ing. valentina floran rezumatul tezei de doctorat · fiind şi un remediu valoros în tratarea...

Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat

1

UNIVERSITATEA DE ŞTIIN ŢE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă VETERINAR Ă

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORAL Ă

FACULTATEA DE HORTICULTUR Ă

Ing. Valentina FLORAN

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Analize genetice spaţiale în populaţii naturale de

pin silvestru (Pinus sylvestris L.)

Conducător ştiin ţific:

Prof. univ. dr. Radu SESTRAȘ

Cluj-Napoca

2011


2

CUPRINS

INTRODUCERE ……………………………………………………………………………….. 3

CAPITOLUL I CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND PINUL SILVESTRU ……………………………

5

1.1 Distribuţia pinului silvestru........................................................................................... 6

1.2. Importanţa pinului silvestru........................................................................................... 6

CAPITOLUL II STADIUL ACTUAL AL CUNOA ŞTERII PRIVIND DISTRIBU ŢIA POSTGLACIAL Ă A SPECIEI PINUS SYLVESTRIS..............................................................

8

2.1. Consecinţe genetice ale schimbărilor climatice din timpul cuaternarului...................... 8

2.2. Scopul şi obiectivele cercetării …….............................................................................. 9

2.1.2. Obiectivele cercetării.......................................................................................... 10

CAPITOLUL III MATERIALUL ŞI METODELE DE CERCETARE ...............................................................

11

3.1. Materialul de cercetare ….............................................................................................. 11

3.2. Metodele de analiză utilizate în laborator …………………………………………… 12

CAPITOLUL IV REZULTATE OB ŢINUTE ……………………………………………………………...............

13

4.1. Diversitatea genetică a pinului silvestru din românia, ungaria şi suedia la nivelul ADN-ului mitochondrial.......................................................................................................

13

4.2. Diversitatea genetică a pinului silvestru din românia, ungaria şi suedia la nivelul ADN-ului cloroplastic...........................................................................................................

16

4.3. Structura genetică spaţială în populaţii naturale de pin silvestru................................... 25

4.3.1. Interpolarea genetică a populaţiilor de pin silvestru din România, Ungaria şi Suedia...........................................................................................................................

25

4.3.1.1. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial pentru populaţiile din România şi Ungaria…………………………………….

25

4.3.1.2. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial a populaţiilor din Suedia………….……………………………………...............

26

CAPITOLUL V DISCUŢII ŞI CONCLUZII PRIVIND EVOLU ŢIA POSTGLACIARA A PINULUI SILVESTRU ŞI TENDIN ŢELE ACTUALE DE MIGRARE…………………

31

5.1.Contribuţii personale................................................................................................. 34

Rezumatul în limba engleză............................................................................................................. 35

Bibliografie selectivă……………………………………………………………………………... 45


3

INTRODUCERE

Gestionarea durabilă a pădurilor trebuie să aibă în vedere atât măsurile silviculturale

specifice, în acord cu cerințele ecologice ale speciilor, cât și considerentele de ordin genetic legate

de cunoașterea și gestionarea diversității genetice existente în arboretele naturale și cele artificiale.

Faptul că pădurile naturale dispun de o diversitate genetică mare, face ca acestea să se preteze

foarte bine programelor de ameliorare şi conservare a germoplasmei, în comparaţie cu arboretele

artificiale, acestea din urmă prezentând adesea un nivel mai redus al diversităţii genetice.

Schimbările climatice survenite în timpul Cuaternarului şi-au lăsat amprenta puternic

asupra structurii neutre a diversităţii genetice în cadrul populaţiilor aparţinând diferitelor specii de

arbori. În Europa şi America de Nord, repetatele cicluri glaciare şi interglaciare au forţat speciile

din zonele temperate să se retragă în refugii, de-a lungul perioadelor de creştere a gheţii şi

permafrostului fiind posibilă apoi migrarea lor în perioadele de încălzire interglaciare spre regiuni

unde condiţiile climatice le-au permis să supravieţuiască (IBRAHIM şi colab., 1996; TABERLET

şi colab., 1998; HUNTLEY, 1983; BENNETT şi colab., 1991; CHEDDADI şi colab., 2005).

Istoria recolonizării arborilor forestieri ajută la înţelegerea condiţiilor climatice şi de habitat

ale acestora în diferite regiuni din Eurasia în perioada Erei Glaciale. Deşi cele mai multe dintre

specii au avut ca refugiu aceeaşi regiune, dinamica şi căile de recolonizare diferă de la o specie la

alta, astfel încât speciile cu o toleranţă mare la temperaturi scăzute, cum sunt Picea, Pinus, Betula,

sunt considerate a fi originare din zone vestice şi nordice (LAGERCRANTZ şi RYMAN, 1990;

PALME şi colab., 2003).

Pinul silvestru sau pinul de pădure (Pinus sylvestris) este considerat a fi un relict glaciar,

datând din Terţiar (MIROV, 1967) şi având o istorie foarte complexă din punct de vedere al

posibilelor zone de refugiu răspândite pe întreg teritoriul Europei (BIRKS, 1989; TANTĂU şi

colab., 2006; WILLIS şi van ANDEL, 2004). Studiul polenului, macro-şi mega-fosilelor, a

profilelor sedimentare, precum şi datele istorice dovedesc că distribuţia pinului silvestru în sudul


4

Europei a început cu aproximativ 16000 de ani în urmă, ajungând în nordul Scandinaviei cu

aproximativ 7800 de ani în urmă (TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS, 1998; CRITCHFIELD şi

LITTLE, 1966; GODWIN, 1956). Odată cu schimbările climatice survenite acum 500 de ani,

limita nordică a distribuţiei pinului s-a retras spre sud (WILLIS şi colab., 1998). Istoria acestor

specii, refugiile glaciare, rata de supravieţuire, precum şi distribuţia lor după era glaciară, poate fi

urmărită atât prin analiza fosilelor, cât şi cu ajutorul markerilor moleculari (ECKERT 2006,

WILLYARD şi colab., 2007). Astfel, WILLYARD şi colab. (2007) au putut evidenţia fosile de P.

belgica vechi de aproximativ 130 de milioane de ani.

Studiile filogeografice ale dinamicii populaţiilor în timp şi spaţiu, precum şi ale structurii

speciilor la nivel molecular folosind markerii organelari, au arătat că cele mai mari refugii de pin

silvestru au fost localizate în Munţii Balcani, Munţii Alpi şi Peninsula Iberică (BENNETT şi

colab., 1991; HUNTLEY şi BIRKS, 1983). Analiza polenului fosil indică faptul că abundenţa

genului Pinus în Europa a fluctuat de-a lungul sutelor de ani, în funcţie de ciclurile climatice care

au avut loc (CHEDDADI şi colab., 2005; MUELLER şi colab., 2003). În perioada apogeului erei

glaciare (37000 - 16000 de ani în urmă), Fennoscandia (Norvegia, Suedia, Finlanda, Peninsula

Kola şi Karelia) , precum şi părţile vestice din nordul Rusiei au fost acoperite cu gheaţă, însă odată

cu retragerea acesteia, pe parcursul ultimilor 10000 de ani, regiunea a fost colonizată de P.

sylvestris. Pe baza evidenţelor paleoecologice şi genetice au fost făcute numeroase sugestii despre

istoria filogeografică a pinului silvestru în timpul şi după Era Glaciară.

În cadrul cercetărilor aferente acestei teze de doctorat s-a urmărit analiza genetică a pinului

silvestru cu ajutorul markerilor moleculari (ADN mitocondrial şi cloroplastic), cu scopul de a

identifica zonele în care acesta a supravieţuit perioadei glaciare şi de a reconstitui căile de

recolonizare în areale cum ar fi România, Ungaria şi Suedia, urmărind bineînţeles şi diversitatea

genetică din cadrul acestor populații considerate resurse genetice în domeniul forestier.


5

CAPITOLUL I

CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND PINUL SILVESTRU

1.1.DISTRIBUŢIA PINULUI SILVESTRU

Pădurea de conifere reprezintă cel mai întins habitat terestru din lume, în emisfera nordică

ea ocupând o fâşie lată de aproximativ 1300 km.

La nivel global, din suprafaţa totală ocupată cu păduri, un procent de 37% este reprezentat

de pădurile de pin, în timp ce în emisfera nordică acestea ocupă 70% (MIROV, 1967). Dintre

toate speciile de pin, pinul silvestru sau pinul de pădure (P. sylvestris L.) are cea mai largă

distribuţie geografică, care se întinde din nordul Scandinaviei până în sudul Spaniei, şi din vestul

Scoţiei până în Estul Siberiei, la Marea Okhotsk. În cadrul acestui areal, populaţiile de pin

silvestru pot fi întânite la diferite altitudini, în nord fiind prezent de la nivelul mării până la 1000

m, în timp ce limita cea mai sudică este cuprinsă între 1200-2600m altitudine (Sierra Nevada,

Spania).

Pinul silvestru este cel mai răspândit conifer de pe Glob, ocupând circa 143 milioane ha

(37% din suprafaţa împădurită a globului). În România este pinul silvestru puţin răspândit în

comparaţie cu alte ţări, vegetând spontan, în masiv, la altitudini cuprinse între 310m, Dofteana-

Baciu, şi 1600 m, în Munţii Retezat, insular, în lungul Carpaţilor şi în Munţii Apuseni, pe stâncării

aride, turbării etc. Astăzi, bazinul râului Trotuş reprezintă cea mai mare zonă în care pinul este

menţinut sub formă de pădure pură sau în amestec cu molid, brad, stejar. Standuri naturale, unele

fiind de mare productivitate, se găsesc în iazuri ca: Buzău, Râmnic, Putna, Oituz. În general,

limitele sale de răspândire sunt cuprinse între 300 m altitudine în Subcarpaţii Moldovei şi Valea

Oltului şi aproximativ 1900 m în Retezat, izolat în bazinul Gemenele. Distribuţia generală a


6

vegetaţiei forestiere de pe teritoriul României este, pe de o parte, rezultatul evoluţiei generale a

vegetaţiei din Europa, după perioada Postglaciarului, fiind determinată climatic, iar pe de altă

parte, a intervenţiei antropice manifestată atât prin reducerea suprafeţelor deţinute de pădure, cât şi

prin transferul de seminţe şi puieţi.

Fig. 1.1. Arealul pinului silvestru (după DUCUSSO A., Euforgen 2009) Fig. 1.1. Scots pine distribution range (DUCUSSO, A., Euforgen 2009)

1.2. IMPORTANŢA PINULUI SILVESTRU

Pinul silvestru este o specie foarte importantă din punct de vedere comercial. Lemnul

cu duramen roşcat, cu proprietăţi mecanice bune este uşor de prelucrat fiind folosit în

diferite industrii (lemn de cherestea, lemn de construcţii, lemn de celuloză, lemn de mină

etc.). Cheresteaua este numită în limbaj industrial „afacere roşie”(lemn cu duramen roşu),

fiind clasificată drept "lemn moale" şi utilizată pentru o gamă largă de produse, de la

construcţii de case şi bărci, la traverse de cale ferată, mobilier, jucării. Multe hectare de

pădure de pin sunt plantate în fiecare an pentru a furniza industriei lemnul necesar

(PRAVDIN, 1969).


7

Calităţile tehnologice ale lemnului depind în mare măsură de bonitatea staţiunii.

Rusticitatea remarcabilă de care dă dovadă pinul silvestru l-a impus ca specie de primă

importanţă în culturile forestiere din staţiuni de bonitate inferioară, în scopul fixării solului,

asigurând totodată şi o producţie apreciabilă de masă lemnoasă.

După anul 1960, pinul silvestru a fost utilizat frecvent pentru substituirea arboretelor

slab productive de fag, gorun, gârniţă, cer etc., cultivându-se anual pe circa 6000 - 7000 de

hectare (TURNOCK, 2002).

Duşmanii pinului sunt nematodele care provoacă ofilirea, cel mai des întâlnită la

puieţii tineri, de până la 10 ani, provocând moartea acestora în doar câteva săptămâni

(LOWE, 2011).

Cu un conţinut de răşină foarte mare, pinul silvestru se pretează la rezinaj, fiind

derulate programe de selecţie a fenotipurilor valoroase, preconizându-se instalarea de culturi

cu o astfel de destinaţie. Pinul silvestru este de asemenea utilizat cu mult succes şi la

împădurirea terenurilor degradate, mai ales în Transilvania.

În Finlanda şi ţările scandinave, pinul a fost utilizat pentru producerea gudronului în

epoca pre-industrială. Şi acum mai există producători activi de gudron, dar ca şi industrie

aceasta a încetat să mai existe.

Din punct de vedere medicinal, produsele din pin sunt utilizate ca diuretice şi iritante,

fiind şi un remediu valoros în tratarea problemelor de rinichi, boli reumatice şi infecţii ale

mucoasei respiratorii. Din ace, crengi şi scoarţă, care conţin o răşină lipicioasă cu miros

plăcut, sunt extrase substanţe cum ar fi: colofoniu, terebentină şi uleiuri esenţiale.

Terebentina nu este altceva decât esenţa distilată a răşinii brute de pin. Uleiul de terebentină

este folosit pentru uz extern ca stimulent pentru umflături reumatice, pentru entorse,

echimoze şi împotriva paraziţilor. Gudronul este folosit în medicină, în special în practica

veterinară, ca şi stimulent antiseptic, cu acţiune diuretică şi diaforetic.

Colofoniul a fost folosit pentru acoperirea plăcilor de zinc sau cupru, în tipărirea

imaginilor gravate şi pentru arcurile de vioară. Uleiul esenţial de pin nu se distilează direct

din răşină brută, ci cu abur, din ramurile şi acele proaspete, la fel ca şi terebentina.


8

CAPITOLUL II

STADIUL ACTUAL AL CUNOA ŞTERII PRIVIND DISTRIBU ŢIA

POSTGLACIAL Ă A SPECIEI PINUS SYLVESTRIS

2.1. CONSECINŢE GENETICE ALE SCHIMBĂRILOR CLIMATICE DIN

TIMPUL CUATERNARULUI

Efectele schimbărilor climatice asupra speciilor de plante sunt cel mai bine cunoscute în

urma analizelor polenului fosil găsit în decursul ultimilor 20000 de ani în Europa şi America de

Nord (HUNTLEY şi BIRKS, 1983; HUNTLEY şi WEBB, 1988; HUNTLEY, 1990).

Studiul polenului, macro-şi mega-fosilelor, a profilelor sedimentare, precum şi datele

istorice dovedesc că distribuţia pinului silvestru în sudul Europei a început cu aproximativ

16000 de ani în urmă, ajungând în nordul Scandinaviei cu aproximativ 7800 de ani în urmă

(TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS, 1998; CRITCHFIELD şi LITTLE, 1966; GODWIN,

1956). Istoria acestor specii, refugiile glaciare, rata de supravieţuire şi distribuţia lor după

era glaciară, poate fi urmărită prin analiza fosilelor şi cu ajutorul markerilor moleculari.

Răspândirea postglaciară a speciilor a fost influenţată şi de topografia fiecărei regiuni.

Studiile filogeografice ale dinamicii populaţiilor în timp şi spaţiu, ale structurii speciilor

la nivel molecular folosind markerii organelari, au arătat că cele mai mari refugii de pin silvestru

au fost localizate în Munţii Balcani, Munţii Alpi şi Peninsula Iberică (BENNETT şi colab.,

1991; HUNTLEY şi BIRKS, 1983). Analiza polenului fosil a indicat faptul că, abundenţa

genului Pinus în Europa a fluctuat de-a lungul sutelor de ani în funcţie de ciclurile climatice. În

perioada apogeului erei glaciare (37000 - 16000 de ani în urmă), Fennoscandia (Norvegia,


9

Suedia, Finlanda, Peninsula Kola şi Karelia), precum şi părţile vestice din nordul Rusiei au fost

acoperite cu gheaţă, însă odată cu topirea acesteia, pe parcursul ultimilor 10000 de ani, regiunea

a fost colonizată de P. sylvestris.

Numeroase studii pe aloenzime şi un număr tot mai mare de analize de ADN din

organite celulare (ADNcp şi ADNmt) demonstrează că populaţiile de plante care au fost

izolate în anumite areale prezintă o diversitate genetică mai ridicată decât celor dezvoltate

ulterior şi provenite din acestea.

Reducerea diversităţii genetice, în rândul populaţiilor, odată cu creşterea distanţei faţă

de refugiu prin expansiunea postglacială, în general înspre nord, este un fenomen general

datorat constrângerilor genetice repetate. Populaţiile considerate refugii glaciare (cum sunt

cele din sudul Europei) este posibil să fi menţinut o mare parte a variaţiei genetice existente

şi, prin urmare, este indicat a fi folosite cu precădere în programele de conservare genetică.

2.2. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII

Scopul principal al temei de cercetare este studiul structurii genetice spaţiale a pinului

silvestru (Pinus sylvestris L.), de un interes major în procesul de adaptabilitate climatică,

producţie şi conservare a resurselor genetice forestiere a acestei specii. Acest studiu a

urmărit, de asemenea, cuantificarea diversităţii genetice intra şi interpopulaționale a speciei,

în populaţii provenite din trei ţări diferite altitudinal şi latitudinal: Suedia, România şi

Ungaria, în vederea caracterizării structurii lor genetice şi a modului lor de adaptare, precum

şi cu scopul identificării posibilelor rute ale colonizării în perioada postglacială. Datele

obținute vor fi folosite pentru a face recomandări privind modul de adaptare al pinului

silvestru la viitoarele schimbări climatice produse de încălzirea globală; la alegerea şi

utilizarea haplotipurilor valoroase ca material de reproducere în diferite zone geografice.


10

2.2.1. Obiectivele cercetării

Pentru atingerea scopului cercetărilor s-au stabilit următoarele obiective de cercetare:

- evaluarea diversităţii intra- şi interpopulaţionale a unor populaţii naturale de pin

silvestru din România, Ungaria şi Suedia;

- evidenţierea haplotipurilor existente la nivelul ADN-ului mitocondrial şi ADN-ului

cloroplastic atât prin tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction), cât şi prin metoda

electroforezei capilare (Capilary electrophoresis -Sequencing Analysis);

- identificarea refugiilor glaciare din care provin populaţiile de pin silvestru din

România, prin verificarea ipotezei conform căreia Ungaria este zonă de refugiu a pinului

silvestru în perioada glaciară (revizuit de WILLIS şi van ANDEL 2004), precum şi căile de

recolonizare postglaciară pe teritoriul ţării;

- evaluarea diversităţii genetice şi identificarea căilor de recolonizare a populaţiilor de

pin silvestru pe teritoriul Suediei, în zona de nord a distribuţiei acestuia;

- elaborarea de concluzii privind influenţa schimbărilor climatice asupra diversităţii

genetice, evoluţiei şi migraţiei populaţiilor de pin silvestru;

- formularea de recomandări privind alegerea haplotipurilor cu capacitate mare de

adaptare viitoarelor schimbări climatice (de exemplu încălzirea globală preconizată) în

funcţie de zona de interes.


11

CAPITOLUL III

MATERIAL ŞI METODE DE CERCETARE

3.1. MATERIALUL DE CERCETARE

În cercetările aferente prezentei teze de doctorat s-au analizat 13 populaţii naturale de

pin silvestru din România, 2 populaţii din Ungaria şi 53 populaţii din Suedia. Recoltarea

materialului vegetal, respectiv muguri (România, Ungaria şi Suedia) şi ace (Suedia) s-a

desfăşurat în două perioade diferite ale anului II de studiu 2010, respectiv anul III 2011.

Pentru a putea lua în studiu întreaga distribuţie a pinului silvestru de pe teritoriul

României, au fost recoltate populaţiile din zona centrală, respectiv interiorul lanţului Munţilor

Carpaţi (etapa I a recoltării), dar şi partea nord-estică, respectiv, exteriorul lanţului Carpatic

(etapa II a recoltării). Alegerea populaţiilor a fost făcută pe baza Catalogului Rezervaţiilor de

Seminţe, catalog întocmit la nivelul Regiei Naţionale a Pădurilor şi care cuprinde întreaga

suprafaţă a ţării.

Populaţiile din Suedia luate în studiu au provenit din două loturi de experimente cu

provenienţă diferită. Prima serie de provenienţe se află în Sävar, lângă Umeå, la 63˚53'N

20˚32'E, iar materialul a fost furnizat de către Institutul de Cercetări Silvice, Skogforsk. A

doua serie a fost în Remmingstorp, lângă Skövde, la 58˚27'N 13˚40'E şi au fost furnizate de

către Skogssällskapet AB.


12

3.2. METODE DE ANALIZĂ UTILIZATE ÎN LABORATOR

Procesul de izolare al ADN-ului la toate variantele de studiu din România s-a realizat

utilizând protocolul de extracţie ADN creat de LODHI (1994) şi îmbunătăţit de către POP

(2003). În cadrul populaţiilor din Suedia, extracţia ADN s-a ralizat după protocolul CTAB

(DOLYE & DOLYE 1987). Cantităţile de ADN obţinute au variat între 1000 ng/µl şi 6500

ng/µl. Toate probele au avut puritate destul de ridicată, raportul celor două citiri (A260-

A280) s-a încadrat între valori de 1,7 şi 1,9

Primerii folosiţi pentru amplificarea ADN-ului mitocondrial au fost aleşi pe baza

studiilor similare (PYHÄJÄRVI şi colab., 2008; NAYDENOV şi colab., 2007; CHEDDADI

şi colab., 2006); astfel, au fost folosite 2 seturi de primeri, şi anume nad1 intron B/C creat de

SORANZO şi colab. (2000) şi nad7 intron1 creat de JARAMILLO-CORREA (2003).

Nivelul variaţiei genetice intra şi interpopulaţionale a fost urmărit la nivelul

secvenţelor microsatelit din cloroplaste în toate cele 68 populaţii naturale de pin silvestru.

Pentru amplificarea ADN-ului cloroplastic s-au folosit 18 primeri microsateliţi (cpSSR).

Aceştia au fost concepuţi şi testaţi pentru prima dată pe 6 specii diferite de pin printre care şi

P. thunbergii, de către POWELL şi colab. (1995); VENDRAMIN şi colab. (1996). În urma

optimizării condiţiilor PCR de amplificare, pentru a continua analizele au fost aleşi 14

primeri (PCP26106, PCP30277, PCP36567, PCP41131, PCP45071, PCP1289, PCP48256,

PCP63771, PCP71987, PCP87314, după PROVAN şi colab. (1998), Pt87268, Pt1254,

Pt71936, Pt15169 după VENDRAMIN şi colab. (1996).

În vederea evidențierii diversității genetice la nivelul markerilor mitocondriali şi

cloroplastici, datele rezultate în urma interpretării gelurilor de agaroză (cazul primerilor

mitocondriali) şi a cromatrogramelor (cazul primerilor cloroplastici) au fost prelucrate cu

ajutorul diferitelor programe de analiză genetică: CONTRIB, FSTAT, ARLEQUIN, BAPS

şi AIS, fiind determinați diferiţi parametrii.


13

CAPITOLUL IV

REZULTATE OB ŢINUTE

4.1. DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA, UNGARIA

Şi SUEDIA LA NIVELUL ADN-ULUI MITOCONDRIAL

Din punct de vedere al diversităţii genetice a pinului silvestru au fost identificate două

haplotipuri distincte de ADNmt, din care cel mai reprezentativ este haplotipul AA, întâlnit în

toate cele 15 populaţii analizate, urmat de haplotipul AB comun în partea centrală a ţării şi în

proporţie redusă în cele 2 populaţii din Ungaria.

O importanţă deosebită este atribuită acestui studiu datorită faptului că nici un alt

studiu anterior cu privire la rutele de colonizare a pinului silvestru în Europa nu au cuprins şi

populaţii din România, cu excepţia lui NAYDENOV şi colab. (2007), care au studiat o

singură populaţie din Cugir (rezervaţie de seminţe), observând prezenţa unui singur hapotip,

haplotipul AA.

Prezenţa haplotipului BA într-o singură populaţie din România este corelată cu

prezenţa aceluiaşi haplotip în Peninsula Iberică şi Munţii Balcani (NAYDENOV şi colab.,

2007), fiind posibilă migrarea acestuia de-a lungul timpului spre România, datorită

topografiei şi poziţiei izolate a Peninsulei Iberice. Probabilitatea unei deplasări ale

seminţelor pe distanţe aşa lungi ar fi mai mare în cazul populaţiilor mai nordice şi estice ale

distribuţiei pinului silvestru datorită lipsei barierelor majore (munţi). O altă explicaţie

plauzibilă pentru prezenţa atât de rară a acestui haplotip (datorită alelei B a locusului nad1)

în populaţia din România şi în câteva populaţii din Balcani, ar fi aceea conform căreia alela

B este o alelă veche care a fost prezentă în era glaciară în mai multe refugii din zona de sud a


14

Europei. Frecvenţa ridicată sau scăzută a acestei alele este datorată variaţiei stochastice, în

special în cazul în care refugiile din sud au trecut prin puternice fenomene de bottleneck, sau

datorită intervenţiilor umane.

Prezenţa alelei B a locusului nad7 în proporţie de aproximativ 50% în majoritatea

populaţiilor din România nu poate fi explicată ca fiind o mutaţie din timpul Holocenului,

deoarece ea este foarte răspândită în populaţii din nord - estul Europei (NAYDENOV şi

colab., 2007), făcând de asemenea parte din populaţii nordice considerate zone de refugiu

(SINCLAIR şi colab., 1999).

Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu ipoteza conform căreia Ungaria şi Cehia

sunt considerate refugii ale pinului silvestru în era glaciară, după cum arată studii ale

polenului fosil (revizuit de WILLIS şi van ANDEL 2004). Se pot urmări două căi de migrare

din refugiu şi colonizare a României, astfel, prima rută de colonizare cel mai probabil s-a

realizat din populaţia Fenyőfő din partea de sud-vest a Ungariei, populaţie considerată relict,

urmând fluviul Dunărea ce străbate Ungaria şi Romania, fiind astfel posibil transportul

seminţelor pe această cale spre populaţiile din exteriorul arcului Carpatic: Vâlcea, Vrancea şi

Suceava. Cea de-a doua rută de colonizare s-a realizat prin transportul seminţelor cu ajutorul

vântului sau a apei din partea de nord - vest a Ungariei, respectiv din populaţia Velemer

considerată de asemenea relict, prin partea central - nordică a României, colonizând zonele

din interiorul Munţilor Carpaţi. De asemenea, pentru Picea abies, conifer foarte comun în

Europa şi rezistent la temperaturi scăzute, Munţii Carpaţi au fost consideraţi zonă de refugiu

în timpul glaciaţiunii (GUGERLI şi colab., 2001).


15

Fig. 4.6. Distribuţia haplotipurilor mitocondriale în popula ţiile analizate

din România şi Ungaria Fig. 4.6. Distribution of mitochondrial haplotypes in populations from Romania and Hungary

Populaţiile din Suedia au evidenţiat prezenţa haplotipului AA la 80% dintre indivizii

analizaţi, iar a haplotipul AB întâlnit la doar 20% dintre indivizi. De asemenea haplotipul

BA a fost nesemnificativ reprezentat datorită prezenţei într-o sigură populaţie din cele 54

populaţii analizate. Din analizele realizate în cadrul acestei teze de doctorat se poate

concluziona, de asemenea, faptul că pinul silvestru a colonizat Suedia urmând două rute

principale care se întâlnesc în centrul ţării, ipoteză susţinută şi de TABERLET şi colab.

(1998), SINCLAIR şi colab. (1999). O rută a colonizării porneşte din partea de nord-est a

Europei şi iar cea de-a doua, din sudul Europei, întâlnindu-se în centrul Suediei, fapt ce

poate fi observat din figurile prezente în teză (Figura 4.6., Figura 4.7.).


16

Fig. 4.7. Distribuţia haplotipurilor mitocondriale în popula ţiile analizate din Suedia Fig. 4.7. Mitochondrial haplotypes distribution in populations from Sweden

4.2. DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA, UNGARIA

Şi SUEDIA LA NIVELUL ADN-ULUI CLOROPLASTIC

În analizele ADN-ului cloroplastic fiecare locus analizat a fost polimorf, prezentând

în medie 2 până la 6 alele. Pe baza acestei frecvenţe a alelelor se observă o distribuţie


17

unimodală la nivelul fiecărui locus, cu alele ce se diferenţiază prin una sau două perechi de

baze. Aceasta sugerează faptul că cea mai mare parte a variaţiei observate poate fi explicată

datorită erorilor care apar în timpul replicării ADN-ului prezent în markerii microsatelit

(VALDES şi colab., 1993; DIRIENZO şi colab., 1994, FREIMER şi SLATKIN 1996).

Datorită faptului că genomul cloroplastic nu este supus procesului de recombinare,

variabilitatea observată la nivel de ADN nu poate fi explicată prin crossing-over. În urma

analizei frecvenţelor microsatelit din ADN-ul cloroplastic, obţinute prin amplificarea cu 14

primeri, s-a evidenţiat un nivel foarte ridicat al variaţiei. Astfel, în 288 de indivizi analizaţi,

din România şi Ungaria, s-au identificat 235 de haplotipuri diferite, din care 182 (77%) sunt

haplotipuri unice, ele aparţinând câte unui singur individ. Aceasta înseamnă că 63% (182 din

288) din indivizii analizaţi au avut un profil unic la nivelul locilor microsatelit analizaţi; la

nivelul întregului studiu 82% dintre indivizii analizaţi au prezentat haplotip caracteristic.

În vederea grupării populaţiilor pe baza relaţiilor genetice s-a folosit programul

BAPS. Utilizând opţiunea de grupare a populaţiilor (clustering of populations) s-a presupus

un număr K=15 sau K=3 de populaţii, rezultând o grupare a populaţiilor în 2 mari clustere

reprezentate în figura de mai jos.

Considerând modul de transmitere a ADN-ului cloroplastic pe cale paternă prin

polen, fluxul de gene este mult mai mare, răspândirea polenului fiind posibilă pe distanţe

foarte mari de zeci şi chiar sute de kilometri. Astfel se poate observa o diversitate ridicată în

cadrul populaţiilor analizate. Cele 15 populaţii au fost astfel grupate în două clutere cu o

proporţie de 50:50 în fiecare cluster reprezentate pe hartă prin culoarea galben şi maro.

Populaţiile din ambele ţării au fost analizate împreună pentru a evidenţia legătura genetică

dintre acestea, fapt ce poate susţine ipoteza lui WILLIS van ANDEL 2004, Ungaria fiind

considerată refugiu glaciar pentru această specie.


18

Fig. 4.11. Distribuţia clusterelor cloroplastice rezultate în urma analizei bayesiene Fig. 4.11. Distribution of the chloroplast clusters given by BAPS program

Prin analiza ADN-ului cloroplastic al celor 54 de populaţii, cu ajutorul celor 14

primeri microsatelit, s-a evidenţiat un număr de 230 haplotiuri unice fiecărui individ din

totalul de 317 indivizi analizaţi (Figura 4.13.). Un nivel ridicat al diversităţii intra şi

interpopulaţionale poate fi observat şi comparativ cu analizele ADN-ului mitocondrial,

datorită modului de transmitere a ADN-ului cloroplastic, şi anume pe cale paternă cu

ajutorul polenului, caz în care fluxul de gene este mult mai mare.

Astfel, utilizând varianta de calcul “clustering individuals” sau populaţii “ clustering

groups of populations” s-a observat o grupare a populaţiilor în 4 clustere. Aceste clustere

prezintă o distribuţie aproximativ egală de-a lungul întregii ţării, subliniind astfel gradul

ridicat de diversitate la nivelul populaţiilor analizate.

Diferenţierea genetică între populaţiile din România şi cele din Ungaria, la nivelul

ADN-ului cloroplastic, a înregistrat o valoare de Gst= 0,0549 ceea ce indică o diferenţiere

destul de ridicată a populaţiilor comparativ cu valorile înregistrate în cazul ADN-ului

mitocondrial. Nivelul diversităţii genetice totale (HTCP) se situează în jurul valorii de 52%.


19

Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice a fost găsită în populaţia Caraş Severin

(HSCP= 0,496) (Tabelul 4.23.), urmată de populaţia Gurghiu (HSCP =0.491), iar valoarea cea

mai scăzută a fost înregistrată în populaţia Timişoara (HSCP =0.4256) şi Reghin (HSCP =

0.4348).

Fig. 4.13. Reprezentarea geografică a clusterelor ADN-ului cloroplastic rezultate în urma analizei bayesiene

Fig. 4.13. Geographical distribution of the chloroplast clusters resulted from BAPS analy


20

Tabelul 4.23. Table 4.23.

Parametrii diversitt ăţii genetice intrapopulaţionale pentru populaţiile de pin silvestru analizate în România şi Ungaria; N-mărimea eşantionului, H SMT/SCP-diversitatea genetică medie în ADN-uli mitochondrial,cloroplastic ASMT/SCP-diversitatea alelelor mitocondriale, cloroplastice, Gst, Nst- diferenţierea genetică interpopulaţională

Genetic diversity parameters for scots pine analyzed population from Romania and Hungary; N-sample size, HSMT/SCP-mitochondria/chloroplast mean genetic diversity, ASMT/SCP- mitochondrial/chloroplast allelich richness, Gst, Nst- genetic

differentiation within populations

Ţara Judeţul Locaţia Longitudine Latitudine Marimea eşantionului

HSMT ASMT BAPS

HSCP ASCP G-W

Country County Location Longitude Latitude Sample size Mitocondria Cloroplast

Romania Alba Baia de Aries 23°20’00” 46°24’33” 20 0.218 0.433 2,3 0.465 0.996 1.038 Romania Alba Sebes 23°30’09” 45°53’32” 20 0.505 0.505 2 0.448 0.996 1.196 Romania Mures Gurghiu 24°51’16” 46°46’28” 20 0.478 0.456 2 0.491 0.995 0.914 Romania Mures Reghin 24°31’42” 46°53’02 20 0.442 0.456 2 0.434 0.996 0.989 Romania Sibiu Agnita 24°45’47” 46°00’53” 20 0.514 0.515 2 0.477 0.995 1.043 Romania Harghita Toplita 25°20’35” 46°54’40” 20 0.505 0.505 2 0.449 0.996 0.988 Romania Brasov Zarnesti 25°19’31” 45°33’59” 17 0.400 0.382 2 0.486 1.000 1.027 Romania Caras Anina 21°51’41” 45°05’60” 20 0.521 0.521 2 0.496 0.993 1.009 Romania Hunedoara Pui 23°06’05” 45°31’24” 19 0.514 0.503 2 0.470 1.000 1.076 Romania Suceava Candreni 21°51’12” 47°20’59” 20 0.000 0.000 1 0.483 0.991 0.982 Romania Timisoara Nadragu 21°11’00” 45°39’00” 19 0.424 0.456 2 0.425 0.990 1.003 Romania Valcea Voineasa 23°52’01” 45°28’12” 16 0.000 0.000 1 0.465 0.183 1.061 Romania Vrancea Tulnici 26°38’57” 45°55’18” 20 0.000 0.000 1 0.450 0.996 0.950

Ungaria Győr Moson Sopron

Fenyőfő 17°45’47” 47°5’20” 20 0.100 0.100 1 0.458 0.994 0.832

Ungaria Vas Velemer 16°22’35” 46°44’04” 18 0.522 0.523 2 0.489 1.000 0.964 Total Gst= 0.184

Nst =0.184


21

Tabelul 4.24. Table 4.24.

Parametrii diversitt ăţii genetice intrapopulaţionale pentru populaţiile de pin silvestru analizate în Suedia N-mărimea eşantionului, HSMT/SCP-diversitatea genetică medie în ADN-uli mitochondrial,cloroplastic ASMT/SCP-

diversitatea alelelor mitocondriale, cloroplastice, Gst, Nst- diferenţierea genetică interpopulaţională Genentic diversity parameters for scots pine analyzed population from Sweden N-sample size, HSMT/SCP-

mitochondria/chloroplast mean genetic diversity, ASMT/SCP- mitochondrial/chloroplast allelich richness, Gst, Nst- genetic differentiation within populations

Ţara Judeţul Locaţia Id.Tag

Latitudine Longitude Marimea eşantionului HSMT ASMT HSCP ASCP G-W BAP

S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Sävar Rönnbäck AC 493 63°55’ 20°03’ 7 0.400 0.333 0.414 1.000 1.154 1 Sweden Sävar Hjoggböle AC 494 64°30’ 21°00’ 6 0.333 0.333 0.442 1.000 1.230 2 Sweden Sävar Krångfors AC 495 64°46’ 20°29’ 6 0.000 0.000 0.400 1.000 1.580 5 Sweden Sävar Tallsjö AC 496 64°10’ 17°56’ 7 0.000 0.476 0.377 1.000 1.431 1 Sweden Sävar Segersjökullen AC 497 64°03’ 18°33’ 6 0.000 0.000 0.533 1.000 1.211 1

Sweden Sävar Fjällbränna,

Ormsjö AC 498 64°30’ 16°03’ 5 0.000 0.000 0.471 1.000 1.295 1

Sweden Sävar Innanbäck AC 499 65°00’ 21°03’ 5 0.000 0.000 0.242 1.000 3.200 1 Sweden Sävar Tallunda AC 501 65°18’ 18°49’ 6 0.000 0.000 0.392 1.000 1.407 1

Sweden Sävar Plantage 18+20,

Brån AC 560 63°52’ 19°52’ 7 0.285 0.286 0.458 1.000 1.230 1

Sweden Sävar Lindviken 2/68 BD401 65°50’ 20°53’ 5 0.000 0.000 0.540 1.000 1.333 1 Sweden Sävar Ö. Nykåtatjärn BD403 65°50’ 18°53’ 7 0.285 0.286 0.522 1.000 1.003 1 Sweden Sävar Pasainen BD 405 66°30’ 23°03’ 6 0.000 0.000 0.328 0.933 1.600 1 Sweden Sävar Korro BD 406 66°31’ 19°53’ 7 0.400 0.333 0.473 1.000 1.251 1 Sweden Sävar Abtaur BD 407 66°00’ 18°53’ 7 0.285 0.286 0.328 0.964 1.501 1 Sweden Sävar Krp. Ö. Uddjaur BD 408 66°01’ 18°03’ 6 0.333 0.333 0.328 1.000 1.401 1 Sweden Sävar Suopikåive BD 409 66°20’ 20°00’ 7 0.000 0.000 0.560 1.000 1.119 1 Sweden Sävar Suopikåive BD 410 66°20’ 20°00’ 4 0.000 0.000 0.559 1.000 1.148 1 Sweden Sävar Uijatievat BD 411 67°48’ 21°53’ 7 0.571 0.333 0.386 0.964 1.347 1 Sweden Sävar Äijänrova BD 412 67°38’ 21°22’ 6 0.400 0.333 0.538 1.000 1.230 1


22



S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Sävar Selsberget BD 424 66°00’ 21°03’ 6 0.533 0.333 0.419 1.000 1.260 2 Sweden Sävar Selsberget BD 425 66°00’ 21°03’ 8 0.000 0.000 0.685 1.000 1.095 1 Sweden Sävar Krp. Flinsberget Bg 419 60°00’ 16°00’ 6 0.000 0.000 0.516 1.000 1.541 1 Sweden Sävar Stempen, Särna Bg 420 61°30’ 13°03’ 6 0.533 0.000 0.466 1.000 1.251 2 Sweden Sävar Granåsen Bg 422 61°40’ 13°00’ 4 0.333 0.500 0.504 1.000 1.250 2 Sweden Sävar Nora, Nyland Y 824 62°52’ 17°55’ 4 0.000 0.000 0.500 1.000 1.375 4 Sweden Sävar Nordanede Y 825 62°35’ 16°18’ 7 0.000 0.000 0.580 1.000 0.917 3 Sweden Sävar Finnbäcken Y 826 62°20’ 16°28’ 7 0.000 0.000 0.421 0.952 1.238 3 Sweden Sävar Dalstjärn Y 827 63°30’ 19°03’ 6 0.000 0.000 0.492 1.000 1.057 1 Sweden Sävar Viken Y 828 63°30’ 16°31’ 5 0.000 0.000 0.454 1.000 1.371 1 Sweden Sävar Bergetjärn Y 829 64°10’ 16°03’ 5 0.000 0.000 0.509 1.000 1.138 4 Sweden Sävar Fudan Z 423 62°40’ 14°33’ 5 0.000 0.000 0.521 1.000 1.242 4 Sweden Sävar Bodbacksbränn Z 424 62°30’ 14°33’ 6 0.000 0.000 0.430 1.000 1.500 4 Sweden Sävar Vävelsberget Z 425 62°40’ 13°03’ 7 0.476 0.476 0.521 1.000 1.076 4

Sweden Sävar Kittelsjön, Lillhärdal

Z 426 62°00’ 13°33’ 6 0.000 0.000 0.421 0.933 1.219 4

Sweden Sävar Medskogen Z 427 62°26’ 13°02’ 7 0.333 0.476 0.525 1.000 0.976 4 Sweden Sävar Kvitsle, Mattmar Z 428 63°17’ 13°49’ 6 0.000 0.000 0.488 1.000 1.118 4 Sweden Sävar Borön, Lockne Z 429 63°15’ 14°53’ 6 0.000 0.000 0.490 1.000 0.968 4 Sweden Sävar Gransjölandet Z 430 63°03’ 15°38’ 7 0.000 0.000 0.447 1.000 1.272 5 Sweden Sävar Krp. Golhammar Z 431 63°00’ 14°00’ 5 0.000 0.000 0.534 1.000 1.032 5 Sweden Sävar Brämön, Sanna 40S 62°12’ 17°42’ 2 0.000 0.000 0.428 1.000 2.122 5

Sweden Sävar Kilafors,

Hemstanäs 48H 61°08’ 16°31’ 6 0.333 0.333 0.500 1.000 1.076 5

Sweden Remmingstorp

Orsa, Högståsen 49H 61°05’ 14°58’ 10 0.000 0.000 0.543 0.978 0.922 5

Sweden Remmingstorp

Sandhamn 61S 59°17’ 18°55’ 2 0.000 0.000 0.428 1.000 2.277 5

Sweden Remmi Varnhem,Billing 69B 58°22’ 13°41’ 9 0.000 0.476 0.472 0.972 1.129 5


23

ngstorp en



S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast

Sweden Remmingstorp

Västervik 70V 57°46’ 16°39’ 2 0.000 0.000 0.500 1.000 2.000 5

Sweden Remmingstorp

Eckersholm 74E 57°36’ 14°13’ 2 1.000 1.000 0.571 1.000 1.708 5

Sweden Remmingstorp

Färingtofta 80F 56°03’ 13°23’ 9 0.200 0.429 0.524 0.978 0.932 5

Sweden Remmingstorp

Granna G 58°01’ 14°28’ 4 0.000 0.000 0.404 1.000 1.614 1

Sweden Remmingstorp

Hornso H 57°00’ 16°12’ 7 0.476 0.476 0.512 1.000 1.125 1

Sweden Remmingstorp

Kohult K7V 57°48’ 13°47’ 5 0.600 0.000 0.452 1.000 1.380 4

Sweden Remmingstorp

Timmer Nabben TN 56°41’ 12°55’ 8 0.600 0.667 0.414 1.000 1.400 4

Sweden Remmingstorp

Torup&Halland TH 56°54’ 12°29’ 5 0.000 0.600 0.433 1.000 1.166 1

Total GST= 0.194,

NST= 0.197


24

În ceea ce priveşte situaţia populaţiilor din Suedia, diversitatea genetică totală (HTCP)

la nivelul ADN-ului cloroplastic se situează în jurul valorii de 99%. Valoarea cea mai mică a

diversităţii genetice medii la nivelul fiecărei populaţii a fost înregistrată în populaţia din

Innanbäck, notată în tabel prescurtat AC 499 (HSCP =0,24286), urmată de populaţiile

Pasainen (BD 405), Abtaur (BD407), Uddjaur (BD408), care au înregistrat o valoare egală

(HSCP =0,32857). Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice s-a observat în populaţia

Selsberget (BD 425) (HSCP =0,68537), populaţii situată printre cele mai nordice analizate.

Din punct de vedere latitudinal populaţiile cele mai nordice au prezentat o diversitate

genetică mai pronunţată la nivelul locuşilor analizaţi, comparativ cu populaţiile aflate la

latitudini mai joase, înspre sud.

Pentru a testa dacă populaţiile au suferit o constrângere (fenomenul de bottleneck) de-

a lungul anilor, dar şi în timpul procesului de recolonizare, indicele Garza - Williamson a

fost calculat cu valori cuprinse între 0,832 în populaţia Fenyőfő Ungaria şi 1,196 în

populaţia Sebeş, Romania. Se constată astfel că populaţia Fenyőfő a suferit mici modificări

datorită fenomenului de bottleneck, în timp ce restul populaţiilor au avut o valoare a

indicelui G-W≥1, ce indică o stabilitate/staţionare a mărimii populaţiei efective. Această

situaţie se poate explica prin faptul că s-au analizat exemplare bătrâne de pin silvestru, care

reprezintă rezultatul unor încrucişări realizate cu mult timp în urmă. În populaţiile din

Suedia indicele G-W a avut valori cuprinse între 0,922 în populaţia Orsa, Högståsen, cu

urme uşoare de constrângere a mărimii populaţiei efective, şi 3,22 în populaţia Innanbäck,

urmată de restul de 52 de populaţii toate înregistrând valori mai mari sau egale cu 1 ceea ce

indică faptul că nu au fost detectate efecte ale derivei genetice de tip bottleneck.

Analize spaţiale au fost realizat cu programele BAPS şi AIS. În urma analizei

bayesiene a ADN-ului mitocondrial, populaţiile au fost grupate în două clustere principale şi

unul secundar.

1. Primul cluster cuprinde populaţiile din exteriorul arcului Carpatic, respectiv

Suceava, Vrancea şi Vâlcea, de pe teritoriul României şi populaţia din sud - vestul Ungariei,

Fenyőfő.


25

2.Cel de-al doilea cluster cuprinde restul populaţiilor de pe teritoriul României situate

în interiorul arcului Carpatic şi cea de-a doua populaţie din nord - vestul Ungariei, Velemer.

Considerând modul de transmitere a ADN-ului cloroplastic pe cale paternă prin

polen, fluxul de gene este mult mai mare, răspândirea polenului fiind astfel posibilă pe

distanţe foarte mari, de zeci şi chiar sute de kilometri. Astfel, se poate observa existenţa unei

diversităţi ridicate în cadrul populaţiilor analizate. Astfel, cele 15 populaţii au fost grupate în

două clustere, în proporţie de 50:50 în fiecare cluster, fiind reprezentate pe hartă prin

culoarea galben şi maro. Populaţiile din ambele ţări au fost analizate împreună pentru a

evidenţia legătura genetică dintre acestea, fapt ce poate susţine ipoteza lui WILLIS van

ANDEL (2004), Ungaria fiind considerată refugiu glaciar pentru această specie.

4.3. STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE

DE PIN SILVESTRU

4.3.1. Interpolarea genetică a populaţiilor de pin silvestru din România, Ungaria

şi Suedia

4..3.1.1 Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial pentru

populaţiile din România şi Ungaria

Metoda interpolării a fost folosită pentru vizualizarea modelelor diversităţii genetice

în conformitate cu terenul/relieful zonei analizate.

Interpolarea realizată prin metoda Delanuay Triagulation sau teselaţia (WATSON

PHILIPS, 1985; WATSON, 1992) a fost utilizată pentru a deduce distanţele genetice între

locaţii pe o grilă suprapusă uniform pe întreaga zonă recoltată (Figura 4.14.). Urmărind

procedeul interpolarii, a fost generată o figură 3D reprezentând distanţele genetice

interpolate, unde X şi Y corespund coordonatelor geografice ale populaţiilor analizate, iar Z

-distanţele genetice.


26

Cu alte cuvinte, s-a utilizat această metodă pentru a “întării”/confirma rezultatele

obţinute cu ajutorul programului BAPS, ambele metode fiind bazate pe acelaşi principiu, şi

anume de a grupa indivizii în funcţie de distanţa genetică dintre ei, dar şi de distanţa

geografică. Metoda de interpolare folosită în acest program a fost metoda teselaţiei, luând la

întâmplare indivizi ce se aseamănă din punct de vedere genetic şi poartă aproximativ

aceleaşi alele, urmând ca ulterior sa fie grupaţi în clustere.

Poate fi observată o grupare a populaţiilor aflate în exteriorul arcului Carpatic

(Suceava, Vrancea, Vâlcea) cu populaţia din partea de sud - vest a Ungariei, Fenyőfő. De

asemenea, populaţiile situate în interiorul arcului Carpatic au fost grupate cu populaţia din

nord - vestul Ungariei, Velemer. Culoarea vârfurilor indică cât de asemănători respectiv cât

de diferiţi sunt indivizii/populaţiile între ele (exemplu, populaţiile în culoarea albastru închis

sunt asemănătoare din punct de vedere genetic, au alele comune; populaţiile în gri se

aseamănă între ele însă sunt diferite de cele în albastru la nivelul alelelor) (Figura 4.14.).

4.3.1.2. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial a populaţiilor din

Suedia

În mod aşteptat, rezultatele interpolării populaţiilor din Suedia după datele ADN-ului

mitochondrial sunt în perfectă concordanţă cu rezultatele obţinute în programul BAPS,

evidenţiind astfel faptul că populaţiile din nordul şi sudul ţării prezintă o diversitate mult mai

ridicată şi o frecvenţă a alelelor mult mai mare în comparaţie cu populaţiile situate în partea

centrală a ţării acestea fiind mult mai “sărace” din punct de vedere al diversităţii genetice şi

frecvenţei alelice; rezultă o evidenţă clară a colonizării pinului silvestru în Suedia urmând

două rute principale: una din refugii situate în partea de nord a Europei (cel mai probabil

Rusia, PYHAJARVI şi colab., 2008, NAYDENOV şi colab.,2007) şi cea de-a doua rută

colonizând partea de sud a ţării din refugii sud-estice cum ar fi: Balcani, Peninsula Italică,

Ungaria, Cehia (CHEDDADI şi colab., 2006, ROBLEDO-ARNUNCIO şi colab., 2005).


27

Fig. 4.14. Interpolarea genetică a 15 populaţii de Pinus sylvestris din Romania şi Ungaria calculate pe baza variaţiei genetice la nivelul ADN-ului mitocondrial. Axele X şi Y reprezintă locaţia geografică a populaţiilor în interiorul re ţelei de triangulaţie

Delaunay (WATSON, 1992, BROUNS şi colab., 2003), iar “înălţimile” suprafeţei (axele Z) reprezintă media distanţelor genetice dintre indivizi.

Fig. 4.14. Genetic Landscape Shape Interpolation analysis for 15 scots pine populations based on mitochondrial DNA variation. The X and Y axes show the geographic locations within a

Delaunay triangulation network constructed among the sampled stands. Surface plots heights reflect average between interindividual genetic distances.

Atât populaţiile din partea de nord a distribuţiei sunt corelate cu distanţa geografică,

cât şi cele din partea de sud (Figura 4.15.), rezultând în vârfuri proeminente şi de aceeaşi

culoare, în timp ce pentru populaţiile din zona centrală a ţării se observă o mai slabă

interpolare prin lipsa diversităţii genetice.


28

Fig. 4.15. Interpolarea genetică a 54 populaţii de Pinus sylvestris din Ungaria calculate pe baza variaţiei genetice la nivelul ADN-ului mitochondrial. Axele X şi Y reprezintă

locaţia geografică a populaţiilor în interiorul re ţelei de triangulaţie Delaunay (WATSON 1992, BROUNS şi colab., 2003) iar “înălţimile” suprafeţei (axele Z)

reprezintă media distanţelor genetice dintre indivizi.

Fig. 4.15. Genetic Landscape Shape Interpolation analysis for 54 scots pine populations from Sweden based on mitochondrial DNA variation. The X and Y axes show the geographic locations within a Delaunay triangulation network constructed among the sampled stands. Surface plots

heights reflect average between interindividual genetic distances.

Rezultatele analizei bayesiene (Figura 4.12. din teză) confirmă ipoteza celor două rute

de colonizare (tratate în Capitolul IV) din refugii situate în nord - estul Europei şi din refugii

din zona de sud a Europei, acestea întâlnindu-se în partea centrală a Suediei.

Rezultatele analizei bayesiene au fost susţinute şi de rezultatele analizei interpolării

genetice şi autocorelaţiei spaţiale.

Rezultatele testului Mantel indică o valoare negativă a coeficientului de corelaţie (r)

între distanţa genetică şi distanţa geografică de - 0,0286 nesemnificativ statistic (Figura


29

4.18.a din teză), cum de altfel se aştepta luând în calcul aşezarea geografică şi orografia

României. În mod asemănător, valoarea coeficientului de regresie (r) pentru datele ADN-

ului cloroplastic, este de 0,09813, ceea ce indică o corelaţie redusă, nesemnificativă din

punct de vedere statistic (Figura 4.18.b din teză). Se poate concluziona astfel faptul că

diferenţierea genetică a populaţiilor de pe teritoriul României nu se datorează distanţei

geografice dintre acestea, ci mai degrabă datorită orografiei - munţilor. În acest sens Carpaţii

României au funcţionat ca o barieră naturală în faţa diversităţii genetice a populaţiilor de pin

silvestru, respectiv în procesul de reproducere, (diseminare a seminţelor, polenului) şi a

schimbului de gene între populaţii.

Fig. 4.18.a. Corelaţia dintre distanţa genetică la nivelul ADNmt şi distanţa geografică (Testul Mantel) reprezentând populaţiile din România şi Ungaria

Fig. 4.18.a.Correlation of genetic and geographical distances (Mantel test) showing Romanian and Hungarian scots pine populations

Pentru populaţiile din Suedia, testul Mantel a prezentat un coeficient de corelaţie

pozitivă între distanţa genetică şi distanţa geografică, r =0,1078, şi o probabilitate de a

observa această corelaţie de P = 1,0000, în graficul de mai jos observându-se o uşoară

creştere a diversităţii genetice odată cu creşterea distanţei geografice. O posibilă explicaţie


30

pentru această corelaţie este suprafaţa mare (în lungime) de pe care populaţiile au fost

recoltate şi lipsa barierelor naturale, a munţilor, diversitatea genetică fiind astfel influenţată

de un model geografic şi nu orografic (cazul României şi Ungariei). Deasemenea, indivizii

aflaţi la o distanţă mai mare sunt mai diferiţi, (exemplu, indivizii din nord cu cei din sud)

prezintă o diversitate genetică mai mare datorită celor două rute de colonizare, provenind din

două refugii diferite, respectiv Nordul Europei (Rusia, Finlanda) şi una din sudul Europei

(partea central-vestică, Balcani, Peninsula Italică).

Fig. 4.19.a. Corelaţia dintre distanţa genetică, ADNmt, şi distanţa geografică

(Testul Mantel) reprezentând popuaţiile din Suedia Fig. 4.19.a. Correlation of genetic and geographical distances (Mantel test)showing Swedishscots

pine populations.

În cazul analizei datelor ADN-ului cloroplastic, testul Mantel a fost nesemnificativ

(Figura 4.19.b din teză), coeficientul de corelaţie înregistrând o valoare de r= ,0118. Acest

rezultat a fost estimat datorită transmiterii paternale a cloroplastelor printr-un flux mare de

gene, respectiv de polen.


31

CAPITOLUL V

DISCUŢII ŞI CONCLUZII PRIVIND EVOLU ŢIA POSTGLACIARA A PINULUI

SILVESTRU ŞI TENDIN ŢELE ACTUALE DE MIGRARE

După cum indică rezultatele obţinute, structura genetică a populaţiilor analizate nu a

fost afectată de translocările masive de materiale forestiere de reproducere de origine

necunoscută de la începutul secolului al XIX-lea. Spre deosebire de arboretele regenerate

artificial, arboretele naturale prezintă o structură genetică uniformă, formată din unul,

maxim două haplotipuri (populaţii naturale posibile sunt considerate populaţiile Suceava,

Vrancea şi Vâlcea). Apariţia a două haplotipuri este rezultatul migraţiei postglaciare a

pinului în procesul de recolonizare, acestea întâlnindu-se de regulă în zonele de contact

dintre două regiuni/subregiuni.

Analiza distribuţiei haplotipurilor la nivel naţional se observă o structurare bine

definită a populaţiilor, atât în ceea ce priveşte diversitatea genetică intrapopulaţională, cât şi

specificitatea haplotipurilor din zonele geografice analizate. Valorile coeficientului de

diferenţiere GST, fiind egale cu valorile coeficientului NST şi mai mari decât 0, evidenţiază

de asemenea faptul că există o structură a populaţiilor analizate, însă fără influenţe

filogeografice; este vorba aici mai mult de un model orografic care a dus la o structurare a

populaţiilor de astăzi. Studierea evoluţiei postglaciare a pinului silvestru şi modalităţile de

migrare a acestuia au evidenţiat originea diferită a populaţiilor din Bazinul Carpatic faţă de

cea a populaţiilor din zona extracarpatică.

Pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial, care au arătat o origine filogenetică

diferită pentru arboretele situate în diferite areale (exteriorul şi interiorul arcului Carpatic),

se poate recomanda acţiunea de conservare “in situ”, care trebuie să includă cel puţin o


32

populaţie pentru fiecare haplotip de ADN mitocondrial. Astfel, unităţile de conservare “in

situ” nu trebuie să lipsească din următoarele populaţii: Suceava, care pe lângă haplotip

prezintă şi condiţii speciale de adaptare-supravieţuire, creştere şi dezvoltare (pe sol tip

turbă), urmată de populaţiile Vrancea şi Baia de Arieş (pe sol tip calcaros), şi populaţiile din

interiorul arcului Carpatic spre exemplu: Topliţa, Hunedoara, Agnita, Caraş ce poartă

ambele haplotipuri evidenţiate la nivelul ADN-ului mitocondrial.

Metodele de genetică moleculară pot constitui un instrument de control al transferului

de material genetic în practica silvică, acestea fiind utilizate cu succes pentru speciile de

răşinoase în ţările vest europene; astfel, prin analize la nivelul ADN-ului mitocondrial se

poate identifica dacă seminţele au fost într-adevăr recoltate din populaţiile Suceava, Vrancea

sau Vâlcea, deoarece acestea trebuie să prezinte un singur haplotip, AA. Nu se poate afirma

cu tărie că problema transferului de material genetic este direct corelată cu instabilitatea

ecologică şi că exemplarele care prezintă haplotipurile străine prezintă şi o vitalitate redusă,

este importantă însă menţinerea diversităţii naturale prin regenerarea naturală sau transfer de

puieţi din populaţiile analizate în acest studiu. De asemenea faptul că nu au fost detectate

efecte ale derivei genetice de tip bottleneck constituie un bun argument pentru alegerea unor

entităţi de conservare “in situ” în care se găsesc câteva mii de exemplare din specia în cauză,

pentru a diminua riscul pierderii unor variante genetice valoroase sub aspectul capacităţilor

de adaptare şi supravieţuire.

Aceste rezultate nu au putut fi comparate cu alte studii datorită faptului că până în

prezent, în România, nici un alt studiu nu a fost condus pe această temă în populaţii de pin

silvestru.

În Suedia, situaţia se prezintă în felul următor: distribuţia haplotipului AA a fost

aproximativ uniformă pe toată suprafaţa analizată, ceea ce indică faptul ca ar fi fost prima

alelă care a colonizat Suedia (alela părinte). Pe de altă parte, distribuţia alelei AB a fost

observată în cele mai multe exemplare din populaţiile din sudul Suediei şi mai puţin întâlnită

sau chiar lipsind din partea de nord a ţării. Se poate astfel afirma că, în Suedia, colonizarea

pinului silvestru a urmat două rute: una fiind partea de sud a Europei, a doua rută de


33

colonizare ar fi partea de nord - est a Europei, fapt evidenţiat şi de PYHAJARVI şi colab.

(2007) în analizele efectuate. Astfel poate fi explicat amestecul de gene, respectiv

haplotipuri în zona centrală a Suediei. Pentru a întări cele două ipoteze, în special ruta de

colonizare din nord-estul Europei, pe viitor mai multe populaţii din această zonă trebuie

analizate.

În aceste populaţii valorile coeficientului de diferenţiere Gst sunt mai mici decât

valorile coeficientului Nst, diferenţe înregistrate gradient pe toată suprafaţa recoltată

(acoperind toate zonele Suediei), ceea ce înseamnă că există o structurare filogeografică în

cadrul zonei.

Cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat au avut ca principal obiectiv studiul

genomului mitocondrial, a cărui ereditate este exclusiv maternală, având o structură genetică

bine conservată datorită ratei reduse a mutaţiilor genetice şi care indică modul de evoluţie al

speciilor în perioada de după ultima glaciaţiune (circa 15000 ani în urmă), permiţând astfel

evaluarea refugiilor glaciare a diverselor provenienţe, a căilor de migrare şi tendinţele

actuale de evoluţie. În acest sens, studiile aferente acestei teze de doctorat au relevat o

variabilitate redusă a populaţiilor de pin silvestru din România, precum şi o structurare în

două subregiuni, care sunt caracterizate prin haplotipuri distincte, atât ca variabilitate, cât şi

ca provenienţă postglacială.

Gestionarea durabilă a pădurilor pentru amplificarea multiplelor funcţii ale acestora

necesită punerea în aplicare a unui complex de măsuri, printre care se numără stabilirea şi

delimitarea regiunilor de provenienţă pentru producerea, comercializarea şi utilizarea

materialelor forestiere de reproducere, acţiune importantă, menită să fundamenteze cadrul

normativ şi de reglementare la nivel naţional, în acest domeniu, armonizat cu cerinţele

Uniunii Europene şi în concordanţă cu prevederile Schemei Organizaţiei pentru Cooperare şi

Dezvoltare Economică

În prezent, regiunile de provenienţă sunt delimitate pe baza unităţilor de zonare şi

regionare a pădurilor, care au fost stabilite prin metoda indicatorilor ecologici sintetici,

folosind în acest scop răspândirea fitocenozelor şi plantelor forestiere indicatoare de climat.


34

Cunoscând mărimea mică a genomului mitocondrial şi cloroplastic, dar și a faptului că

majoritatea genelor specializate în adaptare sunt localizate în genomul nuclear şi după

distribuția geografică a haplotipurilor identificate în prezentul studiu, nu se pot face

recomandări în privința circulației de material forestier de reproducere.

Mutarea informaţiei genetice şi înfiin ţarea plantaţiei în condiţii de mediu diferite,

duce la schimbări adaptive ale structurilor genetice. Pe viitor, prin analize genetice (expresie

genică) se vor putea determina genele cu rol în adaptabilitate. Pe de altă parte, dacă populații

apropiate geografic au haplotipuri diferite, în scopul evitării scăderii gradului de puritate a

populațiilor din zona respectivă, nu se recomandă transferul de material genetic cu un alt

haplotip.

5.1. CONTRIBUȚII PERSONALE

Printre cele mai importante contribuții personale se pot menţiona următoarele:

1. Pentru prima dată s-a efectuat un studiu genetic prin analiza ADNmt şi ADNcp, pe

baza căruia au fost identificate rutele de recolonizare a ţărilor luate în studiu, cu specia Pinus

sylvestris;

2. În această teză de doctorat este prezentat cel mai amplu studiu genetic efectuat în

ţara noastră asupra acestei speci de arbori, prin utilizarea a două seturi de markeri genetici;

3. Prin cercetările efectuate, respectiv rezultatele obţinute, studiul de față a adus

contribuții la îndesirea hărților mitocondriale şi cloroplastice existente, în vederea stabilirii

cu precizie a rutelor de recolonizare postglaciară;

4. Prin analizele de ADN mitocondrial au fost identificate trei haplotipuri dintre care

doua comune si unul rar, întâlnit la doar un individ într-o populaţie;

ing. valentina floran rezumatul tezei de doctorat · fiind şi un remediu valoros în tratarea...

Documents