LUCRAREA PRACTICA NR.3

Numărătoarea leucocitelor.Variații fiziologice și patologice ale numărului de leucocite. Principiul metodei, descrierea camerei de numărat Burker-Turk, variații fiziologice și patologice ale numărului de leucocite – importanța, buletine de analiză-interpretare

DETERMINAREA NUMARULUI DE LEUCOCITE

Sângele recoltat in pipete speciale, diluat cu un lichid hemolizant ce păstrează intacte leucocitele, este introdus intr-un hemocitometru, unde acestea se numără într-un volum precis determinat.

Leucocitele se recunosc după structura lor celulara (nucleu, citoplasmă), deosebindu-se de artefacte (care apar ca structuri amorfe) şi de resturile eritrocitare.

VALORI NORMALEL/mm3 = 4000-10.000 leucocite/mm3

VARIAŢII ALE NUMĂRULUI DE LEUCOCITE

1. Fiziologicea. La nou-născut se constată o leucocitoză de 20.000-30.000/mm3. După 4-5 zile, numărul

scade, însă în primul an de viaţă valoarea fiziologică se menţine la 10.000-12.000/mm3.b. În ultimile 2 luni de sarcină, la gravide se observă o creştere a numărului de leucocite,

chiar din ziua naşterii şi încă o săptămână, numărul leucocitelor mamei ajungând la 20000-30000/mm3.

c. În timpul menstruaţiei, variaţiile numărului de leucocite sunt uşoare, fie în plus, fie în minus.

d. Numărul de leucocite creşte în emoţii, efort fizic, putând ajunge la 15000-20000/mm3, dar la o oră dupa efort numărul leucocitelor revine la normal.

e. La 3-4 ore după ingestia de alimente, există de asemenea o creştere a numărului de leucocite, care poate sa ajungă la 10.000 – 20.000/mm3. La unele persoane sensibilizate faţă de diferite alimente, mai ales pentru lapte şi care prezinta o intoleranţă pentru alimentul respectiv, se constată o leucopenie, sub 3000/mm3.

f. Unele persoane pot prezenta o leucopenie permanentă de 2000 – 3000 elemente/mm3, fără să aibă nici o manifestare a patologică. Unele leucopenii sunt congenitale şi rămân neschimabate toată viată, altele sunt trecătoare, dureaza câteva luni sau ani, apoi dispar secundar.

2. Patologicea. Leucocitoze – reprezintă creşteri ale numărului de leucocite peste 10000/mm3. Pot fi:

creşteri adaptative, reversibile cauzate mai ales de infecţii cu coci (pneumococ, streptococ, meningococ etc.) sau provocate de distrugerea ţesuturilor proprii

(traumatisme, infarct miocardic) şi creşteri neadaptative, apărute în leucemii,numărul leucocitelor putând depăşi 100.000/mm3, iar în circulaţie sunt aruncate elemente tinere ce nu-şi pot îndeplini rolul fagocitar,denumite blasti.Creşteri ale numărului de leucococite peste 30000/mm3 sunt cunoscute ca şi reacţii

leucemoide, deosebindu-se de leucemie prin absenţa celulelor imature în sângele periferic şi revenirea numărului la normal după încetarea acţiunii factorului declanşator.

b. Leucopenii – reprezintă scăderea numărului de leucocite sub 4000/mm3. Pot să apară în: unele infecţii microbiene (febra tifoidă, febre paratifoide, tularemia, bruceloza), infecţii virale (gripa, rujeola, rubeola, hepatita), parazitoze (malarie), infecţii grave de orice natură (septicemii), după iradieri masive cu raze X etc.

B. Formula leucocitară

METODĂ DE DETERMINARE1. Executarea frotiuluia. Principiul metodei – Se întinde o picătură de sânge proaspăt recoltat pe o lamă, în strat

subţire, în aşa fel încât elementele să nu fie suprapuse.b. Materiale necesare:

- lame curate, degresate- microscop optic, ulei de cedru- sânge capilar.

c. Tehnica executării frotiului de sânge- Se recoltează o picătură de sânge proaspăt pe marginea unei lame şlefuite şi cu

un colţ rupt pentru ca latura sa să fie mai mică decât lama pe care se va executa frotiul .- Se aplică apoi pe o lamă de sticlă, aşezată pe masa de lucru, într-un unghi de

aproximativ 30o, astfel încât picătura de sânge să se întindă prin capilaritate la marginea de contact dintre cele două lame;

- Se imprimă lamei şlefuite o mişcare de translaţie uşoară, ceea ce va permite sângelui să se întindă într-un strat subţire;

- Imediat după întinderea frotiului, lama se agită pentru uscarea rapidă a acestuia.2. Colorarea panoptică a frotiului de sângeReactivi şi materiale necesare

- Soluţia May-Grűnwald cu următoarea formulă: eozinat de albastru de metilen – 1g, glicerină neutră – 50ml., alcool metilic – 100ml.

- Soluţie Giemsa conţinând: eozinat de azur de metilen – 3g, azur de metilen – 0,8g, glicerină neutră – 250ml, alcool metilic 200ml.

- Apa distilată neutră sau apă tamponată.- Lame de sticlă.- Pipete Pasteur, pipete gradate.- Ceas.

Etapele colorării- Fixarea – frotiul se acoperă cu un număr cunoscut de picături din soluţia May-

Grűnwald şi se lasă 2-3 minute;- Colorarea – se face în doi timpi: timpul 1 – se adaugă peste soluţia May-

Grűnwald un număr egal de picături de apă distilată neutră sau apă tamponată, se omogenizează şi se lasă astfel 2 minute; timpul 2 – se îndepărtează soluţia de pe lamă fără să se spele, se acoperă lama cu soluţie Giemsa diluată în proporţie de 1-2 picături soluţie Giemsa concentrată la 1ml apă distilată neutră sau apă tamponată, după care se lasă în repaus

20 de minute , iar ulterior lama se spală sub jet puternic de apă şi se lasă pe stativ pentru uscare.3. Calcularea formulei leucocitare

Formula leucocitară reprezintă exprimarea procentuală a diferitelor categorii de leucocite şi se calculează după numărarea a cel puţin 200 de elemente pe frotiul de sânge.

Tehnica de lucru – Pe frotiu se pune o picătura de ulei de cedru şi se fixează poziţia microscopului, folosind obiectivul cu imersie, diafragmul deschis şi condensatorul sus.

Se parcurge frotiul deplasând preparatul într-un singur sens şi în zig-zag pentru a surprinde atât elementele marginale cât şi pe cele din mijlocul lamei (limfocitele au tendinţa de a se grupa spre centru, iar neutrofilele şi monocitele se dispersează spre margine şi în franjuri). Pe măsura ce se întâlnesc leucocitele, ele se notează pe categorii într-un tabel, în grupuri de câte 5 elemente, pentru diversele tipuri celulare folosindu-se notaţia:

- N = neutrofile nesegmentate- S = neutrofile segmentate- E = eozinofile- B = bazofile- L = limfocite- M = monocite- P = plasmocite

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10NSEBLMP

După numărarea a 200 de elemente se face procentajul fiecărei clase de elemente.Numărul absolut a diferitelor tipuri de leucocite – exprimă numărul de tip de leucocit

conţinut într-un mm3 de sânge. Se calculează printr-o regulă de trei simplă, cunoscând distribuţia procentuală şi numărul absolut total de leucocite/mm3.Exemplu:

- numărul de leucocite este de 6600/mm3

- limfocite 22%- deci, numărul absolut de limfocite este: (6600 x 22)/100 = 1452 limfocite/mm3

VALORI NORMALE ALE FORMULEI LEUCOCITARE

Neutrofile nesegmentate 0 - 4%Neutrofile segmentate 50 - 65%Eozinofile 1 - 4%Bazofile 0 - 1%Limfocite 20 - 40%Monocite 4 - 8%

Variaţiile cantitative ale numărului de leucocite se însoţesc de modificări în formula leucocitară.

1. Leucocitoză cu neutrofilie- infecţii localizate sau generalizate;- acutizări ale bolilor cronice;- intoxicaţii endogene sau exogene;- LGC (leucemia granulocitară cronică) etc.

2. Leucopenie cu neutropenie- în unele infecţii bacteriene (febra tifoidă, febre paratifoide);- infecţii virale (gripă, rujeolă, rubeolă);- colagenoza;- afecţiuni hematopoetice cu hipoplazie medulară;- agranulocitoză;- boli autoimune citotoxice-citolitice etc.

3. Leucopenie cu limfopenie- infecţii supraacute;- boala Hodgkin;- după tratament cu cortizon sau citostatice imunosupresive etc.

4. Leucocitoză cu limfocitoză- debutul TBC;- alte boli infecţioase;- LLC (leucemie limfatică cronică) etc.

5. Leucocitoză cu eozinofilie- stări imunoalergice;- parazitoze;- sindrom Löfler; boală Hodgkin;- LGC cu eozinofilie etc.

6. Leucocitoză cu bazofilie- Malarie;- intoxicaţie cu plumb;- tumori maligne;- LGC etc.

7. Monocitoză- boli infecţioase (mononucleoza infecţioasă, febra tifoidă);- parazitoze (malaria, trepanozomiaza);- leucemie mielomonocitară;- boala Hodgkin etc.