quorum sensing and response

1

Universitatea din București, Facultatea deBiologie

TEZĂ DE DOCTORAT

IMPLICAŢIILE FENOMENULUI DE QUORUM SENSING AND RESPONSE ÎN EXPRIMAREA COORDONATĂ A FACTORILOR DE

PATOGENITATE ŞI VIRULENŢĂ LA TULPINI DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ŞI PSEUDOMONAS AERUGINOSA

-REZUMAT-

CONDUCĂTOR ȘTIINŢIFIC DOCTORAND PROF. UNIV. DR. VERONICA STOIAN ANI IOANA COTAR

București 2009

2

Cuprins

PARTEA TEORETICĂ - Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa - modele de studiu al mecanismelor de reglare prin quorum-sensing a expresiei factorilor de virulenţă la bacteriile Gram-pozitive, şi respectiv Gram-negative Abrevieri Introducere 1 I. Caracterizare generală a modelelor bacteriene (S. aureus şi Ps. aeruginosa) 2

I.1. S. aureus şi Ps. aeruginosa – încadrare taxonomică 2 I.2. Patogeneza infecţiilor determinate de Staphylococcus aureus 3

I.2.1. Colonizare 4 I.2.1.1. Receptine asociate suprafeţei celulare 5 I.2.1.2. Receptine secretate 10 I.2.1.3. Polizaharide extracelulare 11

I.2.2. Internalizare 11 I.2.3. Invazie şi diseminare sistemică 12

I.2.3.1. Invazine 14 I.2.4. Toxigeneză 16

I.2.4.1. Hemolizine 16 I.2.4.2. Superantigene 19 I.2.4.3. Sindroame determinate de superantigene 22

I.2.4.3.1. Sindromul de şoc toxic 22 I.2.4.3.2. Toxiinfecţii alimentare 22 I.2.4.3.3. Sindromul pielii pătate 22

I.3. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus 23 I.4. Patogeneza infecţiilor determinate de Ps. aeruginosa 24

I.4.1. Colonizare 27 I.4.1.1. Adezine, capsulă 27

I.4.2. Invazie şi diseminare 29 I.4.3. Toxigeneză 31

I.5. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Ps. aeruginosa 33 II. Mecanismele de quorum-sensing and response (QS) la S. aureus şi Ps. aeruginosa 35 II.1. Moleculele implicate în mecanismul de QS 38 II.2. Clasificarea sistemelor de quorum-sensing bacterian 40 II.3. Fenomenul QS la bacteriile Gram-negative 41

II.3.1. Mecanismele QS la Pseudomonas aeruginosa 43 II.3.1.1. Sistemul QS las 43 II.3.1.2. Sistemul QS rhl 44 II.3.1.3. Molecula de semnalizare PQS 46 II.3.1.4. Mecanisme complexe de reglare ale sistemelor QS 48

II.3.2. Rolul QS şi a moleculelor semnal în patogeneza infecţiilor cu Ps. aeruginosa 49 II.3.2.1. Contribuţia QS în controlul suprainfecţiilor arsurilor 51

3

II.3.2.2. Rolul QS în controlul infecţiilor pulmonare 52 II.3.2.3. Rolul QS în reglarea biofilmelor cu Ps. aeruginosa 54

II.4. Fenomenul de quorum sensing la bacteriile Gram-pozitive 55

II.4.1. Mecanismul QS la S. aureus – reglatorul agr 56 II.4.2. Reglatorii expresiei factorilor de virulenţă la S. aureus 59

II.4.2.1. Reglatorul global sar 59 II.4.2.2. Reglatorul global sae 60 II.4.2.3. Sistemul ArlRS 60 II.4.2.4. Sistemul SrrAB 61 II.4.2.5. Reglatorul Rot 62 II.4.2.6. Factorul alternativ sigma 63

III. Modalităţi de atenuare a virulenţei şi patogenităţii bacteriene prin blocarea QS 63 III.1. Interferenţe cu mecanismele de QS - concept terapeutic în infecţiile cu Ps. aeruginosa 64

III.1.1. Inhibiţia sintezei AHL 64 III.1.2. Inhibiţia diseminării semnalului AHL 65 III.1.3. Inhibiţia receptării semnalului AHL 66 III.1.4. Inhibitorii QS exprimaţi de organismele superioare 67 III.1.5. Interferenţe cu mecanismele de QS - concept terapeutic in infecţiile cu S. aureus 68

III.2. Probiotice – potenţiali inhibitori ai QS 68

PARTEA EXPERIMENTALĂ - Implicaţiile fenomenului de quorum sensing and response în exprimarea coordonată a factorilor de patogenitate şi virulenţă la tulpini de Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa IV. Materiale şi metode 71

IV.1. Caracterizarea fenotipică şi genotipică a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa analizate 71

IV.1.1. Tulpini bacteriene patogene 71 IV.1.2. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin metode fenotipice standardizate

(CLSI, 2009) 80

IV.1.2.1. Determinarea fenotipurilor de rezistenţă specifice la tulpinile de S. aureus 81 IV.1.2.2. Determinarea fenotipurilor de rezistenţă specifice la tulpinile de Ps. aeruginosa 82

IV.1.3. Caracterizarea fenotipică a factorilor de virulenţă solubili (toxine formatoare de pori, exoenzime) 84 IV.1.4. Caracterizarea genotipică a factorilor de virulenţă 86

IV.1.4.1. Extracţia ADN 86 IV.1.4.1.1. Determinarea purităţii şi a concentraţiei ADN prin metoda spectrofotometrică 86

IV.1.4.2. Detectarea prin PCR a genelor de virulenţă la tulpinile de S. aureus 87 IV.1.4.3. Detectarea prin PCR a genelor de virulenţă la tulpinile de Ps. aeruginosa 91

IV.2. Caracterizarea sistemelor de QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa 94

IV.2.1. Determinarea prin PCR a tipului de sistem QS agr la tulpinile de S. aureus 94 IV.2.2. Caracterizarea genotipică a reglatorilor genelor de virulenţă la tulpinile de S. aureus 94 IV.2.3. Caracterizarea genotipică a sistemelor QS las şi rhl la tulpinile de Ps. aeruginosa 95

IV.3. Stabilirea prin metode fenotipice a influenţei probioticelor asupra tulpinilor patogene 97

4

IV.3.1. Tulpini de probiotice utilizate 97 IV.3.2. Testarea influenţei probioticelor asupra curbei de creştere a tulpinilor patogene prin metoda

turbidimetrică 98 IV.3.3. Cuantificarea influenţei probioticelor asupra aderenţei tulpinilor patogene la substratul inert

prin testul producerii de slime 99 IV.3.4. Studiul influenţei probioticelor asupra expresiei unor factori solubili de virulenţă la tulpinile

patogene 99 IV.4. Evidenţierea prin metode genetice a efectelor inhibitorii ale probioticului asupra expresiei QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa 100

IV.4.1. Extracţia ARN total la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa 100 IV.4.2. Sinteza ADNc prin revers-transcrierea ARN total 101 IV.4.3. Real-time - PCR – versus PCR standard 103

IV.4.3.1. Tipuri de experimente real-time PCR 104 IV.4.3.1.1. Real-time PCR cu sonde moleculare marcate fluorescent 105 IV.4.3.1.2. Real-time PCR cu colorantul fluorescent SYBR Green I 108

IV.4.3.2. Parametri monitorizaţi în experimentele real-time PCR 110 IV 4.3.3. Real-time qRT-PCR – caracteristici generale 111 IV.4.3.4. Tipuri de cuantificare a expresiei genice în real-time qRT-PCR 112

IV.4.3.4.1. Cuantificarea relativă a expresiei genei agr la tulpinile de S. aureus prin real-time qRT-PCR cu sonde MGB şi SYBR Green I 117

IV.4.3.4.2. Cuantificarea relativă a expresiei genelor QS la tulpinile de Ps. aeruginosa prin real-time qRT-PCR cu SYBR Green I 120

V. Rezultate şi discuţii 125 V.1. Caracterizarea fenotipică şi genotipică a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa 125 V.1.1 Pattern-urile de rezistenţă la antibiotice la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa 127

V.1.1.1. Rezistenţa la meticilină şi MLSb a tulpinilor de S. aureus 127 V.1.1.2. Rezistenţa la antibioticele beta-lactamice a tulpinilor de Ps. aeruginosa 131

V.1.2. Expresia fenotipică a factorilor de virulenţă solubili 138

V.1.2.1. Spectrul de factori de virulenţă prezenţi la S. aureus 138 V.1.2.2. Spectrul de factori de virulenţă prezenţ la Ps. aeruginosa 140

V.1.3. Caracterizarea genotipică a factorilor de virulenţă 144 V.1.3.1. Gene de virulenţă detectate prin PCR la tulpinile de S. aureus 144 V.1.3.2. Gene de virulenţă detectate prin PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa 156

V.2. Caracterizarea moleculară a sistemelor de QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa 168 V.2.1. Caracterizarea moleculară a sistemului QS agr şi a reglatorilor genelor de virulenţă la tulpinile

de S. aureus 168

V.2.2. Caracterizarea moleculară a sistemelor QS las şi rhl la tulpinile de Ps. aeruginosa 176

V.3. Selectarea şi caracterizarea tulpinii de probiotic cu rol inhibitor asupra expresiei fenotipice a factorilor de virulenţă la tulpinile patogene studiate 180

5

V.4. Evidenţierea prin metode fenotipice a efectelor inhibitorii ale tulpinii de probiotic asupra tulpinilor patogene 180

V.4.1. Influenţa probioticului asupra curbei de creştere a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa 181 V.4.2. Influenţa probioticului asupra expresiei unor factori solubili de virulenţă şi a aderenţei la

substrat inert a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa 181 V.5. Stabilirea prin metode genetice a efectelor inhibitorii ale probioticului asupra expresiei QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa 187

V.5.1. Cuantificarea relativă prin real-time qRT-PCR a expresiei genei agr la tulpinile de S. aureus cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile normale 187

V.5.2 Cuantificarea relativă prin real-time qRT-PCR a expresiei genelor QS la tulpinile de Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile normale 190

VI. Concluzii 196 VII. Bibliografie selectivă 197 VIII. Anexe 212

6

PARTEA TEORETICĂ

Introducere

S. aureus şi Ps. aeruginosa sunt două dintre bacteriile cele mai frecvent izolate din

infecţiile nosocomiale, fiind patogeni oportunişti responsabili de infecţii severe la pacienţii

imunocompromişi. Emergenţa tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa multirezistente la

antibiotice determină dezvoltarea de noi strategii pentru înţelegerea mecanismelor utilizate de

către aceste bacterii în diferite faze ale procesului infecţios în scopul realizării unui control mai

eficient al infecţiilor determinate de aceste bacterii. Ps. aeruginosa şi S. aureus realizează o

expresie coordonată a anumitor factori de virulenţă ca răspuns la contactul cu celulele

eucariote ale gazdei sensibile, rezultatul interacţiunilor bacterie -gazdă fiind influenţat de

densitatea celulară şi reglat prin QS, sistem de semnalizare chimică implicat în reglarea unor

procese fiziologice extrem de variate dependente de densitatea celulară (bioluminiscenţa,

sinteza de factori de virulenţă, sporulare, transfer plasmidic). Unul dintre cele mai importante

roluri ale mecanismelor de QS, atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-

pozitive este reprezentat de reglarea expresiei coordonate a factorilor de virulenţă şi

evitarea mecanismelor de apărare antiinfecţioase ale gazdei [1].

Tratamentele tradiţionale ale bolilor infecţioase bazate pe compuşi cu acţiune

microbicidă sau microbiostatică au condus, datorită suprautilizării, la selectarea şi emergenţa

fenomenelor de rezistenţă şi multirezistenţă la antibiotice. Descoperirea sistemelor de QS, a

permis deschiderea unor noi perspective de tratament şi prevenire a infecţiilor bacteriene, prin

găsirea unor blocanţi ai mecanismului de QS bacterian, reprezentaţi de compuşi naturali sau

obţinuţi prin sinteza chimică [2].

În acest context, studiul de faţă are drept scop evaluarea unei strategi i de atenuare a

patogenităţii şi virulenţei bacteriene la tulpini de Ps. aeruginosa şi S. aureus izolate din clinică,

bazate pe utilizarea de antagonişti ai QS bacterian reprezentaţi de molecule solubile produse

de tulpini de Lactobacillus cu potenţial probiotic.

7

I.1. Caracterizare generală a modelelor bacteriene (S. aureus şi Ps. aeruginosa)

S. aureus este un patogen important, mai ales ca urmare a emergenţei în întreaga

lume a tulpinilor care sunt rezistente la toate antibioticele utilizate în clin ică (tulpinile MRSA,

VRSA – meticillin - and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) [4]. Având în vedere

importanţa şi incidenţa înaltă a infecţiilor invazive cu S. aureus meticilino-rezistent

(33,3% în 2008) (date furnizate prin participarea a 35 de spitale din ţară la reţeaua

europeană EARSS-(European Antimicrobial Resistance Surveillance System)

(www.earss.rivm.nl), găsirea unor noi strategii terapeutice pentru infecţiile stafilococcice

reprezintă o prioritate şi la nivel naţional.

Ps. aeruginosa reprezintă în România unul dintre agenţii oportunişti cu

prevalenţa cea mai mare dintre bacteriile Gram-negative implicate în etiologia infecţiilor

nosocomiale şi cea a infecţiilor severe la pacienţii imunodeprimaţi şi la cei cu dispozitive

protetice. Severitatea şi cronicizarea infecţiilor cu Ps. aeruginosa se datorează

rezistenţei multiple la antibiotice, precum şi abilităţii de a forma biofilme atât pe suprafeţe

abiotice (dispozitive medicale) cât şi biotice (ţesuturi) [6].

În acest context găsirea unor alternative terapeutice la utilizarea substanţelor

antimicrobiene reprezintă o necesitate pentru controlul infecţiilor asociate cu formarea de

biofilme determinate de Ps. aeruginosa sau de S. aureus [7].

I.2. Patogeneza infecţiilor determinate de Staphylococcus aureus

S. aureus reprezintă un patogen major care colonizează şi infectează atât pacienţii

spitalizaţi cu imunitate scăzută, cât şi indivizii imunocompetenţi din comunităţi. Fosele nazale

constituie rezervorul major pentru S. aureus [8]. Astfel, 20% dintre indivizi sunt colonizaţi

persistent la nivelul foselor nazale, 60% sunt purtători intermitenţi, în timp ce 20% nu sunt

niciodată purtători de S. aureus [8]. Statutul de purtător de S. aureus constituie un factor de risc

pentru dezvoltarea infecţiilor invazive [9]. Alte situsuri de colonizare ale S. aureus sunt

reprezentate de: pliuri ale pielii, perineu, axile, vagin şi tractul gastrointestinal [10].

S. aureus posedă cea mai largă varietate de mecanisme de virulenţă dintre toate

microorganismele patogene pentru om şi astfel reprezintă un model pentru studiul patogenezei

bolilor infecţioase. Patogenitatea S. aureus este multifactorială, fiind dependentă de: (1)

repertoriul bogat de factori de virulenţă pe care îi exprimă această specie bacteriană, (2)

imunitatea organismului gazdă, (3) factorii de mediu (dispozitive medicale de tipul cateterelor

8

intravasculare) şi (4) competiţia bacteriană [12]. Factorii de virulenţă sunt exprimaţi în mod

coordonat în cursul diferitelor etape ale infecţiilor pe care le determină la om [12, 13, 14].

S. aureus produce o diversitate de proteine secretate, ce aparţin la unul dintre

următoarele tipuri: receptine, toxine şi enzime. Principalele etape ale patogenezei infecţiilor cu

S. aureus sunt: (1) colonizarea, (2) internalizarea, (3) invazia şi diseminarea sistemică şi (4)

toxigeneza [11]. Atât infecţiile localizate, cum sunt abcesele de la nivelul ţesuturilor moi, cât şi

bolile sistemice ce pun în pericol viaţa, cum este septicemia, apar ca urmare a capacităţii

patogenului (1) de a se ataşa la ţesuturi sau celule, (2) de a scăpa de mecanismele imune

înnăscute şi dobândite ale gazdei, (3) de a produce enzime extracelulare şi exotoxine care

determină lezarea celulară şi tisulară favorizând diseminarea S. aureus în organismul gazdă

[14, 15].

I.3. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus

Rezistenţa la penicilinele stabile la penicilinaze a fost denumită în trecut rezistenţa la

meticilină. În prezent se foloseşte termenul MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus)

sau S. aureus rezistent la oxacilină. Se cunosc două tipuri principale de mecanisme de

rezistenţă la meticilină a S. aureus: (1) mediat de gena cromosomală mecA, care specifică

sinteza unei proteine anormale de legare a penicilinei, denumită PBP2a sau PBP2' şi (2)

mecanisme mediate de sinteza unor beta-lactamaze [46]. Primul mecanism este cel mai

frecvent responsabil de apariţia pattern-ului de rezistenţă MRSA. Complexul genei mecA

conţine situsuri de inserţie pentru plasmide şi transpozoni, ceea ce facilitează achiziţia de gene

de rezistenţă şi la alte clase de antibiotice. Astfel, tulpinile MRSA frecvent prezintă rezistenţă

încrucişată la antibiotice non- -lactamice, cum ar fi: eritromicina, clindamicina, gentamicina,

trimetroprim-sulfametoxazol/ cotrimoxazol şi ciprofloxacin. [46]. Transferul orizontal al genei

mecA la tulpinile MSSA se pare că reprezintă cel mai important mecanism de răspândire a

rezistenţei la meticilină la tulpinile de S. aureus.

Rezistenţa S. aureus la macrolide poate fi datorată efluxului activ (codificat de gena

msrA) sau modificării ţintei ribozomale când apare mecanismul de rezistenţă MLSb (macrolide-

lincosamide-streptogramin B), care este codificat de genele erm (ermA sau ermC). Gena msrA

conferă tulpinilor purtătoare rezistenţă numai la macrolide şi la steptograminele de tip B [48].

Genele erm (ermA, ermB) codifică enzimele care conferă rezistenţa inductibilă sau constitutivă

la agenţii MLSb. Rezistenţa constitutivă la MLSb apare prin metilarea ARNr 23S, ceea ce

conduce la scăderea legării agenţilor MLSb la ribozomi. Tulpinile care prezintă rezistenţă

9

constitutivă la MLSb manifestă in vitro rezistenţă la toţi aceşti agenţi. Rezistenţa MLSb

inductibilă se instalează după expunerea la un macrolid. Tulpinile cu rezistenţă MLSb

inductibilă prezintă in vitro rezistenţă la membrii grupului de macrolide ce au inelul lactonic

central cu 14-atomi (eritromicina, claritromicina) şi 15-atomi (azitromicină), în timp ce rămân

sensibile la membrii macrolidelor cu 16 – atomi (josamicina, spiramicina, rokitamicina), la

lincosamide şi la steptograminele de tip B [48].

I.4. Patogeneza infecţiilor determinate de Pseudomonas aeruginosa

Ps. aeruginosa este patogenul oportunist Gram-negativ cel mai frecvent identificat în

infecţiile nosocomiale, deoarece ~ 50% din pacienţii spitalizaţi prezintă un risc crescut de

colonizare cu acest agent. Această bacterie infectează în primul rând indivizii imunocompromişi

(pacienţii cu cancer, SIDA sau transplant de maduvă osoasă), sau cei la care barierele normale

sunt lezate datorită arsurilor, dispozitivelor medicale (catetere), sau utilizării prelungite a

antibioticelor cu spectru larg. Astfel, Ps. aeruginosa determină apariţia unor infecţii

nosocomiale severe, infecţii care pun în pericol viaţa pacienţilor imunocompromişi, precum şi

infecţii cronice la pacienţii cu fibroză chistică. Pacienţii spitalizaţi ventilaţi din unităţile de

îngrijire intensivă frecvent manifestă o sensibilitate crescută la colonizarea cu Ps. aeruginosa în

tractul respirator superior (gât şi/sau trahee) [5]. Tranziţia de la colonizare la infecţia cu Ps.

aeruginosa este frecvent observată în cazurile de imunosupresie a mecanismelor de apărare

ale gazdei, cum sunt cele care apar la pacienţii cu cancer, aflaţi sub chemoterapie, când

nivelurile sangvine ale neutrofilelor PMN sunt sub 100/mm3. Capacitatea Ps. aeruginosa de a

determina un număr impresionant şi divers de infecţii acute şi cronice se datorează unui

arsenal de factori de virulenţă (asociaţi celulei bacteriene şi factori lor extracelulari) pe care

această bacterie îi posedă [49].

Sistemele de semnalizare celulară controlează expresia şi permit producerea

coordonată dependentă de densitatea celulară, a mai multor factori de virulenţă extracelulari

[49]. De asemenea, aceste sisteme sunt implicate şi în producerea factorilor care ajută Ps.

aeruginosa să depășească mecanismele de apărare ale gazdei.

I.5. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Ps. aeruginosa

Tulpinile de Ps. aeruginosa manifestă rezistenţă naturală la numeroase antibiotice

active faţă de bacilii Gram-negativi: aminopeniciline, cefalosporine de generaţia I (cefalotin,

cefazolin) şi generaţia II (cefamandol, cefuroxim), precum şi la unele cefalosporine de

10

generaţia III (cefotaxim şi moxalactam) [67]. Fenotipul sensibil de Ps. aeruginosa (aşa-numitul

tip sălbatic) prezintă sensibilitate la antibioticele -lactamice anti-pseudomonadale

[carboxipeniciline (carbenicilina, ticarcilina), ureidopeniciline (azlocilina, piperacilina), la unele

cefalosporine de generaţie III (cefsulodin, cefoperazonă şi ceftazidim), la toate cefalosporinele

de generaţie patru, la monobactami (aztreonam) şi la carbapenemi (imipenem şi meropenem)]

[68]. Rezistenţa intrinsecă a celulelor de Ps. aeruginosa la agenţii antimicrobieni este mult mai

accentuată când microorganismul creşte într-un biofilm. Anumite tulpini sălbatice de Ps.

aeruginosa pot dobândi rezistenţă în cursul tratamentului cu antibiotice -lactamice. Astfel,

tulpinile de Ps. aeruginosa pot prezenta rezistenţă dobândită la -lactami prin unul din

următoarele mecanisme: (1) inactivarea enzimatică a antibioticului datorită sintezei de -

lactamaze, (2) permeabilitate redusă a membranei externe şi/sau (3) expresia crescută a

transportorilor de eflux. [68]. De asemenea, au apărut tulpini de Ps. aeruginosa la care pot

exista simultan sau în diferite combinaţii toate aceste mecanisme de rezistenţă la -lactami.

II. Mecanismele de quorum-sensing and response (QS) la S. aureus şi Ps. aeruginosa

Organizarea multicelulară şi comportamentul social la bacterii este rezultatul unor

procese complexe de comunicare şi semnalizare intra - şi intercelulară, reglate prin quorum-

sensing and response (QS), sistem de reglare ubiquitar în lumea bacteriană [71].

Comunicarea între bacterii se realizează prin intermediul unor molecule semnal cu

greutate moleculară mică, denumite feromoni sau autoinductori (AI), pe care bacteriile le

secretă [72]. Bacteriile în mod specific eliberează, detectează şi răspund la acumularea acestor

molecule în mediul extracelular. QS reprezintă mecanismul ce le permite bacteriilor să simtă

densitatea populaţiei bacteriene înconjurătoare cu ajutorul moleculelor semnal şi să răspundă

în mod coordonat la această informaţie prin reglarea expresiei diferitelor gene [72, 73, 74].

II.1. Moleculele implicate în mecanismul de QS

Mediatorii QS sunt reprezentaţi de feromonii bacterieni, ce au fost definiţi de Karlson şi

Luscher in 1959 ca substanţe secretate de către un individ în mediul înconjurător, unde vor fi

recepţionate de un al doilea individ aparţinand aceleiasi specii şi având drept consecinţă o

acţiune specifică (de exemplu, un anumit comportament sau declanşarea unui proces evolutiv).

Moleculele de semnalizare QS aparţin unor familii distincte de compuşi chimici: (i) acil-

homoserin-lactone (AHL) la bacteriile Gram-negative, (ii) oligopeptide AIP (autoinducing

11

peptides) la bacteriile Gram-pozitive, (iii) AI2, o molecula de semnalizare implicată în

comunicarea între speciile bacteriene, fiind prezentă atât la bacteriile Gram-negative cât şi la

cele Gram-pozitive şi (iv) butanolide, compuşi difuzibili similari autoinductorilor, sintetizaţi de

unele specii de Streptomyces, care intervin în reglarea producţiei de antibiotice şi de metaboliţi

generaţi în faza staţionară de creştere [75].

II.3.1. Mecanismele QS la Pseudomonas aeruginosa

Iniţial, la Ps. aeruginosa au fost identificate 2 sisteme de semnalizare intercelulară:

lasR-lasI si rhlR-rhlL. Ulterior, a fost identificată o moleculă nouă de QS, 2-heptil-3-hidroxil-4-

quinolona, denumită PQS, care constituie o legătură reglatorie suplimentară între circuitele de

quorum-sensing Las şi Rhl [83].

II.3.1.1. Sistemul quorum-sensing las

Sistemul quorum-sensing las reprezintă primul sistem de semnalizare intercelulară

descris la această specie bacteriană, fiind alcătuit din 2 gene: lasI şi lasR. Produsul genei

lasI, autoinductor-sintetaza LasI, direcţionează sinteza moleculei semnal 3-oxo-C12-HSL (N-

[3-oxododecanoil]-L-homoserinlactona [86]. Gena lasR codifică sinteza proteinei reglator LasR

cu rol de activator transcripţional. LasR recunoaşte molecula semnal, se leagă la aceasta

formând complexul LasR-3-oxo-C12-HSL, ce reglează expresia unor gene de virulenţă (lasB,

lasA, aprA şi toxA), precum şi a genei lasI, astfel se constituie o buclă feedback de autoinducţie

[85, 88, 89].

II.3.1.2. Sistemul quorum-sensing rhl

Al doilea sistem de semnalizare descoperit la Ps. aeruginosa este rhl, are o organizare

structurală similară cu cea a sistemului las, fiind alcătuit din activatorul transcripţional RhlR şi

din autoinductor-sintetaza RhlI, responsabilă de sinteza moleculei semnal N-butiril-L-

homoserinlactona (C4-HSL) [86]. Complexul activator-autoinductor RhlR-C4-HSL indeplineşte

câteva funcţii importante: (i) reglează expresia operonului rhlAB, ce codifică

ramnosiltransferaza, responsabilă de sinteza ramnolipidului, (ii) activează expresia genei rpoS,

ce codifică sinteza factorului sigma de fază staţionară RpoS, responsabil de controlul expresiei

a numeroase gene, (iii) reglează producerea de metaboliţi secundari: piocianina şi cianide şi

(iv) reglează expresia coordonată a unor factori de virulenţă: elastaza LasB şi proteaza alcalină

[88].

12

Sistemul las controlează la nivel transcripţional şi posttranscripţional activatorul

transcripţional RhlR al sistemului rhl, reglează pozitiv expresia proteinelor RhlR şi RhlI, iar

complexul LasR/3-oxo-C12-HSL activează transcripţia genei rhlR [90]. De asemenea, sistemul

las exercită un control suplimentar asupra sistemului rhl, deoarece 3-oxo-C12-HSL poate

acţiona posttranslaţional blocând activarea RhlR de către C4-HSL, datorită capacităţii sale de a

competiţiona cu C4-HSL pentru legarea la RhlR [90].

II.4.1. Mecanismul QS la S. aureus – reglatorul agr

Sistemul agr (accessory gene regulator) este primul reglator global al expresiei genelor

de virulenţă detectat la stafilococci şi codifică elaborarea mecanismului de QS dependent

de densitatea bacteriană. S. aureus utilizează o AIP modificată postranslaţional, ce conţine

un inel tiolactonic spre a regla producerea factorilor de virulenţă ca raspuns la creşteri ale

densităţii populaţiei bacteriene. Locusul agr are 3-kb şi este alcătuit din regiuni înalt conservate

şi din regiuni hipervariabile în rândul tulpinilor de S. aureus. Secvenţa regiunii hipervariabile

este ţinta amplificării PCR pentru definirea tipurilor agr. Variaţia de secvenţă în genele agrB,

agrD şi agrC a condus la identificarea a cel puţin 4 grupe de specificitate agr la S. aureus, în

care octapeptidele produse de un grup inhibă expresia agr din alte grupe prin inhibiţie

competitivă [110]. Fiecare grup are caracteristică o secvenţă de aminoacizi specifică

feromonului, în care numai structura tiolactonică (sau structura lactonei) este conservată [110].

Expresia reglatorului agr contribuie la patogeneza infecţiilor stafilococcice în câteva

modele experimentale: abces subcutan murin, artrite septice şi endocardite la iepure. Astfel,

tulpinile mutante agr obţinute pe aceste modele de infecţie prezintă o virulenţă atenuată

comparativ cu tulpinile parentale corespunzatoare, ceea ce indică că expresia exoproteinelor

de fază post-exponenţială este esenţială pentru patogeneza bolii stafilococcice [109]. Expresia

agr este implicată în invazia şi apoptoza celulelor epiteliale [111].

II.4.2. Reglatorii expresiei factorilor de virulenţă la S. aureus

Expresia factorilor de virulenţă la S. aureus este controlată de trei tipuri de sisteme

reglatorii, reprezentate prin: (1) reglatorii globali: agr, sar, sae şi sigB, (2) sisteme de

transducţie a semnalului cu 2 componente, cu rol de reglatori ai expresiei genelor de virulenţă:

ArlRS, SrrAB şi (3) alţi reglatori transcripţionali: represorul toxinelor (Rot) şi factorul alternativ

sigma ( B) [117].

13

III. Modalităţi de atenuare a virulenţei şi patogenităţii bacteriene prin blocarea QS

Primul nivel la care se poate realiza inhibarea procesului de QS este cel al sintezei

autoinductorilor sau a diseminării acestora prin diminuarea concentraţiei lor extracelulare.

Astfel, inhibiţia poate fi realizată prin: (i) utilizarea unor enzime bacteriene, lactonaze, secretate

de diferite specii de Bacillus, care degradează autoinductorii, (ii) hidroliza alcalină a

autoinductorilor, nonenzimatică la pH ridicat şi (iii) utilizarea unor microorganisme provenite din

mediile naturale (ex. Variovorax paradoxus), care utilizează HSL ca unică sursă de C şi N,

conducând la diminuarea concentraţiei moleculelor de semnalizare în mediu [126].

Al doilea nivel la care poate fi blocată declanşarea mecanismului de QS este inhibarea

receptării semnalelor prin utilizarea unor molecule competitive (cu structură chimică

asemănătoare feromonilor bacterieni) sau necompetitive (cu structură chimică diferită) capabile

să interfere cu legarea HSL la proteina senzor sau cu transmiterea semnalului la proteina

reglatoare [126].

O altă strategie de blocare a QS bacterian este utilizarea unor inhibitori naturali

sintetizaţi de organismele superioare. Astfel s-a demonstrat că enonele şi furanonele

halogenate secretate de alga marină Delisea pulchra inhibă QS bacterian, prevenind

colonizarea suprafeţelor şi formarea biofilmelor bacteriene, ca şi procesul de biofuling

consecutiv formării acestora. De asemenea există studii care arată că o serie de plante produc

compuşi care inhibă QS bacterian (ex. Pisum sativum) [126].

III.3. Probiotice – potenţiali inhibitori ai QS

Probioticele sunt suplimente alimentare care conţin microorganisme (Mo) viabile, care

atunci când sunt administrate în cantităţi adecvate au un efect benefic asupra stării de sănătate

a gazdei (FAO/WHO, 2002) [131]. Mo probiotice sunt membri ai microbiotei intestinale

normale, sau sunt specii tranzitorii cu efecte benefice pentru organism la trecerea lor prin

tractul gastrointestinal. Mo benefice sunt adăugate sub forma de aditivi în anumite alimente

(iaurt, kefir sau alte produse lactate) sau în produse farmaceutice (capsule, tablete) [131].

O strategie mai puţin menţionată în literatura de specialitate, utilizată în atenuarea

patogenităţii şi virulenţei bacteriene la tulpini izolate din clinică aparţinând genurilor P.

aeruginosa şi S. aureus prin interferenţa cu QS bacterian, este reprezentată de utilizarea de

antagonişti ai QS bacterian, reprezentaţi de molecule solubile produse de tulpini de

Lactobacillus cu potenţial probiotic.

14

PARTEA EXPERIMENTALĂ Obiectivul general al acestui studiu a fost investigarea in vitro a influenţei unei tulpini de

probiotic asupra expresiei genelor ce codifică sistemele quorum-sensing and response (QS),

precum şi asupra unor procese bacteriene reglate prin QS la tulpini de Ps. aeruginosa şi de S.

aureus, izolate din surse clinice, multirezistente la antibiotice şi cu potenţial de formare a

biofilmelor.

Obiective specifice

1. Caracterizarea fenotipică a tulpinilor analizate prin identificarea biochimică, stabilirea

pattern-urilor de rezistenţă la antibiotice prin teste convenţionale şi complementare

(antibiograma difuzimetrică, CMI prin E-Test) şi detectarea unor factori de virulenţă solubili.

2. Caracterizarea genotipică a factorilor de virulenţă caracteristici tulpinilor de S. aureus şi Ps.

aeruginosa studiate.

3. Caracterizarea moleculară a sistemelor de quorum-sensing (QS) la tulpinile de S. aureus şi

Ps. aeruginosa: grupul agr şi reglatorii globali ai genelor de virulenţă (sar, rot, srrAB şi arlRS) şi

sistemele QS (las şi rhl) la Ps. aeruginosa.

4. Evidenţierea prin metode fenotipice a efectelor inhibitorii ale fracţiunii solubile de cultură de

probiotice asupra tulpinilor patogene de S. aureus şi Ps. aeruginosa.

5. Demonstrarea, prin metode genetice a efectelor inhibitorii ale probioticului asupra expresiei

QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa prin real-time qRT-PCR.

V. Rezultate şi discuţii

V.1. Caracterizarea fenotipică şi genotipică a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa

Identificarea celor 60 de tulpini de S. aureus și Ps. aeruginosa selectate pentru studiul

de faţă s-a realizat cu ajutorul galeriilor API Staph și API NE 20, precum și a sistemului

automat Vitek 2. Tulpinile de S. aureus analizate în acest studiu au fost izolate din diferite

probe patologice de la pacienţi cu dispozitive cardiovasculare. Cele mai multe tulpini de S.

aureus au provenit din hemoculturi venoase (61%) (Fig. 42).

15

Sursele de izolare ale tulpinilor de S. aureus studiate

61%

7%3%3%

20%

3%3%

hemoculturi venoase secreţii plagă

secreţii pleurale secreţii nazale

exsudat faringian secreţie vaginală

boală ocluzivă inghinală

Figura 42. Distribuţia procentuală, în funcţie de sursa de izolare, a tulpinilor de S. aureus analizate.

Tulpinile de Ps. aeruginosa analizate în acest studiu au fost izolate de asemenea de la pacienţi

spitalizaţi cu diferite afecţiuni cardiovasculare, sursele de izolare fiind foarte variate (Fig. 43),

(tabel 28).

Sursele de izolare ale tulpinilor de Ps. aeruginosa analizate

26%

17%17%

10%

10%

7%7%3% 3%

secreţii bronşice secreţii plagă secreţii pleurale

secreţii nazale uroculturi spute

secreţii traheale exsudat faringian hematom

Figura 43. Distribuţia procentuală, în funcţie de sursa de izolare, a tulpinilor de Ps. aeruginosa studiate.

V.1.1.1. Rezistenţa la meticilină şi MLSb a tulpinilor de S. aureus

Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer utilizată pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a

tulpinilor de S. aureus analizate a permis stabilirea pattern-urilor de rezistenţă la antibiotice

specifice pentru S. aureus, de importanţă clinică şi epidemiologică. Astfel, din cele 30 tulpini de

S. aureus analizate, 24 prezintă fenotipul de rezistenţă MLSb (macrolide-lincosamide-

streptogramin B), dintre care 22 au fenotipul MLSb inductibil, iar 2 tulpini prezintă fenotipul

MLSb constitutiv. 17 tulpini din cele 24 MLSb sunt de asemenea rezistente la meticilină (MRSA

- Methicillin-resistant Staphylococcus aureus).

Toate tulpinile de S. aureus analizate au fost sensibile la trimethoprim-

sulfamethoxazole (SXT), care rămâne o opţiune de tratament pentru infecţiile cu tulpini de S.

aureus cu rezistenţă multiplă la antibiotice.

16

V.1.1.2. Rezistenţa la antibioticele β-lactamice a tulpinilor de Ps. aeruginosa

Analiza interpretativă a rezultatelor testelor difuzimetrice realizate pentru tulpinile de

Ps. aeruginosa studiate a permis stabilirea pattern-urilor de rezistenţă caracteristice. Astfel,

tulpinile de Ps. aeruginosa studiate prezintă câteva fenotipuri de rezistență la -lactami: (1)

cefalosporinază constitutivă (la 5 tulpini) (Fig. 47), (2) cefalosporinază inductibilă (la 6 tulpini)

(Fig. 48), (3) carbapenamaze sau alt mecanism de rezistenţă la carbapenemi (pierderea unei

porine sau expresie unei pompe de eflux) (la 6 tulpini) (Fig. 47), (4) metalo- -lactamaze (la 3

tulpini) (Fig. 49, 50), (5) ESBL (la 2 tulpini) (Fig. 51) şi (6) penicilinază sensibilă la inhibitorii de

beta-lactamaze (2 tulpini) (Fig. 52).

Figura 47. Fenotipuri de cefalosporinază constitutivă (stânga) şi respectiv cefalosporinază constitutivă plus carbapenemază (dreapta). Săgeata dublă roşie indică cefalosporinaza constitutivă, iar săgeata verde prezenţa unei posibile carbapenamaze.

Figura 48. Cefalosporinază inductibilă (o β-lactamază a cărei expresie este indusă de imipenem) este indicată prin săgeata roşie.

Figura 50. Fenotipurile de cefalosporinază inductibilă şi metalo- -lactamază identificată prin E-test MBL.

carbapenemaza

17

14 dintre tulpinile studiate prezintă sensibilitate la toate antibioticele folosite pentru stabilirea

pattern-urilor de rezistenţă, în timp ce patru dintre tulpinile studiate manifestă rezistenţă la toţi

-lactamii analizați (Fig. 52).

Figura 51. Fenotip ESBL (extended-spectrum-beta-lactamases).

Figura 49. Carbapenamază (stânga) şi confirmarea carbapenamazei prin E-test MBL (dreapta). Raportul

între CMI IP/IPI 8 indică prezenţa unei metalo- -lactamaze.

Figura 52. Penicilinază sensibilă la inhibitorii de beta-lactamaze (TIM – ticarcilină – acid clavulanic) indicată de săgeata verde (stânga). Fenotipul de rezistenţă la toţi agenţii beta-lactamici testaţi (dreapta).

V.1.2. Expresia fenotipică a factorilor de virulenţă solubili

Spectrul de factori de virulenţă caracteristic fiecărei tulpini de S. aureus, respectiv de

Ps. aeruginosa studiate, s-a determinat prin metode fenotipice şi genotipice. Metodele

carbapenemaza

ESBL

penicilinază

sensibilă la TIM

18

fenotipice au fost alese pentru detectarea unor factori de virulenţă solubili prin cultivarea

tulpinilor pe medii ce conţin substratul enzimatic corespunzător fiecărui factor de virulenţă.

Metodele genetice au fost utilizate pentru a caracteriza anumiţi factori de virulenţă pentru care

metodele PCR reprezintă o alternativă la metodele clasice, care nu sunt optimizate, sau nu îi

pot detecta în mod corepunzător. Abordarea mixtă, fenotipică şi genotipică utilizată este

complementară, lărgind spectrul de factori de virulenţă analizaţi.

Astfel, atât la tulpinile de S. aureus cât şi la cele de Ps. aeruginosa metodele fenotipice

au fost alese pentru a detecta: toxinele formatoare de pori (lecitinaza, lipaza, hemolizine), şi

exoenzimele (cazeinaza, amilaza şi DN-aza).

V.1.2.1. Spectrul de factori de virulenţă prezenţi la S. aureus

Din cele 30 tulpini de S. aureus analizate, majoritatea au prezentat toxine formatoare

de pori (lecitinază, lipază, hemolizină alfa şi beta) iar 4 tulpini sunt non-hemolitice, dar au

factorul CAMP (Fig. 57) (tabel 32).

Distribuţia procentuală a factorilor de virulenţă

solubili la tulpinile de S. aureus analizate

53,30%

40%46,66%

66,66%

100%

10%

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

lecitinază lipază cazeinază amilază factor

CAMP

DN-ază

Pro

ce

nt

%

Distribuţia procentuală a tipului de hemolizină

caracteristic tulpinilor de S. aureus studiate

13,33%

40%

46,66%

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

alfa-hemolizină beta-hemolizină gamma-hemolizină

Pro

ce

nt

%

Figura 57. Spectrul factorilor de virulenţă solubili prezenţi la tulpinile de S. aureus studiate.

V.1.2.2. Spectrul de factori de virulenţă prezenţi la Ps. aeruginosa

Analiza rezultatelor testelor fenotipice pentru prezenţa factorilor de virulenţă solubili la

tulpinile de Ps. aeruginosa a demonstrat abilitatea acestor tulpini de a produce un adevărat

cocktail de exoenzime şi toxine formatoare de pori (Fig. 58). Producerea factorilor de virulenţă

extracelulari: proteaze, hemolizine (fosfolipaze şi lecitinază), citotoxină, siderofori, pigementul

difuzibil piocianină şi exotoxinele A, S, T, U, Y, este responsabilă de invazia ţesuturilor de către

Ps. aeruginosa.

19

Distribuţia procentuală a factorilor de virulenţă

solubili la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate

80%76,60%

50% 50%

63,30%

16,60%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

lecitinază lipază cazeinază amilază hemolizină DN-ază

Pro

ce

nt

%

Figura 58. Spectrul factorilor de virulenţă solubili prezenţi la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate.

V.1.3.1. Gene de virulenţă detectate prin PCR la tulpinile de S. aureus

Din analiza rezultatelor testelor PCR efectuate se poate remarca că abundenţa şi

redundanţa factorilor de virulenţă este responsabilă de diversitatea extraordinară a entităţilor

clinice infecţioase în care sunt implicate aceste microorganisme.

Tabel 34. Prevalenţa genelor ce codifică opt adezine tip MSCRAMM la tulpinile de S. aureus analizate.

Nr. crt.

Tulpina de S. aureus

Sursa de izolare Gene pentru 8 adezine tip MSCRAMM

bbp ebpS fib clfA clfB fnbA fnbB cna

1 10936 hemocultură - + + + + + - +

2 11372 hemocultură - + + + + + - +

3 11327 hemocultură - + + + + + - +

4 11325 hemocultură - + + + + + - + 5 11573 hemocultură - - + + + + - +

6 11047 hemocultură - - + + + + - +

7 5/06 hemocultură - - + + + + - +

8 9/06 hemocultură - + + + + + - +

9 11323 hemocultură - + + + + + - +

10 1391 secreţie vaginală - + + + + + - -

11 11916 hemocultură venoasă

- - + + - + - -


- - + + - + - +

13 128 secreţie pleurală - - + + - + - -

14 424/07 exsudat nazal - + - + - + - -


- - + + - + - -


- - - - - + - -


- - - - - + - -


- + + + - + - -


+ + + + - + - -

20 393 secreţie plagă - - + + - + - - 21 14596 hemocultură

venoasă - - + + - + - -

22 839 secreţie pleurală - - + + - + - -

23 890 boala oculziva inghinală

- + + + - + - -

20

24 994 secreţie plagă - + + + - + - +

25 2380 exsudat faringian - + + + - + - +

26 1022 secreţie plagă - + + + - + - +


- + - + - + - +

28 900 secreţie plagă - + + + - + - +

29 1004 plagă mediastinala

- + + + - + - -

30 911 secreţie plagă - + + + - + - -

Tabel 35. Prevalenţa genelor ce codifică pentru coagulază, proteina A şi câteva exoproteine la tulpinile de S. aureus studiate.

Nr. crt.

Tulpina de S. aureus

Gena coag

Gena spa

Gena hlg

Gena lukPV

Gena tst

Gene pentru enterotoxine

sea seb sec sed see

1 10936 + + + - - - - + - -

2 11372 + + + - - - - + - -

3 11327 + + + - - - - + - -

4 11325 + + + - - - - + - -

5 11573 + + + - - - + - - +

6 11047 + + + - - - - - - +

7 5/06 + + + - - - + - - +

8 9/06 + + + - - - - + - -

9 11323 + + + - - - - + - +

10 1391 + + + - - - - - - -

11 11916 + + + - - + - - - -

12 11501 + + + - - + + - - +

13 128 + + + - - - - + - -

14 424/07 + + + - - + + - + +

15 75 + + + - - - - - - -

16 14654 + + + - - - - - - -

17 14652 + + + + - - - - - -

18 688 + + + - - - - - - -

19 14653 + + + + - - - - - -

20 393 + + + - - + - - - -

21 14596 + + + - - - - - - -

22 839 + + + - - - - - - -

23 890 + + + - - - - - - -

24 994 + + + - - - - - - -

25 2380 + + + - - - - - - -

26 1022 + + + - - - - - - -

27 14946 + + + - + + - - -

28 900 + + + - - - - - - -

29 1004 + + + - - - - - - -

30 911 + + + - - + - - - +

V.1.3.2. Gene de virulenţă detectate prin PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa

Analiza rezultatelor PCR pentru detectarea prezenţei genelor ce codifică 12

dintre cei mai importanţi factori de virulenţă implicaţi în patogeneza infecţiilor cu Ps.

aeruginosa, a arătat că toate tulpinile de Ps. aeruginosa analizate posedă genele ce

codifică sinteza a 8 factori de virulenţă (tabel nr. 36) .

21

Tabel 36. Prevalenţa genelor ce codifică pentru 12 factori de virulenţă la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate.

Nr. crt.

Tulpina de Ps. aeruginosa

Sursa de izolare Gene pentru proteaze Gene pentru proteine solubile Gene pentru toxine Gena

algD Gena pvdA lasB aprA tcr rhlAB plcH plcN exoA exoS exoT exoU

1 101 secreţie bronşică + + + + + + + + + + + +


3 111 secreţie plagă + + + + - + + - + + + +

4 1443 secreţie plagă + + + + + + + - + + + +

5 1093 - + + + + + + + - + + + +

6 1561 secreţie plagă + + + + + + + + + + - +

7 20 spută + + + + - + + + + + - -

8 1442 secreţie bronşică + + + + + + + + + + - +

9 84 secreţie bronşică + + + + + + + - + + - +

10 1562 secreţie plagă + + + + + + + + + + - +

11 891/07 secreţie pleurală + + + + + + + + + + + +

12 1150/07 secreţie bronşică + + + + + + + + + + + +

13 2527 esxudat nazal + + + + + + + + + + + +

14 1366/07 urocultură + + + + + + + + + + + +

15 2584 urocultură + + + + + + + + + + + +

16 1563 secreţie pleurală + + + + - + + + + + - +

17 768 secreţie pleurală + + + + + + + + + + + -


19 1491 secreţie bronşică + + + + + + + + + + + -

20 008 Cap + + + + + + + + + + + +

21 196 - + + + + + + + + + + + +

22 3211 esxudat faringian + + + + + + + + + + + +

23 794 secreţie plagă + + + + + + + + + + + +

24 796 secreţie traheală + + + + + + + + + + + +

25 848 secreţie pleurală + + + + + + + + + + + -

26 811 hematom + + + + + + + + + + + +

27 823 secreţie pleurală + + + + + + + - + + + +

28 810 secreţie bronşică + + + + + + + + + + + -

29 865 secreţie traheală + + + + + + + + + + + +

30 1612 urocultură + + + + + + + + + + + -

V.2. Caracterizarea sistemelor de QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa

V.2.1. Caracterizarea moleculară a sistemului QS agr și a reglatorilor genelor de virulență la tulpinile de S. aureus Rezultatele detectării prin PCR a grupelor agr şi a genelor ce codifică patru dintre reglatorii

factorilor de virulenţă la tulpinile de S. aureus analizate sunt listate în tabelul nr. 37.

Tabel. 37. Prevalenţa genelor ce codifică sistemul QS agr și a genelor ce codifică patru reglatori globali ai genelor de virulență la tulpinile de S. aureus analizate.

Nr. crt. Tulpina de S. aureus Sursa de izolare Locus agr Gene care codifică reglatorii genici ai

factorilor de virulență

sarS rot srrAB arlRS

1 10936 hemocultură III + + + +



4 MRSA 11325 hemocultură III + + + +

5 MRSA 11573 hemocultură I + + + +

6 MRSA 11047 hemocultură I + + + +

7 5/06 hemocultură I + + + +

8 9/06 hemocultură III + + + +


10 MRSA 1391 secreţie vaginală III + + + +

11 11916 hemocultură venoasă I + + + +

12 MRSA 11501 hemocultură venoasă I + + + +

13 128 secreţie pleurală I + + + +

14 MRSA 424/07 exsudat nazal I + + + +

15 MRSA 75 hemocultură venoasă I + + + +



18 MRSA 688 hemocultură venoasă III + + + +

19 14653 hemocultură venoasă IV + + + +

20 383 sau 393 MRSA secreţie plagă I + + + +

21 14596 hemocultură venoasă III + + + +

22 839 secreţie pleurală III + + + +

23 890 MLSb boala oculzivă inghinală III + + + +

24 MLSb 994 secreţie plagă III + + + +

25 2380 MRSA exsudat faringian III + + + +

26 1022 MRSA, MLSb secreţie plagă III + + + +

27 14946 hemocultură venoasă III + + + +

28 900 MRSA secreţie plagă III + + + +

29 1004 MLSb plagă mediastinala III + + + +

30 911 MLSb secreţie plagă II + + + +

Analiza rezultatelor PCR privind prezenţa genei agr şi a genelor ce codifică 4 reglatori

globali (sar, srrAB, arlRS şi rot) la tulpinile de S. aureus analizate, a arătat că toate tulpinile posedă

atât sistemul QS agr, cât şi cei 4 reglatori ai genelor de virulență, ceea ce demonstrează rolul

acestor sisteme în coordonarea expresiei factorilor de virulență la tulpinile studiate.

23

V.2.2. Caracterizarea moleculară a sistemelor QS las și rhl tulpinile de Ps. aeruginosa

Analiza rezultatelor PCR privind prezenţa genelor ce codifică cele două sisteme QS las şi

rhl la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate, a arătat ca toate tulpinile de Ps. aeruginosa studiate

prezintă genele lasI, lasR, rhlI şi rhlR. Circuitele de quorum-sensing la Ps. aeruginosa controlează

expresia unui număr mare de factori de virulenţă extracelulari: exoenzime (elastaze, proteaza

alcalină), metaboliţi secundari (piocianina, cianide-hidrogen, pioverdina) şi toxine (exotoxina A),

precum şi dezvoltarea de biofilme [90]. Prin urmare, cele două sisteme de de semnalizare celulară

las și rhl sunt implicate în controlul expresiei şi în producerea coordonată dependentă de

densitatea celulară a mai multor factori de virulenţă extracelulari, care determină leziuni tisulare

extinse, invadează sistemul circulator, şi consecutiv promovează diseminarea sistemică,

conducând la apriția atât a infecţiilor pulmonare acute cât şi cronice [89].

V.3. Selectarea şi caracterizarea tulpinii de probiotic cu rol inhibitor al expresiei fenotipice a factorilor de virulenţă la tulpinile patogene studiate

Din tulpinile de probiotice Y, FA și FO I s-au obținut supernatantele sterile, prin filtarea

celor trei culturi de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, care au fost utilizate în toate

experimentele pentru stabilirea influenței pe care o exercită asupra creșterii și expresiei factorilor

de virulență solubili la tulpinile de S. aureus și Ps. aeruginosa studiate.

V.4.1. Influenţa probioticului asupra curbei de creştere a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa

Analiza rezultatelor privind influența exercitată de fiecare tip de supernantant de probiotic

asupra creșterii tulpinilor patogene de S. aureus şi Ps. aeruginosa studiate, a arătat scăderea ratei

de multiplicare a culturilor bacteriene în prezenţa fiecărui tip de supernantant testat comparativ cu

tulpinile control (netratate cu probiotice).

V.4.2. Influenţa probioticului asupra expresiei unor factori solubili de virulenţă şi a aderenţei la substrat inert a tulpinilor de S. aureus şi Ps. aeruginosa

Astfel, la S. aureus s-a observat o modificare a creşterii tulpinilor tratate cu probiotic față

de cele netratate în sensul scăderii capacității de a fermenta manitolul, precum și o ușoară scădere

a exprimării hemolizinelor pe mediul cu geloză-sânge.

24

În ceea ce priveşte capacitatea de aderenţă la substrat, rezultatele testului slime au arătat

o scădere a valorilor DO la 490 nm a suspensilor bacteriene crescute în prezenţa supernatantelor

de probiotice comparativ cu cele ale suspensiilor control (crescute în condiţii normale) (Fig. 129,

130), care semnifică o scădere a capacităţii de aderenţă la substrat inert a tulpinilor patogene

crescute în prezenţa supernatantelor de probiotice comparativ cu tulpinile control.

În urma analizei rezultatelor obținute pentru fiecare supernatant testat cu tulpinile

patogene, tulpina Y de probiotic a fost selectată pentru a fi utilizată în experimentele ulterioare,

deoarece a manifestat efectul inhibitor cel mai evident și constant asupra creșterii coloniilor de Ps.

aeruginosa pe mediul selectiv Cetrimid, respectiv asupra capacității de fermentare a manitolului de

către tulpinile de S. aureus analizate. De asemenea, din analiza rezultatelor testului slime obţinute

pentru fiecare tulpină de probiotic, s-a observat că tulpina Y a avut efectul inhibitor cel mai evident

asupra aderenţei la substrat inert a tulpinilor de S. aureus și Ps. aeruginosa studiate.

Aderenţa la substrat inert a tulpinilor de S. aureus cultivate în prezenţa

supernatantului Y de probiotic (probe) comparativ cu tulpinile normale

(control)

0,001

0,031

0,061

0,091

0,121

0,151

0,181

0,211

0,241

0,271

0,301

0,331

tip de tulpină

DO

490n

m

control 1 proba 1 control 2 proba 2 control 3 proba 3control 4 proba 4 control 5 proba 5 control 6 proba 6control 7 proba 7 control 8 proba 8 control 9 proba 9control 10 proba 10 control 11 proba 11 control 12 proba 12control 13 proba 13 control 14 proba 14 control 15 proba 15control 16 proba 16 control 17 proba 17 control 18 proba 18control 19 proba 19 control 20 proba 20 control 21 proba 21control 22 proba 22 control 23 proba 23 control 24 proba 24control 25 proba 25 control 26 proba 26 control 27 proba 27control 28 proba 28 control 29 proba 29 control 30 proba 30control ATCC proba ATCC

Figura 129. Influenţa supernantantului tulpinii Y de probiotic asupra capacităţii de aderenţă la substrat inert a tulpinilor de S. aureus studiate.

25

Aderenţa la substrat inert (testul slime) a tulpinilor de Ps. aeruginosa cultivate în

prezenţa supernatantului Y de probiotic (probe) comparativ cu tulpinile normale (control)

0,001

0,031

0,061

0,091

0,121

0,151

0,181

0,211

0,241

0,271

0,301

0,331

tip de tulpină

DO

49

0n

m

control 1 proba 1 control 2 proba 2 control 3 proba 3control 4 proba 4 control 5 proba 5 control 6 proba 6control 7 proba 7 control 8 proba 8 control 9 proba 9control 10 proba 10 control 11 proba 11 control 12 proba 12control 13 proba 13 control 14 proba 14 control 15 proba 15control 16 proba 16 control 17 proba 17 control 18 proba 18control 19 proba 19 control 20 proba 20 control 21 proba 21control 22 proba 22 control 23 proba 23 control 24 proba 24control 25 proba 25 control 26 proba 26 control 27 proba 27control 28 proba 28 control 29 proba 29 control 30 proba 30control ATCC proba ATCC

Figura 131. Influența supernantantului tulpinii Y de probiotic asupra capacității de aderenţă la substrat inert a tulpinilor de Ps. aeruginosa studiate.

V.5. Stabilirea prin metode genetice a efectelor inhibitorii ale probioticului asupra expresiei QS la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa

Sistemele de QS sunt implicate în reglarea expresiei coordonate a factorilor de virulenţă la

tulpinile de S. aureus și Ps. aeruginosa. Influența exercitată de supernatantul obținut prin filtrarea

culturii de tulpină Y de probiotic asupra expresiei genelor de QS la tulpinile patogene studiate a

fost studiată prin real-time-PCR. Expresia genelor de QS la tulpinile patogene crescute în prezența

supernatantului de probiotic Y a fost comparată cu cea a genelor QS de la tulpinile patogene

crescute în condiții normale.

V.5.1. Cuantificarea relativă prin real-time qRT-PCR a expresiei genei agr la tulpinile de S. aureus cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile normale

Cuantificarea relativă a expresiei genei agr la cele 30 tulpini de S. aureus crescute în

prezenţa probioticului (considerate probe) s-a realizat prin comparaţie cu valorile de expresie

genică obţinute de aceleaşi tulpini crescute în condiţii normale (considerate controale). De

asemenea, gena de referinţă pentru ARNr 16S a fost folosită pentru a normaliza expresia genelor

agr la tulpinile studiate.

26

Cuantificarea relativă a expresiei genei agr III la tulpinile de S. aureus

cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic (probe) comparativ

cu tulpinile crescute în condiţii normale (control)

-1,3

-1,2-1,1

-1

-0,9

-0,8-0,7

-0,6

-0,5

-0,4-0,3

-0,2

-0,1

00,1

0,2

0,3

0,40,5

0,6

0,7

0,80,9

1

tip de tulpină

log10

control 1 proba 1 control 2 proba 2 control 3 proba 3





control 28 proba 28 control 29 proba 29 control ATCC proba ATCC Figura 134. Valorile expresiei genei agr III obținute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de S. aureus crescute în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile control.

Cuantificarea relativă a expresiei genei agr I la tulpinile de

S. aureus cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic (probe)

comparativ cu tulpinile crescute în condiţii normale (control)

-1

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

tip de tulpină

log

10

control 5 proba 5 control 6 proba 6 control 7 proba 7control 11 proba 11 control 12 proba 12 control 13 proba 13control 14 proba 14 control 15 proba 15 control 16 proba 16control 17 proba 17 control 20 proba 20

Figura 135. Valorile expresiei genei agr III obţinute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de S. aureus crescute în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile control.

27

Cuantificarea relativă a expresiei genelor agr II şi agr IV la

tulpinile de S. aureus cultivate în prezenţa supernatantului

de probiotic (probe) comparativ cu tulpinile crescute în

condiţii normale (control)

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1

tip de tulpină

log

10

control 19

proba 19

control 30

proba 30

Figura 136. Valorile expresiei genei agr II şi respectiv agr IV, obţinute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de S. aureus tratate cu probiotic comparativ cu tulpinile control.

Analiza rezultatelor de cuantificare relativă a expresiei genei agr la tulpinile de S. aureus

cultivate în prezenţa supernatantului de cultură de probiotic Y comparativ cu tulpinile control, a

arătat că toate tulpinile crescute în prezenţa supernatantului de probiotic au exprimat gena agr, dar

probioticul a determinat o scădere a nivelului de expresie genică la tulpinile tratate cu probiotic

comparativ cu cel al tulpinilor control. Astfel, nivelul de expresie al genei agr III la tulpinile crescute

în prezenţa supernatanatului de probiotic a scăzut în medie cu 34% faţă de nivelul de expresie de

la tulpinile control. Nivelul de expresie al genei agr I la tulpinile cultivate în prezenţa supernatantului

de probiotic a scăzut în medie cu 42% faţă de nivelul de expresie de la tulpinile control; în cazul

tulpinii cultivată cu supernatantul de probiotic, ce exprimă agr II, nivelul de expresie a scăzut cu

43,7% faţă de nivelul expresiei de la tulpina control. Expresia genei agr IV la tulpina cultivată în

prezenţa supernatantului de probiotic a scăzut cu 46,7% faţă de nivelul de expresie de la tulpina

control.

V.5.2 Cuantificarea relativă prin real-time qRT-PCR a expresiei genelor QS la tulpinile de Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile normale

Cuantificarea relativă a expresiei fiecărei gene QS prin real-time PCR la tulpinile de Ps.

aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile control s-a

realizat după formula lui Pfaffl. Valorile raportului de expresie relativă normalizată a fiecărei gene

(lasI, lasR, rhlI şi rhlR) sunt prezentate în graficele din figurile nr. 139 – 142.

28

Cuantificarea relativă a expresiei genei lasI la tulpinile de

Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic (probe)

comparativ cu tulpinile cultivate în condiţii normale (control)

-2,5-2,4-2,3-2,2-2,1

-2-1,9-1,8-1,7-1,6-1,5-1,4-1,3-1,2-1,1

-1-0,9-0,8-0,7-0,6-0,5-0,4-0,3-0,2-0,1

00,10,20,30,40,5

tip de tulpină

log

10

control 1 proba 1 control 2 proba 2 control 3 proba 3 control 4

proba 4 control 5 proba 5 control 6 proba 6 control 7 proba 7







control 30 proba 30 control ATCC proba ATCC

Figura 139. Valorile expresiei genei lasI obţinute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile control.

Cuantificarea relativă a expresiei genei lasR la tulpinile de

Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului probiotic (probe)

comparativ cu tulpinile cultivate în condţii normale (control)

-2

-1,9

-1,8

-1,7

-1,6

-1,5

-1,4

-1,3

-1,2

-1,1

-1

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

tip de tulpină

log10











control ATCC proba ATCC Figura 140. Valorile expresiei genei lasR obţinute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa tratate cultivate în prezenţa supernatantului de comparativ cu tulpinile control.

29

Cuantificarea relativă a expresiei genei rhlI la tulpinile de



-2,5-2,4

-2,3-2,2

-2,1-2

-1,9-1,8-1,7

-1,6-1,5

-1,4-1,3

-1,2-1,1

-1

-0,9-0,8

-0,7-0,6

-0,5-0,4

-0,3-0,2-0,1

00,1

0,20,3

0,40,5

tip de tulpină

log10









control 29 proba 29 control 30 proba 30 control ATCC proba ATCC Figura 141. Valorile expresiei genei rhlI obţinute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile control.

Cuantificarea relativă a expresiei genei rhlR la tulpinile de



-2

-1,9

-1,8

-1,7

-1,6

-1,5

-1,4

-1,3

-1,2

-1,1

-1

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

tip de tulpină

log

10









control 29 proba 29 control 30 proba 30 control ATCC proba ATCC

t

Figura 142. Valorile expresiei genei rhlR obţinute prin cuantificarea relativă prin real-time PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa cultivate în prezenţa supernatantului de probiotic comparativ cu tulpinile control.

30

Nivelul de expresie al fiecărei gene QS la tulpinile cultivate în prezenţa supernatantului

steril de probiotic s-a modificat comparativ cu cel de la tulpinile control. Astfel, nivelul de expresie

al genei lasI la tulpinile cultivate în prezenţa filtratului de probiotic a scăzut în medie cu 35,6% faţă

de cel de la tulpinile control, expresia genei lasR a scăzut în medie cu 41,6%, a genei rhlI a scăzut

în medie cu 35,6%, iar a genei rhlR a scăzut în medie cu 41,5% faţă de nivelul de expresie de la

tulpinile control.

VI. Concluzii

1. Majoritatea tulpinilor de S. aureus izolate de la pacienţi cu infecţii asociate dispozitivelor

protetice cardiovasculare prezintă simultan fenotipurile MRSA şi MLSb, iar 50% dintre tulpinile de

Ps. aeruginosa studiate prezintă fenotipuri de multirezistenţă la majoritatea antibioticelor, ceea ce

conduce la scăderea drastică a opţiunilor de tratament şi la un prognostic grav, în cazul pacienţilor

cu imunitate scăzută sau cu boli cronice şi la necesitatea dezvoltării de noi alternative de tratament

la utilizarea antibioticelor.

2. Analizele fenotipice şi genetice au evidenţiat abundenţa şi redundanţa factorilor de

virulenţă la tulpinile de S. aureus şi Ps. aerguinosa analizate, ceea ce explică diversitatea

extraordinară a entităţilor clinice infecţioase în care sunt implicate aceste microorganisme.

3. Tulpinile de S. aureus studiate au prezentat gene pentru majoritatea factorilor de virulenţă

caracteristici acestei specii bacteriene; factorii de virulenţă detectaţi fiind responsabili de infecţiile

asociate cu dispozitivele cardiovasculare determinate de tulpinile de S. aureus analizate.

4. Majoritatea tulpinilor de Ps. aerguinosa analizate, indiferent de sursa de izolare sau de

pattern-ul de antioborezistență, au prezentat genele pentru toți factorii de virulenţă consacraţi la

Ps. aeruginosa, aspect care demonstrează clar faptul că aceşti factori sunt implicaţi şi în alte

procese, fiziologice, nu numai în inițierea şi dezvoltarea procesului infecţios, aceste tulpini fiind

ubicuitare.

5. Rezultatele testelor fenotipice au arătat că în supernatantul culturilor de Lactobacillus

paracasei subsp. paracasei cu proprietăţi probiotice, izolată din materii fecale de nou-născut, se

acumulează molecule solubile cu activitate inhibitorie asupra creşterii şi expresiei unor factori de

virulenţă solubili la tulpinile de S. aureus şi Ps. aeruginosa studiate.

31

6. Analiza expresiei genelor QS prin real-time PCR la tulpinile patogene crescute în prezenţa

supernatantului de probiotic, a arătat o scădere a nivelului de expresie a genei agr la tulpinile de S.

aureus şi a genelor lasI, lasR, rhlI şi rhlR de la tulpinile de Ps. aeruginosa.

7. În perspectivă, izolarea și purificarea prin HPLC a moleculelor inhibitorii conținute în

supernantantul tulpinilor de probiotice, va permite studiul influenței pe care aceste molecule îl

exercită asupra expresiei genelor de virulență şi al modalităţilor în care aceste molecule cu acțiune

anti - patogenică vor putea fi utilizate ca adjuvanţi în terapia unor infecții determinate de bacteriile

patogene oportuniste studiate.

8. Rezultatele prezentului studiu demonstrează posibilitatea unei noi abordări a privind

controlul unor infecţii severe prin interferarea unor compuşi cu activitate inhibitorie produşi de

tulpini de probiotice cu fenomenul de QS, având drept consecinţă atenuarea patogenităţii şi

virulenţei agenţilor patogeni studiaţi.

32

VII. Bibliografie selectivă 1. Willcox M. D. P., Zhu H., Conibear T. C. R., Hume E. B. H., Givskov M., Kjelleberg S.and Rice S. A. 2008. Role of quorum sensing by Pseudomonas aeruginosa in microbial keratitis and cystic fibrosis. Microbiology 154: 2184–2194. 2. Hentzer Morten and Givskov Michael. 2003. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. The Journal of Clinical Investigation 112 (9): 1300 – 1307. 4. Bamberger D. M., and Boyd Sarah E. 2005. Management of Staphylococcus aureus Infections. Am Fam Physician 72: 2474-81. 5. Van Delden Christian and Iglewski Barbara H. 1998. Cell-to-Cell Signaling and Pseudomonas aeruginosa Infections. Emerging Infectious Diseases 4(4): 551-560. 6. Lazăr Veronica. 2003. Aderenţa microbiană. Editura Acedemiei Române, Bucureşti. ISBN: 973-27-0992-8. 7. Donlan R. M. 2001. Biofilms and Device-Associated Infections. Emerging Infectious Diseases, 7(2): 277-281. 8. Foster T. J. 2004. The Staphylococcus aureus “superbug”. The Journal of Clinical Investigation 114:1693–1696. 9. Peacock Sharon J., de Silva L., Lowy F. D. 2001. What determines nasal carriage of Staphylococcus aureus?Trends Microbiol. 9:605–610. 10. Haggar Axana. 2005. Interaction between Extracellular adherence protein (Eap) from Staphylococcus aureus and the human host. Stockholm, Sweden, ISBN 91- 7140-496 -1. 11. Gordon L. Archer. 1998. Staphylococcus aureus: A Well-Armed Pathogen. Clinical Infectious Diseases 26:1179–81. 12. Holtfreter Silva and Bröker Barbara M. 2005. Staphylococcal superantigens: do they play a role in sepsis? Arch. Immunol. Ther. Exp. 53:13–27. 13. Peacock Sharon J., Moore Catrin E., Justice Anita, Kantzanou Maria, Story Lisa, Mackie Kathryn, O’Neill Gael, Day N. P. J. 2002. Virulent Combinations of Adhesin and Toxin Genes in Natural Populations of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity 70(9): 4987–4996. 14. Todar Kenneth. 2008. Staphylococcus aureus and Staphylococcal Disease. 15. Saunders N. A., Underwood A., Kearns Angela M. and Hallas G. 2004. A virulence-associated gene microarray: a tool for investigation of the evolution and pathogenic potential of Staphylococcus aureus. Microbiology 150: 3763–3771. 46. Simor Andrew E. 2001. Containing methicillin-resistant S aureus Surveillance, control, and treatment methods, Postgraduate Medicine 110 (4). 48. Leclercq Roland and Courvalin Patrice. 1991. Bacterial Resistance to Macrolide, Lincosamide, and Streptogramin Antibiotics by Target Modification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 35 (7): 1267-1272. 49. SOM 208 Microbiology Syllabus Updated November 2005 Pseudomonas.

67. Vedel G. 2005. Simple method to determine -lactam resistance phenotypes in Pseudomonas aeruginosa using the disc agar diffusion test. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 56: 657–664. 68. Strateva Tanya and Yordanov Daniel. 2009. Pseudomonas aeruginosa – a phenomenon of bacterial resistance. Journal of Medical Microbiology 58: 1133–1148.

33

71. Winzer, K., Hardie, K.R., and Williams, P. 2002. Bacterial cell-to-cell communication: Sorry, can't talk now - gone to lunch! Current Opinion in Microbiology 5: 216-222. 72. Smith R.S, Harris SG, Phipps R, Iglewski Barbara. 2002. The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule N-(3- oxododecanoyl) homoserine lactone contributes to virulence and induces inflammation in vivo. J Bacteriol. 184:1132- 1139. 73. Visick Karen L. & Fuqua Clay. 2005. Decoding Microbial Chatter: Cell-Cell Communication in Bacteria. Journal of Bacteriology 187(16): 5507–5519. 74. Federle Michael J. and Bassler Bonnie L. 2003. Interspecies communication in bacteria. J. Clin. Invest. 112: 1291–1299. 75. Waters Christopher M. and Bassler Bonnie L. 2005. Quorum Sensing: Cell-to-Cell Communication in Bacteria. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21:319–46. 83. Juhas M., Eberl L., Tümmler B. 2005. Quorum sensing: the power of cooperation in the world of Pseudomonas, Environmental Microbiology 4: 459–471. 85. Hentzer M., Riedel Kathrin, Rasmussen T. B., Heydorn Arne, Andersen Jens Bo, Parsek M. R., Rice S. A., Eberl L., Molin S., Høiby N., Kjelleberg S. and Givskov M. 2002. Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria by a halogenated furanone compound. Microbiology, 148: 87–102. 86. Suga Hiroaki and Smith Kristina M. 2003. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as a new drug target. Current Opinion in Chemical Biology 7:586–591. 88. Diggle S. P., Pierre C., Paul W. and Cámara M. 2006. Quinolone signalling in Pseudomonas aeruginosa: Old molecules, new perspectives. International Journal of Medical Microbiology 296: 83–91. 89. Hooi D., Barrie S. W., Bycroft W., Chhabra S. R., Williams P., and Pritchard D. I. 2004. Differential Immune Modulatory Activity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signal Molecules. Infection and Immunity, 72(11): 6463–6470. 90. Pearson, J.P., Feldman, M., Iglewski, Barabara H., Prince, A. 2000. Pseudomonas aeruginosa Cell to Cell Signaling Is Required for Virulence in a Model of Acute Pulmonary Infection. Infect. Immun. 68, 4331-4334. 110. Novick Richard P. 2003. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Molecular Microbiology 48 (6):1429–1449. 111. Traber Katrina E., Lee Elsie, Benson Sarah, Corrigan Rebecca, Cantera Mariela, Shopsin Bo and Novick R. P. 2008. agr function in clinical Staphylococcus aureus isolates. Microbiology 154: 2265–2274. 117. Tseng Ching Wen, Zhang Shuping, and Stewart G. C. 2004. Accessory Gene Regulator Control of Staphyloccoccal Enterotoxin D Gene Expression. Journal of Bacteriology 186(6): 1793–1801. 126. Smith R. S. and Iglewski Barbara H. 2003. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target. J. Clin. Invest. 112 (10): 1460-1465. 131. Sanders Mary Ellen, Gibson G., Harsharnjit G. S., Guarner F., Gilliland S. E., Todd R. Klaenhammer, Gregor Reid, Gerald W. Tannock, Harold Swaisgood. 2007. Probiotics: Their Potential to Impact Human Health. Council For Agricultural Science And Technology, No. 36.

quorum sensing and response

Documents