holotype hla™ c 24/11 a1 Și ce/a2 ce/a3 Și ce/a4 Și ce ... · registru de lucru excel . se...

0086 Pregătește ADN-ul pentru analiza de

secvențializare cu ajutorul Illumina MiSeq

HOLOTYPE HLA™ CONFIGURAȚIE 24/11 A1 ȘI CE/A2

ȘI CE/A3 ȘI CE/A4 ȘI CE INSTRUCȚIUNI DE UTILIZARE

VERSIUNEA 1 16.04.2018

Pentru diagnosticare in vitro

Instrucțiuni de utilizare, v1, pentru Omixon Holotype 24/11 – CONFIGURAȚIE A1 și CE/A2 și CE/A3 și CE/A4 și CE Pentru diagnosticare in vitro. Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Informații confidențiale și protejate.

Pagina 2 │ 49

Cuprins INFORMAȚII CU PRIVIRE LA PRODUCĂTOR ............................................................................................................. 7

LEGENDA SIMBOLURILOR UTILIZATE ...................................................................................................................... 7

CONȚINUTUL KITULUI HOLOTYPE HLA – CONFIGURAȚIE 24/11 A1 ȘI CE/A2 ȘI CE/A3 ȘI CE/A4 ȘI CE ...................... 8

CUTIA CU COMPONENTE PRIMER ..................................................................................................................................... 8 CUTIA CU COMPONENTE REACTIVI NECESARI PENTRU PREPARAREA BIBLIOTECILOR ..................................................................... 9 PLACĂ CU ADAPTORI CU 96 DE GODEURI ........................................................................................................................... 9 REGISTRU DE LUCRU EXCEL ............................................................................................................................................. 9 SOFTWARE – OMIXON HLA TWIN ................................................................................................................................. 10

TRANSPORT ȘI DEPOZITARE ................................................................................................................................. 10

AVERTISMENTE ȘI MĂSURI DE PRECAUȚIE ........................................................................................................... 10

LIMITĂRILE CUNOSCUTE ALE PRODUSULUI ........................................................................................................................ 11

INFORMAȚII PRIVIND SIGURANȚA ....................................................................................................................... 11

PARAMETRI DE PERFORMANȚĂ ........................................................................................................................... 11

ASISTENȚĂ TEHNICĂ ............................................................................................................................................. 11

Asistență telefonică: ........................................................................................................................................ 11

ECHIPAMENTE, REACTIVI ȘI CONSUMABILE ......................................................................................................... 12

RECOMANDĂRI TEHNICE ȘI CU PRIVIRE LA ECHIPAMENTE ..................................................................................................... 12 RECOMANDĂRI CU PRIVIRE LA REACTIVII ASOCIAȚI ............................................................................................................. 12

Capacitatea kitului cu reactivi MiSeq ............................................................................................................... 13 CONSUMABILE RECOMANDATE ...................................................................................................................................... 13

AVIZ LEGAL ........................................................................................................................................................... 14

DESTINAȚIE .......................................................................................................................................................... 14

NOTĂ IMPORTANTĂ ÎNAINTE DE UTILIZARE ......................................................................................................... 15

IZOLAREA RECOMANDATĂ A ADN-ULUI GENOMIC ............................................................................................................. 15

PRINCIPIUL METODEI ........................................................................................................................................... 16

REZUMATUL ETAPELOR ........................................................................................................................................ 17

GLOSAR/DEFINIȚII ................................................................................................................................................ 18

ETAPA 1 – PREPARAREA AMESTECULUI PRINCIPAL PENTRU AMPLIFICAREA HLA ................................................. 19

LISTA REACTIVILOR ...................................................................................................................................................... 19 PROTOCOL ................................................................................................................................................................ 19

Amestec principal: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 și DQA1 ...................................................... 20 Amestec principal: HLA-DRB4 .......................................................................................................................... 20 Amestec principal: Set 3 HLA-DQB1 ................................................................................................................. 20

ETAPA 2 – AMPLIFICĂRI HLA CLASA I ȘI CLASA II .................................................................................................. 21


Amestec principal încărcat cu polimerază Taq: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 și DQA1 22 Amestec principal încărcat cu polimerază Taq: Set 3 HLA-DQB1 ..................................................................... 22 Amplificare Clasa I (HLA-A, B și C) .................................................................................................................... 22


Pagina 3 │ 49

Amplificare Clasa II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 și DQB1) ......................................... 23 Dimensiuni preconizate ale ampliconilor ......................................................................................................... 23

ETAPA 3 – CUANTIFICAREA ȘI NORMALIZAREA AMPLICONILOR (CU AJUTORUL UNUI FLUOROMETRU CU PLACĂ) ............................................................................................................................................................................. 24


Combinarea ampliconilor ................................................................................................................................. 26 Purificarea PCR a ExoSAP-IT Express ................................................................................................................ 26

ETAPA 4 – PREPARAREA BIBLIOTECII .................................................................................................................... 27


Amestecul principal de fragmentare................................................................................................................ 28 Program de fragmentare ................................................................................................................................. 28 Amestecul principal de reparare a capetelor ................................................................................................... 29 Program pentru repararea capetelor............................................................................................................... 29 Amestecul principal de ligare ........................................................................................................................... 30 Program de ligare ............................................................................................................................................ 30 Combinarea și purificarea bibliotecilor ............................................................................................................ 31

ETAPA 5 – SELECȚIA DIMENSIUNII BIBLIOTECII ..................................................................................................... 33


ETAPA 6 – CUANTIFICAREA BIBLIOTECILOR CU AJUTORUL UNUI INSTRUMENT QPCR .......................................... 34


Amestec primer qPCR ....................................................................................................................................... 34 Amestec principal qPCR ................................................................................................................................... 35

ETAPA 7 – SECVENȚIEREA PE ILLUMINA MISEQ .................................................................................................... 37

LISTA REACTIVILOR ...................................................................................................................................................... 37 Capacitatea kitului cu reactivi MiSeq ............................................................................................................... 37

PROTOCOL ................................................................................................................................................................ 38

ETAPA 8 – ANALIZA DATELOR DE SECVENȚIALIZARE A HLA .................................................................................. 39

PROTOCOL AUTOMAT .................................................................................................................................................. 39 Setare IT și configurare .................................................................................................................................... 39 Protocol pentru fiecare analiză ........................................................................................................................ 39

PROTOCOL MANUAL SERVER ......................................................................................................................................... 39 Setare IT și configurare .................................................................................................................................... 39 Protocol pentru fiecare analiză ........................................................................................................................ 39

PROTOCOL MANUAL SPAȚIU DE LUCRU ............................................................................................................................ 40 Setare IT și configurare .................................................................................................................................... 40 Protocol pentru fiecare analiză ........................................................................................................................ 40

FIGURI SUPLIMENTARE ........................................................................................................................................ 41

EXEMPLU DE PLACĂ PENTRU PLACA CU AMPLICONI, PLACA DE AMPLIFICARE, PLACA DE DILUȚIE, PLACA DE CUANTIFICARE A AMPLICONILOR (PENTRU UN LOCUS INDIVIDUAL) ȘI PLACA DE REACȚIE .......................................................................................................... 41 EXEMPLU DE PLACĂ DE CUANTIFICARE A STANDARDELOR .................................................................................................... 41 EXEMPLU DE CUANTIFICARE A UNEI BIBLIOTECI KAPA – PLACĂ QPCR .................................................................................. 42


Pagina 4 │ 49

ANEXA 1: PIPPIN PREP.......................................................................................................................................... 43

PROGRAMAREA INSTRUMENTULUI PIPPIN PREP ................................................................................................................ 43 UTILIZAREA INSTRUMENTULUI PIPPIN PREP...................................................................................................................... 43

ANEXA 2: CUANTIFICAREA AMPLICONILOR CU AJUTORUL UNUI INSTRUMENT QPCR .......................................... 46


ANEXA 3: CUANTIFICAREA BIBLIOTECILOR CU AJUTORUL COLORANTULUI FLUORESCENT DSDNA INTERCALAT ....... 48



Pagina 5 │ 49

Istoricul documentului – Note importante și actualizări

Versiunea Data Autorul Rezumatul modificărilor Aprobat de Data

emiterii V1 29.11.2017 Tünde Vágó Prima versiune Efi Melista 16.04.2018


Pagina 6 │ 49

Declinarea responsabilității

Omixon a depus toate eforturile necesare pentru a se asigura că aceste Instrucțiuni de utilizare (IFU) sunt exacte. Omixon își declină răspunderea cu privire la orice inexactități sau omisiuni care se pot produce. Informațiile conținute în aceste instrucțiuni de utilizare pot face obiectul modificărilor fără notificare prealabilă. Omixon nu își asumă nicio responsabilitate pentru eventualele inexactități ale acestor instrucțiuni de utilizare.

Omixon își rezervă dreptul de a efectua modificări ale acestor instrucțiuni de utilizare și/sau ale produselor descrise în acestea fără notificare prealabilă.

În cazul în care găsiți în aceste instrucțiuni de utilizare informații incorecte, incomplete sau care induc în eroare, vă rugăm să ne comunicați observațiile și sugestiile dvs. Ni le puteți transmite la adresa de e-mail [email protected].


Pagina 7 │ 49

Informații cu privire la producător Denumirea companiei: Omixon Biocomputing Ltd

Adresă pentru relații cu clienții: Fehérvári út 50-52/6

Localitate: Budapesta

Cod poștal: H-1117

Țară: Ungaria

Legenda simbolurilor utilizate

Numărul lotului/seriei

Număr de referință/număr de catalog

Consultați Instrucțiunile de utilizare

Conține reactiv pentru numărul N al testării

Producător legal. Data însoțită de acest simbol reprezintă data fabricării

Temperatură de stocare recomandată

Data expirării

Dispozitiv medical de diagnostic in vitro

Conține o componentă de înlocuire Componentă de înlocuire


Pagina 8 │ 49

Conținutul kitului Holotype HLA – Configurație 24/11 A1 și CE/A2 și CE/A3 și CE/A4 și CE În această secțiune este descris conținutul configurațiilor disponibile pentru produsul Holotype HLA 24/11, după cum urmează:

Tipul produsului NR. REF. Rxns Configurație Holotype HLA 24/11 A1 și CE

H62 24

Configurație Holotype HLA 24/11 A2 și CE

H64 24


H66 24


H68 24

Vă rugăm să rețineți că atât cutia cu componente primer, cât și cutia cu componente reactivi pentru prepararea bibliotecilor sunt identice pentru toate configurațiile produsului. Componenta placă cu adaptori indexați cu 96 de godeuri este diferită la nivelul secvenței indexului pentru fiecare configurație. Vă rugăm să consultați Secțiunea Placă cu adaptori cu 96 de godeuri de mai jos, pentru mai multe informații.

Cutia cu componente primer Cutia cu componente primer conține soluții primer specifice, pregătite pentru utilizarea imediată, pentru amplificarea Long Range PCR a genelor HLA A, B, C, DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 și DRB5. De asemenea, aceasta conține și două tipuri de aditivi PCR (Amplificator 1 și Amplificator 2).

Amestec primer NR. REF. Rxns Vol/eprubetă Număr de eprubete

Cod de culoare

HLA-A P013 24 60 µl 1 Galben HLA-B P023 24 60 µl 1 Roșu HLA-C P033 24 60 µl 1 Portocaliu HLA-DRB1/DRB3 P043.1 24 60 µl 1 Verde HLA-DRB4 P103 24 60 µl 1 Alb HLA-DRB5 P113 24 60 µl 1 Roz HLA-DPA1 P133 24 60 µl 1 Negru HLA-DPB1 P073 24 60 µl 1 Violet HLA-DQA1 P083 24 60 µl 1 Maro HLA-DQB1 (Set 3) P123 24 60 µl 1 Albastru Amplificator 1 E01 96 1100 µl 1 Transparent Amplificator 2 E02 96 300 µl 1 Transparent


Pagina 9 │ 49

Cutia cu componente Reactivi necesari pentru prepararea bibliotecilor Cutia cu componente pentru prepararea bibliotecilor conține reactivi pentru prepararea bibliotecilor (fragmentare, capete tăiate drept și adenilat pentru capetelor ampliconilor și pentru ligarea secvențelor indexate ale adaptorilor la acestea) din ampliconi HLA.

Reactiv Nr. ref. Rxns Vol/

eprubetă Număr de eprubete

Cod de culoare

Enzimă de fragmentare (A) R12 24 70 µl 1 Galben Soluție tampon de fragmentare (B) R22 24 70 µl 1 Roșu Enzimă pentru repararea capetelor (C) R32 24 41 µl 1 Verde Soluție tampon pentru repararea capetelor (D) R42 24 82 µl 1 Portocaliu

Enzimă de ligare (E) R52 24 81 µl 1 Albastru Soluție tampon de ligare (F) R62 24 900 µl 2 Negru

Placă cu adaptori cu 96 de godeuri Componenta Placă cu adaptori cu 96 de godeuri conține adaptori NGS pregătiți pentru utilizarea imediată (oligonucleotide ADN dublu catenar) în 5 μl de soluție pentru generarea bibliotecilor NGS individuale. Placa cu adaptori cu 96 de godeuri conține un număr suficient de adaptori indexați pentru generarea unui număr de 24 de biblioteci NGS individuale și pentru identificarea probelor în aval.

Tipul produsului Reactiv asociat Nr. ref. Rxns Vol/

godeu Număr de plăci

Configurație Holotype HLA 24/11 A1 și CE (REF:H62)

Placa cu adaptori A1 (i1-24) N4 24 5 µl 1


Placă cu adaptori A2 (i25-48) N7 24 5 µl 1





Registru de lucru Excel Se pune la dispoziție un registru de lucru Excel care completează protocolul Holotype HLA 24/11 cu calcule, configurații ale plăcilor, ținerea evidențelor, generarea de Fișe de probe MiSeq și multe altele. În cazul în care nu dețineți un exemplar, vă rugăm să contactați [email protected].

mailto:[email protected]


Pagina 10 │ 49

Software – Omixon HLA Twin Contactați [email protected] pentru creditele Omixon HLA Twin asociate achiziției kitului Holotype HLA 24/11.

Notă importantă: Utilizați toate cele trei componente ale kitului Omixon Holotype HLA 24/11 și programul informatic Omixon HLA Twin în cadrul aceluiași flux de lucru, pentru a obține un flux de lucru care poate fi utilizat pentru diagnosticare in vitro. Vă rugăm să consultați Secțiunea Avertismente și măsuri de precauție, pentru a afla care sunt limitările care afectează utilizarea produsului.

La solicitarea specială transmisă de utilizator se pot pune la dispoziție componente de schimb. Vă rugăm să rețineți că Omixon asigură înlocuirea cutiilor cu componente, nu a fiolelor individuale. Contactați [email protected] , pentru mai multe informații.

Transport și depozitare Livrat pe pungi cu gheață carbonică, în cutie din polistiren extrudat; se recomandă depozitarea la temperaturi de -20 °C după recepție. Vă rugăm să verificați procesul de control al temperaturii și de monitorizare a congelatoarelor dvs. și să efectuați regulat operațiunile de întreținere necesare. Kiturile nedesfăcute sunt stabile până la data expirării kitului (indicată pe eticheta kitului), dacă sunt depozitate la temperaturi de -20 °C. După deschiderea produsului, se recomandă maximum 4 (patru) cicluri de înghețare/dezghețare, pentru a asigura stabilitatea produsului. Kiturile desfăcute sunt stabile pentru o perioadă de până la 3 luni, dacă sunt depozitate la temperaturi de -20 °C.

Avertismente și măsuri de precauție Limitările care afectează utilizarea produsului

Pentru performanțe optime, utilizați fluxul de lucru specific kitului Holotype HLA 24/11 și programul informatic Omixon HLA Twin pentru tipizarea HLA cu NGS, împreună cu materialele, reactivii și echipamentele recomandate în secțiunea „Echipament și reactivi”. Utilizarea unor materiale diferite de cele specificate în secțiunea „Echipamente și reactivi” trebuie să fie verificată și validată de utilizator. Nu reconstituiți și nu diluați reactivii în volume diferite de cele descrise în aceste Instrucțiuni de utilizare. Nu utilizați un volum de reactiv mai scăzut decât cele specificate în aceste instrucțiuni de utilizare. Aceste activități pot conduce la erori de performanță. Omixon nu poate asigura asistența tehnică pentru probleme care apar ca urmare a nerespectării etapelor protocolului descris în aceste Instrucțiuni de utilizare. Nu utilizați produsul în cazul în care componentele sunt vizibil deteriorate (fiole sau plăci sparte, capace neînșurubate corespunzător etc.).




Pagina 11 │ 49

Limitările cunoscute ale produsului Vă rugăm să consultați Ghidul cu limitări cunoscute ale produsului, pentru a identifica ambiguitățile și limitările cunoscute ale software-ului aferent produsului Holotype HLA. Ghidul este distribuit împreună cu Instrucțiunile de utilizare, dar poate fi găsit și pe site-ul web al Omixon, în secțiunea MyHolotype/Support (MyHolotype/Asistență) și Services/HLA Twin Instructions for Use (Servicii/Instrucțiuni de utilizare pentru HLA Twin) sau poate fi solicitat prin trimiterea unei cereri la [email protected].

Informații privind siguranța Înainte de utilizare, citiți secțiunile „Informații privind siguranța” și „Note importante” pentru orice reactivi sau kituri specificate în secțiunea „Echipamente, reactivi și consumabile”. Atunci când lucrați cu substanțe chimice, purtați întotdeauna un halat de laborator adecvat, mănuși de unică folosință și ochelari de protecție. Pentru mai multe informații, consultați fișele tehnice de securitate (FTS) puse la dispoziție de furnizorul produsului specificat. Prezentarea generală a compușilor chimici care intră în structura reactivilor poate fi găsită în Fișele cu date de siguranță ale kitului Holotype HLA 24/11, care sunt disponibile la cerere. La eliminarea componentelor produsului, acestea vor fi considerate deșeuri medicale generale.

Parametri de performanță Parametrii principali de performanță au fost stabiliți în conformitate cu validarea produsului.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilitate 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Specificitate 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Precizie 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Acuratețe 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Reproductibilitate 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Repetabilitate 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

Asistență tehnică Pentru asistență cu caracter general în legătură cu acest protocol, contactați [email protected]

Asistență telefonică: Statele Unite ale Americii | +1 (617) 500-0790 Europa | +36 70 574 8001 Restul lumii | +1 (617) 500-0790



Pagina 12 │ 49

Echipamente, reactivi și consumabile

Recomandări tehnice și cu privire la echipamente Termociclu cu format cu 96 de godeuri Fluorometru cu plăci (sau orice instrument capabil să detecteze fluorescența în condițiile

utilizării formatului plăcii cu 96 de godeuri, care se utilizează împreună cu sistemul dsDNA Promega QuantiFluor)

Instrument Pippin Prep (Nr. catalog PIP0001) sau Blue Pippin (Nr. catalog BLU0001), fabricate de SAGE Science

Instrument qPCR cu plăci cu 96 sau cu 384 de godeuri Fluorometru Qubit (Nr. catalog Q33216, Thermo Fisher Scientific) (opțional) Illumina MiSeq (Nr. catalog SY-410-1003) Computer 64 de biți cu minimum 4 nuclee și 16 GB de memorie RAM Stocare de date pe termen lung (aproximativ 2 TB de date MiSeq pe an)

Recomandări cu privire la reactivii asociați Kituri LongRange PCR fabricate de Qiagen (Nr. catalog 206401, 206402 sau 206403)

Pentru fiecare probă sunt necesari 4,4 μl de polimerază Taq Nr. catalog 206401 – Kit LongRange PCR (20) conține 8 μl de polimerază Taq Nr. catalog 206402 – Kit LongRange PCR (100) conține 40 μl de polimerază Taq Nr. catalog 206403 – Kitul LongRange PCR (250) conține 100 μl de polimerază Taq

ExoSAP-IT fabricat de Affymetrix (Nr. catalog75001-200, 75001-1ML, 75001-4X-1ML sau 75001-10ML) Pentru fiecare probă combinată, sunt necesari 4 μl de enzimă ExoSAP-IT Nr. catalog 75001-200 conține 200 μl de enzimă ExoSAP-IT Express Nr. catalog 75001-1-ML conține 1 ml de enzimă ExoSAP-IT Express Nr. catalog 75001-4X-1ML conține 4 ml de enzimă ExoSAP-IT Express Nr. catalog 75001-10ML conține 10 ml de enzimă ExoSAP-IT Express

Kit de cuantificare a bibliotecii – Illumina/Universal fabricat de KAPA Biosystems (Nr. catalog KK4824)

Kit cu teste Qubit dsDNA BR (Nr. catalog Q32850 sau Q32853) (opțional) Nr. catalog Q32850 conține 100 de teste Nr. catalog Q32853 conține 500 de teste

Sistem QuantiFluor dsDNA fabricat de Promega (Nr. catalog E2670) Sfere Agencourt AMPure XP fabricate de Beckman Coulter (Nr. catalog A63880, A63881 sau

A63882) Pentru fiecare utilizare a Holotype HLA, este nevoie de o cantitate de maximum 900 μl

de sfere AMPure XP Nr. catalog A63880 conține 5 ml de sfere AMPure XP Nr. catalog A63881 conține 60 ml de sfere AMPure XP Nr. catalog A63882 conține 450 ml de sfere AMPure XP


Pagina 13 │ 49

Casetă cu gel, 1,5 % agaroză, fără colorant, cu standard intern (Marker K/R2), pentru Pippin Prep/Blue Pippin (Nr. catalog CDF1510 pentru Pippin Prep și BDF1510 pentru Blue Pippin)

Etanol pentru biologie moleculară (Alcool anhidru) Apă pentru biologie moleculară (nu conține DNază și RNază) Hidroxid de sodiu 1x soluție tampon TE (pH 8,0) Kit cu reactivi MiSeq fabricat de Illumina

Capacitatea kitului cu reactivi MiSeq

Kit cu reactivi Illumina MiSeq

Timp Ore

Probe 24/11

Ciclu Std 500 (MS-102-2003)

~39 24

Ciclu Std 300 (MS-102-2002)

~24 24

Ciclu Micro 300 (MS-103-1002)

~19 20

Ciclu Nano 500 (MS-103-1003)

~28 8

Ciclu Nano 300 (MS-103-1001)

~17 4

Consumabile recomandate Eprubete pentru microcentrifugare cu capacitatea de 1,5 ml Eprubete pentru microcentrifugare cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de

1,5 ml Eprubete pentru microcentrifugare cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de

2,0 ml (se recomandă Nr. catalog 022431048 – Eppendorf DNA LoBind) Eprubete cu pereți subțiri, cu capacitatea de 0,5 ml pentru instrumentul Qubit (se recomandă

Nr. catalog Q32856 – eprubete pentru teste Qubit) Pipete cu volum reglabil (capacitate de 1,0 – 1.000 µl) Pipete cu 8 canale, cu volum reglabil (capacitate de 1,0 – 100 µl) Plăci cu 96 de godeuri, compatibile cu termociclul Plăci optice cu 96 de godeuri, compatibile cu fluorometrul cu plăci Plăci cu 96 de godeuri, compatibile cu instrumentul qPCR Sigilii pentru plăci de uz general Sigilii pentru plăci, compatibile cu termociclurile (testate pentru compatibilitatea cu LR-PCR) Sigilii pentru plăci optice, compatibile cu instrumentul qPCR (opțional) Suport magnetic compatibil cu eprubete de microcentrifugare, cu capacitatea de 2 ml Grile de răcire cu de 96 godeuri (2 bucăți) Eprubete conice, cu capacitatea de 50 ml Rezervoare cu capacitatea de 50 ml


Pagina 14 │ 49

Aviz legal Instrucțiunile de utilizare ale Holotype HLA 24/11 și conținutul acestora reprezintă proprietatea Omixon Biocomputing Limited („Omixon”) și sunt destinate exclusiv utilizării de clienții acesteia, în condiții contractuale, în legătură cu produsul(e) descris(e) în prezentul document și în niciun alt scop. Acest document și conținutul său nu vor fi utilizate sau distribuite în niciun alt scop și/sau nu vor fi comunicate, divulgate sau reproduse în niciun mod fără consimțământul scris acordat în prealabil de Omixon. Omixon nu transferă niciun fel de licență în temeiul brevetului deținut, al mărcii comerciale, al drepturilor de autor sau al prevederilor dreptului comun sau al drepturilor similare ale unor terțe părți.

Se acordă clientului o licență pentru Omixon HLA Twin („Software-ul”) în conformitate cu termenii și condițiile Acordului de licență pentru utilizatorul final al Omixon HLA Twin (www.omixon.com/ hla-twin-eula/). În cazul în care nu sunteți de acord cu termenii și cu condițiile din prezentul document, Omixon nu vă va transmite o licență pentru software și dvs. nu aveți voie să utilizați sau să instalați software-ul.

Instrucțiunile din acest document trebuie să fie strict respectate de personalul calificat și instruit corespunzător, pentru a asigura utilizarea corectă și sigură a produsului (produselor) descris(e) în prezentul document. Conținutul acestui document trebuie să fie parcurs și înțeles pe deplin înainte de a utiliza acest(e) produs(e).

NECITIREA TEXTULUI INTEGRAL AL INSTRUCȚIUNILOR ȘI NERESPECTAREA INSTRUCȚIUNILOR CONȚINUTE ÎN ACEST DOCUMENT POT CONDUCE LA DETERIORAREA PRODUSULUI (PRODUSELOR), LA VĂTĂMĂRI CORPORALE, INCLUSIV A UTILIZATORILOR SAU A ALTOR PERSOANE ȘI LA DETERIORAREA ALTOR BUNURI.

OMIXON NU ÎȘI ASUMĂ NICIO RĂSPUNDERE CU PRIVIRE LA UTILIZAREA NECORESPUNZĂTOARE A PRODUSULUI (PRODUSELOR) DESCRIS(E) ÎN PREZENTUL DOCUMENT (INCLUSIV A SECȚIUNILOR ACESTUIA SAU A SOFTWARE-ULUI) SAU CU PRIVIRE LA ORICE UTILIZARE A UNUI ASTFEL DE PRODUS ÎN AFARA SFEREI DE APLICABILITATE A LICENȚELOR SAU A PERMISIUNILOR EXPRESE ACORDATE ÎN SCRIS DE OMIXON ÎN LEGĂTURĂ CU ACHIZIȚIA DE CĂTRE CLIENT A UNUI(UNOR) ASTFEL DE PRODUS(E).

PENTRU DIAGNOSTICARE IN VITRO © 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Toate drepturile rezervate.

Destinație Produsul Holotype HLA 24/11 – Configurație A1 și CE / A2 și CE/A3 și CE/A4 și CE (denumit „Holotype HLA”) este o combinație de reactivi de testare pentru diagnosticare in vitro și software de analiză de date (Omixon HLA Twin™), fiind destinat identificării și definirii antigenilor leucocitari umani (HLA) din Clasele I și II; acesta se utilizează pentru tipizarea HLA cu ajutorul platformei de secvențializare Illumina® MiSeq. Holotype HLA furnizează informații cu privire la histo-compatibilitatea umană a locusurilor HLA clasa I (A, B și C) și clasa II (DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 și DRB5), utilizând ADN genomic uman.


Pagina 15 │ 49

Software-ul Omixon HLA Twin™ inclus în produsul Holotype HLA interpretează și asociază datele de secvențializare generate de sistemul Illumina® MiSeq, rezultând astfel tipizări HLA extrem de precise, la nivel de alele, obținute în urma unei singure treceri, cu o rată de ambiguitate foarte scăzută la nivelul a 2 câmpuri.

Produsul Holotype HLA este destinat utilizării pentru diagnosticare in vitro de cadre medicale, cum ar fi tehnicieni de laborator și medici instruiți în tipizarea HLA în laboratoare de diagnostic acreditate EFI sau ASHI sau care pot să lucreze conform specificațiilor EFI sau ASHI.

Notă importantă înainte de utilizare

Izolarea recomandată a ADN-ului genomic ADN-ul genomic uman trebuie să fie pregătit utilizând kituri de preparare ADN testate corespunzător, disponibile în comerț, pentru a garanta caracterul consecvent al preparării. Oricare ar fi abordarea aleasă, stabilirea cu exactitate a concentrației și purității este necesară pentru un nivel optim de performanță al testelor.

ADN-ul nu trebuie să conțină agenți contaminanți care pot afecta amplificarea ulterioară, etapele de preparare a bibliotecii și etapele de secvențializare (de exemplu alcool, săruri, detergenți, formaldehidă și heparină). Nu recoltați probe de sânge în eprubetele heparinizate; evitați utilizarea probelor de sânge recoltate de la pacienți heparinizați sau a probelor lipemice sau hemolizate.

ADN-ul genomic preparat poate fi utilizat imediat dacă este preparat în apă fără nuclează sau depozitat pentru perioade lungi de timp la temperaturi de -20 °C sau mai joase. Recomandăm utilizarea apei pentru prepararea ADNg, deoarece EDTA din soluția tampon TE poate inhiba reacțiile LR PCR. Se recomandă evitarea ciclurilor de înghețare/dezghețare repetate, pentru a reduce degradarea.

Se recomandă utilizarea unei concentrații de 20-30 ng/µl de ADN pentru obținerea unei cantități de 100-150 ng de ADN genomic pentru fiecare amplificare PCR. Se recomandă utilizarea unei metode de cuantificare bazată pe fluorescență pentru determinarea concentrației ADNg.

Se recomandă o rată de absorbanță de 1,7 – 2 pentru 260 nm/280 nm și 260 nm/230 nm.

Pentru amplificarea HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 și HLA-DQB1 este necesară o cantitate de 1,0 – 1,5 µg de ADNg pentru fiecare probă.


Pagina 16 │ 49

Principiul metodei De mulți ani, comunitatea HLA depune eforturi în direcția stabilirii unei metode care să identifice cu exactitate polimorfismul genelor HLA și al produselor genice ale acestora. Apariția PCR, utilizată în combinație cu alte tehnologii (secvențializare Sanger, SSOP, SSP, Luminex), reprezintă o formulă care a condus la eficientizarea semnificativă a procesului de detecție a polimorfismelor HLA, în pofida unor limitări care continuă să afecteze capacitatea de caracterizare completă a genelor HLA. Tehnologiile dezvoltate în ultimii ani, denumite global Next Generation Sequencing (NGS), ne pun la dispoziție noi oportunități de caracterizare completă a genelor HLA în mod haploid. NGS are două caracteristici distincte: 1) secvențializarea clonală a fragmentelor de ADN și 2) un randament foarte ridicat. NGS oferă posibilitatea de a introduce polimorfismele, eliminând astfel toate ambiguitățile și face posibilă tipizarea HLA la nivelul a trei până la patru câmpuri fără testare reflexivă, reprezentând astfel o potențială soluție completă pentru problema tipizării HLA. Protocolul descris în acest document utilizează această tehnologie și combină amplificarea LR PCR a genelor HLA cu secvențializarea pe platforma Illumina MiSeq. Mai exact, genele HLA A, B, C, DPA1, DQA1 și DQB1 sunt amplificate pe toată lungimea lor de codificare, inclusiv elemente ale regiunilor netranslatate de la capetele 5 'și 3', în timp ce DRB1, DRB3 și DRB4 sunt amplificate de la intronul 1 la intronul 4, iar DRB5 și DPB1 sunt amplificate de la intronul 1 la regiunea netranslatată 3'. Ampliconii sunt apoi prelucrați în cadrul mai multor etape care:

1. Fragmentează ampliconii la dimensiuni adecvate, în vederea secvențializării pe platforma Illumina,

2. Taie drept capetele și adenilează capetele ampliconilor fragmentați

3. Efectuează ligarea secvențelor de adaptori utilizate în cursul procesului la MiSeq, pentru a capta, a amplifica și a secvențializa ADN-ul. Adaptorii includ și un index, care este o secvență scurtă, unică pentru fiecare adaptor în parte, care identifică originile bibliotecii (probă/locus).

După combinarea bibliotecilor indexate, selectarea dimensiunii și cuantificare, proba este încărcată în MiSeq pentru secvențializare. Întregul proces durează 3-5 zile, în funcție de selecția flow cell de pe platforma Illumina. Rezumatul etapelor protocolului este afișat pe ecran, în figura de mai jos:


Pagina 17 │ 49

Rezumatul etapelor

PREPARAREA ADNg PREPARAREA AMESTECULUI PRINCIPAL

TIMP ACTIV EFECTIV: 0H 45, TIMP TOTAL: 0H 45

AMPLIFICĂRILE HLA CLASA I ȘI CLASA II


CUANTIFICAREA ȘI NORMALIZAREA AMPLICONILOR


PREPARAREA BIBLIOTECII

TIMP ACTIV EFECTIV: 0H 55, TIMP TOTAL: 3H

SELECȚIA DIMENSIUNII BIBLIOTECII


CUANTIFICAREA BIBLIOTECILOR


SECVENȚIALIZARE PE ILLUMINA MISEQ


ANALIZA DATELOR DE SECVENȚIERE A HLA



Pagina 18 │ 49

Glosar/Definiții Placă pentru ampliconi – Denumire alternativă pentru placa de amplificare Placa de cuantificare a ampliconilor – placă cu 96 de godeuri, compatibilă cu fluorometrul

cu plăci, în care sunt cuantificați ampliconii diluați Placa de amplificare – placa PCR cu 96 de godeuri utilizată pentru amplificarea locusurilor

HLA Biblioteca finală – Biblioteca ce include toate bibliotecile de probe care sunt pregătite

pentru secvențializare în cadrul aceluiași lot MiSeq Placa de reacție – Placa pe care se efectuează reacțiile secvențiale prin care se fragmentează

se repară capetele și se efectuează ligarea adaptorilor indexați la bibliotecile de probe Placa pentru reactiv – Placa utilizată pentru alicotarea diverșilor reactivi utilizați pentru

prepararea bibliotecilor Biblioteca de probe – O bibliotecă preparată prin combinarea tuturor locusurilor HLA pentru

o anumită probă Placa cu ampliconi combinați – Placă ce conține o bibliotecă de probe (toate locusurile

combinate) pentru fiecare godeu Placa de cuantificare a standardelor – placă cu 96 de godeuri, compatibilă cu fluorometrul

cu plăci, în care sunt introduse standardele ADN pentru cuantificarea ampliconilor


Pagina 19 │ 49

Etapa 1 – Prepararea amestecului principal pentru amplificarea HLA Durată: ~45 de minute Scopul acestei etape este pregătirea de amestecuri principale specifice locusurilor, pentru a amplifica individual fiecare locus HLA vizat. Locusurile amplificate prin acest protocol sunt HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 și HLA-DQB1.

Notă: Amestecurile principale preparate în cadrul acestei etape includ toți reactivii necesari pentru amplificare, cu excepția polimerazei Taq.

Lista reactivilor Articol Depozitare Furnizat de

Amestec primer HLA-A -20 °C Omixon Amestec primer HLA-B -20 °C Omixon Amestec primer HLA-C -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DRB1/DRB3 -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DRB4 -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DRB5 -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DPA1 -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DPB1 -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DQA1 -20 °C Omixon Amestec primer HLA-DQB1 Set 3 -20 °C Omixon Amplificator 1 -20 °C Omixon Amplificator 2 -20 °C Omixon Soluție tampon LongRange PCR (10×) -20 °C Qiagen dNTP (10 mM fiecare) -20 °C Qiagen Apă pentru biologie moleculară -20 °C Qiagen

Protocol 1.1 – Scoateți toate amestecurile de primer, Amplificator 1 și 2, dNTPs și soluția-tampon Long-

Range PCR (10×) din locul de depozitare și dezghețați-le la temperatura camerei.

1.2 – Preparați Amplificatorul combinat: adăugați 132 μl de Amplificator 2 în eprubeta cu Amplificator 1. Reetichetați eprubeta cu Amplificator 1, redenumind-o Amplificator combinat. Păstrați cantitatea rămasă de Amplificator 2 care urmează să fie utilizat în cadrul reacției Long-Range PCR pentru DRB4.


Pagina 20 │ 49

1.3 – Preparați un amestec principal pentru fiecare amestec Primer în conformitate cu tabele de mai jos:

Amestec principal: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 și DQA1

Reactiv Volum/probă/locus Volum/24 de probe/locus Amestec primer 2 µl 51 µl Soluție tampon LongRange PCR (10×) 2,5 µl 63,8 µl Amestec dNTP (10 mM fiecare) 1,25 µl 31,9 µl Apă pentru biologie moleculară 13,85 µl 353,2 µl Volum total 19,6 µl 499,9 µl

Amestec principal: HLA-DRB4

Reactiv Volum/probă/locus Volum/24 de probe/locus Amestec primer 2 µl 51 µl Soluție tampon LongRange PCR (10×) 2,5 µl 63,8 µl Amestec dNTP (10 mM fiecare) 1,25 µl 31,9 µl Amplificator 2 0,6 µl 15,3 µl Apă pentru biologie moleculară 13,25 µl 337,9 µl Volum total 19,6 µl 499,9 µl

Amestec principal: Set 3 HLA-DQB1

Reactiv Volum/probă/locus Volum/24 de probe/locus Amestec primer 2 µl 51 µl Soluție tampon LongRange PCR (10×) 2,5 µl 63,8 µl Amestec dNTP (10 mM fiecare) 1,25 µl 31,9 µl Amplificator combinat 5,6 µl 142,8 µl Apă pentru biologie moleculară 7,85 µl 200,2 µl Volum total 19,2 µl 489,7 µl

1.4 – Agitați fiecare amestec principal și rotiți-l până la oprire, timp de 1 secundă. Așezați amestecurile principale pe gheață.

1.5 – Diluați toate ADNg la o concentrație de 20 – 30 ng/µl (volumul minim este de 55 µl).

Notă: Holotype HLA include suficienți reactivi pentru 24 de reacții, la care se adaugă volumul suplimentar pentru pierderi cauzate de pipetare și pentru amplificări eșuate.


Pagina 21 │ 49

Etapa 2 – Amplificări HLA Clasa I și Clasa II Durată: ~6 ore și 50 de minute Scopul etapei 2 este amplificarea locusurilor HLA. Amplificările Clasa I și Clasa II au fost optimizate folosind două seturi separate de condiții PCR. După finalizarea reacțiilor PCR, amplificarea este verificată cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză (opțional).

Sfat – Deși este recomandată, electroforeza în gel de agaroză nu este necesară pentru finalizarea cu succes a protocolului Holotype HLA. Atunci când ampliconii sunt cuantificați (Etapa 3), se va considera că orice amplificare caracterizată de o concentrație de peste 50 ng/μl s-a realizat cu succes. Electroforeza în gel de agaroză este o etapă importantă a controlului calității și nu trebuie să fie omisă în cazul în care nu aveți suficientă experiență în ceea ce privește protocolul complet Holotype HLA.


Amestec principal HLA-A -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-B -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-C -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DRB1/DRB3 -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DRB4 -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DRB5 -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DPA1 -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DPB1 -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DQA1 -20 °C Pasul 1 Amestec principal HLA-DQB1 Set 3 -20 °C Pasul 1 Polimeraza Taq -20 °C Qiagen ADNg 4 °C Utilizator Apă pentru biologie moleculară 20 °C Utilizator

Protocol 2.1 – Scoateți polimeraza Taq din locul de depozitare, rotiți-o până la oprire și adăugați-o la

fiecare amestec principal în conformitate cu tabelele de mai jos, clătind bine vârfurile pipetelor prin pipetare:


Pagina 22 │ 49

Amestec principal încărcat cu polimerază Taq: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 și DQA1

Reactiv Volum/probă/locus Volum/24 de probe/locus Amestecul principal de la Etapa 1 19,6 µl 499,9 µl Polimeraza Taq 0,4 µl 10,2 µl Total 20 µl 510,1 µl

Amestec principal încărcat cu polimerază Taq: Set 3 HLA-DQB1

Reactiv Volum/probă/locus Volum/24 de probe/locus Amestecul principal de la Etapa 1 19,2 µl 489,7 µl Polimeraza Taq 0,8 µl 20,4 µl Total 20 µl 510,1 µl

2.2 – Centrifugați pentru câteva momente și lăsați să se oprească toate amestecurile principale încărcate cu polimerază taq. Alicotați 20 μl din fiecare amestec principal cu polimerază Taq în godeurile separate ale plăcilor PCR cu 96 de godeuri.

Notă: Amplificarea Clasa I și Clasa II a fost optimizată folosind două condiții PCR diferite, astfel încât amestecurile principal pentru Clasa I și Clasa II să nu se afle pe aceeași placă.

2.3 – Adăugați 5 μl din fiecare gDNA diluat în godeul corespunzător al plăcilor preparate în etapa anterioară. Amestecați prin pipetare. Aplicați un sigiliu termic și inspectați vizual fiecare godeu. Rotiți toate plăcile de amplificare într-o centrifugă, până la oprirea completă.

2.4 – Așezați plăcile de amplificare în termocicloare și executați programele pentru amplificarea Clasa I și II, în conformitate cu tabelele de mai jos:

Amplificare Clasa I (HLA-A, B și C)

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 95 °C 3 minute 95 °C 15 secunde

35 65 °C 30 de secunde 68 °C 5 minute

1 68 °C 10 minute 1 4 °C ∞


Pagina 23 │ 49

Amplificare Clasa II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 și DQB1)

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 95 °C 3 minute 93 °C 15 secunde

35 60 °C 30 de secunde 68 °C 9 minute

1 68 °C 10 minute 1 4 °C ∞

Notă: Succesul procesului de amplificare poate fi confirmat prin introducerea unei cantități de 2 μl din fiecare amplicon într-un gel de agaroză standard 2% la 250 V timp de 30 de minute. (Opțional)

Dimensiuni preconizate ale ampliconilor

Locus HLA Dimensiuni preconizate ale ampliconilor (kb) HLA-A, B și C ~3

HLA-DRB1/DRB3 ~4,3 HLA-DRB4 ~4,2 HLA-DRB5 ~5 HLA-DPA1 ~5,5 HLA-DPB1 ~6,6 HLA-DQA1 ~5,5

HLA-DQB1 (Set 3) ~6,5

Punct sigur de oprire. Ampliconii pot fi depozitați la o temperatură de 4 °C peste noapte sau la -20 °C pentru perioade mai lungi.


Pagina 24 │ 49

Etapa 3 – Cuantificarea și normalizarea ampliconilor (cu ajutorul unui fluorometru cu placă) Durată: ~40 de minute CUANTIFICAREA ȘI NORMALIZAREA AMPLICONILOR este recomandată pentru a asigura introducerea de date exacte în etapa de preparare a bibliotecii (opțional). Concentrația ampliconilor este măsurată cu ajutorul sistemului QuantiFluor dsDNA, care conține un colorant fluorescent de legare a ADN-ului și ADN standard pentru cuantificarea sensibilă a unor cantități mici de ADN dublu catenar (dsDNA). Consultați Anexa 2, pentru Instrucțiuni privind modul de realizare a cuantificării ampliconilor cu ajutorul unui aparat qPCR.

Sfat – Deși este recomandată, cuantificarea ampliconilor nu este necesară pentru finalizarea cu succes a protocolului Holotype HLA. Normalizarea ampliconilor nu necesită măsurarea precisă a concentrației de ampliconi. Se poate utiliza o estimare a concentrațiilor de ampliconi obținută pe baza experienței acumulate sau pe baza electroforezei în gel de agaroză. Cuantificarea ampliconilor este o etapă importantă care nu trebuie să fie omisă în cazul în care nu aveți suficientă experiență în ceea ce privește protocolul complet Holotype HLA.


Placă pentru amplificare Clasa I 4 °C Etapa 2 Placa pentru amplificare Clasa II 4 °C Etapa 2 Standard ADN Lambda (100 ng/µl) 4 °C Promega Colorant QuantiFluor dsDNA (200x) 4 °C Promega 20x soluție tampon TE (pH 7,5) 4 °C Promega Apă pentru biologie moleculară 20 °C – 25 °C Utilizator ExoSAP-iT Express -20 °C Affymetrix


Pagina 25 │ 49

Protocol 3.1 – Preparați standardele ADN prin diluția în serie a standardului ADN Lambda (100 ng/μl)

inclus în kitul QuantiFluor, în conformitate cu tabelul de diluție de mai jos:

Eticheta eprubetei ADN introdus Volum ADN (µl) Volum 1x TE

(µl) Concentrație finală (ng/μl)

Standard 1 ADN Lambda 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Standard 2 Standard 1 250 µl 250 µl 0,75 ng/µl Standard 3 Standard 2 250 µl 250 µl 0,38 ng/µl Standard 4 Standard 3 250 µl 250 µl 0,19 ng/µl Standard 5 Standard 4 250 µl 250 µl 0,09 ng/µl Standard 6 Standard 5 250 µl 250 µl 0,05 ng/µl Martor Martor 0 µl 250 µl 0 ng/µl

3.2 – Preparați plăcile de cuantificare a ampliconlor (consultați figurile suplimentare). Alicotați 99 μl 1x soluție tampon TE în godeurile unei plăci optice cu 96 de godeuri pentru numărul total de ampliconi care urmează să fie cuantificați.

3.3 – Adăugați 1 μl de ampliconi din godeurile corespunzătoare de pe plăcile cu ampliconi în godeurile de pe plăcile de cuantificare a ampliconilor. Amestecați prin pipetare.

3.4 – Preparați 1× soluție de lucru cu colorant QuantiFluor, folosind formula de mai jos: 0,5 μl de colorant QuantiFluor (200X) + 99,5 μl 1× soluție tampon TE. Preparați o cantitate suficientă de soluție de lucru 1× colorant QuantiFluor, pentru ca fiecare probă (număr total de probe de pe plăcile cu ampliconi) și standard (14 în total) să primească o alicotă de 100 μl.

3.5 – Preparați o placă de cuantificare pentru standarde și plăcile de cuantificare a ampliconilor. Alicotați 100 μl de 1× soluție de lucru cu colorant QuantiFluor în godeurile plăcii optice cu 96 de godeuri, care va fi placa de cuantificare pentru standarde și pe plăcile de cuantificare a ampliconilor de la Etapa 3.2.

3.6 – Folosind standardele preparate mai sus, adăugați 100 μl din fiecare standard, în duplicat, în godeurile individuale de pe placa de cuantificare a standardelor (14 godeuri în total). Amestecați prin pipetare.

3.7 – Agitați bine pentru amestecare și rotiți până la oprire.

3.8 – Așezați placa de cuantificare a standardelor pe fluorometrul cu placă, urmată de plăcile de cuantificare a ampliconilor.

3.9 – Calculați concentrația ADN-ului de pe plăcile de cuantificare a ampliconilor cu ajutorul datelor RFU generate de fluorometrul cu placă. Consultați fila Diluție din registrul de lucru pus la dispoziție, dacă aveți nevoie de asistență în ceea ce privește calculele.


Pagina 26 │ 49

3.10 – Diluați ADN-ul de pe plăcile cu ampliconi cu apă pentru biologie moleculară, astfel încât concentrația finală de ADN să fie de aproximativ 67 ng/μl.

În cazul în care concentrația de ADN este de 150 ng/µl sau mai mare: adăugați 25 µl de H2O

În cazul în care concentrația de ADN este de 100-150 ng/µl: adăugați 10 µl de H2O În cazul în care concentrația de ADN este mai mică de 100 ng/µl: nu adăugați deloc H2O

Combinarea ampliconilor 3.11 – Combinați toate locusurile pentru fiecare probă pe o singură placă cu ampliconi

combinați. Combinați volumele indicate pentru fiecare locus ca în tabelul de mai jos, pentru a obține un volum final de 35 μl:

Locus HLA Volum combinat A 3,5 µl B 3,5 µl C 3,5 µl

DRB1/DRB3 3,5 µl DRB4 3,5 µl DRB5 3,5 µl DPA1 3,5 µl DPB1 3,5 µl DQA1 3,5 µl

Set 3 DQB1 3,5 µl

3.12 – Adăugați 4 μl de ExoSAP-iT Express la fiecare bibliotecă aferentă probei. Clătiți vârfurile de pipetă prin pipetare. Acoperiți placa cu un sigiliu termic și rotiți-o până la oprire.

3.13 – Introduceți placa cu ampliconi combinați într-un termociclu și executați programul de mai jos:

Purificarea PCR a ExoSAP-IT Express

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 37 °C 4 minute 1 80 °C 1 minut 1 4 °C ∞

Punct sigur de oprire. Ampliconii pot fi depozitați la o temperatură de 4 °C peste noapte sau la -20 °C pentru perioade mai lungi.


Pagina 27 │ 49

Etapa 4 – Prepararea bibliotecii Durata: ~3 ore În cursul acestei etape, ampliconii combinați sunt preparați pentru secvențializare pe Illumina MiSeq. Ampliconii sunt fragmentați enzimatic, capetele sunt reparate și adenilate și se efectuează ligarea adaptorilor indexați la capete. Bibliotecile sunt apoi combinate, fiind urmate de o etapă unică de curățare și de concentrare, efectuată cu ajutorul sferelor AMPure XP.

Notă: Omixon recomandă utilizarea de volume mai mari decât este necesar pentru 24 de probe, deoarece multe dintre enzime și soluții tampon au o consistență vâscoasă, ceea ce conduce la pierderi excesive cauzate de pipetare.


Placa cu ampliconi combinați 4 °C Etapa 3 Enzimă de fragmentare (A) -20 °C Omixon Soluție tampon de fragmentare (B) -20 °C Omixon Enzimă pentru repararea capetelor (C) -20 °C Omixon Soluție tampon pentru repararea capetelor (D) -20 °C Omixon

Enzimă de ligare (E) -20 °C Omixon Soluție tampon de ligare (F) -20 °C Omixon Placa cu adaptori -20 °C Omixon Sfere AMPure XP 4 °C Beckman Coulter Etanol 80% (proaspăt preparat) 20 °C – 25 °C Utilizator Apă pentru biologie moleculară 20 °C – 25 °C Utilizator

Protocol 4.1 – Puneți în funcțiune termociclul. Verificați dacă crește temperarura capacului încălzit.

Notă: Asigurați-vă că ați amestecat bine în vortex enzima de fragmentare (A) înainte de utilizare.

4.2 – Preparați amestecul principal de fragmentare în conformitate cu tabelele de mai jos:


Pagina 28 │ 49

Amestecul principal de fragmentare

Reactiv Volum per bibliotecă (µl)

Volume recomandate pentru 24 de biblioteci (μl)

Cod de culoare

Enzimă de fragmentare (A) 2 µl 55,2 µl Galben Soluție tampon de fragmentare (B) 2 µl 55,2 µl Roșu Volum total 4 µl 110,4 µl

4.3 – Preparați o placă pentru reactiv: așezați o placă PCR cu 96 de godeuri pe un stand de răcire PCR și alicotați cantități egale de amestec principal de fragmentare în fiecare godeu al unei singure coloane.

Notă: Reacția de fragmentare a fost concepută în așa fel încât să furnizeze ADN cu dimensiuni ideale pentru secvențializarea pe Illumina MiSeq. Este important să păstrați reactivii la temperaturi scăzute până când începe reacția în termociclu, pentru a evita fragmentarea excesivă. Se recomandă utilizarea pipetelor multicanal, pentru a minimiza fragmentarea excesivă.

4.4 – Centrifugați ampliconii combinați timp de 10 secunde, apoi transferați-i pe gheață sau pe un bloc cu temperatură scăzută.

4.5 – Preparați o placă de reacție: așezați o placă PCR cu 96 de godeuri pe un termobloc PCR.

4.6 – Adăugați 4 μl de amestec principal de fragmentare de pe placa cu reactivi în godeurile plăcii de reacție, în funcție de probele de pe placa cu ampliconi combinați. Se recomandă utilizarea unei pipete multicanal.

4.7 – Transferați 16 μl din fiecare amplicon de pe placa cu ampliconi combinați în godeul corespunzător de pe placa de reacție, utilizând o pipetă multicanal. Amestecați prin pipetare.

4.8 – Acoperiți placa de reacție cu un sigiliu termic și centrifugați timp de 10 secunde.

4.9 – Incubați placa de reacție într-un termociclu, respectând programul de mai jos:

Program de fragmentare

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 37 °C 10 minute 1 70 °C 15 minute 1 4 °C ∞

Punct sigur de oprire. Bibliotecile pot fi depozitate la o temperatură de 4 °C peste noapte sau la -20 °C pentru perioade mai lungi de timp.

4.10 – Preparați amestecul principal de reparare a capetelor în conformitate cu tabelele de mai jos:


Pagina 29 │ 49

Amestecul principal de reparare a capetelor

Reactiv Volum per bibliotecă (µl)

Volume recomandate pentru 24 de biblioteci (μl)

Cod de culoare

Apă pentru biologie moleculară 1,25 µl 34,8 µl Enzimă pentru repararea capetelor (C) 1,25 µl 34,8 µl Verde

Soluție tampon pentru repararea capetelor (D) 2,5 µl 69,6 µl Portocaliu

Volum total 5 µl 139,2 µl

4.11 – Alicotați o cantitate egală de amestec principal pentru repararea capetelor într-o coloană neutilizată a plăcii cu reactivi.

4.12 – Centrifugați placa de reacție (care conține probele fragmentate) timp de 10 secunde. Adăugați 5 μl de amestec principal de reparare a capetelor de pe placa cu reactivi în fiecare godeu al plăcii de reacție. Se recomandă utilizarea unei pipete multicanal. Amestecați prin pipetare.


4.14 – Incubați placa de reacție într-un termociclu, respectând programul de mai jos:

Program pentru repararea capetelor

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 20 °C 30 de minute 1 70 °C 5 minute 1 4 °C ∞


4.15 – Scoateți placa cu adaptori indexați din locul de depozitare și dezghețați-o la temperatura camerei după începerea programului termociclului pentru repararea capetelor. Când Placa cu adaptori a ajuns la temperatura camerei, centrifugați-o timp de 3 minute la 3000 rpm.

4.16 – Îndepărtați cu grijă sigiliul Plăcii cu adaptori. Nu scuturați Placa cu adaptori după îndepărtarea sigiliului, pentru a împiedica contaminarea încrucișată.

4.17 – Transferați întregul volum din fiecare godeu al plăcii de reacție (25 µl) în godeul corespunzător de pe placa cu adaptori.


Pagina 30 │ 49

Notă: Dacă nu se va utiliza toată placa cu adaptori, puteți utiliza numai numărul necesar de adaptori. Tăiați banda de sigilare a plăcii între godeurile care urmează să fie utilizate și cele care vor fi păstrate. – Trageți cu grijă sigiliul Plăcii cu adaptori, dar nu îl îndepărtați complet; acesta trebuie să acopere godeurile.

a. Transferați 25 µl de la fiecare probă cu capetele reparate de pe Placa de reacție într-un godeu al plăcii cu adaptori, amestecând bine cu o pipetă.

b. Transferați în întregime fiecare probă de pe Placa cu adaptori în godeul inițial al Plăcii de reacție.

c. Resigilați Placa cu adaptori și depozitați-o la o temperatură de -20 °C. Utilizați Placa de reacție în locul Plăcii cu adaptori pentru restul etapelor descrise în manual.

4.18 – Preparați amestecul principal de ligare. Preparați o cantitatea suficientă de amestec principal pentru ligare pentru fiecare probă.

Amestecul principal de ligare

Reactiv Volum (μl) Volume recomandate pentru 24 de biblioteci (μl)

Cod de culoare

Enzimă de ligare (E) 2,5 µl 63,2 µl Albastru Soluție tampon de ligare (F) 30 µl 757,5 µl Negru Volum total 32,5 820,7 µl

4.19 – Alicotați amestecul principal de ligare într-o coloană neutilizată a plăcii cu reactivi. Se recomandă utilizarea unei pipete multicanal.

4.20 – Adăugați 32,5 μl de amestec principal de ligare în fiecare godeu de pe placa de reacție. Se recomandă utilizarea unei pipete multicanal. Amestecați prin pipetare.


4.22 – Incubați placa de reacție în termociclu, respectând programul de mai jos:

Program de ligare

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 25 °C 10 minute 1 70 °C 10 minute 1 4 °C ∞



Pagina 31 │ 49

Combinarea și purificarea bibliotecilor 4.23 – Lăsați sferele AmPure XP să ajungă la temperatura camerei. Asigurați-vă că acestea sunt

omogene (fără aglomerări și fără ghemotoace). Preparați 5 ml de etanol 80%, proaspăt preparat (4 ml EtOH + 1 ml H2O).

4.24 – Creați biblioteca combinând câte o alicotă din fiecare amplicon combinat, care acum reprezintă o bibliotecă specifică fiecărei probe, în aceeași eprubetă de microcentrifugare cu afinitate scăzută pentru legare cu capacitatea de 2,0 ml.

I. Pentru 16 sau mai multe probe – Calculați cantitățile de biblioteci de probe care urmează să fie combinate sub forma unei singure Biblioteci cu un volum total de 900 µl. Împărțiți 900 µl în funcție de numărul bibliotecilor de probe. Acesta este volumul alicotei care trebuie să fie extrasă din fiecare bibliotecă de probe și pipetată în Bibliotecă.

II. Pentru un număr mai mic de 16 probe – Transferați 60 µl din fiecare bibliotecă de probe într-o Bibliotecă.

4.25 – Adăugați 900 μl de sfere de AMPure XP în eprubeta Bibliotecă, dar nu atingeți Biblioteca cu vârful pipetei. Amestecați bine în vortex și centrifugați pentru scurt timp. Nu lăsați sferele să se separe. Incubați biblioteca la temperatura camerei timp de 10 minute.

Notă: În cazul în care combinația finală conține mai puțin de 900 µl de bibliotecă, adăugați o cantitatea echivalentă de sfere AMPure XP. Raportul Combinație finală – sfere AMPure XP trebuie să fie 1:1.

4.26 – Așezați eprubeta Bibliotecă pe suportul magnetic și incubați timp de 10 minute.

4.27 – Ținând eprubeta pe suportul magnetic, îndepărtați cu grijă și aruncați supernatantul din eprubeta Bibliotecă, fără a atinge sferele.

4.28 – Ținând eprubeta pe suportul magnetic, adăugați ~1,5 – 2 ml de etanol 80% proaspăt preparat în eprubeta Bibliotecii. Volumul de etanol adăugat trebuie să fie suficient pentru a acoperi sferele.

Notă: Aplicați etanolul pe partea laterală a eprubetei care nu conține sfere.

4.29 – Incubați eprubeta Bibliotecii la temperatura camerei timp de 30 de secunde, apoi îndepărtați cu grijă supernatantul și aruncați-l.

4.30 – Repetați pașii 4.28 și 4.29.

4.31 – Rotiți rapid până la oprire eprubeta Bibliotecă și așezați-o din nou pe suportul magnetic, cu capacul deschis. Îndepărtați etanolul rezidual cu o pipetă. Nu atingeți sferele.


Pagina 32 │ 49

Notă: Asigurați-vă că sferele nu conțin urme de etanol. Pentru aceasta, este posibil să fie nevoie ca eprubeta să fie rotită pe suportul magnetic, pentru a îndepărta etanolul fără a perturba ghemotoacele de sfere.

4.32 – Lăsați sferele să se usuce la aer timp de 5-8 minute, pe suportul magnetic, până când sferele sunt uscate.

4.33 – Scoateți eprubeta Bibliotecă de pe suportul magnetic și efectuați eluția Bibliotecii cu 31 µl de apă pentru biologie moleculară. Nu atingeți sferele cu vârful pipetei, deoarece sferele se vor lipi de acesta.

4.34 – Agitați biblioteca pentru ca sferele să se afle din nou în suspensie. Centrifugați pentru scurt timp dacă sunt prezente picături pe pereții laterali. Asigurați-vă că sferele rămân în suspensie.

4.35 – Incubați biblioteca la temperatura camerei timp de 2 minute.

4.36 – Așezați eprubeta Bibliotecă pe suportul magnetic timp de 2 minute.

4.37 – Colectați biblioteca: țineți eprubeta Bibliotecă finală pe suportul magnetic și colectați 31 μl de supernatant într-o eprubetă de microcentrifugare neutilizată, cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml.

Punct sigur de oprire. Bibliotecile pot fi depozitate la o temperatură de -20 °C pentru perioade lungi de timp.


Pagina 33 │ 49

Etapa 5 – Selecția dimensiunii bibliotecii Durata: ~1 oră În etapa 5 se preia biblioteca de la etapa 4 și se efectuează selecția în funcție de dimensiuni, cu ajutorul instrumentului Pippin Prep. Instrumentul Pippin Prep poate selecta automat o gamă de dimensiuni ale fragmentelor de ADN și le poate elua într-o cameră de colectare. Notă: Blue Pippin poate fi utilizat în loc de Pippin Prep. Consultați Anexa 1 pentru Instrucțiunile de utilizare ale instrumentului Pippin Prep.


Casetă cu 1,5% gel de agaroză, fără colorant 20 °C – 25 °C Sage Science Soluție de încărcare/amestec marker pentru Pippin (etichetată K) 4 °C Sage Science

Bibliotecă combinată 4 °C Etapa 4

Notă: Marker K este utilizat împreună cu dispozitivul Pippin Prep. Instrumentul Blue Pippin utilizează Marker R2.

Protocol 5.1 – Lăsați soluția Marker K să ajungă la temperatura camerei.

5.2 – Combinați 31 µl de amestec combinat cu 10 µl de soluție de încărcare Marker K.

5.3 – Amestecați în vortex și rotiți până la oprire.

5.4 – Configurați Pippin Prep în vederea colectării fragmentelor de ADN între 650 și 1300 bps. Încărcați proba de 40 µl în portul pentru probe și puneți în funcțiune aparatul. Durata programului este de 45-50 de minute.

5.5 – Colectați întregul conținut (aproximativ 40 μl) din portul de eluție al Pippin Prep și transferați-l într-o eprubetă de microcentrifugare neutilizată cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml. Aceasta este biblioteca selectată în funcție de dimensiune.

Punct sigur de oprire. Bibliotecile pot fi depozitate la o temperatură de -20 °C pentru perioade lungi de timp.


Pagina 34 │ 49

Etapa 6 – Cuantificarea bibliotecilor cu ajutorul unui instrument qPCR Durată: ~1 oră și 15 minute Este necesară cuantificarea bibliotecii selectate în funcție de dimensiune, pentru o utilizare optimă a rezultatelor generate de Illumina MiSeq. Concentrația bibliotecii selectate în funcție de dimensiuni poate fi măsurată cu exactitate de qPCR. Opțional, puteți utiliza kitul Qubit dsDNA BR și un aparat Qubit pentru măsurarea concentrației bibliotecii. Pentru a avea acces la acest protocol, consultați Anexa 3.


10× Premix Primer Illumina -20 °C KAPA Biosystems 2× amestec principal KAPA SYBR FAST qPCR -20 °C KAPA Biosystems Std 1 (20,00 pM) -20 °C KAPA Biosystems Std 2 (2,00 pM) -20 °C KAPA Biosystems Std 3 (0,20 pM) -20 °C KAPA Biosystems Std 4 (0,02 pM) -20 °C KAPA Biosystems Standarde ADN Illumina -20 °C KAPA Biosystems Apă pentru biologie moleculară 20 °C – 25 °C Utilizator 1x soluție tampon TE (pH 8,0) 20 °C – 25 °C Utilizator Bibliotecă selectată în funcție de dimensiune 4 °C Etapa 5

Protocol 1 – Preparați amestecul de primer qPCR, folosind 10× Premix Primer Illumina și 2× amestec

principal KAPA SYBR FAST qPCR:

Notă: Reactivii din kitul qPCR KAPA SYBR FAST (Amestec principal qPCR, Premix Primer și soluții ROX) sunt combinați în timpul primei utilizări a kitului. Soluția combinată este stabilă pentru cel puțin 30 de cicluri de înghețare/dezghețare. Consultați documentația KAPA, pentru a stabili dacă ROX este recomandat pentru instrumentul qPCR utilizat de dvs.

Amestec primer qPCR

Reactiv Volum (ml) 10× Premix Primer Illumina 1 ml 2× amestec principal KAPA SYBR FAST qPCR 5 ml Volum total 6 ml


Pagina 35 │ 49

2 – Preparați amestecul principal qPCR.

Amestec principal qPCR

Reactiv Volum (μl) Amestec primer qPCR 228 µl Apă pentru biologie moleculară 76 µl Volum total 304 µl

3 – Preparați o diluție în serie a Bibliotecii selectate în funcție de dimensiuni.

a. Preparați o diluție 1:1000, adăugând 1 μl de Bibliotecă selectată în funcție de dimensiune la 999 μl de 1× soluție tampon TE (pH 8,0), clătind bine vârful pipetei. Amestecați în vortex și rotiți până la oprire.

b. Preparați o diluție 1:2000, adăugând 100 μl de diluție 1:1000 la 100 μl de 1× soluție tampon TE (pH 8,0). Amestecați în vortex și rotiți până la oprire.

4 – Preparați o placă de cuantificare qPCR pe o placă PCR nouă, compatibilă cu sistemul dvs. qPCR.

5 – Alicotați 16 μl de amestec principal qPCR, în triplicat, pentru standardele 1-4, diluție 1:1000 și diluție 1:2000 (consultați figurile suplimentare).

6 – Alicotați 4 μl de standarde 1-4, diluție 1:1000 și diluție 1:2000 și introduceți-le în godeurile corespunzătoare.

7 – Sigilați placa de cuantificare qPCR și centrifugați-o timp de 10 secunde.

Notă: Evitați formarea de bule în godeurile plăcii de cuantificare qPCR. Centrifugați în funcție de necesități, pentru a elimina bulele.

8 – Setați triplicatele 1:1000 și 1:2000 ca probe vizate și definiți standardele (puncte: 4, concentrație inițială: 20 pM, diluție: 1:10). Rulați următorul program pe aparatul qPCR, pentru a stabili concentrația de ADN a Bibliotecii selectate în funcție de dimensiune:

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 95 °C 5 minute

25 (fără curbă de topire)

95 °C 30 de secunde 60 °C 90 de secunde (achiziție de date)

9 – Pentru a converti concentrația pM în concentrație nM pentru rezultatul qPCR, introduceți rezultatele pentru „Quantity mean” (Medie cantitate) ale celor două replicări ale bibliotecii în fila Manualului Omixon intitulată „Library Quantitation” (Cuantificare biblioteci).

10 – Utilizând volumele din manual, diluați 10 µl din biblioteca selectată în funcție de dimensiuni cu o concentrație de 2 nM cu apă sterilă, într-o eprubetă de microcentrifugare neutilizată, cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml. Depozitați Biblioteca selectată în funcție de dimensiune, la o temperatură de -20 °C.


Pagina 36 │ 49

Punct sigur de oprire. Bibliotecile pot fi depozitate la o temperatură de -20 °C pentru perioade lungi de timp. În cazul depozitării pe termen lung, se recomandă recuantificarea bibliotecii înainte de rularea pe MiSeq.


Pagina 37 │ 49

Etapa 7 – Secvențierea pe Illumina MiSeq Durată: ~ 24 de ore Illumina MiSeq este un instrument NGS automat, care poate secvenția Biblioteca selectată în funcție de dimensiune care a fost preparată în etapele anterioare. Demultiplexarea probelor indexate se efectuează automat, după încheierea programului de secvențializare.

Sfat – Puteți utiliza un spike-in de 1% PhiX ca un control suplimentar, pentru a monitoriza reacția de secvențializare. Consultați documentația Illumina cu privire la controlul PhiX, pentru informații suplimentare.


Cartușul cu reactiv -20 °C Illumina HT1 -20 °C Illumina PR2 4 °C Illumina Flow Cell MiSeq 4 °C Illumina Bibliotecă la 2nM 4 °C Etapa 6 NaOH 1 N sau 2 N 20 °C – 25 °C Utilizator Apă pentru biologie moleculară

20 °C – 25 °C Utilizator

Capacitatea kitului cu reactivi MiSeq

Kit cu reactivi Illumina MiSeq

Timp Ore

Probe 24/11

Ciclu Std 500 (MS-102-2003)

~39 24

Ciclu Std 300 (MS-102-2002)

~24 24

Ciclu Micro 300 (MS-103-1002)

~19 20

Ciclu Nano 500 (MS-103-1003)

~28 8

Ciclu Nano 300 (MS-103-1001)

~17 4


Pagina 38 │ 49

Protocol 7.1 – Pregătiți MiSeq în conformitate cu protocoalele Illumina standardizate.

7.2 – Preparați o bibliotecă denaturată 1 nM: Combinați 10 µl de NaOH 0,2 N proaspăt preparat și 10 µl de Bibliotecă selectată în funcție de dimensiune, diluată, de 2 nM, într-o eprubetă nouă de microcentrifugare cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml. Amestecați în vortex și rotiți până la oprire. Incubați biblioteca denaturată 1 nM la temperatura camerei, timp de 5 minute.

7.3 – Preparați o Bibliotecă denaturată 20 pM: Adăugați 980 μl of HT1 răcit la 20 μl din Biblioteca denaturată 1 nM. Amestecați în vortex și rotiți până la oprire.

7.4 – Preparați o Bibliotecă denaturată 9 pM: Adăugați 550 μl de HT1 răcit și 450 μl din Biblioteca denaturată 20 pM într-o eprubetă de microcentrifugare neutilizată cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml. Amestecați în vortex și rotiți până la oprire.

7.5 – Transferați 600 µl din biblioteca denaturată 9 pM în rezervorul de încărcare a probelor al cartușului cu reactiv MiSeq.

Sfat – Se recomandă utilizarea registrului de lucru pus la dispoziție pentru a genera Fișa cu probe solicitată de Miseq.


Pagina 39 │ 49

Etapa 8 – Analiza datelor de secvențializare a HLA Illumina MiSeq va procesa Biblioteca combinată 9 pM și va genera date de secvențializare sub forma unor fișiere fastq. Vă rugăm să consultați manualul HLA Twin, pentru asistență cu privire la instalarea corectă a HLA Twin și pentru informații cu privire la interpretarea analizei de genotipare a datelor dvs. obținute în urma secvențializării. Pentru implementarea Protocolului Automatizat și pentru orice probleme legate de instalare sau de analiza datelor, contactați [email protected].

Protocol automat

Setare IT și configurare 1. Instalați HLA Twin Server pe server.

Instalați clientul HLA Twin pe un PC client: – este posibil ca mai mulți clienți HLA Twin să se conecteze la server.

Contactați Serviciul de Asistență al Omixon ([email protected]), pentru instrucțiuni personalizate de instalare pentru Automatizare.

Protocol pentru fiecare analiză 1. Lansați HLA Twin Client și autentificați-vă.

2. Datele au fost deja prelucrate sau sunt în curs de prelucrare. Examinați rezultatele cu ajutorul sistemului de tip „semafor” (Traffic Light System) din HLA Twin.

3. Exportați rezultatele genotipării și/sau secvențele consens, în funcție de necesități.

Protocol manual server

Setare IT și configurare Instalați HLA Twin Server pe server. Instalați clientul HLA Twin pe un PC client.

Protocol pentru fiecare analiză Lansați HLA Twin Client și autentificați-vă. Selectați datele MiSeq introduse în format fastq sau fastq.gz și porniți programul de tipizare

Holotype HLA. După încheierea tipizării Holotype HLA, examinați rezultatele cu ajutorul sistemului de tip

„semafor” (Traffic Light System) din HLA Twin. Exportați rezultatele genotipării și/sau secvențele consens, în funcție de necesități.




Pagina 40 │ 49

Protocol manual spațiu de lucru

Setare IT și configurare Instalați HLA Twin Desktop.

Protocol pentru fiecare analiză 1 Lansați HLA Twin și autentificați-vă.

2 Selectați datele MiSeq introduse în format fastq sau fastq.gz și porniți programul de tipizare Holotype HLA.

3 După încheierea tipizării Holotype HLA, examinați rezultatele cu ajutorul sistemului de tip „semafor” (Traffic Light System) din HLA Twin.

4 Exportați rezultatele genotipării și/sau secvențele consens, în funcție de necesități.


Pagina 41 │ 49

Figuri suplimentare

Exemplu de placă pentru Placa cu ampliconi, Placa de amplificare, Placa de diluție, Placa de cuantificare a ampliconilor (pentru un locus individual) și Placa de reacție

Exemplu de placă de cuantificare a standardelor


Pagina 42 │ 49

Exemplu de cuantificare a unei Biblioteci KAPA – Placă qPCR


Pagina 43 │ 49

Anexa 1: Pippin Prep

Programarea instrumentului Pippin Prep 1. Faceți clic pe fila Editor Protocol și apoi faceți clic pe butonul „New” (Nou).

2. Faceți clic pe pictograma folderului de lângă câmpul Casetă și selectați „1,5 % DF Marker K” pentru Pippin Prep sau „1,5 % DF Marker R2” pentru Blue Pippin.

3. În banda pe care o programați:

a. Evidențiați câmpul „Range” (Interval). b. Setați valoarea „Ref Lane” (Bandă de referință) în așa fel încât să corespundă

numărului benzii pe care lucrați. c. Setați valoarea 650 pentru câmpul „Start*”. d. Setați valoarea 1300 pentru câmpul „End*” (Sfârșit).

4. Selectați, în câmpul Bandă de referință, banda pe care lucrați.

5. Faceți clic pe butonul „Save As” (Salvare ca) și denumiți programul.

Utilizarea instrumentului Pippin Prep 1. Puneți în funcțiune instrumentul Pippin Prep, apăsând butonul de alimentare de pe partea

din spate a acestuia.

2. Inspectați vizual instrumentul Pippin Prep. Asigurați-vă că cele 5 LED-uri sunt aprinse și că interiorul dispozitivului este curat și uscat.

3. Apăsați pe sigla Sage Science care se află în partea din dreapta jos a ecranului. Acest pas vă va permite să introduceți o parolă. Parola implicită setată în fabrică este „pips”.

4. Faceți clic pe fila Setări fabrică și asigurați-vă că valoarea Bază-Prag este setată la 0,02.

5. Așezați dispozitivul de calibrare în interiorul dispozitivului Pippin Prep, asigurându-vă că banda de culoare închisă este așezată cu fața în jos și peste LED-uri.

6. In fila Meniu principal, faceți clic pe butonul „Calibration” (Calibrare).

7. În fereastra Calibrare, asigurați-vă că câmpul „Target I pH mA” (I pH mA țintă) este setat la 0,80 (0,60 pentru Blue Pippin) și apoi apăsați butonul „Calibration” (Calibrare).

8. Accesați fila Protocoale. Faceți clic pe butonul „Load” (Încărcare) și selectați programul pentru Holotype HLA și banda specifică pe care urmează să o utilizați. Asigurați-vă că:

a. Banda corectă este activată b. Indicatorul de selecție a spectrului larg este în funcțiune c. Banda de referință este aceeași bandă care va fi utilizată.

9. Accesați fila Meniu principal. Asigurați-vă că:

a. Programul încărcat de dvs. este cel selectat.


Pagina 44 │ 49

b. Banda de referință corespunzătoare este selectată; aceasta este și banda pe care se va analiza proba.

10. Inspectați caseta. Înainte de a îndepărta banda cu care sunt sigilate godeurile, inspectați portul de eluție, pentru a vă asigura că nu s-au format bule la nivelul acestuia. Dacă în spatele portului de eluție s-au format bule, bateți ușor cu degetul și rotiți caseta în mână, pentru a îndepărta bulele.

11. Așezați caseta, cu banda încă aplicată peste godeuri, în interiorul instrumentului Pippin Prep.

12. Dezlipiți banda cu grijă, asigurându-vă că o îndepărtați dinspre porțiunea curată a casetei (banda 5) în direcția porțiunii utilizate a casetei (banda 1). Asigurați-vă că nu împroșcați cu lichid atunci când îndepărtați banda, pentru a preveni contaminarea.

13. Îndepărtați întregul volum de soluție tampon din portul de eluție al benzii pe care urmează să o utilizați și adăugați 40 μl de soluție tampon pentru electroforeză, proaspătă, în portul de eluție respectiv.

14. Aplicați o bucată subțire de bandă peste porturile de eluție.

15. Se va introduce soluția tampon pentru electroforeză în toate rezervoarele care nu sunt umplute pe 3/4, până la umplerea acestora. Umpleți godeurile doar cu cantitatea necesară! Nivelul soluției tampon trebuie să ajungă la plastic, însă să nu îl depășească, pentru a evita transferul la glisarea capacului. Aplicați soluție tampon din godeurile curate (Banda 5) în godeurile utilizate (Banda 1).

16. Asigurați-vă că fiecare godeu de încărcare (godeuri cu agaroză) este umplut cu soluție tampon pentru electroforeză. Soluția tampon trebuie să se afle peste agaroză și să pară plată la inspecția vizuală.

17. Închideți încet Pippin Prep, asigurându-vă că soluția tampon nu atinge capacul în timp ce închideți dispozitivul.

18. Efectuați testul de continuitate. Atunci când senzorii sunt uscați, se întâmplă frecvent ca testul de continuitate să nu se poată efectua o dată. În cazul în care testul de continuitate nu are rezultate pozitive, efectuați testul încă o dată. Deschideți ușor dispozitivul Pippin după finalizarea testului de continuitate. Asigurați-vă că lichidul nu este transferat de-a lungul casetei de capacul dispozitivului Pippin Prep.

19. Amestecați în vortex, pentru scurt timp, soluția de încărcare cu Marker K și rotiți-o până la oprire. – Adăugați 10 µl de soluție de încărcare Marker K la cei ~30 μl ai bibliotecii.

20. Amestecați în vortex biblioteca pentru scurt timp și rotiți-o până la oprire.

21. Scoateți 40 μl de soluție tampon din godeul probei pe care urmează să-l utilizați.

22. Adăugați ~40 μl din biblioteca încărcată cu Marker K în godeul probei pe care o veți utiliza.

23. Marcați banda pe care o utilizați cu inițialele tehnicianului și cu data.


Pagina 45 │ 49

24. Închideți Pippin Prep și faceți clic pe butonul „Start”. Asigurați-vă că banda corespunzătoare a fost activată. Proba trebuie să fie prelucrată timp de aproximativ 45 de minute.

25. După terminarea programului, deschideți cu grijă Pippin Prep. Inspectați capacul pentru a vă asigura că nu se transferă lichid de-a lungul casetei atunci când acesta glisează.

26. Îndepărtați banda care acoperă porturile de eluție, având grijă să nu stropiți cu lichid.

27. Transferați întregul volum de la portul de eluție într-o eprubetă cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml.

28. Acoperiți toate godeurile deschise cu două bucăți de bandă de sigilare pentru plăci. Rețineți că trebuie să lăsați o ureche pe partea curată. Aceasta va simplifica îndepărtarea benzii din secțiunea curată către secțiunea utilizată.

29. Introduceți caseta sigilată în punga corespunzătoare și puneți-o deoparte.

30. Umpleți caseta de spălare cu apă MiliQ. Închideți ușor capacul Pippin Prep, asigurându-vă că nu transferați lichid de-a lungul casetei de spălare.

32. Lăsați Pippin Prep închis timp de câteva secunde.

33. Deschideți dispozitivul Pippin Prep, asigurându-vă că nu transferați lichid de-a lungul casetei de spălare.

34. Scoateți caseta de spălare, goliți-o de apă și lăsați-o să se usuce.

35. Îndepărtați orice urme de apă de pe Pippin Prep și închideți-l ușor.

36. Selectați butonul „Shut Down” (Oprire) din meniul instrumentului Pippin Prep.


Pagina 46 │ 49

Anexa 2: Cuantificarea ampliconilor cu ajutorul unui instrument qPCR Durată: 40 de minute


20x soluție tampon TE (pH 7,5) 4 °C Promega Standard ADN Lambda (100 ng/µl) 4 °C Promega 200× colorant QuantiFluor dsDNA 4 °C Promega Apă sterilă 20 °C – 25 °C Utilizator Placă(i) pentru amplificare Clasa I 4 °C Etapa 2 Placa(plăcile) pentru amplificare Clasa II 4 °C Etapa 2

Protocol 2. Efectuați o diluție în serie, utilizând eprubete de microcentrifugare cu capacitatea de 1,5 ml

și standardul QuantiFluor Lambda DNA (100 ng/μl). Respectați instrucțiunile din tabelul de diluție de mai jos:

Eticheta eprubetei ADN introdus Volum ADN (µl)

Volum 1x TE (µl)

Concentrație finală (ng/μl)

Standard 1 ADN Lambda 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Standard 2 Standard 1 250 µl 250 µl 0,75 ng/µl Standard 3 Standard 2 250 µl 250 µl 0,38 ng/µl Standard 4 Standard 3 250 µl 250 µl 0,19 ng/µl Standard 5 Standard 4 250 µl 250 µl 0,09 ng/µl Standard 6 Standard 5 250 µl 250 µl 0,05 ng/µl Standardul 7, martor Martor 0 µl 250 µl 0 ng/µl

3. Preparați plăcile de cuantificare a ampliconlor (consultați figurile suplimentare). Alicotați 49,5 μl 1x soluție tampon TE în godeurile unei plăci curate cu 96 de godeuri, pentru numărul total de ampliconi care urmează să fie cuantificați.

4. – Adăugați 0,5 μl de ampliconi din godeurile corespunzătoare de pe plăcile cu ampliconi în godeurile individuale de pe plăcile de cuantificare a ampliconilor. Amestecați prin pipetare.

5. Preparați 1× soluție de lucru cu colorant QuantiFluor, folosind formula de mai jos: 0,25 μl de colorant QuantiFluor (200X) + 49,75 μl 1× soluție tampon TE. Preparați o cantitate suficientă de soluție de lucru 1× colorant QuantiFluor, pentru ca fiecare probă (număr total de probe de pe plăcile cu ampliconi) și standard (14 în total) să primească o alicotă de 50 μl.


Pagina 47 │ 49

6. Preparați o placă de cuantificare pentru standarde și plăcile de cuantificare a ampliconilor. Alicotați 50 μl of 1× soluție de lucru cu colorant QuantiFluor în godeurile plăcilor optice cu 96 de godeuri, utilizând formatul plăcii de cuantificare pentru standarde și pe cel al plăcilor de cuantificare pentru ampliconi (consultați figurile suplimentare).

7. – Folosind standardele preparate mai sus, adăugați 50 μl din fiecare standard, în duplicat, în godeurile individuale de pe placa de cuantificare a standardelor (14 godeuri în total).

8. – Amestecați bine în vortex și rotiți până la oprire.

9. Introduceți pe rând plăcile de cuantificare în aparatul qPCR și rulați programul de mai jos:

Număr de cicluri Temperatură Timp 1 25 °C 10 secunde 25 °C 15 secunde

2 25 °C 30 de secunde (achiziție de date)

10. Calculați concentrația ADN-ului de pe plăcile de cuantificare a ampliconilor cu ajutorul datelor RFU generate de instrumentul qPCR.

11. Diluați ADN-ul de pe plăcile cu ampliconi cu apă pentru biologie moleculară, astfel încât concentrația finală de ADN să fie de aproximativ 67 ng/μl.

În cazul în care concentrația de ADN este de 150 ng/µl sau mai mare: adăugați 25 µl de H2O

În cazul în care concentrația de ADN este de 100-150 ng/µl: adăugați 10 µl de H2O În cazul în care concentrația de ADN este mai mică de 100 ng/µl: adăugați 0 µl de H2O


Pagina 48 │ 49

Anexa 3: Cuantificarea bibliotecilor cu ajutorul colorantului fluorescent dsDNA intercalat Durată: ~15 minute Concentrația bibliotecii selectate în funcție de dimensiuni poate fi măsurată cu exactitate cu ajutorul unui colorant fluorescent dsDNA intercalat, cum ar fi verde SYBR sau un colorant echivalent. Kiturile și instrumentele disponibile în comerț în acest scop includ, dar nu se limitează la cititorul Qubit fabricat de Thermo Fisher (care utilizează kitul de testare Qubit BR dsDNA), cititorul Quantus fabricat de Promega (care utilizează colorantul fluorescent Quantifluor dsDNA) etc. În continuare este descrisă metoda Qubit, deoarece acesta este instrumentul cel mai frecvent utilizat. În cazul în care se utilizează un alt instrument și un alt kit, respectați instrucțiunile standard ale producătorului.

Notă: Metoda fluorometrică dsDNA este o metodă rapidă, dar suficient de precisă pentru stabilirea concentrației bibliotecii finale selectate în funcție de dimensiuni. Aceasta măsoară tot dsDNA prezent în bibliotecă.


Kit cu teste Qubit dsDNA BR la temperatura camerei Thermo Fisher Standarde Qubit dsDNA BR 4 °C Thermo Fisher Bibliotecă selectată în funcție de dimensiune 4 °C Etapa 5

Protocol 6.1 – Lăsați Standardele Qubit să ajungă la temperatura camerei. Pregătiți eprubetele de

testare Qubit (500 μl, cu pereți subțiri) în duplicat pentru biblioteca dvs., precum și cele două standarde. Amestecați în vortex și centrifugați standardele și biblioteca.

6.2 – Adăugați 995 μl de soluție tampon și 5 μl de colorant într-o eprubetă de centrifugare cu capacitatea de 1,5 ml. Amestecați în vortex și rotiți până la oprire.

6.3 – Transferați 190 μl din amestecul de reactivi în eprubetele Qubit pentru cele două standarde. Transferați 198 μl de amestec de reactivi în eprubetele Qubit pentru duplicatele bibliotecii.

6.4 – Adăugați 10 μl din standard 1 în eprubeta Qubit aferentă și amestecați în vortex timp de 2 secunde. Repetați operațiunile pentru standardul 2.

6.5 – Adăugați 2 μl din bibliotecă în cele două eprubete Qubit corespunzătoare și amestecați în vortex timp de 2 secunde.

6.6 – Incubați eprubetele Qubit la temperatura camerei timp de 2 minute.


Pagina 49 │ 49

6.7 – Puneți în funcțiune aparatul Qubit și selectați protocolul BR.

6.8 – Introduceți eprubeta Qubit cu standard 1 și apăsați GO. Repetați operațiunile pentru standardul 2.

6.9 – Introduceți eprubeta bibliotecii în Qubit și apăsați GO. Repetați operațiunea pentru replicat.

6.10 – Pentru a converti rezultatul Qubit din ng/μl în concentrație nM, introduceți concentrația medie pentru cele două replicări ale bibliotecii în fila Manualului Omixon intitulată „Library Quantitation” (Cuantificare biblioteci).

6.11 – Utilizând rezultatele măsurătorii Qubit, diluați 10 µl din biblioteca selectată în funcție de dimensiuni cu o concentrație de 2 nM cu apă sterilă, într-o eprubetă de microcentrifugare neutilizată, cu afinitate scăzută pentru legare, cu capacitatea de 1,5 ml. Depozitați Biblioteca selectată în funcție de dimensiune, la o temperatură de -20 °C.

Punct sigur de oprire. Bibliotecile pot fi depozitate la o temperatură de -20 °C pentru perioade lungi de timp. În cazul depozitării pe termen lung, se recomandă recuantificarea bibliotecii înainte de rularea pe MiSeq.

holotype hla™ c 24/11 a1 Și ce/a2 ce/a3 Și ce/a4 Și ce ... · registru de lucru excel . se...

Documents