lp 01. notiuni de baza metode de separare in analiza substantelor toxicologice

7/22/2019 Lp 01. Notiuni de Baza Metode de Separare in Analiza Substantelor Toxicologice

1/19

1

LP.1

NOTIUNI DE BAZA : METODE DE SEPARARE IN

ANALIZA SUBSTANTELOR TOXICOLOGICE

CLASIFICAREA SUBSTANTELOR TOXICE :

Functie de starea de agregare :toxici gazositoxici lichizitoxici solizi

Functie de provenienta(origine , natura): toxici mineralitoxici organici naturali vegetali

animalitoxici organici de semisinteza si sinteza

Ogier si Kohn-Abrestau clasificat toxicii functie de criteriul analitic, adica de modul incare sunt izolati din aer si/sau material biologic in vederea identificarii si dozarii lor :

a)toxici gazosi, care se izoleaza in general prin recoltare din aer , mai rar din materialbiologic (ex:CO , H2S , AsH3) ; marea majoritate sun anorganici.

b)toxici volatili- care se izoleaza prin distilare (au p.f.100C) din mediu acid sau bazic . In

aceasta grupa se incadreaza cea mai mare parte a toxicilor volatili;- care se izoleaza prin antrenare cu vapori de apa (aup.f. 100C) ex : fenol ,

nitrobenzen , anilina.Marea majoritate a toxiclor volatili sunt organici.

c)toxici minerali ficsi- care se izoleaza prin mineralizarea (distrugerea) materiei organice- care se izoleaza prin extractie apoasa , hidroalcoolica sau dializa (metode

blande pentru a nu-i denatura); exemple : nitriti , nitrati , cloruri , acizi corozivi , bazecaustice ; ei se izoleaza in portiunea C de organe (10% din proba pentru expertiza)

d)toxici organici ficsi (nevolatili)- care se izolaza din mediu acid (cei cu caracter slab acid sau neutru)- care se izoleaza din mediu bazic (cei cu caracter slab bazic)

In ambele cazuri extractia se face cu solventi organici nepolari (cloroform , eter) simai rar cu solventi organici slab polari .

Metodele de extractie folosite sunt :- extractia prin echilibrare (cu palnia de separare)- extractia exhaustiva (cu aparatul soxhlet)


2/19

2

Analiza toxicologica:

Totalul probelor recoltate pentru analiza se imparte in doua parti egale : o jumatate esteutilizata pentru analiza , cealalta jumatate este destinata contraanalizei sau a unor cercetari

suplimentare.Prima jumatate (destinata analizei) dupa maruntire este impartita in trei portiuni :

portiunea A (aprox.45%) se utilizeaza pentru cerectarea toxiclor volatili , iar reziduulramas dupa izolarea acestora prin distilare sau antrenare cu vapori de apa , se cerceteaza toxiciiminerali (izolati prin mineralizare)

portiunea B (aprox.45%) se utilizeaza pentru cercetarea toxicilor organici ficsi (carese izoleaza prin extractie cu solventi organici)

portiunea C (aprox.10%) se utilizeaza pentru cercetari speciale , la randul eiimartindu-se in doua portiuni: una pentru cercetarea cloroformului si a tiocianatilor

cealalta pentru cercetarea unor toxici minerali care pot scapamersului analizei generale (argint , plumb , bariu , zinc) si pentru cercetarea sarurilor minerale(clorati , nitriti , nitrati).

Analiza toxicologica comporta 4 etape :1.analiza preliminara2.izolarea substantelor toxice3.identificarea si determinarea cantitativa4.corelarea si interpretarea rezulatelor.

1.ANALIZA PRELIMINARA : precede analiza toxicologica propriu-zisa , nu are

caracter de certitudine . Foloseste hartii indicatoare , tuburi indicatoare , reactii chimice pehartie de filtru sau chiar in eprubeta.

2.METODE DE IZOLARE :

2.1.Izolarea toxicilor gazosiSe realizeaza de obicei in atmosfera (prelevarea unui volum de atmosfera viciata sau

barbotarea unui volum de aer printr-o solutie absorbanta sau trecerea peste un materialabsorbant) dar pentru unii toxici gazosi (CO , H2S , AsH3) este necesara cercetarea prezentei

lor in sange si urina.Variante de recoltare : recoltarea in vase vidate (daca toxicul reactioneaza cu apa) saurecoltarea prin procedeul dezlocuirii de lichid (cand toxicul nu reactioneaza cu apa), recoltareain pipete de gaz prin procedeul dezlocuirii de aer si recoltarea prin procedeul de absorbtie prinvase absorbante.

2.2.Izolarea toxicilor volatiliTehnicile de izolare sunt aceleasi ca la toxicii gazosi ; se folosesc : distilarea sau


3/19

3

antrenarea cu vapori de apa (pentru toxicii volatili cu puncte de fierbere mai mari de 100 gradecelsius ex.fenol , anilina , benzen)

2.3.Izolarea toxicilor mineraliToxicii minerali se gasesc in diverse combinatii in materialul de analizat , de aceea se

deosebesc doua tipuri de operatii in analiza lor toxicologica : izolarea toxicilor minerali din combinatii nedisociabile (combinatii intre toxiciiminerali si constituentii normali ai organismului) se poate realiza numai dupa distrugerea(mineralizarea) prealabila a materiei organice;

izolarea toxicilor minerali din combinatii disociabile (in cazul sarurilor mineralede genul nitritilor , nitratilor , cloratilor , acizii minerali tari , bazele caustice si se folosescmetode ca extractia apoasa sau hidroalcoolica , macerarea , dializa).

Izolarea toxicilor minerali din combinatii nedisociabileDeoarece toxicii minerali contracteaza combinatii cu constituentii normali ai organismului

(de regula proteinele ) , caz in care proprietatile lor analitice sunt disimulate , pentru punerea inliberatate a toxicului sub forma ionica , in vederea caracterizarii lui ulterioare prin metodelechimiei analitice , se recurge la operatia de mineralizare (distrugere) . Prin distrugereea partiiorganice a materialului , metalele trec sub forma ionica , ceea ce justifica termenul demineralizare . Operatia se executa pe reziduul ramas din portiunea A de organe dupa izolareatoxiclor volatili.

Mineralizarea materiei organice poate fi realizata :- pe cale uscata (prin calcinare , directa sau cu adaos de oxidanti , cu carbonat

si azoatat de sodiu , in curent de oxigen);

- pe cale umeda (cu clor nascand sau cu acizi oxigenatiacid azotic , acidsulfuric).A.mineralizarea cu clor nascand:

A.1.metoda Fresenius-BaboPrincipiul metodei : distrugerea suportului organic de care este legat toxicul mineral se

face sub actiunea clorului , rezultat in reactia dintre clorat de potasiu si acid clorhidric , la cald(70 C).

A.2.metoda OgierModificarea consta intr-un curent de acid clorhidric gazos peste materialul de analizat

amestecat cu clorat de potasiu (KClO3).Metoda are avantajul ca reduce considerabil timpul de

analiza.A.3.Metoda Stepanov :Principiul metodei consta de asemenea in mineralizarea cu clor nascand . Organele

maruntite se aduc intr-un balon Kjeldhal , inchis cu dop de pluta sau de cauciuc , prin care treceun tub in forma de spirala , cu rol de refrigerent . Peste organele din balon se adauga acidclorhidric , apoi mici cantitati de clorat de potasiu.


4/19

4

B.Mineralizarea prin metoda sulfonitricaB.1.Metoda DenigesPrincipiul metodei : distrugerea suportului organic de care este legat toxicul mineral

se face sub actiunea unui amestec de acid azotic si acid sulfuric concentrat . Acidul sulfuricconcentrat are actiune deshidratanta si oxidanta (prin continutul de trioxid de sulf liber) . Acidul

azotic concentrat are actiune oxidanta , ca o consecinta a descompunerii progresive cu eliberarede oxigen.B.2.Metoda Denigesmodificata de Ioanidsi BorsMateria organica este dezagregata in prealabil cu acid azotic concentrat si apoi

lichidul rezultat se adauga picatura cu picatura intr-un amestec de acid sulfuric concentrat siacid azotic concentrat , adus la fierbere.

B.3.Metoda Stepanov este tot o metoda sulfonitrica de distrugere , sub actiuneaacidului sulfuric si a azotatului de amoniu.

2.4.Izolarea toxicilor organici nevolatili (ficsi)Sunt cercetati de obicei in mediu biologic si se izoleaza prin extractie cu solventi organici

nemiscibili cu apa . Extractia se realizeaza in mediu acid pentru toxicii cu caracter acid(acidularea se face cu acizi minerali-acid clorhidric , sulfuric , acizi organici-acid acetic , acidtartric , acid citric sau cu solutii tampon cu pH acid) sau in mediu bazic pentru toxicii cucaracter bazic (alcalinizarea se face cu hidroxizi alcalini , carbonati alcalini , solutii tampon de

pH bazic).Extracia este operaia prin care unul sau maimuli componeni ai unei faze (lichide sau

solide) sunt transferai ntr-o alt faz (lichid), nemiscibil sau parial miscibil, adus ncontact cu prima.

In funcie de starea de agregare a produsului din care se face extracia, sedeosebete:1. extracia solid lichid2. extracia lichid lichid;3. extracia gaz lichid.

Repartiia unei substane dizolvate n doua faze este dat de legea de distribuie a luiNernstce const n raportul concentraiilor la echilibru a substanei n cele dou fazelichide (ai b) nemiscibile ce este constant la o temperatur dat.

unde K este coeficientul de repartitie.

Extracia solid lichid

Extracia solid-lichid urmrete separarea unei substane organice ntr-un anumitsolvent n care componentul este solubil.

K = Ca/Cb


5/19

5

Fig.1 : Extractoare Soxhlet.

Pe scar larg se aplic extracia continu n aparatur special (extractoare Soxhlet) ncare, de obicei, solventul proaspt este furnizat prin fierberea extractului.

Extractorul Soxhlet se compune dintr-un balon, un corp de extracie i un refrigerentascendent , legate ntre ele. Materialul solid , mrunit n prealabil pentru ca solventul s vinncontact cu o suprafa ct mai mare, se aeaz n spaiul de extracie, fie introdus ntr-un cartuspecial de hrtie de filtru , fie vrsat direct nspaiul de extracie prevzut cu un fund de sticl

poroas . Faza extractoare (solventul) din balonul de fierbere distil printr-un tub lateral prevzut eventual cu o izolaie termica, iar vaporii condensai nrefrigerentul de reflux picurpeste materialul din cartu . Cnd spaiulde extracie se umple pn la nlimea stratului depreaplin , soluia cuextract trece prin sifonare n balonul de fierbere i procesul se repet.

Principalii factori care influeneaz o extracie solid lichid sunt:- solubilitatea solidului n solvent;- viteza de transfer a solidului n faz lichid.

Extracia lichid lichid

Aceast operaie are la baz diferena de solubilitate a componentului extras n unul saumai muli solveni nemiscibili sau parial miscibili ntre ei.


6/19

6

n laboratoare , extraciile se efectueaz prin agitareasoluiei cu solventul de extracien plnii de separare, caredatorit formei specifice ofer o suprafa de separaie mare

se fac prin agitarea soluiei cu solventul de extracie. Esterecomandat ca umplerea cu lichid a plniei de separare s nuse fac mai mult de din volumul su. Pentru o extracieeficient este necesar asigurarea unui contact optim ntrecele dou faze este necesar agitarea intens a plniei timpde 3-5 minute, dup care aceasta se las n repaus pn lasepararea complet a celor dou faze. n cazul apariiei deemulsii nu mai este recomandat agitarea, ci n acest caz estesuficientefectuarea unor micri circulare n plan orizontal.

Fig.2 : Palnia de separare.

Din timp n timp este necesar efectuarea aerisirii, prin inversarea poziiei plniei ideschiderea temporar a robinetului.Aceast operaie este absolut necesar mai ales ncazulsolvenilorextrem de volatili (eter etilic, eter de petrol etc.).

Dup separarea complet a celor dou faze, se scoate dopulde la partea superioar a

plniei i faza inferioar este separat cugrij ntr-un flacon Erlenmeyer.Faza apoas poate fi uor deosebit de faza organic nemiscibil pe baza densitilorcelordou faze (faza cu densitatea cea mai mare va constitui faza inferioar) . Atunci cnd limita deseparaie dintre cele dou faze se apropie de robinet, se reducemult viteza de separaie.

La final, pentru a se evita o eventual impurificare, faza superioar se toarn pringura plniei ntr-un alt flacon, faza organic se usuc utiliznd un agent de deshidratareconvenabil (Na2SO4 anh., CaCl2 anh., MgSO4 anh. etc.), iar ulterior se ndeprteazsolventul

prin distilare.

Metode de izolare a toxicilor organici nevolatili


7/19

7

1.Metoda Stas-Otto-Ogier

Etape : digestia metrialului biologic cu alcool in mediu acid (pH 4-5 creat cu acidtartric) ;

filtrare si indepartarea alcoolului prin distilare in vid , la 50 C ;

purificarea reziduului apos prin extractie cu eter de petrol ; eterul de petrolextrage grasimi , unele substante volatile (ex. fenol , camfor) , unele insecticide (ex.organoclorurate) sau unele medicamente (ex. glutetimida) ;

extractia lichidului cu eter etlic : in extractul organic sunt separate substante cucaracter acid sau neutru (ex. acid salicilic , acid oxalic , acid picric , derivati barbiturici ,glicozizi cardiotonici , meprobamat , colchicina)

alcalinizarea fazei apoase la pH 8-9 urmata de extractia cu eter etilic saucloroform , cand se separa substante cu caracter bazic (alcaloizi si alte substante organice desinteza cu caracter bazic).

2. Metoda Dragendorffse bazeaza pe solubilizarea substantelor toxice in apa acidulatacu acid sulfuric si precipitarea proteinelor cu alcool , urmata de extractia selectiva cu solventiorganici la pH optim (se epuizeaza intai lichidul R acid apoi lichidul R alcalin).

3. Metoda Floranceacidularea se face cu acid tricloracetic , la cald conditii in care seasegura si deproteinizarea . Filtratul acid si apon alcalin se epuizeaza cu solventi organici , ca inmetoda clasica.

4. Metoda Fabre (proteolizei)organele sunt intai supuse deproteinizarii enzimatice cu

tripsina . Filtratul acid si apoi cel alcalin se epuizeaza cu solventi organici ca in metoda clasica.5. Metoda Griffonpresupune extractia cu aparatul Soxhlet . Materialul de analizat se

amesteca cu sulfat de sodiu anhidru , se adauga acid tartric sau oxid de magneziu (in functie decaracterul acido-bazic al toxicului urmarit a fi extras) , iar pulberea obtinuta se aduce in cartasde hartie de filtru si se supune extractiei cu solventi in aparatul Soxhlet.

Pentru usurarea procesului de extractie a unui toxic in material biologic exista acumsisteme de unica folosinta care simplifica procesal de extractie : cartusele de extractie tip lichid

lichid sau solidlichid .

Cartusele pentru extractie lichid-lichidsunt tuburi mici de polipropilena umplute cudiatomita calcinata , de inalta puritate ce contin un filtru de separare a fazelor , pentru a evitacontaminarea solventilor organici cu faza apoasa . Extractia se face gravitational (nu suntnecesare sisteme de vid) si are urmatorii pasi :

se pipeteaza solutia apoasa care contine analitul in cartusul de filtrarese asteapta 3-5 minutese adauga solventul organic si secolecteaza analitul purificat.

Exista o mare varietate de umpluturi pentru cartusele de extractie lichid-lichid , adaptate


8/19

8

necesitatilor analitice , dintre care trebuie mentionate cartusele pre-tamponate , care simplificaprocesal de extractie si un necesita ajustarea pH-ului probei inainte de separare.

Cartusele de extractiesolid-lichidsunt prevazute cu umplutura pe baza de silice , carbuneactiv si rasini . Analitii sunt retinuti la nivelul sorbentului printr-o combinatie de mecanisme

permitand obtinerea unor probe concentrate , care pot fi analizate ulterior in mod optim prin

metode CSS , HPLC sau GC.O varianta a extractiei in faza solida o constituie micro-extractia in faza solida , care serealizeaza cu ajutorul unui sistem care are drept componenta principala o fibra de silice topita ,acoperita cu un strat polimeric , strat care contine si un material adsorbant solid (de exemplu ,un polimer de divinilbenzen sau carbune poros); fibra este fixata pe un piston si protejata prinintermediul unui ac adaptabil la injectorul HPLC sau GC.

3. IDENTIFICAREA SI DETERMINAREA CANTITATIVA

In general , pentru dozare se utilizeaza metode :

- spectrofotometrice (in UV si vizibil)- cromatografice (HPLC , GC).

Metode cromatografice - privire de ansamblu

Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentalecare include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amesteculuidin prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de unnumr mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre doufaze. Una dintre faze este imobil i

poart denumirea defaz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt -

faza mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se petrece ncoloana cromatografic. Faza mobil, denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cuvitez constant) prin interstiiile fazei staionare, adeseoriporoase, poate provoca migrarea, cuviteze diferite, a celor n componeni ai amestecului deseparat de-a lungul coloanei. Amesteculsupus separrii se introduce sub form de soluie lanceputul coloanei, folosindu-se undispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afliniialfixat ntr-o zonngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, oparte din componeniiprobei migreazapoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru sedatoreaz interaciunilor fizice specifice,dintre moleculele probei i faza staionar (desigur,nu orice molecul poate migra pe orice fazstaionar). Efectul, este numit retenie i aceastaprovoac o aa-numit migrare difereniat.

Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pernd, la prsirea coloanei, de ctre uninstrument , analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod idealla oricare) dintrecomponeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dupieirea din coloan.Acest analizor , denumit detector este capabil s dea un semnalproporional cu masa sau cuconcentraia soluiei de component n faza mobil. Reprezentarea grafic a semnaluluidetectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram.


9/19

9

Clasificarea tehnicilor cromatografice

Functie de natura fazei mobile i a celei staionarecromatografia de lichide (LC)cnd faza mobil este un lichid cromatografia de gaze (GC)cnd aceasta este un gaz cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobileste un lichid aflat

peste temperatura critic.n cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincie ntre cromatografiape coloandeschis i ceape coloan nchis Pe de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingemmai multe variante.

n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare: Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un

secol , utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule dedimensiuni mici i mediipe adsorbeni, casilicagel i alumin, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri desolveni organici.

Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid,

poroas, format din materiale specifice -schimbtorii de ioni - substane cu o reea solidafnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul deobinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare deioni - organice - la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe acestecentre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie (electrolit sauneelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de schimb ionic.

Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cuporozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuseseparrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul

solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practicnereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi desit la scar molecularsepararea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete isub denumirea defiltrare prin geluri saupermeaie prin geluri n funcie de natura apoassau organic a fazei mobile.

Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid,nemiscibilcu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul solideste, celpuin principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla impregnare aunui suportporos cu un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs la legarea pe calechimic a acestora de suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice -faze staionare

legate chimic. Molecule organice de dimensiuni mici sunt, prin sintez, legate de suportulporos, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind practic anulat. Acesttehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu cromatografia de lichide.

Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la ungrup de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil circul

printr-un material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar decompoziie asemntoare cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting:


10/19

10

Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas dinceluloz(iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare.

Cromatografia pe strat subire (TLC),n care faza staionar pulverulent estefixat desuportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire(0.1-0.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate.

Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care fazastaionar aregranulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i vitezaacestora.

Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort,dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub

presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze , denumit prescurtat GC se disting

urmtoarele tehnici: Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe un

suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aa-numita

cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat dedimensiuni capilare, n cromatografia pe coloan capilar.

Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie ila cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific selectivitatea.Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (nitesilicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem deimportant pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

FR.X.defineste cromatografia ca fiind o metoda fizico-chimica de separare a unor

substante dintr-un amestec, intr-un sistem constituit dintr-o faza stationara si o faza mobila carese deplaseaza intr-o directie data . Metoda se bazeaza pe migrarea dinamica diferentiata asubstantelor din amestecul respectiv ca urmare a unor diferente in adsorbtie , repartitie ,solubilitate , presiune de vapori , marimea moleculei etc.

Metodele cromatografice oficializate :-cromatografia pe hartie- cromatografia pe strat subtire- gaz-cromatografia- cromatografia de lichide sub presiune.

CROMATOGRAFIA PE HARTIE :Cromatografia pe hartie este o metoda fizico-chimica de separare si identificare a unor

amestecuri de substante bazata pe repartitia lor diferita intre faza stationara constituita din hartiasi lichidul impregnat pe ea si faza mobila formata dintr-un solvent sau un amestec de solventiorganici si anorganici . Pentru o mai buna separare hartia se poate impregna cu solutii tampon ,


11/19

11

acizi , baze , saruri , agenti de complexare , agenti de precipitare , shimbatori de ioni lichizi sausolizi.

Aplicatii :-separarea si identificarea substantelor medicamentoase-identificarea si separarea principiilor active din forme farmaceutice

Exemplu : solutia ce contine codeina , benzoat de sodiu , tinctura de aconit si tincturabelladonna se preteaza separarii si identificarii cromatografice in cadrul sistemului H1 (hartieWhatman 1 sistem se solventi specifici) . Codeina se identifica prin Rf specific (UV) , iaratropina si aconitina prin vizualizare cu reactiv Dragendorff (amestec de subnitrat de bismut ,acid clorhidric concentrat , iodura de potasiu).

F.R.Xprevede urmatoarele :Aparatura : vase cromatografice dinsticla , cu posibilitatea de inchidere etansa , cu

dimensiuni si forme diferite , corespunzatoare benzilor de hartie prevazute cu un dispozitiv defixare a hartiilor cromatografice si cu o cuva , care in cazul tehnicii ascendente se aseaza la bazavasilui cromatografic , iar in cazul tehnicii descendente se fixeaza la partea superioara a vasului.

benzi de hartie cromatografica prevazute la fiecare monografie in parte micropipete , microseringi sau alte dispozitive.

Tehnica de lucru : linia pe care se aplica solutiile (linia de start) trebuie sa fie situata la odistanta de 5-6 cm de marginea benzii de hartie pentru tehnica de developare ascendenta si de10-12 cm , pentru tehnica de developare descendenta . Distanta dintre doua puncte de aplicare asolutiilor trebuie sa fie de 3-4 cm ; distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie safie de cel putin 2.5 cm . Solutiile se aplica pe hartia cromatografica , daca nu se prevede altfel ,in pete circulare cu diametrul de cel mult 6 mm .

Tehnica cromatografica (ascendenta ,descendenta) , pregatirea benzilor de hartie

cromatografica , developantul , modul de preparare a solutiilor de aplicat (probe , etalon) ,volumele aplicate pe hartia cromatografica si distanta parcursa de developant sunt prevazute inmonografia respectiva.

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIREEste o metoda de separare in care mediul adsorbant este dispus intr-un strat subtire (0.1-

0.5 mm) care poate fi format dintr-o pelicula de lichid depusa pe un suport poros , suprafataunui adsorbant sau o sita moleculara . Adsorbanti utilizati : alimina , silicagel , kieselgur ,

pulberea de celuloza , silicatul de magneziu etc.F.R.X prevede :


12/19

12

Apratura : placi cromatografice din sticla sau din alte materiale , de dimensiunidiferite , cu lungimea de obicei , de 20 cm si latime variabila , pe care se aplica un strat subtirede adsorbant de puritate cromatografica (silicagel , kieselgur , celuloza microcristalina , oxid dealuminiu etc) la care se pot adauga lianti (sulfat de calciu , amidon , carboximetilceluloza) sauagenti fluorescenti.

vase cromatografice din sticlapipete , micropipete sau alte dispozitive.Tehnica de lucru : linia de start trebuie situata la o distanta de 2 cm de marginea placii .

Distanta dintre doua puncte de aplicare a solutiilor trebuie sa fie de cel putin 1.5 cm , distantadintre punctele marginale si laturile placii trebuie sa fie de cel putin 2 cm.

Solutiile se aplica pe placa cromatografica in pete circulare , cu diametrul de 2-6 mm sauin benzi , conform prevederilor din monografia respectiva . Daca este cazul , solutia se aplica infractiuni , asteptand de fiecare data evaporarea solventului , eventual cu ajutorul unui curentmoderat de aer . Dupa evaporarea solventului , placa cromatografica se introduce in vasulcromatografic cu developant , pe cat posibil in pozitie verticala . Petele de pe linia de start nu

trebuie sa atinga suprafata stratului de developant . Dupa ce developantul a parcurs distantaprevazuta , de obicei 10-15 cm , placa cromatografica se scoate din vasul cromatografic , seusuca si se pun in evidenta petele , conform prevederilor din monografia respectiva.

De obicei , punerea in evidenta a petelor de pe cromatograma se efectueaza prinexaminarea acestora ca atare sau dupa tratare cu reactivi potriviti , in lumina vizibila sauultraviolet.

Pentru identificarea substantelor se compara pe aceeasi cromatograma valoarea Rf sicularea sau fluorescenta petei obtinute cu solutia proba cu valoarea Rf si culoarea saufluorescenta petei obtinute cu solutia etalon : cele doua pete trebuie sa fie asemanatoare.

Valoarea Rf a unei substante este :

in care : a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare al solutiri pana lacentrul petei (in centimetri);

b = distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiri pana lafrontul developantului , trecand prin centrul petei (in centimetri).

Identificarea unei substante se realizeaza in anumite cazuri , fata de o substanta dereferinta cu ajutorul Rr.

Valoarea Rr a unei substante este :

in care : a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare a solutiei pana lacentrul petei (in centimetri).

b = distanta parcursa de substanta de referinta de la punctul de aplicare al solutieipana la centrul petei (in centimetri).

Rf = a/b

Rr = a/c


13/19

13

Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza , dupa razuirea petelorrespective si eluarea substantelor de pe adsorbant cu un solvent potrivit , prin spectofotometriesau direct pe placa , de obicei prin densitometrie.

GAZ-CROMATOGRAFIA

F.R.Xprevede :Cromatografia de gaze este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care

faza mobila este un gaz (gaz-purtator) , iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care esteimpregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat uniform pe peretii unei coloane capilare .Faza stationara se afla intr- coloana cromatografica , confectionata , de obicei din sticla sau dinotel inoxidabil . Faza mobila se deplaseaza continuu prin coloana , iar la iesire , gazul-purtatortrece prin detector.

Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale : sursa de gaz ,

camera de evaporare , coloana cromatografica , termostatul , detectorul si sistemul deinregistrare.

Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare , preia probade analizat si o introduce in coloana cromatografica , unde se realizeaza separareacomponentelor . La iesirea din coloana cromatografica , gazul purtator trece impreuna cucomponentele separate prin detector , care emite un semnal electric proportional cu concentratiacomponentei din faza gazoasa . Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare . Rezultatelese prezinta sub forma unui grafic semnal-timp . Deoarece probele de analizat dizolvate intr-unsolvent trebuie sa fie aduse in stare de vapori , camera de evaporare este incalzita la o

temperatura suficient de ridicata pentru a asigura o evaporare rapida , fara a produce odegradare termica a probelor.In timpul determinarii , temepratura coloanei cromatografice trebuie sa ramana constanta

sau , daca este necesar , trebuie sa creasca dupa un anumit program.


14/19

14

Fig.3 : Schema unui gaz-cromatograf.

= butelie gaz purator= coloana= inregistrator= injector + camera de evaporare.= detector= masurator de debit.

Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz cromatografe, avnd rolulde a sesiza n mod continuu, rapid i cu o mare sensibilitate, componentele din proba supusanalizei. n corpul detectorului zonele cromatografice care ies separate din coloan, coninndde preferin moleculele unei singure substane, se transform n semnale electrice (picuri).Pentru a se putea compara, ca performane, fiecare detector este caracterizat de nite mrimifizice: specificitate, sensibilitate, zgomot de fond, drift, limit de detecie, constant de timp,reactivitate, efect asupra probei i altele, comune multor metode analitice. n orice gazcromatograf trebuie s existe cel puin un detector universal care s permit nregistrarea sigura tuturor componenilor. n afar de acesta mai pot exista i alidetectori specifici, care mresc

sigurana analizei componenilor de interes practic, deoarecerspund doar la anumite tipuri demolecule.Gaz cromatografia este potrivita pentru separarea si identificarea unor compusi

bazici - alcalozi (cafeina , nicotina , papaverina , atropina , morfina , teofilina) , fenotiazine ,benzodiazepine (diazepam , nitrazepam , clordiazepoxid) , compusi acizibarbiturice ,compusi neutristeroizi.

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)


15/19

15

Cromatografia de lichide de nalt performan acoper azi, n proporieaproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganiceinclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas molecularridicat (naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un

punct de sprijin important n analizele chimice moderne.

Rezervoarele coninnd unul sau mai muli solveni pompa (sau pompele), alimenteazcoloana cu eluent (de regul un amestec de doi sau mai muli solveni). n imediata vecintatea coloanei se introduce proba, automat. n coloana aflat ntr-o etuv termostat, are locsepararea propriu-zis. Efluentul coloanei intrntr-un detector de unde componentul, dac esteseparat complet, poate fi colectat i izolat, cuajutorul unui colector de fraciuni. Semnalul estenregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator.

F.R.Xprevede :Cromatografia de lichide sub presiune este o metoda fizico-chimica de separare

cromatografica in care faza mobila este un lichid , iar faza stationara , continuta intr-o coloana ,este constituita dintr-un solid cu granulatie fina sau un solid impregnat cu un lichid sau un solid

pe care sunt grefate grupari organice.Cromatograful de lichide sub presiune se compune din urmatoarele parti principale :

sistemul de pompare , sistemul de injectie , coloana cromatografica , detectorul si sistemul deinregistrare.

Faza mobila , furnizata de unul sau mai multe rezervoare , circula prin coloanacromatografica cu un debit constant , sub efectul unei presiuni si apoi trece prin detector.Temperatura coloanei cromatografice se mentine constanta in timpul determinarii si inmajoritatea cazurilor este temperatura camerei.

Sistemul de detectare folosit trebuie sa permita determinarea contitatilor de componente

prezente in eluent si se bazeaza pe spectofotometrie de absorbtie , refractometrie diferentiala,fluometrie , combustie sau metode electro-chimice.

Fig. 4. Schema a unui cromatograf HPLC


16/19

16

1-rezervor solvent2-pompa presiune3-sistem evaporare4-sistem injectare proba5-coloana cromatografica

6-detector7-inregistrator8-colector fractiuni.

SPECTROFOTOMETRIA

1

2

3

4

5

6

7

8


17/19

17

F.R.Xprevede : proprietatea substantelor de a absorbi selectiv radiatiile electromagneticesta la baza spectrofotometriei de absorbtie si este folosita pentru identificare , determinarea

puritatii si dozare.Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicul de radiatii continue prin substanta

de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia .Functie de domeniile spectrale in care are loc absorbtia luminii se deosebesc :-spectrofotometria in ultraviolet (185-400 nm)-spectrofotometria in vizibil (400-800 nm)-spectrofotometria in infrarosu (peste 800 nm)

Spectrele de absorbtie in domeniul ultraviolet si vizibil , numite si spectre electronice , sedatoresc tranzitiilor dintre nivelele energetice ale starii electronice ale moleculelor.

Spectrele de absorbtie in infrarosu se datoresc tranzitiilor de rotatie , de vibratie si derotatie-vibratie ale moleculelor.

Spectrele de absorbtie in ultraviolet si vizibil se obtin grafic prin reprezentarea absorbantei

sau a transmitantei in functie de lungimea de unda.Absorbanta (A) (densitatea optica , extinctia) unei solutii este logaritmul zecimal al

inversului transmitantei (T) (transimisiei) respectiv logaritmul zecimal al raportului dintreintensitatea luminii incidente (Io) si intensitatea luminii transmise (I) si este proportionala cuconcentratia in substanta de analizat a solutiei (c) si cu grosimea stratului de absorbtie (l):

Transmitanta (T) (transmisia) este raportul dintre intensitatea luminii transmise (I) siintensitatea luminii incidente (Io) :

Dozarile spectrofotometrice un domeniul ultraviolet si vizibil se bazeaza pe masurarealuminii absorbite atunci cand este respectata legea BouguerLambertBeer , care stabilesterelatia dintre lumina absorbita , structura si concentratia in substanta de analizat a solutiei sigrosimea stratului absorbant , pentru o anumita lungime de unda exprimata in nanometri.

I = intensitatea luminii transmise;Io = intensitatea luminii incidente ; = constanta caracteristica fiecarei substante;

A=log 1/T = log Io/I = cl

T = I/Io

I = I0 10-cl


18/19

18

c = concentratia in substanta de analizat a solutiei (%m/V)l = grosimea stratului absorbant (in centimetri)

Spectrofotometrul de absorbtie in ultraviolet si vizibil se compune din urmatoarele partiprincipale : sursa de radiatii , monocromatorul , suportul pentru cuve , detectorul ,amplificatorul si inregistratorul .

Sursa de radiatii este constituita de obicei dintr-un bec cu filament de wolfram , pentrudomeniul vizibil si dintr-o lampa de hidrogen sau deuteriu pentru domeniul ultraviolet.Monocromatorul si cuvele sunt confectionate din sticla , pentru domeniul vizibil si din

cuart pentru domeniul ultraviolet.Pentru detreminarile spectrofotometrice se folosesc odua cuve identice : o cuva in care se

introduce solutia substantei de analizat (solutia-proba) si o cuva in care se introduce lichidul decompensare constituit din solventul sau amestecul de solventi si reactivi folositi la preparareasolutiei proba.

Cauzele producerii spectrelor : energia luminoasa se absoarbe pe seama promovariielectronilor implicati in tranzitii dintr-un orbital de legatura sau ocupati cu electroni in

starea fundamentala intr-un orbital de antilegatura * sau * neocupat in starea fundamentala ,capabil de a fi ocupat in starea excitata.

In spectroscopia UV si VIS sunt caracteristice urmatoarele patru tipuri de tranzitii :-tranzitii -*-tranzitii -*-tranzitii n-*-tranzitii n-*.

Aplicatii ale spectrofotometriei : spectrele UV-VIS ofera informatii in legatura cu structuraglobala a electronilor substantei analizate . Se obtin date suplimentare in legatura cu natura

cromoforilor existenti , pozitia lor fata de alte elemente structurale , stereochimia moleculei ,existenta legaturilor de hidrogen etc.Astfel : hidrocarburile saturate au legaturi covalente , legaturi puternice . Sunt substante

transparente (nu absorb) si de aceea au o larga utilizare ca solventi in spectroscopia UV-VIS. substante care contin heteroatomi : O , S , N in acesti compusi au loc

tranzactilor -*. substante nesaturate : toate substantele cu duble si triple legaturi ; tranzitiile

electronice sunt -*.substante cu caracter acid si derivati functionali poliene conjugate

compusiaromatici.

BIBLIOGRAFIE :


19/19

19

1.Balalau D,Baconi D.Toxicologie generala.Ed.Tehnoplast Company.Bucuresti 2005.344-372.

2.Lazar M.Lazar D.Controlul medicamentului.EdMedicala.Iasi 1998.204-267,338-359.

3.Farmacopeea Romana, ed.X.

lp 01. notiuni de baza metode de separare in analiza substantelor toxicologice

Documents