Leucocitele

Sangele are matricea extracelulara fluida. El are doua componente: plasma si componenta celulara. Hematiile si plachetele sunt elemente care isi desfasoara functiile fiziologice in spatiul vascular. Leucocitele se afla doar in trecere prin spatiul vascular si au rol doar in tesuturi.

Tehnici de studiere a morfologiei si fiziologiei celulelor sangvine:· Tehnica examinarii pe frotiu a sangelui periferic - se vad forma, dimensiunile si aspectele

caracteristice ale celulelor, numarul acestora si se pot stabili raporturile intre unele elemente figurate (formula leucocitara).

Importanta utilizarii frotiului:Cu ajutorul lui se poate stabili un diagnostic ipotetic. Diagnosticul cu ajutorul sangelui

periferic se face prin hemoleucograma. Frotiul este relativ usor de realizat, sangele periferic fiind usor de prelevat iar un esantion mic da informatii multe.

Se pot obtine date orientative pentru diagnostic, chiar cand nu exista nici un semn de boala asa cum este cazul in leucemii sau reactii inflamatorii. Astfel se permite orientarea planului de investigatii: anemia cu hematii mici poate fi determinata insuficienta Fe - anemie feripriva. Dupa tratament se face din nou investigatia prin frotiu.

Frotiul este necesar pentru pacientii ce suporta cure agresive de radioterapie si chimioterapie in cazul neoplaziilor (exista aprox. 200 de tipuri de cancer). Exista elemente comune tuturor cancerelor: proliferarea anarhica a unor celule si ............................................................................ metastaze.

In cazul diagnosticului precoce are loc interventia chirurgicala si tumora este eliminata. In cazul diagnosticului tardiv, cand a avut loc si o metastazare se incearca iradierea pacientului sau chimioterapie. Prin chimioterapie se incearca de fapt intarzierea proliferarii celulelor tumorale, insa aceasta terapie nu este selectiva, actionand si pe celulele indemne. Tesutul hematopoietic din MRH, avand un turn-over crescut, poate fi afectat, ajungandu-se uneori pana la aplazie medulara. De aceea este obligatorie transfuzia de sange periodica la bolnavii aflati sub chimioterapie.

· Citometria in flux - foloseste instrumente scumpe, necesita proteine marcate, sau anticorpi marcati. Aceasta tehnica este folosita frecvent in centre de hematologie si transplant de organe. Ajuta la stabilirea compatibilitatii intre receptor si donator. Se ofera informatii despre dimensiuni, granularitatea si fosforescenta celulelor.

Tehnica este urmatoarea:Celulele trec prin fata unui fascicul si se inregistreaza fluorescenta lor. Initial celulele sunt

puse in contact cu anticorpi marcati pentru anumite proteine. Avand in vedere faptul ca celulele cu acelasi rol functional prezinta pe suprafata acelasi set de proteine, anticorpii marcati se vor atasa numai la anumite tipuri de celule.

Aceasta tehnica poate fi folosita in vindecarea unor leucemii folosindu-se autotransplantul de maduva. Se preleveaza maduva de la pacient (care de obicei prolifereaza anarhic pe o singura linie hematopoietica, mai rar multiclonal) si apoi, cu ajutorul proteinelor marcate si a citometriei in flux se separa celulele stem sanatoase de cele anormale, acestea prezentand antigene de suprafata diferite. Apoi maduva purificata este introdusa inapoi in organismul pacientului. De altfel, cancerele constau de obicei in proliferare monoclonala. In cazul leucemiei linia celulara proliferata creste si sufoca celelalte linii impiedicand dezvoltarea lor. Prin citometria in flux se reactiveaza maduva hematopoietica. In viata oricarui individ se formeaza cateva zeci de celule canceroase, care sunt insa distruse de sistemul imun si pacientii nu se imbolnavesc de cancer.

· Exista si unele aparate care au sortatoare de celule si se obtin grupuri de celule identice.

Neutrofilele

Au originea in MRH.Dupa raportul cu peretele vascular exista doua populatii de neutrofile: circulante si marginale

(au tendinta de aderare).Numarul 3.000 - 6.000 / mmc.Durata de viata este de 6 h in sange dupa care trec in tesuturi unde au o durata medie de viata

de 4 zile.Au rol in apararea antiinfectioasa, apartinand sistemului fagocitar.In sange ele au stadiul de evolutie final, diferentiat. Ele nu se mai divid si se pot autoelimina,

activandu-si programul genetic de autodistrugere. La microscopul optic se calculeaza dimensiunea lor 10 -12 mm, raportul nucleu / citoplasma = 1 : 1. Celulele au un singur nucleu care este segmentat. Celulele sunt PMN (polimorfonucleare) avand nucleul lobat. La celulele tinere nucleul este nesegmentat, in banda. Nucleul se va segmenta in 2, 3, 4, sau 5 lobi.

Citoplasma prezinta granulatii mici, colorate roz sau rosu-portocaliu si unele granulatii colorate in albastru-violet. Ele sunt raspandite uniform in citoplasma. Se poate vedea un apendice, ca un bat de toba - corpusculul Barr.

Distributia granulelor la microscopul electronic arata ca in vecinatatea membranei exista mai putine granule si mai multe structuri ale citoscheletului. In momentul aderarii la endoteliul vascular miscarea neutrofilului este de tip amoeboidal care se face ca urmare a rearanjarii citoscheletului.

Continutul granulelor a fost studiat prin histochimie. Granulele pot fi de doua feluri primare (comune) si secundare (specifice), clasificare care s-a facut dupa afinitatile tinctoriale. Granulele primare sunt azurofile si dau reactii pozitive pentru coloranti azur. Ele contin un set de enzime lizozomale. Granulele specifice nu au aceleasi enzime specifice si au proteine bazice numite fagocitone. Aceste granule asigura capacitatea neutrofilului de a fagocita bacterii.

D.p.d.v. functional neutrofilele se clasifica in:1. celule inactive2. celule activate.

Celulele activate prezinta pe suprafata lor anumite molecule de adeziune cu ajutorul carora se ataseaza la celulele ce captusesc vasele, migreaza apoi in tesuturi unde ingera particulele straine pe care apoi le digera.

Etapele distrugerii microorganismelor:1. Identificarea microorganismelor prin factori chemotactici care sunt niste compusi chimici pe care

celula ii detecteaza ca fiind prezenti in mediu iar apoi are loc raspunsul celular, neutrofilul migrand spre zona din organism unde concentratia factorilor detectati este maxima.

2. Apoi celulele se ataseaza de vas, strabat peretele endotelial la locul de jonctiune intre doua celule endoteliale, distrugand membrana celulara cu enzima numita colagenaza. Neutrofilele trec apoi in tesutul conjunctiv prin miscari amoeboidale si ajung la locul unde concentratia de microorganisme este maxima.

3. Distrugerea, liza microorganismelor.4. Prelucrarea materialului rezultat din liza.

Atasarea neutrofilelor atat la celulele endoteliale cat si la tesutul conjunctiv se face prin molecule de adeziune care se gasesc fie pe leucocite fie pe celulele epiteliale sau pe celulele tesutului conjunctiv. Exemple de molecule de adeziune:· ICAM 1 (molecula de adeziune intercelulara - intercelular adhesion molecule)· ELAM 1 (endothelial-leukocyte adhesion molecule)

Exemple de factori chemotactici:· peptide scurte, cu radicali N-formil· diferite tipuri de componente ale sistemului complement· mesageri ai mastocitelor?: metaboliti ai acidului arahidonic.

Ingestia este precedata de procesul de opsonizare (bacteria este acoperita din loc in loc de proteine de tip Ig sau elemente componente ale sistemului complement). Opsonizarea reprezinta acoperirea unei molecule (particule) bacteriene cu proteine plasmatice recunoscute de receptorii neutrofilului ca semnal pentru ingestie. Rolul opsonizarii este de a reduce mobilitatea microorganismului si de a recunoaste particula antigenica.

In momentul recunoasterii, citoscheletul neutrofilului se distruge, si veziculele de fagocitoza sunt internalizate. Ulterior veziculele de fagocitoza fuzioneaza cu granulele neutrofilului si are loc o degranulare (eliberarea continutului granular spre vezicula de fagocitoza). In acest moment se activeaza productia de radicali liberi care ulterior desfac elementele componente ale microorganismelor ingerate. Pentru neutrofile, degranularea are loc in citoplasma celulei, spre deosebire de bazofile si eozinofile unde degranulare are loc extracelular, uneori cu efecte toxice asupra organismului propriu.

Eozinofile

Se gasesc atat in sange cat si in unele tesuturi. Sunt bine reprezentate in tesuturile ce au contact direct cu mediul extern: aparatul respirator, digestiv, genito-urinar.

Numarul este de 450 / ml (mmc). Raportul de eozinofile in sange / tesuturi este 1 / 300. Numarul lor creste in infectiile parazitare.

Durata de viata este mai mare dacat la neutrofile, fiind de cateva saptamani.La MO se stabilesc dimensiunile de 10-12 mm, raportul nucleu / citoplasma este 1 : 1.

Nucleul poate fi nesegmentat sau, mai frecvent, are doi lobi iar nucleul are un aspect caracteristic, in forma de desaga. Citoplasma se coloreaza in rosu portocaliu cu eozina iar granulele se coloreaza eozinofil.

La ME, granulele au in centru un miez cristaloid caracteristic, diferit de la o specie la alta. D.p.d.v. histochimicgranulele contin:· un set de hidrolaze lizozomale· un set de proteine cationice

Rolul functional:· Fagocitoza si liza bacteriana, putin importanta in vivo. S-a experimentat acest lucru pe sobolani,

modificandu-li-se formula leucocitara. Li se scot neutrofilele si li se introduce un numar egal de eozinofile. Ulterior, soarecii mor din cauza unor infectii cu germeni obisnuiti. Concluzia este ca unele eozinofile sunt capabile de fagocitoza dar ele nu pot suplini lipsa neutrofilelor.

· Apararea in infectiile cu paraziti multicelulari. In infectiile parazitare, celulele sistemului imun detecteaza celulele straine, secreta o serie de molecule implicate in comunicarea intercelulara, numite limfokine care determina elaborarea unui raspuns mai specific fata de acest tip de infectie. Ca urmare, creste numarul de eozinofile, creste concentratia unui anume tip de anticorpi, din familia IgE.

Moleculele de anticopri se ataseaza de parazit, recunoscand proteinele de suprafata. Eozinofilele au receptori ce recunosc celalalt domeniu al anticorpului si prin intermediul lui se ataseaza de celula parazitara. Apoi are loc procesul de degranulare care este citotoxic pentru celulele parazitare. Procesul de degranulare se face in spatiul extracelular si prin urmare el poate provoca un raspuns si din partea celulelor proprii ale organismului. Pot aparea astfel asa numitele boli alergice, caracterizate printr-o hipersensibilitate a propriilor celule la actiunea eozinofilelor asupra parazitilor. Aceasta hipersensibilitate se poate manifesta chiar in absenta parazitului si prezenta doar a antigenului.

Bazofilele

Sunt celule cu proprietati asemanatoare cu mastocitele.Numarul lor este intre 15-50 / mmc, aproximativ 100 milioane in total in organism.Au durata scurta de viata. In sange se gasesc sub forma de celule diferentiate, ce nu se divid.La MO se stabilesc diametrul - 12-25 mm, raportul nucleu / citoplasma - 1 : 1, forma

nucleului, de potcoava la cele tinere sau bilobat la cele adulte. Citoplasma este abundenta, si adesea tinde sa aiba o tenta bazofila. Exista granule foarte neuniforme d.p.d.v. al conturului care se coloreaza cu un colorant bazic si apar in albastru inchis pana la negru. Granulele se suprapun si peste nucleu. Continutul granulelor este hidrosolubil, si de aceea, pe frotiu, la spalare intensa, continutul granulelor se poate dizolva.

La ME se vad organitele: aparatul Golgi, RE, mitocondrii si incluziunile - granule de glicogen.

Granulele sunt rotunde sau ovale si specifice. Au un continut de histamina, heparina si alti mediatori. Nu au enzime lizozomale.

Rolul lor functional este incert. Datorita faptului ca reprezinta o proportie mica din totalul de leucocite adesea exista tendinta de a se considera neimportante. Degranularea lor rapida poate avea insa consecinte grave. In aceste cazuri au loc pusee hipersensibile, cand se elibereaza anticorpi IgE.

Bazofilele au pe suprafata lor receptori pentru IgE. Cand o persoana hiperreactiva produce IgE acestea pe de o parte circula in sange, pe de alta parte se leaga de bazofile. La reexpunerea acelei persoane la acelasi antigen, bazofilele cu anticoprii atasati fixeaza antigenul respectiv, se degranuleaza si astfel se pot produce diferite tipuri de reactii alergice, de la astm bronsic pana la urticarie acuta si chiar soc anafilactic, care este cel mai grav dintre bolile alergice.

Limfocitele

Exista atat in sange cat si in organele limfoide. Ca numar sunt 5-10 miliarde in sange si 2*1012 in diferite organe limfoide.Durata de viata este lunga deoarece cea mai mare parte sunt recirculate: sange ® organe

limfoide ® sange ®organe limfoide ® sange ® ..........O particularitate a limfocitelor consta in afinitatea proprie fiecarui limfocit pentru un anume

organ limfoid. Pe suprafata limfocitului se exprima un receptor pentru care exista un contrareceptor potrivit in endoteliul organului limfoid.

La MO, dupa dimensiuni, se pot distinge 3 categorii de limfocite: mici (cu diametrul 6-8 mm), mari (diametrul de 12-18 mm) si intermediare cu dimensiuni intermediare. Raportul nucleu / citplasama este de 4 : 1 sau 3 : 1. Forma nucleului este rotunda sau indentata, pozitia lui este excentrica, nucleolul este absent. Nucleul se coloreaza cu colorant bazic si apare in “pata de cerneala”. Citoplasma este ca un inel subtire perinuclear si este albastra ca “cerul senin”.

Conform teoriei clasice limfocitele apartin agranulocitelor. Insa azi se considera ca unele limfocite au granule in citoplasma la fel ca unele monocite.

S-a stabilit ca exista mai multe populatii celulare: unele se maturizeaza in timus si sunt deci timodependente - limfocitele T. Altele se maturizeaza in maduva osoasa la om - limfocitele B (bone marrow). Acestea din urma, la pasare, se dezvolta in bursa lui Fabricius.

Dupa studierea la ME s-a stabilit ca nu exista diferente intre limfocitele B si T in stare inactiva. In stare activata apar mici diferente:· limfocitele T activate au diametrul mai mare decat al celulei inactive, nucleul mai putin

condensat, iar in citoplasma apar cateva cisterne ale RE si cativa ribozomi liberi.· limfocitele B activate au dimensiuni mult mai mari decat ale celulei inactive, iar citoplasma este

plina cu RER. Aceste celule sunt specializate in sinteza anticorpilor care se face in stadiul final de diferentiere - plasmocitul.

Sistemul imun cuprinde milioane de clone (familii) de limfocite. Limfocitele din fiecare familie poseda un receptor de suprafata unic - apartine doar acestei familii. Acest receptor permite legarea unui determinant antigenic specific.

Cele doua mari populatii de limfocite sunt limfocitele B, specializate in sinteza de anticorpi, si limfocitele T care participa la raspunsul imun. Diferentierea la MO intre cele doua clase nu se poate face iar la ME exista diferente doar intre formele activate ale limfocitelor, diferente care se evidentiaza prin metode imunocitochimice (identificarea unor markeri de suprafata).

Fenomene de memorie imunologica si toleranta imunaIn evolutia limfocitelor exista 3 stadii potentiale in functie de intalnirea cu antigenul pe care

il recunoaste.Limfocitele naive nu au avut contact cu antigenul. Prima intalnire cu antigenul poate

determina comportament diferit din partea limfoctelor: unele determina raspuns imun specific iar altele nu determina raspunsul imun ci doar prolifereaza intens aparand un set de limfocite denumite limfocite cu memorie biologica.

Limfocitele cu memorie, la o alta intalnire cu antigenul respectiv, elaboreaza un raspuns imun prompt, rapid. In cursul elaborarii raspunsului imun pot lua nastere familii de limfocite care recunosc drept straine celulele proprii ale organismului. Lipsa de raspuns a sistemului fata de structurile proprii se numeste toleranta imuna. Mecanismul de instalare e legat fie de distrugerea clonelor autoreactive fie de inactivarea lor. Exista un grup de boli denumite boli autoimune, in care apar defecte ale raspunsului imun, sistemul imun reactionand asupra propriilor structuri.

Limfocitele B sintetizeaza anticorpi. Caracteristicile anticorpilor:· Au unul sau doua locuri de legare pentru proteinele straine.· Au domenii ce pot activa sistemul complementului sau pot fi recunoscute de receptorii de pe

suprafata fagocitelor. Reprezentantii unei singure familii de limfocite elaboreaza un singur tip de anticorp.

· Are forma literei Y, avand doua lanturi polipeptidice lungi (cu masa moleculara mare - heavy H) si doua lanturi polipeptidice scurte (cu masa moleculara mai mica - light L). Zona centrala este o zona balama.

Exista 5 clase de anticorpi: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, care difera intre ele prin structura lantului greu.

Moleculele de anticorpi sunt fixate pe membrana limfocitului dar sunt si eliberate in circulatie.

Orice vaccin induce proliferarea familiei de limfocite care produce anticorpul ce recunoaste antigenul introdus.

Limfocitele T cuprind doua subpopulatii: limfocitele T citotoxice si limfocitele T helper, care au pe suprafata receptori ce se aseamana dar cele doua subpopulatii difera d.p.d.v. functional. Limfocitele T citotoxice lizeaza direct celulele infectate (mai ales viral) iar limfocitele T helper faciliteaza producerea de anticorpi de catre limfocitele B si ingerarea si distrugerea celulelor infectate de catre macrofage. Limfocitele T detecteaza si celulele proprii ca fiind nonself.

Receptorii limfocitelor T recunosc proteinele straine atunci cand sunt legate de un set de proteine denumite moleculele sistemului major de histocompatibilitate (CMH). Exista 2 clase de complexe de histocompatibilitate: clasa I si clasa II. Cele din clasa I se gasesc pe membrana aproape a tuturor celulelor nucleate. Moleculele CMH II se gasesc pe membrana celulelor ce coopereaza cu limfocitele T. Acest sistem s-a descoperit in cursul cercetarilor pentru refuzul transplantelor. Acest sistem arata ca celulele organismului sunt sanatoase.

Limfocitele T citotoxice provoaca moartea celulelor ce poarta pe suprafata o proteina straina legata de moleculele CMH. Moartea celulei este provocata prin doua mecanisme:1. mecanismul lung

2. mecanismul scurt: limfocitul T elibereaza o proteina care se numeste perforina care polimerizeaza si formeaza canale transmembranare in membrana celulei tinta. Apoi din citoplasma, prin pori trec cateva enzime ce activeaza verigile finale ale cascadei biochimice. Proteozomul este o “masinarie ce taie”celulele infectate.

Limfocitele T helper au mecanism de actiune asemanator ca etape iar rezultatul final consta in eliberarea de molecule semnal de catre limfocitul T helper cat si de catre celula cu proteina straina. Diferenta la acest mecanism este legata de tipul de celule implicate: celule prezentatoare de antigen si de tipul de molecule ce prezinta moleculele straine, care in acest caz apartin CMH II.

Dupa natura lor, semnalele chimice se impart in:· substante chemotactice (“cheama” si alte celule)· interleukine (determina proliferarea unor seturi de celule albe)

In infectia cu HIV, unele celule infectate pot exprima pe suprafata lor proteine-semnal ce intorc semnalul primit de la limfocitele T citotoxice (ex.:moarte celulara). In cazul camerei anterioare a globului ocular sau a testiculului prezinta continuu un semnal de apoptoza, astfel incat orice celula ajunsa aici moare (“moartea intrusilor”), lucru care este folositor in transplanturi.

Monocitele

Sunt celule aflate in trecere prin sange unde stau 1/2-1 zi. Ele ajung in tesuturi unde isi schimba morfologia (se transforma in macrofage). Exemple: macrofagele din tesutul conjunctiv din ficat, din plaman.

Sunt in numar de 300-500 / mmc.La MO apar ca fiind celule mari, cu diametrul pana la 20 mm. Raportul nucleu / citoplasma

este 2 : 1 iar nucleul are forma de potcoava. In nucleu eucromatina si heterocromatina alterneaza, dand aspectul de tabla de sah. Citoplasma este bazofila si apare colorata in albastru intens. Uneori exista granulatii mici ce apar roz palid.

La ME se observa RE, ribozomi liberi si mitocondrii. Granulele au enzime lizozomale.Rolul fagocitelor mononucleare:

1. secreta diversi compusi (proteici sau neproteici)2. ingera diferite particule de dimensiuni mari (celule intregi sau resturi celulare)3. coopereaza cu limfocitele mai ales4. fagocitoza (functia principala) - ingera celulele imbatranite (vezi splina pentru eritrocite).

Eritrocitele exprima semnale de degenerescenta care sunt recunoscute si fagocitate. De asemenea fagocitele pot inghiti proteine straine, resturi celulare, produsi fiziologici formati in exces (factori de coagulare). Mecanismul de transport poate fi pinocitoza (pentru faza fluida), endocitoza (pentru particulele solide) sau fagocitoza (vezi neutrofilul).

Diferente intre neutrofil si macrofag:· macrofagul utilizeaza un set amplu de molecule de adeziune· macrofagul poate fagocita particule dupa ce au fost opsonizate cu mai multe tipuri de anticorpi.· macrofagele se pot deplasa sub actiunea factorilor chemotactici sintetizati de limfocite· macrofagele au receptori pentru manoza (se gaseste in capsula bacteriana) si astfel bacteria poate

fi fagocitata fara opsonizare.