Capitolul 6

M surarea activit ii enzimatice

6.1. Determinarea activit ii enzimatice a unor enzime din diverse surse

6.1.1. Determinarea activit ii catalitice a peroxidazei din hrean Peroxidaza din hrean este o enzim (o glicoprotein ) cu masa

molecular de 44 KDa i care posed protohemin IX drept grupare prostetic . Pentru o activitate catalitic corespunz toare hemul este indispensabil.

Mecanismul de reac ie al peroxidazelor este descris în Schema 6.1. Enzima reac ioneaz cu un echivalent de ap oxigenat , reac ie în urma c reia rezult un cation-radical, în care atomul de fier î i schimb starea de oxidare (de la III la IV). Aceast reac ie de oxido-reducere implic cedarea a doi electroni. Un echivalent rezult de la ionul FeIII, dând na tere la intermediarul oxiferil (FeIV=O). Acest intermediar, I, oxideaz un substrat organic (AH2) la radicalul corespunz tor (·AH). Compusul rezultat sufer din nou o reac ie de oxidare (cel de-al doilea electron este cedat) conducând la intermediarul II, în care centrul oxiferil este coordinat de ligandul porfirinic normal (dianionic). În final, compusul II, este redus la starea nativ (feric ) concomitent cu oxidarea substratului.

Func ia peroxidazei este de a converti apa oxigenat , compus care poate produce unele reac ii metabolice nedorite, în ap i oxigen:

Int roducere în laboratorul de biochimie 144

Oxigenul poate adesea reac iona cu al i compu i din celul pentru a produce compu i secundari.

Schema 6.1. Mecanismul de ac iune al peroxidazelor în forma simplificat

Reac ia catalizat de peroxidaz poate fi m surat prin urm rirea form rii oxigenului rezultat prin dou variante:

a. acumularea gazului într-un sistem închis i m surarea acestuia cu ajutorul unui nanometru;

Figura 6.2. Determinarea enzimatic a peroxidazei prin intermediul oxid rii guiacolului la un dimer colorat

Activ ita tea enzimatic 145

b. prin apari ia unei forme �active� a oxigenului. O serie de compu i reac ioneaz cu oxigenul i sunt transforma i în compu i colora i. Drept donor de hidrogen se pot utiliza 5-amino-1,4-ftalazin-diona (luminol), 3-amino-9-etilcarbazolul (AEC), acid 5-amino-salicilic (5AS), 4-cloro-1-naftolul (4C1N), 3,3�-diamino-benzidina (DAB), o-dianisidina, guia-colul, o-fenilendiamina (OFD), acid ascorbic, rezorcina, pirogalol.

Peroxidaza este o enzim ideal pentru experimente, deoarece este u or de izolat din diferite surse (bacterii, vegetale, ciuperci sau animale).

Aplica ii Peroxidaza a fost folosit cu succes în imunologie prin legarea

acestei enzime de anticorpi în scopul localiz rii antigenilor. Reactivi i materiale 1) Solu ie stoc de ap oxigenat 10 mM (în tampon fosfat 100

mM pH 7); 2) Solu ie tampon 100 mM (fosfat pH 6); 3) Solu ie o-dianisidin 30 mM (10 mg într-un ml metanol); 4) Solu ie tampon de reac ie: 9,6 ml solu ie tampon + 0,1 ml

o-dianisidin 30 mM. Modul de lucru Într-o cuv din plastic se pipeteaz 0,97 ml solu ie tampon de

reac ie i 20 µl enzim . Se omogenizeaz con inutul dup care se adaug 10 µl de ap oxigenat . Se înregistreaz absorban a la 436 nm i 25 °C. Se m soar viteza de reac ie utilizând un coeficient de extinc ie

436 = 8300 M-1cm-1. Se determin viteza de reac ie men inând constant concentra ia

enzimei i temperatura de reac ie variind concentra ia apei oxigenate. Se va m sura viteza de reac ie la 15, 25, 37 °C folosind condi iile

ini iale de reac ie. Toate m sur torile vor fi repetate de cel pu in 3 ori. Se vor

determina urm torii parametri: Vmax, Km i Ea.

Int roducere în laboratorul de biochimie 146

Determinarea activit ii peroxidazei cu ajutorul fluorescen ei Sistemul peroxidaza/H2O2 a fost utilizat cu succes pentru detec ia

produ ilor de reac ie rezulta i în urma reac iilor catalizate de oxigenaze (P450). În prima faz substratul este un compus aromatic, de exemplu naftalina, care poate fi convertit la compu i aromatici hidroxila i. Compu ii rezulta i (de exemplu, - sau -naftolul) pot fi converti i în urma reac iei de oxidare de la un compus incolor la un substrat fluorescent. Compu ii aromatici hidroxila i formeaz dimeri sau polimeri, care în func ie de condi ii pot fi detecta i prin colorimetrie sau fluorescen , permi ând determinarea compusului ini ial.

Schema 6.3. Detec ia monooxigenazelor prin intermediul unei reac ii enzimatice cuplate în urma c reia rezult un produs fluorescent

Pe aceea i reac ie se bazeaz i detec ia bacteriilor ce produc peroxidaza în medii lichide sau solide prin ad ugarea apei oxigenate. Mutan ii care dau reac ie pozitiv se disting prin propriet i colorime-trice sau fluorescente.

Reactivi Solu ie tampon: PBS pH 7,4 (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4,

0,24 g KH2PO4 la 1 litru solu ie); Solu ie 1: 0,01 M -naftol în metanol; Solu ie 2 (se prepar proasp t ): solu ie diluat de peroxidaza din

hrean; Ap oxigenat 30%. Modul de lucru

La 975 µl solu ie tampon se adaug 10 µl solu ie 1. Se adaug 5 µl ap oxigenat 30%, 10 µl solu ie 2. Rezult produ i de reac ie care prezint fluorescen albastr . Fluorescen a relativ a produ ilor de

Activ ita tea enzimatic 147

reac ie se m soar dup 1, 5 i 10 min. Se repet m sur torile utilizând diverse concentra ii de -naftol men inând constan i ceilal i parametri. Toate m sur torile se execut în triplicat.

Întreb ri 1. Ce ioni metalici se g sesc în structura peroxidazelor? 2. Care sunt sursele vegetale ce con in o cantitate mare de

peroxidaz ? 3. Care este maximul de emisie al compusului fluorescent rezultat

în urma conversiei naftolului asistat de peroxidaz ? 4. Poate fi folosit peroxidaza la determinarea concentra iei apei

oxigenate?

Bibliografie 1. Tauber, H. i Petit, E.L. (1952) Convenient methods for preparing

crystalline catalase from cow liver, JBC, 195, 703. 2. Bisswanger, H. (2004) Practical Enzymology, Wiley-VCH GmbH,

Weinhein. 3. Torres, E. i Ayala, M. (2010) Biocatalysis based on heme

peroxidises: Peroxidases as potential industrial biocatalysts, Springer-Verlag, Berlin.

4. Moller, K. M. i Ottolenghi, P. (1966) The oxidation of o-dianisidine by H2O2 and peroxidase at neutral pH. C.R Trav Lab Carlsberg, 35(16), 369-389.

5. Claiborne, A. i Fridovich, I. (1979) Chemical and enzymic intermediates in the peroxidation of o-dianisidine by horseradish peroxidase. 2. Evidence for a substrate radical-enzyme complex and its reaction with nucleophiles, Biochemistry, 18 (11), 2329-2335.

6. Hamilton, T.M., Dobie-Galuska, A.A. i Weintstock, S.M. (1999) The o-phenylenediamine-horseradish peroxidise system: enzyme kinetics in the general chemistry laboratory, J Chem Edu., 76(5), 642.

7. Joo H., Arisawa, A., Lin, Z. i Arnold, F.H. (1999), A high-throughput digital imaging screen for the discovery and directed evolution of oxygenases, Chem. Biol., 6, 699-706.

8. http://www.worthington-biochem.com/hpo/default.html