Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS 2 plăci 192 72396 96 HBe Ag - 96 HBe Ab Trusă de detecţie imunoenzimatică a antigenului HBe şi a anticorpilor anti-HBe

883599 - 2014/01

2 [RO]

CUPRINS

1 - DESTINAŢIA TRUSEI 2 - VALOAREA CLINICĂ 3 - PRINCIPIUL TESTĂRII 4 - COMPONENTELE TRUSEI 5 - MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ 6 - PRECAUŢII 7 - MĂSURI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII 8 - RECONSTITUIREA REACTIVILOR 9 - VALABILITATE - PĂSTRARE 10 - PROBELE BIOLOGICE 11 - METODA DE LUCRU 12 - CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR 13 - VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR 14 - PERFORMANŢELE TESTULUI 15 - BIBLIOGRAFIE

3 [RO]

1 - DESTINAŢIA TRUSEI Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS este o trusă concepută pentru determinarea calitativă printr-un test imunoenzimatic în ser sau plasmă umane a antigenului e al virusului hepatitei B (AgHBe), sau a anticorpilor specifici de antigenul e al virusului hepatitei B (Anti-HBe). 2 - VALOAREA CLINICĂ Prezenţa AgHBe reflectă în general statutul de replicare virală activă la o persoană, indicând şi potenţialul infecţios al unei probe de ser. AgHBe apare timpuriu în infecţia cu virusul hepatitei B, iar persistenţa sa (peste o lună) semnifică risc crescut de boală hepatică prin replicare virală. Apariţia anticorpilor dirijaţi împotriva AgHBe indică scăderea replicării virale şi este, în general, un factor de pronostic favorabil pentru evoluţia clinică. 3 - PRINCIPIUL TESTĂRII a) Determinarea antigenului HBe Detecţia AgHBe se bazează pe o reacţie imunoenzimatică de tip “sandviş” în 2 etape, ce foloseşte anticorpi anti-HBe de provenienţă umană şi o pereche de anticorpi monoclonali anti-HBe de şoarece (mab 1 şi mab 2), cu specificitate faţă de epitopi diferiţi, şi marcaţi cu peroxidază. Faza solidă este alcătuită din barete de polistiren a câte 8 godeuri sensibilizate cu anticorpi de om anti-HBe. Testarea cuprinde următoarele etape: 1. Incubarea controalelor şi a probelor de cercetat cu anticorpii anti-HBe de pe faza solidă. 2. Spălare, apoi incubarea complexelor imobilizate cu anticorpii monoclonali marcaţi cu

peroxidază. 3. Eliminarea prin spălare a conjugatului liber (în exces), apoi adăugarea substratului

pentru dezvoltarea activităţii enzimatice legată la faza solidă. 4. Stoparea reacţiei de dezvoltare a culorii, citirea absorbţiilor la 492/620 nm, apoi

interpretarea rezultatelor. b) Determinarea anticorpilor anti-HBe Pentru detecţia anti-HBe, se foloseşte aceeaşi fază solidă ca şi la detecţia AgHBe. Testul se bazează pe competiţia dintre anticorpii imobilizaţi şi anticorpii prezenţi în probele cercetate, pentru o cantitate limitată de AgHBe folosită ca agent de neutralizare. Detecţia se realizează apoi prin intermediul unui nou amestec de anticorpi monoclonali (mab 1 şi mab 2) marcaţi cu peroxidază. Testarea cuprinde următoarele etape: 1. lncubarea controalelor şi a probelor de cercetat cu anticorpii anti-HBe de pe faza solidă şi cu agentul de neutralizare.

2. Spălare, apoi incubarea complexelor imobilizate cu anticorpi monoclonali marcaţi cu peroxidază.

3. Eliminarea prin spălare a conjugatului liber (în exces), apoi revelarea activităţii enzimatice legate la faza solidă, prin adăugarea substratului.

4. Stoparea reacţiei de dezvoltare a culorii, citirea absorbţiilor la 492/620 nm şi interpretarea rezultatelor.

4 [RO]

4 - COMPONENTELE TRUSEI Toţi reactivii sunt destinaţi exclusiv diagnosticului in vitro. Reactivii din trusă sunt suficienţi pentru 2 x 96 de determinări în 1-12 serii de lucru independente, conform următoarelor combinaţii: • fie 96 de determinări de AgHBe şi 96 de determinări de anti-HBe • fie 2 x 48 de determinări de AgHBe concomitent cu 2 x 48 de determinări de anti-HBe.

Marcaj Natura Reactivului Prezentare 72396

R1 Microplate Microplacă 12 barete a câte 8 godeuri sensibilizate cu anticorpi anti-HBe din plasmă umană AgHBs pozitivă, inactivată

2 microplăci

R2 Concentrated washing solution (20X)

Solutie de spălare concentrată (20X) Tampon Tris NaCl, pH 7,4 Conservant: ProClin™ 300 (0,04%)

1 flacon 235 ml

R3 Negative control Control negativ Comun atât testului AgHBe cât şi anti-HBe: Ser uman, negativ pentru AgHBs şi pentru anticorpii anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Agent de conservare: azidă de sodiu < 0,1%

1 flacon 8 ml

R4 HBe Ab positive control

Ser de control Anti-HBe positiv Plasmă umană defibrinată anti-HBe pozitivă, potenţial AgHBs pozitivă, dar anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV negativă, inactivată Agent de conservare: azidă de sodiu < 0,1%

1 flacon 1,5 ml

R5 HBe Ag positive control

Ser de control AgHBe positiv Plasmă umană defibrinată AgHBe şi AgHBs pozitivă, negativă pentru anticorpi anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV, inactivată Conservant: azidă de sodiu < 0,1%

1 flacon 1,5 ml

R6 Neutralizing HBe Ag Antigen HBe de neutralizare Plasmă umană defibrinată AgHBe şi AgHBs pozitivă, negativă pentru anticorpii anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV, inactivată Agent de conservare : azidă de sodiu < 0,1%

1 flacon 8 ml

R7a Concentrated anti HBe conjugate

Conjugat pentru testarea Anti-HBe, concentrat (5X) O pereche de anticorpi monoclonali anti-HBe (mab1 şi mab2)* marcaţi cu peroxidază Conservant: ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 3 ml

R7b Concentrated Ag HBe conjugate

Conjugat pentru testarea AgHBe, concentrat (5X) O pereche de anticorpi monoclonali anti-HBe (mab1 şi mab2)* marcaţi cu peroxidază Conservant: ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 3 ml

R8 Substrate buffer Tampon substrat pentru peroxidază Soluţie de acid citric şi acetat de sodiu pH 4,0 ce conţine H2O2 (0,015 %) şi DMSO (4%)

1 flacon 60 ml

R9 Chromogen: TMB solution (11X)

Cromogen Soluţie de tetrametil benzidină (TMB)

1 flacon 5 ml

R10 Stopping solution Reactiv de stopare Soluţie de acid sulfuric 1N

1 flacon 28 ml

Flacon gol pentru reactivul R2 diluat 1 flacon 25 ml

(*) Proporţia Mab 1/Mab 2 este diferită în conjugatul R7a faţă de conjugatul R7b. Nu

schimbaţi cele 2 conjugate între ele!

5 [RO]

5 - MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ • Apa distilată sau complet deionizată • Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu • Hârtie de filtru sau şervetele absorbante • Mănuşi de unică folosinţă • Eprubete de polistiren de 12 x 75 mm, de unică folosinţă • Pipete manuale sau semiautomate, reglabile sau fixe, cu calibre de 50 µl, 100 µl, 200 µl şi 1 ml.

• Cilindri gradaţi de 10 ml, 50 ml, 100 ml şi 1000 ml. • Agitator tip vortex • Container de deşeuri contaminate • Spălător de microplăci automat*, semiautomat*, sau manual • Baie de apă termostatată reglată la 40 ± 1°C, sau incubator de microplăci echivalent* • Cititor de microplăci prevăzut cu filtre de 492 şi 620 nm*. (*) Vă rugăm să contactaţi Bio-Rad pentru detalii privind echipamentele recomandate de

serviciul tehnic pentru efectuarea testării. 6 - PRECAUŢII Veridicitatea rezultatelor depinde de aplicarea corectă a următoarelor Bune Practici de Laborator : • Nu amestecaţi reactivi din loturi diferite în aceeaşi rundă de testare. REMARCĂ : Pentru soluţia de spălare (R2, etichetă de identificare: 20X, scris cu

caractere de culoare verde), tamponul substrat pentru peroxidază (R8, etichetă de identificare: TMB buf., scris cu albastru), cromogen (R9, etichetă de identificare: TMB 11X, scris cu mov) şi soluţia de stopare (R10, etichetă de identificare : 1N, scris cu caractere de culoare roşie), este permisă folosirea altor loturi decât acelea din trusă, cu condiţia să se folosească un singur lot din reactivii menţionaţi în aceeaşi serie de lucru. Aceşti reactivi se pot folosi şi în combinaţie cu alte truse Bio-Rad. În plus, soluţia de spălare (R2, etichetă de identificare: 20X, scris cu verde) se poate amesteca cu celelalte 2 soluţii de spălare incluse în diferite truse de reactivi Bio-Rad (R2, etichete de identificare: 10X scris cu albastru sau 10X scris cu portocaliu), dacă sunt reconstituite corect şi cu condiţia ca în aceeaşi serie de testare să se folosească numai un singur amestec. Vă rugăm să contactaţi Bio-Rad pentru mai multe detalii.

• Denumirea testului, ca şi numărul de identificare dedicat acestuia sunt scrise pe cadrul suport al fiecărei plăcuţe de microtitrare. Numărul de identificare specific mai apare şi pe fiecare baretă detaşabilă.

Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS : Număr ID specific = 56 Verificaţi numărul de identificare înainte de fiecare utilizare. Dacă numărul de identificare

lipseşte sau diferă de cel menţionat, bareta respectivă NU trebuie folosită. • Nu folosiţi reactivi expiraţi • Înainte de utilizare este necesar să echilibraţi toţi reactivii la temperatura camerei timp de

30 minute, cu excepţia tamponului diluat de spălare R2 care necesită minim 1 oră. • Reconstituiţi reactivii cu multă atenţie, evitând contaminarea • Nu efectuaţi testarea în atmosferă cu vapori reactivi (acizi, alcalini, aldehidici) sau cu

praf, deoarece acestea pot afecta activitatea enzimatică a conjugatelor. • Folosiţi sticlărie foarte curată, spălată temeinic şi clătită bine cu apă deionizată, sau

recipiente de unică întrebuinţare • Nu lăsaţi plăcuţa să se usuce între sfârşitul etapelor de spălare şi pipetarea următorului

reactiv • Folosiţi vârfuri de pipete de unică întrebuinţare, schimbând vârful pentru fiecare probă • Spălarea godeurilor este o etapă critică în procedeul de lucru : respectaţi numărul de

cicluri de spălare recomandat şi asiguraţi-vă că toate godeurile au fost bine umplute şi

6 [RO]

apoi golite complet. Tehnica de spălare aplicată incorect poate produce rezultate eronate.

• Nu folosiţi în nici o circumstanţă acelaşi recipient pentru distribuţia conjugatului şi a soluţiei de dezvoltare a culorii

• Verificaţi acurateţea de pipetare şi operarea corectă a pipetelor şi a celorlalte echipamente folosite la distribuţia soluţiilor

• Nu modificaţi protocolul de testare • Soluţia de dezvoltare a culorii (tamponul substrat + cromogen) trebuie să fie de culoare

roz. Modificarea acestei culori în interval de câteva minute de la reconstituire indică alterarea reactivului, care nu trebuie folosit şi trebuie înlocuit. Prepararea soluţiei de developare se poate face într-un recipient (sau tăviţă rezervor) de plastic de unică întrebuinţare sau într-un recipient de sticlă prespălat cu HCl 1N, clătit temeinic cu apă distilată şi perfect uscat. Acest reactiv trebuie păstrat la întuneric.

7 - MĂSURI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII Toţi reactivii din trusă sunt destinaţi exclusiv pentru diagnostic in vitro. • Manipularea reactivilor şi a probelor impune purtarea mănuşilor de protecţie de unică

folosinţă şi spălarea mâinilor după fiecare manipulare. • Nu pipetaţi niciodată cu gura. • Materialul de provenienţă umană folosit la prepararea controlului negativ R3 a fost testat şi găsit nereactiv pentru antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (AgHBs), ca şi pentru anticorpii dirijaţi împotriva virusurilor imunodeficienţei umane dobândite (anti- HIV-1 şi anti-HIV-2).

• Materialul de provenienţă umană folosit la prepararea plăcutei de microtitrare (R1) a fost testat şi găsit nereactiv pentru anticorpii dirijaţi împotriva virusurilor imunodeficienţei umane dobândite (anti-HIV-1 şi anti-HIV-2). Acest material este reactiv pentru antigenul de suprafaţa al virusului hepatitei B (AgHBs). Materialul este inactivat fotochimic.

• Materialele de provenienţă umană folosite la prepararea martorul pozitiv R4 (ser control anti-HBe pozitiv), a controlul pozitiv R5 (ser control AgHBe pozitiv) şi a reactivului R6 (AgHBe de neutralizare) au fost testate şi găsite nereactive pentru anticorpii dirijaţi împotriva virusurilor imunodeficienţei umane dobândite (anti-HIV-1 şi anti-HIV-2) şi anticorpii specifici de virusul hepatitei C (anti-HCV). R5 şi R6 sunt reactive pentru antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (AgHBs), iar R4 este potenţial reactiv pentru AgHBs. Aceşti reactivi sunt inactivaţi prin procedee fotochimice.

• Deoarece nici o metodă de testare cunoscută nu poate garanta absolut absenţa agenţilor infecţioşi, vă rugăm să manipulaţi reactivii şi probele pacienţilor ca materiale capabile să transmită boli infecţioase.

• Orice echipament ce vine în contact direct cu probele şi reactivii, precum şi cu soluţiile de spălare colectate după utilizare, trebuie considerate materiale contaminate biologic şi tratate ca atare.

• Evitaţi stropirea cu probe sau soluţii care conţin probe. • Stropii trebuie curăţaţi cu soluţie de clor menajer, la concentraţie finală de 10% hipoclorit

de sodiu. În caz de stropire cu soluţii acide, neutralizaţi mai întâi cu bicarbonat de sodiu şi apoi uscaţi folosind hârtie absorbantă. Materialele folosite la decontaminare se aruncă în containerul cu deşeuri contaminate.

• Probele şi reactivii de provenienţă umană ca şi materialele şi produsele contaminate trebuie aruncate numai după decontaminare. Decontaminarea se poate face în două moduri :

- Fie prin imersie în clor (concentraţie finală de hipoclorit de sodiu de 5%, adică 1 volum de clor la 10 volume de apă sau lichid contaminat), timp de 30 de minute.

- Fie prin autoclavare timp de minim 2 ore la 121ºC. Cea mai bună metodă de inactivare a virusurilor HBV şi HIV este autoclavarea.

7 [RO]

NU INTRODUCETI ÎN AUTOCLAVĂ SOLUŢII CE CONŢIN HIPOCLORIT DE SODIU. • Nu uitaţi ca înainte de a arunca la canal (chiuvetă) soluţiile sau deşeurile de spălare sau

orice alt lichid ce conţine probe biologice să le neutralizaţi şi/sau să le autoclavaţi. • La cerere, aveţi la dispoziţie fişele de biosecuritate (MSDS). • Chimicalele trebuie manipulate şi evacuate în conformitate cu Bunele Practici de

Laborator. • Evitaţi contactul tamponului substrat, cromogenului şi al soluţiei de stopare cu pielea sau

mucoasele (risc de intoxicaţii, iritaţie sau arsuri). • Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente

chimice din acest kit de test, vă rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.

8 - RECONSTITUIREA REACTIVILOR NOTĂ: Înainte de utilizare aduceţi reactivii la temperatura camerei (18-30ºC) Microplaca (R1) Fiecare support cadru care conţine 12 benzi este împachetat într-o pungă sigilată din folie de aluminiu. Tăiaţi punga cu ajutorul foarfecelor sau al unui scaplel la 0,5 - 1 cm deasupra închiderii etanşe. Deschideţi punga şi scoateţi cadrul. Puneţi înapoi în pungă benzile neutilizate. Închideţi la loc punga cu atenţie şi depozitaţi-o la o temperatură de +2-8°C. Soluţia de spălare concentrată (R2) Diluaţi soluţia 1 : 20 cu apă distilată ca să obţineţi soluţia de spălare gata de lucru. Omogenizaţi. Pentru 1 baretă preparaţi 75 ml soluţie de spălare gata de utilizare (1x). Conjugat Anti HBe concentrat (R7a) Diluaţi reactivul R7a în proporţie de 1:5 în soluţia R2 de lucru preparată, în funcţie de numărul de barete necesare la testare:

Număr de barete de utilizat

Volum de soluţie R7a (ml)

Se completează până la (ml)

cu soluţie R2 preparată

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

AMESTECAŢI ! Conjugatul R7a se poate utiliza şi ca atare, fără diluare prealabilă, respectând procedeul următor: se pipetează în godeuri mai întâi 80 µl de soluţie de spălare diluată (R2) şi apoi 20 µl de Conjugat Anti-HBe R7a concentrat 5X. Se amestecă bine direct în godeu.

8 [RO]

Conjugat Ag HBe concentrat (R7b) Folosiţi aceeaşi schemă de diluţie ca şi la conjugatul R7a Soluţia de dezvoltare a culorii (R8+R9) Diluaţi reactivul (R9) în proporţie de 1:11 folosind reactivul R8 (exemplu : 1 ml reactiv R9 în 10 ml tampon substrat peroxidază R8). Amestecaţi. Pentru 1-10 barete sunt necesari şi suficienţi 10 ml. 9 - VALABILITATE - PĂSTRARE Trusa se va păstra la +2/+8ºC. Depozitat la această temperatură, fiecare reactiv din trusă poate fi folosit până la data de expirare menţionată pe cutie (cu excepţia instrucţiunilor specifice). R1 : După deschiderea pungii sub vid, benzile păstrate la +2-8°c în punga lor originală, îchisă la loc cu grijă, pot fi itilizate timp de 1 lună. R2 : Soluţia de spălare diluată se poate păstra la +2-30°C timp de 2 săptămâni. Soluţia de spălare concentrată (R2) se poate păstra la +2-30ºC. R7a : Conjugatul diluat pentru testarea anti-HBe se poate păstra timp de 8 ore la temperatura camerei (18-30ºC). Conjugatul diluat trebuie protejat de lumină la temperatura camerei (18-30ºC). R7b : Conjugatul diluat pentru testarea AgHBe se poate păstra timp de 8 ore la temperatura camerei (18-30ºC). Conjugatul diluat trebuie protejat de lumină la temperatura camerei (18-30ºC). R8+R9 : După reconstituire, reactivul păstrat la întuneric se poate folosi timp de 6 ore la temperatura camerei (18-30ºC). 10 - PROBELE BIOLOGICE Prelevaţi probele de sânge în conformitate cu practicile uzuale. Testarea va fi executată pe seruri sau plasmă nediluate (plasma se recoltează pe anticoagulante pe bază de EDTA, citrat, ACD). Separaţi serul de cheag sau plasma de hematii cât mai curând posibil. Probele ce conţin agregate trebuie centrifugate înainte de testare. Agregatele de fibrină sau particulele în suspensie pot produce rezultate fals pozitive. Probele vor fi păstrate la +2/+8ºC daca urmează să fie testate în decurs de 7 zile, în caz contrar vor fi congelate la -20ºC. Nu încălziți probele. Evitaţi congelarea / decongelarea în mod repetat. Probele expediate trebuie ambalate în conformitate cu reglementările în vigoare privind transportul agenţilor etiologici. Transportaţi-le de preferinţă în stare congelată. NU TESTAŢI SERURI CONTAMINATE, HIPERLIPEMICE SAU INTENS HEMOLIZATE. REMARCĂ: Probele cu conţinut de până la 100mg/L de bilirubină, probele lipemice cu până la 36 g/L echivalent de trioleină, ca şi probele hemolizate ce nu depăşesc 2,5 mg/ml de hemoglobină, nu afectează calitatea rezultatelor. S-a observat scăderea rapoartelor de reactivitate la probele negative în care s-au introdus 45 mg/ml albumină pentru a mima hiperproteinemia. 11 - METODA DE LUCRU Dozările AgHBe şi anti-HBe pot fi efectuate simultan în aceeaşi placă. Daca doriţi să adoptaţi acest mod de organizare, vă sugerăm următoarea schemă de pipetare: • Folosiţi pentru testarea anti-HBe baretele de la 1 la 6 • Folosiţi pentru testarea AgHBe baretele de la 7 la 12

9 [RO]

a) Procedeul de testare pentru anti-HBe: 1. Pregătiţi soluţia de spălare de lucru. 2. Scoateţi rama şi baretele necesare din punga protectoare. Restul de barete se

reintroduc în ambalajul original, se resigilează şi se reintroduc în frigider. 3. Distribuiţi în godeurile: • A1,B1,C1: 100 µl de control negativ (R3) • D1: 100 µl de control pozitiv (R4) • E1, F1, G1: 100 µl din serurile necunoscute În funcţie de sistemul utilizat, este posibilă modificarea poziţiei controalelor sau a

ordinii de pipetare. NOTĂ: Se observă o diferenţă netă de culoare între un godeu gol (incolor) şi un godeu

în care s-a pipetat o probă (galben). Este posibil să se verifice prezenţa probei în godeu prin citire la spectrofotometru la 490 nm (monocromatic). Consultaţi capitolul 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

4. Adăugaţi rapid câte 50 µl de antigen HBe neutralizant R6 în fiecare godeu. Omogenizaţi.

Acoperiţi cu folie adezivă şi incubaţi 3 ore ± 10 minute la 37ºC ± 1ºC NOTĂ: Pipetarea antigenului HBe neutralizant (R6) de culoare roz poate fi controlată

vizual în această etapă de manipulare. Este posibil să se verifice prezenţa antigenului HBe neutralizant în godeuri prin citire la spectrofotometru la 490 nm (monocromatic). Consultaţi capitolul 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

5. Preparaţi soluţia diluată de conjugat R7a înainte de terminarea etapei 4. 6. Îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul fiecărui godeu într-un container pentru

deşeuri contaminate, apoi spălaţi de 4 ori. 7. Pipetaţi rapid 100 µl de soluţie de conjugat R7a diluat în fiecare godeu (a se vedea

capitolul 8 : RECONSTITUIREA REACTIVILOR), SAU folosiţi conjugatul R7a ca atare, nediluat, astfel : pipetaţi mai întâi cate 80 µl de soluţie de spălare diluată (R2) în fiecare godeu şi apoi câte 20 µl din conjugatul anti-HBe R7a concentrat 5X. Omogenizaţi bine. Acoperiţi placa cu folie adezivă şi incubaţi 30 minute la 37ºC ± 1ºC (minim 25 minute, maxim 40 minute). Îndepărtaţi folia adezivă la terminarea incubării, aspiraţi conţinutul fiecărui godeu în containerul de deşeuri contaminate şi apoi spălaţi de 5 ori.

NOTĂ: Pipetarea conjugatului R7a diluat de culoare violet poate fi controlată vizual în această etapă de manipulare. Este posibil să se verifice prezenţa conjugatului R7a diluat în godeuri prin citire la spectrofotometru la 620 nm (monocromatic). Consultaţi capitolul 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

8. Preparaţi soluţia de dezvoltare a culorii (R8+R9) chiar înainte de utilizare. Consultaţi capitolul 8 : RECONSTITUIREA REACTIVILOR).

9. In fiecare godeu se pipetează rapid câte 80 µl din soluţia de revelare R8+R9. Se incubează la întuneric timp de 30 minute ± 5 minute la temperatura camerei (+18/+30ºC).

NOTĂ: Pipetarea soluţiei de developare de culoare roz poate fi controlată vizual în această etapă de manipulare. Este o diferenţă netă de culoare între un godeu gol (incolor) şi un godeu în care s-a pipetat soluţia de culoare roz. Consultaţi capitolul 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

10. Distribuiţi rapid câte 100 µl soluţie de stopare (R10) în fiecare godeu. NOTĂ: Pipetarea soluţiei de stopare incoloră poate fi controlată vizual în această

etapă de manipulare. După pipetarea soluţiei de stopare, substratul de culoare roz

10 [RO]

devineincolor în godeurile ce conţin probe negative şi virează de la albastru la galben în godeurile ce conţin probe pozitive.

11. Ştergeţi cu grijă fundul plăcii. Citiţi absorbţiile godeurilor la 450/620 nm cu ajutorul unui cititor de placi, în interval de 30 minute de la stoparea reacţiei, dar nu mai devreme de cel puţin 4 minute de la adăugarea soluţiei de stopare.

b) Procedeul de testare pentru AgHBe 1. Pregătiţi soluţia de spălare de lucru. 2. Scoateţi rama şi baretele necesare din punga protectoare. Restul de barete se

reintroduc în ambalaj, se resigilează şi se reintroduc în frigider. 3. Distribuiţi în godeurile: • A1,B1,C1 : 100 µl de control negativ (R3) • D1 : 100 µl de control pozitiv (R5) • E1,F1,G1 : 100 µl din probele de testat În funcţie de sistemul utilizat, este posibilă modificarea poziţiei controalelor sau a

ordinii de pipetare. NOTĂ: Se observă o diferenţă netă de coloraţie între un godeu gol (incolor) şi unul în

care s-a pipetat o probă (de culoare galbenă). Este posibil să se verifice prezenţa probei în godeu prin citire spectrofotometrică la 490 nm (monocromatic). Consultaţi secţiunea 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

4. Acoperiţi cu folie adezivă şi incubaţi 3 ore ± 10 minute la 37°C ± 1°C. 5. Preparaţi soluţia de conjugat R7b, înainte de încheierea etapei 4. 6. Îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul fiecărui godeu într-un container pentru

deşeuri contaminate şi apoi spălaţi de 4 ori. 7. Pipetaţi rapid 100 µl de soluţie de conjugat R7b diluată în fiecare godeu, sau folosiţi

conjugatul ca atare, nediluat, după procedeul următor: pipetaţi mai întâi câte 80 µl de soluţie de spălare diluată (R2) în fiecare godeu şi apoi câte 20 µl de conjugat Anti-HBe R7b (5X). Omogenizaţi bine.

Acoperiţi placa cu folie adezivă şi incubaţi 30 minute la 37°C ± 1°C (minim 25 minute, maxim 40 minute). Îndepărtaţi folia adezivă la sfârşitul perioadei de incubare, aspiraţi conţinutul fiecărui godeu în containerul pentru deşeuri lichide şi apoi spălaţi de 5 ori. NOTĂ: Pipetarea soluţiei diluate de conjugat R7b de culoare turcoaz se poate controla vizual în această etapă de manipulare. Este posibilă verificarea prezenţei conjugatului diluat R7b în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (monocromatic). Consultaţi secţiunea 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

8. Chiar înainte de utilizare preparaţi soluţia de dezvoltare a culorii (R8 + R9) 9. Pipetaţi rapid în fiecare godeu câte 80 µl din soluţia de revelare (R8+R9). Introduceţi

placa la întuneric 30 minute ± 5 la temperatura camerei (+18/+30°C). NOTĂ: Pipetarea soluţiei de dezvoltare a culorii, de culoare roz, poate fi controlată

vizual în această etapă de manipulare. Se observă o diferenţă clară de culoare între un godeu gol (incolor) şi unul în care s-a pipetat soluţia de revelare (de culoare roz). Consultaţi secţiunea 13: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR.

10. Adăugaţi rapid câte 100 µl de soluţie de stopare (R10) în fiecare godeu. NOTĂ: Pipetarea soluţiei de stopare incoloră se poate controla vizual în această etapă

de manipulare. După adăugarea soluţiei de stopare, substratul de culoare roz din godeurile negative devine incolor, iar substratul de culoare albastră din godeurile pozitive devine galben.

11 [RO]

11. Ştergeţi cu atenţie fundul godeurilor. Citiţi densitatea optică (absorbţia) la 450/620 nm folosind un cititor de microplăci, la cel puţin 4 minute de la stoparea reacţiei, dar nu mai târziu de 30 de minute după stoparea reacţiei.

c) Procedeul de testare simultană a Anti-HBe şi a AgHBe (în aceeaşi placă): Procedeul are aceleaşi etape ca acelea explicate anterior. Singurul aspect diferit este schema de pipetare în placă, astfel: • Testarea Anti-HBe: baretele de la 1 la 6 • Testarea AgHBe: baretele de la 7 la 12 12 - CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR a) Testarea Anti-HBe 1. Calculaţi media densităţilor optice (absorbţiilor) obţinute la controalele negative:

Medie DO R3 Exemplu : Controalele negative R3 DO 1 1,607 2 1,410 3 1,552 Total DO = 4,569 Media DO R3 = Total DO / 3 = 4,569 / 3 = 1,523 Aveţi posibilitatea să eliminaţi o singură valoare de absorbţie R3 dacă deviază cu mai mult de 25% faţă de media calculată anterior. Refaceţi apoi calculul mediei folosind cele 2 valori valide rămase. 2. Calculaţi valoarea prag (cut-off, CO) Pentru fiecare microplacă, valoarea CO se calculează după formula: Valoarea prag = CO = Media DO R3 x 0,4 Exemplu: Media DO R3 = 1,523 CO = 1,523 x 0,4 = 0,609 3. Validarea testării anti-HBe Media DO R3 > 0,900 DO R4 < 0,150 4. Calculul rapoartelor de reactivitate, R Pentru fiecare probă de testat, calculaţi raportul de reactivitate R: R = DOProbă/CO 5. Interpretarea rezultatelor Probele vor fi interpretate ca • pozitive, dacă raportul de reactivitate este mai mic sau egal cu 0,9 (R ≤ 0,9) • negative, dacă raportul de reactivitate este mai mare decât 1,1 (R > 1,1). Totuşi, pentru probele ale căror rapoarte se situează în intervalul 0,9 - 1,1 (0,9 < R ≤ 1,1), se recomandă repetarea testării anti-HBe pe un nou eşantion prelevat ulterior. De asemenea, se recomandă retestarea în dublu a eşantioanelor iniţial pozitive. Dacă după repetarea testării cel puţin una din valorile obţinute este pozitivă, eşantionul se interpretează în final ca pozitiv.

12 [RO]

b) Testarea AgHBe 1. Calculaţi media absorbţiilor (DO) controalelor negative : Medie DO R3 Exemplu : Control negativ R3 DO 1 0,023 2 0,022 3 0,026 Total DO = 0,071 Media DO R3 = Total DO / 3 = 0,071 / 3 = 0,024 Aveţi posibilitatea să eliminaţi o valoare de absorbţie R3, dacă deviază cu mai mult de 25% faţă de media calculată anterior. Refaceţi apoi calculul mediei folosind cele 2 valori valide rămase. 2. Calculaţi valoarea prag (cut-off, CO) Pentru fiecare placă, valoarea CO este egală cu: Valoare prag = CO = Media DO R3 + 0,025 Exemplu: Media DO R3 = 0,024 CO = 0,024+ 0,025 = 0,049 3. Validarea testării Ag HBe Media DO R3 < 0,060 DO R5 > 0,800 4. Calculaţi rapoartele de reactivitate, R Pentru fiecare probă testată, calculul R se face după formula: R = DOProbă/CO 5. Interpretarea rezultatelor Probele vor fi interpretate ca • pozitive, dacă raportul de reactivitate este mai mare sau egal cu 1 (R ≥ 1) • negative, dacă raportul de reactivitate este mai mic decât 1 (R < 1). Se recomandă retestarea în duplicat a eşantioanelor iniţial pozitive. Dacă după retestare cel puţin una din valorile R obţinute este pozitivă, eşantionul va fi clasificat ca pozitiv. 13 - VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRILOR 1 - TESTAREA Anti-HBe Verificarea pipetării probelor şi a martorilor Verificaţi prezenţa eşantioanelor şi a martorilor în godeuri prin citire la spectrofotometru la 490 nm. Fiecare godeu în care s-a pipetat probă trebuie să aibă DO mai mare decât 0,050. Verificarea pipetării Ag HBe de neutralizare (R6) Prezenţa antigenului HBe de neutralizare în godeuri se verifică prin citire spectrofotometrică la 490 nm şi calculul diferenţei dintre DO (delta DO = ∆ DO) ∆ DO = (DO490nm godeu cu probă/control + R6) – (DO490nm godeu numai cu probă sau martor). ∆ DO trebuie sa fie mai mare decât 0,150

13 [RO]

Verificarea prezenţei conjugatului pentru testarea Anti-HBe (R7a) Pipetarea conjugatului R7a în godeuri se verifică prin citire spectrofotometrică la 620 nm. Valoarea DO a fiecărui godeu trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,070 şi mai mică sau egală cu 0,200 (0,070 ≤ DO ≤ 0,200). Verificarea pipetării soluţiei de dezvoltare a culorii (R8+R9) Prezenţa soluţiei de dezvoltare a culorii se verifică prin citire la spectrofotometru la 490 nm. În fiecare godeu, DO trebuie să fie mai mare de 0,100. La inspecţia vizuală, se observă culoarea roz după adăugarea soluţiei de revelare a culorii. 2 - TESTAREA AgHBe Verificarea pipetării probelor şi a martorilor Verificaţi prezenţa eşantioanelor şi a martorilor în godeuri prin citire la spectrofotometru la 490 nm. Fiecare godeu în care s-a pipetat probă trebuie să aibă DO mai mare decât 0,050. Verificarea pipetării conjugatului AgHBe (R7b) Pipetarea conjugatului diluat R7b se verifică prin citire spectrofotometrică la 620 nm. DO trebuie să fie mai mare de 0,210. Verificarea pipetării soluţiei de dezvoltare a culorii (R8 + R9) Prezenţa soluţiei de dezvoltare a culorii se verifică prin citire la spectrofotometru la 490 nm. DO trebuie să fie mai mare de 0,100. 14 - PERFORMANŢELE TESTULUI Performanţele testului Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS, conchise în cele ce urmează, au fost evaluate în 2 centre pe eşantioane prelevate de la donatori de sânge, pacienţi internaţi şi paneluri comerciale. 1 - Testarea AgHBe Specificitatea Specificitatea studiată pe un grup de 200 donatori de sânge neselecţionaţi este de 100% [98,51% - 100%], (interval de confidenţă, IC 95). In plus, specificitatea a mai fost evaluată şi cu probe recoltate de la pacienţi internaţi, găsindu-se de 100% [99,28% – 100%], IC 95 (416/416 probe). S-au testat şi 195 de probe provenite de la bolnavi cu alte patologii sau stări fără legătură cu hepatita B (gravide, probe pozitive pentru factori reumatoizi, probe cu anticorpi antinucleari sau anticorpi anti-Ig şoarece, sau alte infecţii virale sau bacteriene), stabilindu- se o specificitate de 99,49% [97,18% - 99,99%] (IC 95, pe baza a 194 probe găsite negative din totalul de 195). Sensibilitatea analitică Limita de sensibilitate a testului evaluată pe baza Standardului PEI este de 0,64 UI/ml [0,49 – 0,84] (IC 95).

14 [RO]

Sensibilitatea clinică Sensibilitatea clinică a fost testată pe 203 probe pozitive de urmărire prelevate de la pacienţi cu infecţii HBV cronice şi pe paneluri comerciale de seroconversie. Per ansamblu, sensibilitatea clinică este de 99,51% [97,29% - 99,99%] (IC 95, adică 202/203 probe). Reproductibilitatea testării Reproductibilitatea testului Monolisa™ HBe Ag-Ab Plus (la testarea pentru AgHBe) a fost determinată prin analiza a 4 eşantioane: 1 negativ, 1 slab pozitiv, 1 pozitiv intermediar şi 1 pozitiv intens pentru AgHBe. Studiul intra-testare a fost efectuat prin analiza de 30 de ori a fiecărei probe în aceeaşi serie de lucru. Studiul inter-testări a fost realizat prin analiza fiecărei probe în dublu, de două ori pe zi, timp de 20 de zile. Rezultatele obţinute sunt după cum urmează: Tabel 1: Repetabilitatea intra-testare n = 30 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Media rapoartelor de reactivitate

0,356 5,29 27,24 45,56

Deviaţia standard (DS)

0,05 0,35 0,63 2,88

CV (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 Tabel 2: Reproductibilitatea inter-testări n = 80 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Media rapoartelor de reactivitate

0,51 8,19 27,33 46,35

Deviaţia standard

0,12 1,17 3,26 4,98

CV (%) 23,86 14,27 11,92 10,74 2 - Testarea Anti-HBe Specificitatea Specificitatea studiată la 200 de donatori de sânge neselecţionaţi este de 100% [98,51% – 100%], (IC 95). În plus, specificitatea evaluată pe 206 probe recoltate de la bolnavi este de 98,54% [95,80% – 99,70%], (IC 95, adică 203/206). S-au mai testat 198 pacienţi cu alte boli sau statut diferit de hepatita B (gravide, factor reumatoid, anticorpi antinucleari sau anti-Ig şoarece, sau alte infecţii virale sau bacteriene). Dintre aceştia, 3 au fost găsiţi pozitivi (2 probe cu HCV şi 1 probă cu factor reumatoid). Specificitatea determinată în această populaţie a fost de 98,48% [95,64% – 99,69%] (IC 95, adică 195 din 198 probe găsite negative). Aceste probe au fost retestate, iar proba cu factor reumatoid a fost găsită repetat reactivă. Cele 2 probe cu HCV au fost la retestare găsite fie negative, fie incerte. Sensibilitatea clinică Studiile de sensibilitate au fost efectuate pe 220 probe de urmărire de la bolnavi cu infecţie cronică cu HBV şi paneluri comerciale. Sensibilitatea a fost de 98,64% [96,07% – 99,72%] (IC 95, adică 217/220).

15 [RO]

Reproductibilitatea testării Reproductibilitatea testului Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS (la testarea anticorpilor anti-HBe) s-a determinat prin analiza a 4 probe, după cum urmează: 1 proba negativă, 1 probă slab pozitivă, 1 proba anti-HBe intens pozitivă şi 1 proba Anti-HBe intermediar pozitivă. Studiul intra-testare s-a evaluat prin analiza acestor 4 probe de 30 de ori în aceeaşi rundă de lucru. Studiul inter-testări a fost efectuat prin analiza celor 4 probe în dublu, timp de 20 de zile, în 2 serii de lucru pe zi. Rezultatele sunt prezentate în tabelele următoare: Tabel 1: Repetabilitatea intra-testare n = 30 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Media rapoartelor de reactivitate

3,15 0,69 0,42 0,03

Deviaţia standard (DS)

0,05 0,04 0,04 0,00

CV (%) 1,7 5,7 10,5 6,6 Tabel 2: Reproductibilitatea inter-testări n = 80 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Media rapoartelor de reactivitate

2,39 0,81 0,59 0,03

Deviaţia standard

0,23 0,077 0,09 0,01

CV (%) 9,6 9,5 14,5 39,3 15 - BIBLIOGRAFIE 1 - MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press.,

chap. 4: 47-76 2 - KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.;

SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with

type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) 15-19 3 - BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l'hépatite B en 1987.

Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; 9-12 4 - THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C.,

(1986) L'ADN du virus de l'hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison

avec l'antigène HBe et l'anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: 1219-1222 5 - LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l'hépatite B. Biologiste et praticien;

56; 13-22 6 - ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.;

SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis

B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), 293-297 7 - TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M.

(1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of

hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); 102 - 105

16 [RO]

17 [RO]

18 [RO]

19 [RO]

20 [RO]