METABOLISMUL MICROBIAN

Metabolismul microorganismelor reprezinta totalitatea reactiilor biochimice implicate in activitatea lor biologica, prin intermediul carora energia si elementele biogene sunt preluate din mediu si utilizate pentru biosinteza, degradare si crestere, ca si pentru alte activitati fiziologice secundare (mobilitate etc). In urma acestor reactii ale metabolismului, substantele din mediu sunt transformate in constituenti celulari, energie si produsi de metabolism.

Functiile metabolismului sunt, in principal, urmatoarele: a) eliberarea de energie si stocarea acesteia sub forma de ATP si alti compusi macroergici; b) producerea subunitatilor necesare in procesele de biosinteza; c) activarea subunitatilor si formarea constituentilor celulari si d) formarea si degradarea biomoleculelor necesre anumitor functii ale celulei.

Caile metabolice reprezinta secvente de reactii chimice, catalizate enzimatic, care permit organismelor vii sa obtina din nutrienti substantele si energia necesare vietii. Reactiile metabolice se pot desfasura prin una din urmatoarele cai: catabolice; anabolice; amfibolice; anaplerotice.

Caile catabolice

Catabolismul este reprezentat de procesele biochimice implicate in degradarea diferitilor compusi nutritivi din mediu si eliberarea de energie in celula. Reactiile catabolice sau de dezasimilare au loc in trei etape:

1. - degradarea macromoleculelor din mediul extern pana la unitatile mai mici constitutive. Proteinele sunt degradate la aminoacizi, polizaharidele la monozaharide, iar lipidele la glicerol si acizi grasi. In urma acestei etape este eliberata o mica parte din energia chimica a acestor compusi, aproximativ 1%, care se pierde sub forma de caldura si nu este accesibila celulei.2. - moleculele rezultate in prima etapa sunt degradate incomplet, pana la producerea unor substante numite intermediari ai cailor metabolice centrale, cu eliberare de energie (aprox. 1/3 din total), CO2 si H2O. In urma reactiilor acestei etape se obtin un numar redus de 12 intermediari ai cailor metabolice centrale, cum este piruvatul sau acetil-CoA. Energia rezultata este utilizata de celula atat pentru biosinteze cat si pentru formarea prin fosforilare a compusilor macroergici.3. - cea de a treia etapa decurge diferit in functie de microorganisme. In cazul microorganismelor aerobe, reactiile continua cu ciclul acizilor tricarboxilici si cu fosforilarea oxidativa, rezultand in final, ca produsi principali, CO2 si H2O. Aceasta cale se desfasoara cu eliberarea unei mari cantitati de energie, sub forma compusilor macroergici. Microorganismele anaerobe sau facultativ anaerobe continua aceasta etapa prin procese de fermentatie anaeroba (alcoolica, lactica, butirica, propionica, acetonobutilica), in care produsii cailor catabolice pot functiona ca donatori si acceptori de H si electroni, in reactii de oxidoreducere cuplate. In aceste cazuri, cantitatea de energie eliberata este mult mai scazuta, in raport cu cea eliberata in cursul respiratiei aerobe.

Caile anabolice (de asimilare) sunt cai metabolice prin care celula utilizeaza compusi simpli (de obicei intermediari ai cailor metabolice centrale) pentru sinteza blocurilor de constructie ce intra in structura inalt organizata a celulei.Caile catabolice si cele anabolice nu sunt complet reversibile si sunt numai partial comune. Procesele de biosinteza sunt procese consumatoare de energie si sunt cuplate cu degradarea ATP la ADP si Pi. Ca si procesele de catabolism, procesele anabolice se desfasoara in trei faze succesive, in sens invers. In urma acestor reactii, moleculele cu masa mica produse in faza a treia a catabolismului sunt convertite la molecule cu masa mai mare (blocuri de constructie), care sunt apoi asamblate in molecule proteice, glucidice sau lipidice specifice celulei microbiene.

La microorganismele eucariote poate exista o separare a cailor catabolice si anabolice in compartimente diferite ale celulei (de exemplu in mitocondrii, RE si citoplasma).

Caile amfibolice sunt cai metabolice centrale care indeplinesc in acelasi timp functia de eliberare de energie si furnizare a unor precursori pentru biosinteze. Ele constau in reactii reversibile cu functie in degradare si biosinteza, in acelasi timp.

Caile anaplerotice (colaterale) sunt reprezentate de una sau mai multe etape catalizate enzimatic, care asigura completarea deficitului de intermediari metabolici, atunci cand accidental s-a produs inhibarea sau blocarea caii metabolice centrale.

Caracteristicila metabolismului microbian

Metabolismul microbian este caracterizat printr-o serie de particulariti care l deosebesc de cel al organismelor superioare, cu care se aseamn totui n cele mai multe aspecte.

Diversitatea nutrienilor folosii. Dei dimensiunile reduse ale celulei microbiene au sugerat caracterul primitiv al cilor metabolice, s-a demonstrat c metabolismul microbian este caracterizat printr-o multitudine a reactiilor, prin simplitatea i variabilitatea foarte larg a exigenelor nutritive, numrul mare de substane asimilabile i deosebita varietate a produilor finali. Considerate n totalitate, microorganismele sunt organismele cele mai tipic omnivore, deoarece pot utiliza cele mai numeroase i diverse surse de substane nutritive. Teoretic, aproape orice substan din mediu, organic sau anorganic, este accesibil metabolismului microbian. Microorganismele pot utiliza substane i materiale cu o larg gam de complexitate chimic, ncepnd de la acizii formic, oxalic i sulfuric pn la fenoli, parafine, petrol, piele, cauciuc, lemn i chiar substane antibiotice. Unele specii microbiene pot utiliza o gam larg de substraturi, de exemplu bacteriile din genul Pseudomonas pot folosi drept surs de carbon 70-100 de substane chimice diferite. Alte specii pot utiliza ns numai un numr restrans de compui chimici; de exemplu, Bacillus fastidiosus metabolizeaz numai acidul uric i compuii purinici nrudii, iar bacteriile metilotrofe doar metanul i metanolul. Plasticitatea metabolismului microbian rezult din capacitatea microorganismelor de a se adapta la diferite tipuri i cantiti de nutrieni din mediu. Metabolismul microbian este guvernat de legea maximei economii: bacteriile metabolizeaz mai nti aminoacizii din mediul de cultur (nemaifiind nevoie s-i sintetizeze), apoi azotul sub forma de NH4+. Diversitatea mecanismelor enzimatice. Un substrat poate fi utilizat pe mai multe ci distincte sau parial intricate, cu obinerea de produi finali diferii. Diferitele ci metabolice pot coexista la acelai microorganism i se pot substitui una celeilalte, n funie de condiiile de mediu i de starea fiziologic a celulei. De exemplu, glucoza poate fi metabolizat fie pe calea respiraiei aerobe, fie pe calea fermentaiei. Intensitatea metabolismului microbian este deosebit de mare comparativ cu cea a organismelor superioare. Astfel, activitatea respiratorie a unui gram de s.u. de bacterii aerobe este de cteva sute de ori mai intens dect aceea a omului. Randamentul potenial teoretic al biosintezei proteinelor (kg/zi) este considerat de unii autori la 1 pentru bovine, 10 pentru plantele de soia, 105 pentru drojdii i 1011 pentru bacterii. Acest fenomen ar putea fi explicat datorit suprafeei foarte mari a celulelor microbiene luate n ansamblu, n raport cu greutatea lor, deci schimbul de substane cu exteriorul este foarte intens. Nutriia microorganismelor

Viaa microorganismelor i strategiile de supravieuire a acestora n diferite medii de via sunt puternic influenate de nutrieni i sursele de energie, de temperatura ambiant, cantitatea de umiditate, prezena sau absena gazelor, presiunea osmotic, pH, prezena sau absena luminii i a altor radiaii, alte organisme. Microoeganismele sunt att de bine adaptate i au un metabolism att de flexibil nct au reuit s prolifereze n toate tipurile de habitat (sau nie), ncepnd cu cele mai aspre condiii pn la cele extreme.

Nutrienii reprezint substanele folosite n biosinteze i producerea de energie, fiind necesari totodat pentru cretere i dezvoltare, pentru multiplicare i pentru ntreinerea altor funcii celulare. Dac se cunosc mai multe date referitoare la cerinele nutritive ale microorganismelor cultivate n laborator, despre nutriia celulelor microbiene n habitaturile naturale, informaiile sunt mai reduse, din cauza caracterului heterogen al acestor medii.

n procesul de cretere, microorganismele necesit aceleai elemente chimice care se regsesc n compoziia celulelor, n diferite proporii. Cele mai deosebite grupe de microorganisme, prezentnd cele mai diferite adaptri la mediu, prezint de fapt aceleai cerine de baz fa de nutrieni, reprezentai de aa-numiii nutrieni eseniali. Cele dou categorii majore de nutrieni eseniali sunt bioelementele majore (macronutrienii) i bioelementele minore (micronutrienii).Bioelementele majore (macronutrienii) Macronutrienii, necesari n cantiti mai mari, joac un rol esenial n structura celulei i n metabolismul acesteia. Analiza compoziiei celulei microbiene a demonstrat c mai mult de 95% din substana uscat este reprezentat de cteva elemente chimice: carbon, oxigen, hidrogen, azot, sulf, fosfor, potasiu calciu, magneziu i fier. Aceste elemente sunt necesare celulei n concentraii relativ mari (mai mult de 10-4M) i reprezint constituenii majori ai biomasei celulare a microorganismelor. Primele 6 elemente enumerate sunt componente eseniale ale glucidelor, lipidelor, proteinelor i acizilor nucleici. Celelalte 4 elemente se afl n celul sub form de cationi i ndeplinesc roluri diferite. De exemplu, K+este necesar pentru activitatea unor enzime (inclusiv a celor implicate n sinteza proteinelor); Ca2+ contribuie la rezistena termic a endosporului bacterian; Mg2+ este cofactor enzimatic; Fe2+ i Fe3+ fac parte din citocromi i din proteinele FeS.

Bioelementul majorSursaFuncia n celula microbian

CCO2, compui organici i anorganici din roci i sedimenteIntr n constituia tuturor substanelor organice

OO2, H2O, CO2, compui organici, unii oxiziConstituent al majoritii substanelor organice, acceptor de electroni n respiraia aerob

HCompui organici, H2O, depozite mineraleConstituent al tuturor compuilor organici

NNH4+, NO3-, NO2- N2, din sol i ape, compui organiciIntr n constituia proteinelor, vitaminelor, bazelor azotate, aminozaharuri etc

SS, H2S, SO42-, SO32-, compui organici Intr n constitiia aminoacizilor cu sulf, a unor vitamine

PCompui anorganici din depozite minerale PO43-, H2PO4-Intr n constituia fosfolipidelor, acizilor nucleici, coenzimelor, unor compui macroergici, formeaz rezerve n celul

KK+ - depozite minerale, apeCofactor enzimatic, intr n compoziia unor complexe metalice

MgMg+ - diferite sedimente geologiceCofactor enzimatic, intr n compoziia pereilor celulari, are rol n stabilizarea ribozomilor i a membranei celulare

CaCa+ depozite mineraleCofactor enzimatic, prezent n pereii endosporului

FeFe2+, Fe3+Intr n compoziia citocromilor, a ferredoxinelor, altor proteine cu FeS, cofactor enzimatic

Bioelementele minore (micronutrienii), trace elements (zinc, mangan, sodiu, clor, molibden, seleniu, cupru, nichel, cobalt) , sunt necesare n cantiti foarte mici, n concentraii mai mici de 10-4M, fiind de obicei componente ale enzimelor i cofactorilor i avnd rol n meninerea structurii proteinelor i n desfurarea reaciilor enzimatice. Unele din aceste microelemente (zinc, mangan) sunt necesare tuturor microorganismelor, n timp ce altele numai n anumite activiti.

Micronutrienii sunt necesari n cantiti att de mici, nct pot fi preluai de microorganisme direct din ap, din unii componeni ai mediilor de cultur sau din pereii vaselor utilizate. Zincul este necesar deoarece ADN i ARN polimerazele sunt metaloproteide cu zinc, manganul favorizeaz aciunea unor enzime care catalizeaz transferul de grupri fosfat, molibdenul intr n constituia nitrogenazei, enzim esenial pentru procesul de fixare biologic a azotului, cobaltul este un component al vitaminei B12.

MEDII DE CULTURA

Mediile de cultura sunt necesare pentru izolarea si identificarea microorganismelor, pentru testarea caracterelor lor morfologice si fiziologice, pentru analiza apei si a produselor alimentare, in microbiologia industriala si alte activitati. Desi toate microorganismele necesita surse de energie, carbon, azot, fosfor, sulf si diferite minerale, compozitia precisa a mediului de cultura utilizat trebuie corelata cu cerintele nutritionale ale speciei ce va fi cultivata.

Mediul de cultura reprezinta un suport nutritiv sterilizat, care permite dezvoltarea unui microorganism in afara nisei ecologice naturale.

Un mediu de cultura contine un substrat nutritiv complex, care asigura microorganismului cantitatile necesare de apa, surse de carbon, azot, saruri minerale, factori de crestere, necesare in procesele de crestere si multiplicare si alte functii ale celulei.

Mediile de cultura pot fi clasificate dupa mai multe criterii. Dupa complexitatea lor, mediile pot fi:

* Medii definite sau sintetice, care au o compozitie bine cunoscuta (folosite in special pentru cultivarea microorganismelor fotolitotrofe auxotrofe) si care contin, in general carbonati sau bicarbonati drept surse de carbon si azotati sau saruri de amoniu drept sursa de azot. Microorganismele chemoorganotrofe heterotrofe pot fi cultivate pe astfel de medii ce contin glucoza ca sursa de carbon si saruri cu azot. Acest tip de medii de cultura este utilizat indeosebi in lucrarile de cercetare.

* Medii de cultura complexe, care contin ingrediente a caror compozitie chimica nu este cunoscuta cu exactitate. Aceste medii sunt foarte folosite deoarece sunt suficient de bogate si complete pentru a permite dezvoltarea multor microorganisme. Mediile complexe contin componente cu compozitie aproximativa ca peptonele, extractul de carne si extractul de drojdie. Peptonele sunt hidrolizate proteice preparate prin proteoliza partiala a carnii, caseinei, fainii de soia, gelatinei sau a altor surse proteice. Peptonele servsc drept sursa de carbon, energie si azot.

In functie de destinatia lor, mediile pot fi:

* Medii de cultura generale, care sunt utilizate pentru cultivarea unui numar mare de genuri si specii microbiene. Cel mai cunoscute medii folosite in practica de laborator pentru cultivarea bacteriilor sunt bulionul de carne lichid sau gelozat (agarul nutritiv) sau mediul ce contine triptona, extract de drojdie, glucoza si agar. In scopul cresterii fungilor sunt recomandate mediile continand extract de malt sau extract de cartof, glucoza si agar.

* Medii de cultura selective care favorizeaza cresterea unor microorganisme particulare.. Sarurile biliare sau colorantii ca fucsina bazica si cristal violet favorizeaza cresterea bacteriilor Gram negative, inhiband cresterea bacteriilor Gram pozitive. Un mediu selectiv folosit la determinarea bacteriilor coliforme contine bulion nutritiv, saruri biliare, lactoza si verde briliant, in care sarurile biliare inhiba alte bacterii, in timp ce coliformii sunt adaptati. Bacteriile pot fi selectate, de asemenea, in urma incubarii in prezenta de nutrienti pe care ii utilizeaza in mod specific. De exemplu, un mediu continand celuloza drept unica sursa de carbon poate fi utilizat pentru izolarea bacteriilor celulozolitice. Modalitatile de selectionare a unor grupe de microorganisme sunt nenumarate, iar mediile selective de cultura de asemenea.

* Medii de cultura de diferentiere care permit separarea diferitelor grupe de microorganisme in functie de anumite caractere biochimice, precum si identificarea lor. Agarul cu sange permite realizarea distinctiei intre bacteriile hemolotice si cele nehemolitice. Bacteriile hemolitice (streptococi sau stafilococi izolati din caile respiratorii) produc zone clare in jurul coloniilor, datorita distrugerii celulelor rosii din sange. Daca pe un mediu selectiv s-au izolat, de exemplu, bacterii coliforme, acestea pot fi diferentiate in speciile componente ale grupului pe medii de diferentiere.

* Medii de imbogatire (fortifiate) care sunt medii utilizate pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor pretentioase din punct de vedere nutritiv si care se afla in numar mic in produsul ce trebuie analizat. Microorganismul este insamantat in aceste medii de imbogatire (se folosesc chiar medii de preimbogatire) unde se multiplica, dupa care este trecut pe medii selective, iar rezultatul se exprima prin prezenta sau absenta lui. Acest tip de medii este utilizat la determinarea bacteriilor din genul Salmonella in produsele alimentare.

Dupa consistenta lor, mediile de cultura pot fi clasificate in medii lichide, solide si medii solidificate.

* Mediile lichide sunt utilizate la nivel de laborator pentru cultivarea unor microorganisme anaerobe, microaerofile sau facultativ anaerobe si pentru diferite procese de biosinteza in submers, atat in practica de laborator cat si la nivel industrial.

* Mediile de cultura solide sunt utilizate pentru cultivarea in general a microorganismelor aerobe (mai ales mucegaiuri) si pot fi felii de legume, boabe de cereale, rumegus, paine etc.

* Mediile de cultura solidificate (folosite pentru prima oara de microbiologul german R.Koch) au o mare importanta in practica de izolare, numarare si caracterizare a microorganismelor. La prepararea acestui tip de medii se utilizeaza agenti de solidificare, dintre care cei mai intrebuintati sunt agarul si gelatina. Agarul (geloza) este un polimer sulfatat compus in special din D-galactoza, 3,6-anhidro-L-galactoza si acid D-glucuronic, fiind extras din alge rosii din genul Gelidium. Agarul se adauga in mediile de cultura de obicei in proportie de 0,5 - 2% si este cel mai utilizat agent de solidificare deoarece nu este atacat de majoritatea microorganismelor. Agarul se topeste la temperatura de fierbere a mediului si se solidifica prin racire la 40-42oC. In mediu acid la temperatura de sterilizare isi pierde capacitatea de a forma gel, de aceea sterilizarea mediilor si a solutiilor destinate acidifierii se face separat. Un alt agent de solidificare este gelatina, de natura proteica, extrasa din tesuturile colagenice. Gelatina prezinta dezavantajul ca este degradata de microorganismele ce produc enzime proteolitice. Ea se adauga in mediu in cantitate de 12 -15g%, si, dupa solubilizare prin fierbere, se solidifica lent prin racire la 30-25oC. In diferite scopuri se mai utilizeaza si alti agenti de solidificare. De exemplu, silicagelul este utilizat pentru cresterea bacteriilor autotrofe pe medii solidificate in absenta substantelor organice si, de asemenea, pentru determinarea tipului sursei de carbon pentru bacteriile heterotrofe.

In procesele de biosinteza la nivel industrial se utilizeaza medii de cultura continand diferite componente - deseuri si subproduse ale industriei agroalimentare sau altor industrii, cu pret de cost scazut. Astfel de medii de cultura contin, ca surse de carbon - melasa, lactoza din zer, maltoza din malt, dextrine, diferite tipuri de fainuri, cereale, tarate, amidon, hidrocarburi. Dintre sursele de azot, cele mai utilizate in procesele de biosinteza sunt sarurile cu azor, ureea, fainurile de soia, de peste, extractul de porumb, autolizatele de drojdie, hidrolizatele proteice. Pentru imbogatirea in saruri minerale se adauga in mediile de cultura fosfati, sulfati, cloruri, azotati etc. Mediile industriale de cultura mai pot fi suplimentate cu factori de crestere, precursori si inductori ai unor produsi de biosinteza, detergenti (cu rol de emulgatori), agenti de antispumare, antiseptice etc. Nu in ultimul rand, calitatea si compozitia apei reprezinta un factor important al mediilor de cultura.

CRESTEREA SI MULTIPLICAREA MICROORGANISMELOR

In urma biosintezei de substanta noua, microorganismele cresc prin formare de noi constituenti celulari, apoi se multiplica.

Prin crestere se intelege marirea coordonata a tuturor constituentilor chimici ai unui organism uni- sau pluricelular, ca rezultat al formarii de substanta noua. Marirea masei nu reflecta in mod obligatoriu cresterea normala, echilibrata, deoarece ea poate rezulta din sinteza si acumularea de materiale de rezerva, in absenta biopolimerilor esentiali (AND, ARN, proteine). De asemenea, la microorganisme, marirea masei se poate realiza si prin cresterea continutului in apa.

Cresterea celulei microbiene nu se face la infinit, deoarece se ajunge la un moment dat cand are loc diviziunea celulei. In felul acesta, creasterea unei populatii microbiene este rezultatul cresterii si diviziunii microorganismelor individuale.

Se considera ca activitatea normala a celulei microbiene este conditionata de de existenta unui anumit raport intre volumul celulei, care consuma si suprafata ei, prin care se face absorbtia substantelor nutritive si eliminarea catabolitilor. In cursul cresterii, raportul suprafata/volum se modifica datorita faptului ca in timp ce suprafata creste cu o ratie patratica, volumul se mareste cu o ratie cubica. Schimburile de materie cu mediul extern devin din ce in ce mai putin adecvate cerintelor metabolice. Datorita acestui fenomen, atunci cand disproportia dintre suprafata si volum atinge un anumit punct critic, raportul lor adecvat se restabileste prin diviziunea celulei.

Multiplicarea bacteriilor

Multiplicarea bacteriilor se face fie prin diviziune directa, prin inmugurire, prin fragmentare sau prin spori, in functie de specia bacteriana.

Multiplicarea prin diviziune este forma cea mai raspandita de multiplicare a bacteriilor, prin care celula-mama se divide in doua celule surori, cel mai adesea identice; deci bacteriile se divid prin sciziune binara izomorfa. Procesul de diviziune are loc in trei etape principale: a) formarea unei membrane care separa protoplastii ce vor forma celulele-fiice; b) sinteza peretelui celular pe suprafata membranei respective sau formarea unui sept transversal prin cresterea spre interior a peretelui celular si c) separarea celulelor rezultate.

Estimarea cresterii microorganismelor

Cunoasterea cresterii si multiplicarii microorganismelor esie indispensabila atat pentru studiul caracterelor morfofiziologice ale celulelor microbiene, cat si in domeniul medical, industrial si ecologic.

Ciclul de crestere incepe din momentul formarii celulei microbiene (cand are o masa si dimensiuni minime) si continua cu cresterea acesteia, pana la diviziune.

In timpul cresterii, fiecare microorganism se divide la intervale constante de timp. Astfel, populatia isi va dubla numarul intr-o perioada specifica de timp, numit timp de generatie sau timp de dublare. De exemplu: presupunem ca un tub cu mediu de cultura este inoculat cu o celula care se divide la fiecare 20 minute. Populatia va avea 2 celule dupa 20 minute, 4 celule dupa 40 minute si asa mai departe. Deoarece populatia isi dubleaza numarul cu fiecare generatie, cresterea populatiei va fi 2n, unde n reprezinta numarul de generatii. In acest mod, cresterea populatiei va fi exponentiala sau logaritmica.

TimpNumarul diviziunii2nPopulatia (No x 2n) log10Nt

0020 = 110,000

20121 = 220,301

40222 = 440,602

60323 = 880,903

80424 = 16161.204

100525 = 32321,505

120626 = 64641,806

Curba de crestere a populatiilor microbiene

Cresterea populatiilor microbiene este studiata prin analiza curbei de crestere a unei culturi microbiene. Cand microorganismele sunt cultivate intr-un mediu lichid, ele cresc in culturi discontinue sau batch, in sistem inchis. Deoarece nu este adaugat mediu proaspat, cresterea este limitata la un volum fix de mediu,, in care concentratia nutrientilor scade, si creste concentratia de produsi de metabolism. Cresterea microorganismelor care se reproduc prin diviziune binara poate fi reprezentata grafic ca logaritmul numarului de celule in functie de timpul de incubare. In aceste conditii rezulta o curba care prezinta 6 faze succesive distincte; faza de lag, faza de accelerare, faza de crestere exponentiala, faza de incetinire, faza stationara si faza de declin.

Lg nr. cel.

1 2 3 4 5 6

Timp

Faza de lag - 1 - (engl. to lag = a intarzia), numita si faza de latenta sau de crestere zero, este cuprinsa intre momentul introducerii celulelor in mediu si momentul in care ele incep sa se multiplice. In cursul acestei faze, numarul celulelor din mediu ramane neschimbat, sau chiar scade temporar. Cultura nu este vizibila macroscopic. In aceasta perioada, nu are loc diviziune celulara, iar rata medie de crestere este nula. In faza de lag, celulele isi refac stocul de structuri (ribozomi), sisteme enzimatice, si metaboliti necesari cresterii, in cazul in care acestea lipseau sau erau deficitare din cauza conditiilor de viata anterioare insamantarii. In cursul fazei de lag, celulele individuale cresc foarte mult ca marime, au un continut crescut in proteine, ARN si fosfor. De asemenea, activitatea metabolica si sensibilitatea la agenti fizici si chimici sunt marite.

Durata acestei faze difera in functie de mai multi factori:

Varsta celulelor din inoculum - Atunci cand celulele tinere sunt introduse intr-un mediu nou, faza de latenta poate fi extrem de scurta; dimpotriva, aceasta faza este prelungita in cazul folosirii celulelor din inocul aflate in faza stationara sau in faza de declin. Acest tip de inocul poate contine o mare cantitate de celule moarte si un mic procent de celule vii, care trebuie sa se divida de mai multe ori pana sa produca tulburarea mediului.

Compozitia mediului - Un inocul celular prelevat in faza exponentiala de crestere si introdus intr-un mediu nou cu compozitie chimica identica se multiplica instantaneu, fara faza de latenta. In schimb, daca substantele nutritive (sursa de carbon si azot) sunt diferite, se observa la inceput o faza de lag. Acest fenomen se explica prin absenta enzimelor necesare utilizarii noilor substrate si deci prin necesitatea celulei de a le sintetiza. Intarzierea cresterii poate fi datorata absentei unor factori de crestere, fenomen observat in principal in cazul utilizarii mediilor sintetice. Acelasi efect il are prezenta ionilor metalici toxici care pot fi neutralizati mai usor intr-un mediu peptonat bogat in proteine.

Perioada de lag este necesara pentru celulele lezate (dar inca viabile) de efectul unor agenti fizici (caldura, radiatii) sau chimici (toxine), datorita timpului necesar pentru reparatie.

Faza de accelerare a cresterii 2 succede faza de latenta si se caracterizeaza prin cresterea din ce in ce mai accelerata a numarului de celule si a biomasei, iar rata de crestere este si ea crescatoare.

Atat faza de latenta cat si faza de accelerare a cresterii sunt determinate de varsta culturii si de nacesitatea adaptarii enzimatice, fiind facultative.

Faza exponentiala 3 numita si faza logaritmica este caracterizata prin aceea ca, dupa o scurta perioada de accelerare a ritmului de crestere, in care multiplicarea se face cu o viteza progresiv marita, acest ritm devine constant si maxim (rata de crestere este maxima). In cursul acestei faze , care in coordonate semilogaritmice se exprima grafic printr-o linie dreapta, mortalitatea celulara este practic nula. Celulele aflate in faza logaritmica au o citoplasma omogena, nu contin materiale de rezerva si au o mare afinitate pentru colorantii bazici datorita continutului lor ridicat in ARN. In aceasta faza, populatia este cea mai uniforma in termeni de proprietati chimice si fiziologice; din acest motiv culturile in faza exponentiala sunt utilizate in studiile biochimice si fiziologice.

Faza de incetinire a cresterii 4 corespunde perioadei in care concentratia factorului limitant al cresterii scade sub nivelul care asigura cresterea maxima. Sub denumirea de factor limitant se intelege orice factor a carui lipsa din mediu opreste cresterea. Pe masura ce factorul limitant este consumat, rata de crestere ia toate valorile intermediare intre cresterea cu o rata maxima si zero.

Faza stationara 5 este faza in care numarul de celule viabile ramane constant, iar rata de crestere este 0. Intr-o cultura in care nutrientii nu sunt reinnoiti, cresterea exponentiala dureaza numai cateva generatii, dupa care rata de crestere scade la 0, ca o consecinta a acumularii de produsi toxici sau a epuizarii unui nutrient. In cazul bacteriilor, faza stationara este atinsa la valori de 109 celule / ml, in timp ce pentru alte microorganisme (protozoare si alge), valoarea maxima a densitatii celulare este de 106 celule / ml.

Faza de declin si moarte celulara 6 apare dupa diferite intervale de timp, in functie de natura microorganismelor si a conditiilor de cultura. Rata de crestere este negativa, iar populatia descreste numeric. Multe celule mor si sunt lizate de enzimele pe care le elibereaza (autolizine).

INFLUENTA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA CRESTERII MICROORGANISMELOR

Cresterea microorganismelor este puternic afectata de factorii chimici si fizici din mediul inconjurator. Cunoasterea acestor influenta este importanta in controlul cresterii microbiene in industria alimentara atat pentru procesele de obtinere a culturilor starter, a biomasei sau a unor metaboliti, cat si in studiul conservarii alimentelor.

Temperatura

Temperatura mediului ambiant are o influenta majora asupra microorganismelor, fenomen ce se explica prin faptul ca acestea sunt organisme unicelulare si poikilotermice (adica temperatura lor variaza cu temperatura mediului. Temperatura are un efect puternic asupra reactiilor catalizate enzimatic; la temperaturi scazute, viteza de crestere este mica, deoarece viteza reactiilor catalizate enzimatic este mica. Aceasta se dubleaza la fiecare crestere cu 10oC, ca pentru orice tip de reactie chimica. Din acest motiv, metabolismul este mai activ la temperaturi ridicate, iar cresterea este accelerata, pana la anumite valori ale temperaturii, care devin letale. Temperaturile prea mari sunt daunatoare microorganismelor prin denaturarea enzimelor, a transportorilor din membrana plasmatica si a altor proteine. Membranele microbiene sunt de asemenea distruse de temperaturi ridicate; bistratul lipidic se dezorganizeaza.

Cresterea microbiana este caracterizata de valorile temperaturilor cardinale - temperaturile minime, optime si maxime de crestere, care sunt diferite in functie de specia microbiana, de unii factori externi si de nutrienti. Temperatura minima de crestere poate fi definita ca temperatura cea mai scazuta la care mai poate avea loc cresterea; temperatura optima este temperatura la care rata specifica de crestere este maxima; temperatura maxima este temperatura la care cresterea este inca posibila, dar prin depasirea careia efectuleste letal.

Temperatura optima este cuprinsa in mod normal intre 0oC si 75oC, dar cresterea microbiana se poate intalni la temperaturi cuprinse intre -20oC si 100oC. Domeniul temperaturilor de crestere pentru un anumit microorganism cuprinde aproximativ 30 grade. Unele specii au un domeniu restrans al temperaturilor de crestere - microorganisme stenotermice -, altele, numite euritermice, prezinta un domeniu larg al temperaturilor cardinale.

In functie de valorile temperaturiloe cardinale, microorganismele sunt clasificate in:

* Microorganisme psihrofile - cresc bine la 0oC si au temperatura optima de crestere la 15 C sau mai scazuta; maximul se situeaza in jurul valorii de 20 C. Au fost izolate din habitaturile arctice si antarctice si reprezinta o mare parte din microbiota oceanelor. Din aceasta categorie fac parte genurile Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alcaligenes. Microorganismele psihrofile si-au adaptat enzimele, sistemele de transport si mecanismele sintezei proteice la temperaturi scazute. Membranele celulare ale acestor microorganisme se caracterizeaza prin concentratii ridicate de acizi grasi nesaturati, ramanand semifluide la temperaturi joase. La temperaturi mai mari de 20 C, acest tip de membrane se dezorganizeaza producand moartea celulelor.

* Microorganisme psihrotrofe sau facultativ psihrofile - pot creste la 0 C, au un optim intre 20 - 30 C si o temperatura maxima la 35 C. Aceste microorganisme sunt principalii agenti de degradare a alimentelor refrigerate.

* Microorganisme mezofile - cu o temperatura minima de 15-20oC, temperatura optima 30-40oC, iar cea maxima in jurul valorii de 45oC.

* Microorganisme termofile - care pot creste la temperaturi de 55oC sau mai ridicate; au o temperatura minima de crestere in jurul valorii de 45oC, iar cea optima intre 55-65oC. Exista microorganisme termofile care au un maxim la valori de temperatura peste 100oC.Aceste microorganisme, in majoritate bacterii, se intalnesc in mai multe habitate cum sunt compostul, capitele de fan, izvoarele si apele termale. Spre deosebire de mezofile, termofilele au sisteme enzimatice termostabile, capabile sa functioneze la temperaturi ridicate, iar lipidele membranare sunt mai saturate si au puncte de topire mai ridicate. Din aceasta categorie de microorganisme fac parte unele bacterii lactice ale genului Lactobacillus, Bacillus, Clostridium. Microorganismele termofile sunt utilizate industrial pentru obtinerea de produse lactate acide, a enzimelor termostabile, pentru purificarea apelor reziduale, ca bioindicatori pentru anumite tratamente termice. Pot produce alterarea conservelor si incingerea cerealelor.

Umiditatea si solventii

Deoarece microorganismele sunt separate de mediul extern printr-o membrana semipermeabila, ele sunt afectate de modificarile de presiune osmotica din mediu. Daca un microorganism este plasat intr-o solutie hipotonica, apa va intra in celula determinand aparitia unui fenomen de turgescenta. Cele mai multe bacterii, alge si fungi poseda pereti celulari rigizi care mentin forma si integritatea celulei. Microorganismele isi pastreaza concentratia osmotica interna din citoplasma la valori mai mari decat cele ale mediului extern prin folosirea de soluti compatibili, astfel incat membrana plasmatica sa adere strans la peretele celular. Solutii compatibili sunt solutii compatibili cu metabolismul si cu cresterea, chiar la concentratii mari intracelulare. Multe bacterii isi mentin crescuta presiunea osmotica interna prin sinteza de colina, betaina, prolina, acid glutamic si alti aminoacizi; de asemenea sunt implicate si concentratiile crescute de ioni de potasiu. Algele si fungii actioneaza impotriva presiunii osmotice externe prin concentratii crescute de zaharoza si polioli - arabitol, glicerol si manitol. Poliolii si aminoacizii sunt solutii ideali pentru aceasta functie deoarece acestia nu altereaza structura si functiile enzimelor.

Cand microorganismele cu perete celular rigid sunt plasate intr-un mediu hipertonic, apa iese din celula si membrana plasmatica se desprinde de peretele celular, fenomen cunoscut sub denumirea de plasmoliza. In acest mod celula se deshidrateaza, membrana este, iar celula devine metabolic inactiva si inceteaza sa creasca.

Deoarece concentratia osmotica a mediului extern are efecte profunde asupra microorganismelor, este necesar sa se exprime continutul de apa accesibila pentru celula microbiana. In acest scop, microbiologii utilizeaza in general termenul de activitate a apei (aw). Activitatea apei unei solutii reprezinta 1/100 din umiditatea relativa a solutiei, fiind de asemenea echivalenta cu raportul dintre presiunea de vapori a solutiei si presiunea de vapori a apei pure.

P sol

aw = ---------

P apa

Activitatea apei unei solitii sau a unui solid poate fi determinata prin inchiderea ermetica a probei intr-o incinta si masurarea umiditatii relative dupa ce sistemul a ajuns la echilibru. Activitatea apei este invers proportionala cu presiunea osmotica: daca o solutie are o presiune osmotica mare, activitatea apei este scazuta.

Microorganismele se pot dezvolta intr-un domeniu larg de aw situat intre valori de 0,62 - 1,00, fiind clasificate dupa acest criteriu in trei categorii:

- microorganisme xerofite care se pot dezvolta la aw de 0,62 - 0,75 din care fac parte mucegaiuri din genurila Xeromyces, Aspergillus, drojdii osmotolerante, bacterii halotolerante;

- microorganisme mezofite care se pot dezvolta la valori ale aw de 0,75 - 0,85, fiind reprezentate de majoritatea fungilor si bacteriilor;

- microorganisme hidrofite - aw 0,85 - 0,99 sunt in general bacteriile.

Conservarea alimentelor prin uscare, congelare, sarare si alte procedee are la baza fenomenul de scadere a activitatii apei sub o valoare critica, sub care nu se mai pot dezvolta microorganismele de contaminare; odata cu cresterea umiditatii, apare si pericolul de degradare microbiana a alimentelor.

PH

PH-ul afecteaza dramatic cresterea microbiana, deoarece fiecare specie are un domeniu definit de pH in care se poate dezvolta, cu un pH optim de dezvoltare. In functie de aceste valori, microorganismele se clasifica in:

- microorganisme acidofile care au un pH optim de crestere cuprins intre 1,0 si 5,5;

- microorganisme neutrofile, cu ph optim cuprins intre 5,5 si 8,0;

- microorganisme alcalofile, care prefera valori ale pH cuprinse intre 8,5 si 11,5. Microorganismele extrem alcalofile au pH-ul optim de crestere 10 sau mai mare.

In general diferitele grupe microbiene au preferinte specifice de pH. Cele mai multe bacterii si protozoare sunt neutrofile; cele mai multe mucegaiuri prefera mediile usor acide, cu pH intre 4 - 6; algele microscopice sunt favorizate de asemenea de mediile usor acide.

In ciuda preferintelor variate pentru valori de pH, valorile interne ale acestei marimi, pentru cele mai multe microorganisme sunt neutre, fapt ce rezulta din impermeabilitatea membranei plasmatice fata de protoni.

Variatiile drastice de pH pot afecta celula microbiana prin alterarea structurii membranei plasmatice sau prin inhibarea activitatii enzimelor si a transportului proteic prin membrana. Modificarile pH-ului extern pot altera de asemenea ionizarea moleculelor de nutrienti, reducand astfel accesibilitatea lor pentru celula microbiana.

In mod frecvent, microorganismele modifica pH-ul extern al mediului, prin producerea de metaboliti de degradare acizi sau bazici. De aceea, in mediile de cultura se pot adauga sisteme tampon pentru a preveni inhibitia cresterii la modificari majore de pH.

Concentratia de oxigen

In functie de necesarul de oxigen, microorganismele sunt clasificate in 5 categorii majore:

- microorganisme aerobe, capabile sa creasca in prezenta oxigenului din aer; daca aceste microorganisme sunt complet dependente de oxigen, ele se numesc strict sau obligat aerobe. Oxigenul serveste ca acceptor final de electroni in lantul transportor de electroni in respiratia aeroba. In plus, microorganismele aerobe folosesc oxigenul pentru sinteza sterolilor si a acizilor grasi nesaturati.

- microorganisme facultativ anaerobe, care nu necesita oxigen pentru crestere, dar care cresc mai bine in prezenta acestuia.

- microorganisme aerotolerante anaerobe, care ignora pur si simplu oxigenul si cresc la fel in prezenta sau absenta acestuia.

- microorganisme strict sau obligat anaerobe, care nu tolereaza oxigenul si mor in prezenta acestuia. Microorganismele aerotolerante si cele anaerobe nu pot genera energie prin respiratie aeroba si folosesc calea fermentatiei sau a respiratiei anaerobe in acest scop.

- microorganisme microaerofile, care nu suporta concentratia de oxigen normala din aer (20%) si necesita valori ale concentratiei de oxigen cuprinse intre 2 si 10% pentru crestere.

Cultivarea microorganismelor aerobe nu prezinta dificultati deoarece se poate realiza in aer liber. Cultivarea microorganismelor anaerobe necesita precautii speciale pentru evitarea contactului direct al celulelor cu oxigenul. De aceea, in acest caz, se poate urma unul din procedeele urmatoare: cultura in zona profunda a unui mediu solid saracit in oxigen, adaugarea de agenti reducatori in mediul de cultura, eliminarea oxigenului din recipientul de cultura, cultivarea in vase in care aerul a fost inlocuit cu un gaz inert ca azotul sau un amestec de azot si hidrogen.

Microorganismele obligat aerobe si facultativ anaerobe contin enzimele superoxid dismutaza si catalaza, care catalizeaza transformarea radicalului superoxid si a peroxidului de hidrogen, neutralizand efectul distructiv al acestora:

superoxid dismutaza

2O2-. + 2H+ O2 + H2O

catalaza

2H2O2 2H2O + O2

Presiunea

Cele mai multe microorganisme nu sunt influentate semnificativ de presiune, deoarece traiesc in habitate cu valori ale presiunii de aproximativ 1 atmosfera. Exista totusi bacterii care s-au adaptat la valori extreme ale presiunii. Unele bacterii sunt barotolerante - cresterea presiunii le afecteaza, dar nu atat de mult ca in cazul bacteriilor nontolerante. Unele bacterii care traiesc la adancimi marine mari sunt barifile, crescand mai rapid la presiuni ridicate.

Radiatiile

Lumina solara reprezinta sursa majora de radiatii de pe pamant. Acestea includ radiatia vizibila, ultravioleta, radiatiile infrarosii si undele radio. Lumina este utila bacteriilor din diviziunea Photobacteria, restul microorganismelor chimiosintetizante preferand sa se dezvolte in intuneric.

Radiatiile ultraviolete au un efect letal sau mutagen asupra celulelor microbiene datorita energiei lor inalte. Cele mai daunatoare microorganismelor sunt radiatiile UV cu lungimea de unda de 260 nm, cele mai bine absorbite de And, in structura caruia formeaza dimeri de pirimidina, care inhiba replicarea si functionarea moleculei de AND.

Dintre radiatiile elctromagnetice, cele mai daunatoare pentru microorganisme sunt radiatiile ionizante, care determina formarea de ioni si radicali liberi inalt reactivi. Acestia actioneaza in celula vie prin ruperea legaturilor de hidrogen, oxidarea si formarea dublelor legaturi, modificari de structura, polimerizari. Radiatiile gamma, emise de izotopii radioactivi cum este 60Co, au o putere mare de penetrare si de aceea se pot folosi pentru sterilizarea ambalajelor sau a unor pruduse alimentare. Desi efectul radiatiilor ionizante se manifesta asupra tuturor microorganismelor, acestea au o radiosensibilitate diferita care se poate aprecia in functie de valoarea D10 (doza absorbita care produce distrugerea a 90% din populatia initiala).

Pentru conservarea unor produse alimentare cat si in alte scopuri de inactivare a microorganismelor, se pot aplica urmatoarele tratamente:

Radapertizarea - aplicarea unei doze de iradiere suficiente pentru a reduce numarul sau activitatea microorganismelor vii la limite care nu pot fi decelate prin nici o metoda microbiologica. Se realizeaza la doze cuprinse intre 20 si 50 kGy (1 Gray corespunde la absorbtia unei energii de 1 joule / kg de substanta). Radicizarea - aplicarea unei doze suficiente pentru ca numarul de microorganisme patogene nesporulate sa se reduca astfel incat sa nu mai poate fi detectate prin analize microbiologice standardizate. Dozele trebuie sa fie egale sau mai mici de 10 kGy. Radurizarea - aplicarea unei doze de radiatii ionizante care nu modifica produsul si reduce sensibil numarul de microorganisme, in scopul prelungirii termenului de valabilitate al produsului alimentar.