Universitatea “Politehnica” din BucureştiFacultatea de Chimie Aplicată şi Ştiinţa Materialelor

Proteaze aspartice

NICOLAE IOANA VICTORIACATB IV

Bucureşti, 2010

PROTEAZE ASPARTICE UTILIZATE LA FABRICAREA BRÂNZETURILOR

Introducere

Utilizarea proteazelor aspartice în cadrul obţinerii brânzeturilor datează din anul 6000 Î.C. coagularea enzimatică a laptelui este un proces care se desfăşoară în două etape. În prima etapă, AP hidrolizează legătura dintre restul fenilalanina şi metionină din caseina bovină, rupând proteina în două părţi, o parte hidrofobă (para k caseină) şi o parte hidrofilă (macropeptidă). A doua etapă constă în coagularea miceliilor de caseină care au fost destabilizat de atacul proteolitic.

Enzimele de coagulare ale laptelui sunt extrase de la mamifere, plante si fungi. Deasemenea ele pot fii produse utilizând tehnologia de recombinare genetica a ADNului. În general sunt utilizate enzimele extrase din cel de+al patrulea stomac al viţeilor sugari. In plus, cheagul convenţional conţine, deasemenea, niveluri mai scăzute de pepsină A, enzimă a carei activitate proteolitică impiedică coagularea laptelui. Enzimele extrase din plante şi fungi conţin proteaze nespecifice care au o stabilitate termică mare si a caror actiune prelungită provoacă amărăciune branzeturilor după o perioada mai lungă de depozitare. Consumul ridicat de branzeturi a determinat căutarea unor alternative pentru coagularea laptelui.

În 1988, a fost utilizată pentru prima dată chimozina (renina) obţinută prin recombinare genetică. Câţiva ani mai târziu, a fost găsită o metodă prin care se imbunătăţea producţia de chimozină în Aspergillus niger . În prezent sunt utilizate chimozine recombinate genetic, ca de exemplu Maxiren si Chymogen, ce au o puritate ridicată si o activitate de coagulare foarte mare.

Chimozina extrasă din alte specii de mamifere este utilizată pentru fabricarea unor tipuri speciale de brânzeturi.

Structura proteazelor aspartice

Proteazele aspartice(E.C.3.4.23) aparţin clasei peptidazelor si au o arie larga de activitate si specificitate. Sunt prezente in animale, plante, fungi si virusuri. Au fost corelate cu o varietate de procese fiziologice ( digestia mamiferelor, autoapararea împotriva patogenilor, virulenţa drojdiilor, degradarea hemoglobinei de către paraziţi şi maturizarea proteinelor HIV).

Din punct de vedere structural, AP face parte din familia A1 a pepsinelor. Este sintetizată ca prepoenzimă, după desfacere de enzima semnal, proenzima este secretată si activată autocatalitic. Este constituită dintr-un lanţ de aproximativ 320-360 resturi de aminoacizi.

Cristalografie de raze X indică faptul că AP.urile sunt în general lanturi b cu structură secundară dispuse bilobar.

Cei doi lobi sunt omologi, rezultaţi în urma duplicării genelor. Centrul catalitic este localizat între cei doi lobi si conţine resturi de aspartat, esenţiale pentru activitatea catalitică. La majoritatea pepsinelor, restul aspartat este înglobat într-o strucutră de tip Asp-Thr-Ser sau Asp-Thr-Thr. Aceste resturi activeaza o moleculă de apă care mediază atacul nucleofil asupra legaturii peptidă-substrat. Centru activ este suficient de mare să înglobeze cel puţin 7 resturi de substrat polipeptidic. Specificitatea este controlata de o structură flexibilă localizată la intrarea în situsul catalitic. AP-urile sunt activare la pH acid, astfel încât, se presupune că pH-ul optim pentru fiecare protează aspartică este determinat de potenţialul electrostatic al situsului catalitic, care la rândul lui este determinat de poziţia si orientarea resturilor în apropierea situsului.

Familia A a peptidazelor este inhibată puternic de catre peptatin produsă de Streptomyces . peptadina se leagă de structura flexibilă a centrului catalitic.

Chimozină

Chimozina bovină

Chimozina este o peptidază aspartică digestivă care este responsabilă de coagularea laptelui în stomacul viţeilor neînţărcaţi. La mamifere, aceasta se găseşte la fetuşi şi la nou-născuţi, şi scade pe măsură dezvoltării acestora, devenind nesemnificativă la adulţi. Rolul chimozinei este acela de a hidroloza caseina, cu formarea cheagului care este foarte uşor digerat. Prima etapă în biosinteza chimozinei o reprezintă sinteza de către celulele mucoasei gastrice a prepochimozinei, polipetidă formată din 381 aminoacizi. Prepochimozina are ca precursor inactiv prochimozina formată din 365 aminoacizi. In mediu acid prochimozina este activată autocatalitic prin indepărtarea unui segment de 42 de aminoacizi .

Chimozina bovină este utilizată ca agent de coagulare deoarece scindează caseina la legătura Phe-Met si are activitate proteolitică mica. Drojdiile precum Saccharomyces cerevisiae şi Kluyveromzces lactis şi mucegaiurile filamentoase precum Aspergillus niger şi Trichoderma reesei au fost utilizae cu succes ca gazde pentru chimozina recombinată genetic. Chimozina recombinata genetic produsă în Escherichia coli nu este acceptată în industria brânzeturilor. Nu au fost observate diferenţe între utilizare chimozinei recombinate genetic si a enzimelor naturale, însă absenţa pepsinei bovina în chimozina recombinată îmbunătăţeşte randamentul şi aroma brânzei.

Alte chimozine

Chimozina este produsă şi de alte specii de mamifere cum as fii oile, bivolii , capre, porcii, cămilele, oamenii, maimuţele si şoarecii. Recent a fost realizată clonarea ADN.ului pentru prochimoza caprelor. A fsot observată prezenţa unei proteine de 381 de aminoacizi cu un capăt N terminal su o regiune de proenzimă constituită din 16 si 42 de aminoacizi. Secvenţele observate indică multe asemănări cu celelalte preprochimoze. Cele două resturi active de aspartat şi prezenţa a 6 resturi de cisteină reprezintă cele mai importante asemănări cu enzimele bovinelor. Se poate observa şi o neregularitate şi anume glutamatul ocupă în prochimozele caprine poziţia 36 în propeptidă.

În India, datorită faptului că singura sursă sa lapte o reprezintă bivolii, a fost purificată chimozina din stomacul acestora. Se observă diferenţe mici cu privire la stabilitate şi activitatea proteolitică.

Utilizarea prechimozinei recombinate de la miel a fost testată deasemenea şi nu au fost observate diferenţe legate de propietăţile de coagulare şi legate de calitatea brânzeturilor. O caracteristică specifică a chimozinei recombinate din miel o reprezintă instabilitatea la temperaturi mai mari de 45 grade Celsius.

Proteaze aspartice din plante

Structura primară a unei proteaze aspartice din plante este formată din: 1. peptidă semnal responsabilă de translocaţia la reticulul endoplasmatic2. presegment de 46-50 aminoacizi responsabili de plierea corectă3. enzima matură care posedă 2 secvenţe catalitice ( Asp-Thr-Gly şi Asp-Ser-Gly)4. inserţii specifice plantelor (PSI) reprezentate de aporximativ 100 de aminoacizi

PSI-ul este în general înlaturat în timpul procesului de maturare. Rolul acestor inserţii este încă necunoscut dar se presupune că au rol în cadrul sistemului vacuolar.

Majoritatea AP-urilor din plante sunt localizate în seminţe, în fructe sau în flori. Extractle din plante au fost utilizate de multe secole pe post de coagulant. Acestea, fata

de chimozină, desfac a,b şi k-caseină, fapt ce cauzează aciditate, amărăciune si defecte de textură, ceea ce le limitează utilizarea.

Enzimele din plante sunt utilizate pentru obţinerea brânzeturilor cu arome, miros si consistenţe speciale. Aceste tipuri de brânzeturi sunt fabricate în general în Sudul Europei şi în Africa de Vest.

Extractele din Cynara şi Centaurea calcitrapa (cardosin, ciprosin şi cenprosin) sunt utilizate în Spania si Portugalia pentu obţinerea brânzeturilor tradiţionale. În Nigeria se folosesc extracte din Calotropis procera.

Proteaze aspartice din fungi

Proteazele aspartice din fungi au fost folosite în industrie de-a lungul ultimilor 30 de ani. Enzimele produse de Mucor miehei, Mucor pusillus şi Cryphonectria (Endothia) parasitica cunoscute sub denumirea de Rennilase®, Fromase®, Novoren®, Marzyme®, Hannilase®, Marzyme® şi Suparen® sunt folosite pentru producerea brânzeturilor din lumea întreagă. Specificitatea proteolitică a enzimelor extrase din fungi este diferită de cea a chimozinei deoarece produc unele peptide responsabile de amărăciunea brânzeturilor.

Structura cristalină a acestora a fost determinată iar structura terţiară a acestora este asemănătoare cu cea a altor AP.

Mucorpepsina

AP-urile produse extracelular de cele doua specii de zigomicete, M. pusillus şi M. miehei, au o activitate relativ mare în ceea ce priveşte producerea cheagului, în ciuda specificităţii asupra k-caseinei şi a activităţii proteolitice reduse. Aceste enzime au cea mai mare stabilitate termică şi ca urmare utilizarea acestora este nelimitată. Stabilitatea termică a acestora este evidenţiată prin existenţa activităţii enzimatice si după gătire si prezenţa aromelor din branză pe toată perioada de maturare.

Proteazele aspartice din M. Miehei sunt printre cele mai glicolizate. Compuşii carbohidraţi stabilizează configuraţia MAP conferindu-i acesteia o stabilitate termică ridicată si protejând-o împotriva atacului proteolitic. MAP a fost pentru prima data cristalizată de Jia et al. (1995), şi Yang et al. (1997).

Au fost determinate două metode pentru reducerea stabilităţii termice a acesor enzime şi anume, una prima tratarea în soluţie apoasă de agenţi oxidanţi conţinând clor activ iar ce-a de-a doua constând în acilarea cu un derivat activ al acidului cadboxilic.

Endotiapepsina

C. parasitica, numită şi tăciunele castanului, produce o protează aspartică cu propietăţi asemănătoare cu cele ale cheagului de viţel. În ciuda instabilităţii termice foarte ridicate, acest tip de enzimă este folosit pentru obţinerea brânzeturilor de tip Emmental şi a unor brânzeturi ialiene. Producerea unor varităţi largi de brânzeturi cum ar fii Cheddar, Swiss, Colby, cu ajutorul acestui tip de enzimă indică uneori obţinerea unor produse de o calitate superioară decât cea a produselor obţinute cu cheag animal.

C. parasitica protează are o activitate mai bună decât cea a MAP-ului sau a chimozinei. S-a observat astfel proteoliza atât a a-caseinei cât şi a b-caseinei în timpul depozitării brânzeturilor de tip Mozzarella si Cheddar.

Proteaza lactică irpex

Bazidiomiceta responsabilă de descompunerea lemnului, Irpex lacteus, produce o enzimă ILAP care are o activitate ridicată în ceea ce priveşte închegarea laptelui, raportată la activitatea proteolitică. Acest tip de enzimă ar putea deveni în timp o alternativă a utilizării chimozinei. ILAP conţine 340 de resturi de aminoacizi, este activă la un pH 3 şi este inhibată de pepstatină.

CUPRINS

PROTEAZE ASPARTICE UTILIZATE LA FABRICAREA BRÂNZETURILOR.................2Introducere..............................................................................................................................2Structura proteazelor aspartice................................................................................................2Chimozină...............................................................................................................................4

Chimozina bovină...............................................................................................................4Alte chimozine....................................................................................................................4

Proteaze aspartice din plante...................................................................................................4Proteaze aspartice din fungi....................................................................................................5

Mucorpepsina......................................................................................................................5Endotiapepsina....................................................................................................................6Proteaza lactică irpex..........................................................................................................6

CUPRINS....................................................................................................................................7