sterile, pentru a facilita liza celulară. ADN genomic obținut a fost

verificat din punct de vedere calitativ și cantitativ prin utilizarea spectrofotometrului NanoDrop, iar

secvențializarea de nouă generație a fost realizată de o companie comercială (Macrogen, Coreea de Sud).

Secvențele brute obținute prin secvențializare de nouă generație au fost procesate folosind platformele QIIME și

Usearch v8 (Caporaso și colab. 2010; Edgar 2013). Fragmentele au fost suprapuse in QIIME, filtrate calitativ,

dereplicate iar secvențele unice au fost îndepărtate cu ajutorul Usearch v8. Identificarea secvențelor himerice și

identificarea de novo s-au realizat prin intermediul Usearch v8, utilizând ultima versiune a bazei de date

Greengenes ('13_8') (DeSantis et al. 2006). Clasificarea taxonomică a OTU reprezentative s-a efectuat prin

utilizarea platformei QIIME și a bazei de date Greengenes. Secvențele mitocondriale și plastidiale au fost

îndepărtate din tabelul OTU iar curbele de rarefacție au fost create folosind un prag de 38900 secvențe/probă.

Estimarea alpha și beta-diversității s-a realizat în QIIME. Pentru crearea graficelor de abundență, a fost utilizată

funcția barplot din R, pe baza filumurilor cu abundența peste 1%, pentru fiecare adâncime și sezon.

Rezultate: Straturile oxigenate ale coloanei de apă din Lacul Ursu (0.5-2 m) sunt dominate de membri ai

increngaturilor Proteobacteria, Bacteroidetes și Actinobacteria, în timp de partea anoxică (3-9 m) prezintă o

diversitate mai mare și este marcată de predominanța unor taxoni neclasificați sau aparținând unor increngaturi ce

incă nu au fost caracterizate (GN02, OD1, OP1), împreună cu membri ai increngaturilor Bacteroidetes,

Firmicutes, Chlorobi și Cyanobacteria (Fig. 2a). Abundența relativă a secvențelor aparținând Proteobacteria și

Bacteroidetes scade cu adâncimea, iar cele aparținând Cyanobacteria prezintă maxime la 2 și 4 m. Parametri

fizico-chimici analizați au indicat prezența hidrogenului sulfurat, în concentrații considerabile între 3 și 5 m. Din

analizele de diversitate se poate observa dominanța bacteriilor verzi sulfuroase aparținând increngaturii Chlorobi

9

(bacterii anaerobe fotoautotrofe ce folosesc sulfuri, hidrogen sau Fe2+ ca donor de electroni) la 3.5 m adâncime, în

acest strat concentrația de hidrogen sulfurat fiind considerabilă. Dinamica sezonieră a comunității procariote

indica o variație redusă în structura comunității, microbiomul rezident fiind dominat de bacterii aparținând

increngaturilor Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes si Cyanobacteria (Fig. 2b).

a. b.

Figura 2. Abundenta relativa a unitatilor taxonomice operative (OTUs) la nivel de increngatura identificate prin

tehnici moleculare in Lacul Ursu in functie de adancime (a) si sezon (b).

Obiectiv 3. Gestionarea proiectului si diseminarea rezultatelor

Acest obiectiv a cuprins trei activităţi:

3.1. Intocmirea documentatiei necesare derularii proiectului (platii salariilor, achizitiei de logistica, a

documentelor de deplasare pe teren, raportare etc.) justificat prin documentele auditate;

3.2. Efectuarea unui stagiu de pregatire intr-un laborator din străinătate al unuia dintre membrii echipei de

cercetare) a fost inlocuita cu o activitate analoaga, prin vizita in laboratorul nostru a dlui prof. Aharon OREN

(Universitatea Ebraica din Ierusalim, Israel) in intervalul 22-29 mai 2016 (conform dovezilor de deplasare

anexate). In timp, colaborarea cu dl profesor Oren a fost concretizata prin publicarea a doua articole de sinteza

intr-o revista cu factor de impact (FEMS Microbiology Letters), ambele articole avand mentionate suportul

financiar („Acknowledgments”) al prezentului proiect.

Activitatea 3.3. (Diseminarea rezultatelor prin întreţinerea si actualizarea paginii web a proiectului;

participare la conferinţă naţională sau internaţională) a fost realizată şi ea în proporţie de 100% prin:

10

- Actualizarea continua a paginii de web a proiectului (https://banciuhoria.wordpress.com/). Pagina de web

are linkuri către: Collaborators, Conferences and Symposia, Publications, Preliminary Conclusions, Progress

Reports, Research Team and Training of Human Resources.

- Participarea cu postere şi/sau rezumate la cinci manifestări ştiinţifice: una naţionala cu participare

internaţională (Cluj-Napoca) şi una în străinătate (San Juan, Puerto Rico) (pentru detalii va rugăm accesaţi pagina

de informaţii https://banciuhoria.wordpress.com/conferences-and-symposia/ )

- Publicarea rezultatelor cercetării sub forma a doua articole in reviste cu factor de impact (Andrei et al.,

2016, Geomicrobiology Journal; Voica et al., 2016, FEMS Microbiology Letters).

- Un manuscris pe tema variatiei spatio-temporale a diversităţii microbiene din Lacul Ursu este în lucru,

urmează să fie finalizat şi trimis spre evaluare la un jurnal indexat ISI şi cu factor de impact.

Concluzii la etapa corespunzătoare anului 2016:

1. Coloana de apă a lacului Ursu, unul dintre cele mai mari lacuri sărate heliotermice din Europa, este

dominată de membri ai domeniului Bacteria, aparținând increngăturilor Proteobacteria, Bacteroidetes și

Actinobacteria în straturile oxigenate, și GN02, OD1, OP1 împreună cu Bacteroidetes, Firmicutes,

Chlorobi și Cyanobacteria in straturile anoxice.

2. Analizele de diversitate indica stabilitatea relativă a microbiomului din Lacul Ursu, variațiile în structura

comunității putând fi explicate în mare parte de stratificarea pe adâncime a microorganismelor și mai

puțin de distribuția temporală (sezonieră) a taxonilor.

3. Stratificarea biodiversității microbiene a lacului Ursă reflectă fidel stratificarea fizico-chimică și cea a

nutrienților măsurați pe parcursul unei monitorizări multi-sezoniere.

4. Studiile efectuate au urmărit în mod preferențial caracteristicile Lacului Ursu datorită importanței acestui

sit pentru dezvoltarea economică și turistică a comunității orașului Sovata, cu perspective spre dezvoltarea

unor noi strategii de dezvoltare durabilă și conservare a Lacului Ursu.

5. Considerăm că obiectivele ştiinţifice şi manageriale propuse pentru anul 2016 au fost îndeplinite în

totalitate.

Prin prezenta declar ca datele de mai sus sunt conforme cu realitatea.

Cluj-Napoca, 16.09.2016 Director de proiect

Conf. Dr. Horia Leonard BANCIU