GENETIC UMANConcepte i aplicaii practiceSub redacia: EMILIA SEVERIN

e teste uprind C rine i refe t Interne

EMILIA SEVERIN CRENGUA ALBU ILEANA IOACHIM

GENETIC UMANConcepte i aplicaii practice

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei SEVERIN, EMILIA MARIA Genetic uman: concepte i aplicaii practice / Emilia Maria Severin, Crengua Albu, Ileana Ioachim. - Bucureti: Scripta, 2002 p. ; cm. ISBN 973 - 8238 - 07 - 2 I. Albu, Crengua II. Ioachim, Ileana 575

GENETIC UMANConcepte i aplicaii practice

EMILIA SEVERIN

Profesor universitarCRENGUA ALBU

Asistent universitarILEANA IOACHIM

Preparator universitar

Catedra de Genetic Uman Facultatea de Stomatologie UMF Carol Davila Bucureti

Bucureti, 2002

Editor coordonator: Nicolae Rau Tehnoredactare: Mariana Radu

Reproducerea, transmiterea sau difuzarea, sub orice form sau prin orice mijloace cunoscute sau viitoare, a textelor cuprinse n volumul de fa sunt permise numai cu acordul scris al Editurii SCRIPTA, care are toate drepturile rezervate.

Editura SCRIPTA, 2002 Calea Victoriei nr. 39A BucuretiISBN 973 - 8238 - 07 - 2

CUVNT NAINTE

Genetica uman este una dintre disciplinele fundamentale ale nvmntului medical din ntreaga lume. O disciplin de studiu care furnizeaz date pentru nelegerea biologiei speciei umane, att sub aspect normal, ct i patologic. Acumularea rapid a informaiilor din domeniul geneticii aduce beneficii importante umanitii prin numeroasele aplicaii practice ale conceptelor i principiilor genetice, cu precdere n medicina preventiv. Ar fi suficient s ne gndim la ambiiosul Proiect al Genomului uman, care i-a propus s descifreze secvena complet a ADN-ului uman i a adugat, n scurt timp, noi gene pe lista celor implicate n apariia unor boli umane. Un singur exemplu: descifrarea structurii i funciilor genelor care condiioneaz sinteza hemoglobinelor umane a clarificat etiologia i a facilitat diagnosticarea, terapia i profilaxia multor hemoglobinopatii letale. Studiul geneticii este complex, iar nelegerea conceptelor, principiilor, legilor i mecanismelor sale este, uneori, dificil din cauza multor date nc neclare sau controversate. Apariia acestei cri faciliteaz nelegerea, asimilarea i nvarea rapid a conceptelor i principiilor eseniale ale geneticii umane. Cartea realizeaz o sintez ntre datele geneticii clasice i ultimele informaii din domeniu, ntr-o form accesibil cititorului. Structura general a crii i succesiunea capitolelor iniiaz, treptat, cititorul i l ajut s descopere utilitatea informaiilor transmise n practica medical. Nu s-a omis nimic important din ceea ce nseamn primul nivel de nvare a geneticii umane n nvmntul medical universitar. Volumul de cunotine este perfect adaptat pentru studierea geneticii umane timp de un semestru, dup cum este prevzul n planul de nvmnt, att n Facultatea de Stomatologie, ct i n Facultatea de Medicin. Fiecare capitol al crii are incluse ntrebri recapitulative, teste i rspunsuri, necesare fixrii informaiilor i verificrii modului cum au fost reinute. n acelai timp, testele ofer posibilitatea cititorului s se autoevalueze. Cartea se adreseaz n primul rnd studenilor de la Facultatea de Stomatologie pentru c n exemplificarea conceptelor, principiilor i legilor ereditii s-au folosit preferenial caractere umane patologice care intereseaz viitorul medic stomatolog. Cartea se adreseaz, n egal msur, celor care doresc s se iniieze n acest domeniu sau s-i rennoiasc noiunile fundamentale de genetic uman. Prof. dr. Augustin MIHAI Decanul Facultii de Stomatologie UMF Carol Davila Bucureti aprilie 2002

CUPRINSCuvnt nainte C APITOLUL 7

19

Citogenetic uman

Cromozomii i cariotipul uman normal . . . (Emilia Severin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9Morfologia cromozomilor umani . . . . . . . . . . . . .9 Numrul cromozomilor umani . . . . . . . . . . . . .10 Cariotipul uman normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 Identificarea cromozomilor umani . . . . . . . . . . .13 Simboluri folosite n nomenclatura citogenetic . . .15 Cariotipul uman standardizat . . . . . . . . . . . . . . .16 Indicaii pentru analiza cariotipului . . . . . . . . . .16 Lucrare practic individual . . . . . . . . . . . . . . . .18 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

Deleia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Duplicaia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Inversia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 Translocaia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 Cromozomi inelari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Izocromozomul . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Cromozomi dicentrici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Mecanismul producerii aberaiilor structurale ale cromozomilor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Efectele fenotipice ale aberaiilor cromozomiale . .42 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 ntrebri recapitulative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 Topic Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 Rspunsuri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54

C APITOLUL

255

Meioza i cromozomii meiotici umani (Emilia Severin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20Meioza primar diviziunea reducional . . . . .20 Meioza secundar diviziunea ecvaional . . . .21 Protocolul de evideniere a fazelor meiozei la mamifere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 Gametogeneza la om . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 Semnificaia meiozei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27

Ereditatea caracterelor umane

Legile mendeliene ale ereditii (Ileana Ioachim) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56Relaia genotip-fenotip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56 Legea 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Legea 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64

Cromozomii sexului i cromatina sexual . . la om (Crengua Albu) . . . . . . . . . . . . . . . .28Corpusculul sexual X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 Protocolul de evideniere a apendicilor perinucleari n sngele periferic . . . . . . . . . . . . .30 Protocolul de evideniere a corpusculilor Barr n celulele mucoasei bucale . . . . . . . . . . . . . . . . . .31 Corpusculul sexual Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 Protocolul de evideniere a corpusculilor F n celulele mucoasei bucale . . . . . . . . . . . . . . . .32 Importana studiului corpusculilor sexuali X i Y .33 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33

Modele de transmitere a caracterelor umane (Crengua Albu) . . . . . . . . . . . . . . .65Ereditatea monogenic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 Ereditatea autozomal dominant . . . . . . . . . . . .66 Ereditatea autozomal recesiv . . . . . . . . . . . . . .68 Ereditatea monogenic legat de sex . . . . . . . . .70 Ereditatea monogenic legat de cromozumul X 71 Ereditatea monogenic legat de cromozomul Y 75 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76

Metoda arborelui genealogic (Crengua Albu) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77Material i metod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77 Ancheta medico-biologic familial . . . . . . . . . .77 ntocmirea arborelui genealogic . . . . . . . . . . . . .78 Analiza arborelui genealogic . . . . . . . . . . . . . . .79 Transmiterea genetic autozomal dominant . . .79 Transmiterea genetic autozomal recesiv . . . . .81 Transmiterea genetic recesiv legat de cromozomul X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 Transmiterea genetic dominant legat de cromozomul X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

Studiul anomaliilor cromozomiale la om (Emilia Severin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34Anomalii cromozomiale numerice . . . . . . . . . . .34 Poliploidia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 Aneuploidia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Mozaicul cromozomial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Anomalii cromozomiale de structur . . . . . . . . .38

6

CUPRINSC APITOLUL

Transmiterea genetic legat de cromozomul Y . . .83 Importana studiului . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 Fi pentru boli genetice . . . . . . . . . . . . . . . . . .84

3

Integrarea cunotinelor genetice n practica medical 121Consultaia genetic (Crengua Albu) . . . .121Circumstanele n care se solicit consultaia genetic i sfatul genetic . . . . . . . . . . . . . . . . .122 Etapele i metodele consultaiei genetice . . . . .122 Implicaiile bioetice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .127 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .128 ntrebri recapitulative . . . . . . . . . . . . . . . . . . .128

Caractere umane simple (mendeliene) (Emilia Severin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87Caracterul de gusttor PTC . . . . . . . . . . . . . . . .87 Testarea strii de gusttor PTC . . . . . . . . . . . . . .87 Caracterul de gusttor PTC n populaiile umane 88 Caracterul de gusttor PTC ca marker genetic . .89 Factorul secretor (Se) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89 Metode de determinare a fenotipului secretor sau nesecretor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89 Factorul secretor n populaiile umane . . . . . . . .90 Grupe sangvine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Sistemul ABO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Metoda de determinare a grupei sangvine . . . . . .91 Importana cunoaterii grupei sangvine n sistemul ABO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 Sistemul Rh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 Metoda de determinare a factorului Rh . . . . . . . .93 Importana cunoaterii sistemului Rh . . . . . . . . .93 Sistemul de grup sangvin MNS . . . . . . . . . . . . .94 Metoda de determinare a grupei sangvine n sistemul MN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .95 Importana cunoaterii sistemului MNS . . . . . . .95 Sistemul hemoglobinelor . . . . . . . . . . . . . . . . . .95 Sistemul haptoglobinelor . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97

C APITOLUL

4

Genetica i evoluia populaiilor umane

129

Genetica populaiilor (Emilia Severin) . . .129Frecvena alelelor i a genotipurilor . . . . . . . . .130 Echilibrul Hardy-Weinberg n cazul unei gene autozomale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .131 Echilibrul Hardy-Weinberg n cazul alelelor codominante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .132 Echilibrul Hardy-Weinberg n cazul genelor plasate pe gonozomi . . . . . . . . . . . . . .133 Echilibrul Hardy-Weinberg n cazul aleliei multiple (polialelia) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .134 Factorii care modific echilibrul Hardy-Weinberg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135 Aplicaiile echilibrului Hardy-Weinberg . . . . . .136 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .136

Caractere cefalometrice (Emilia Severin) . .100Investigarea biometric . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 Tipul constituional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 Cefalometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101 Diametre cefalice utilizate mai frecvent n practic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .102 Calcularea indicilor cefalometrici . . . . . . . . . . .103 Clasificarea tipurilor de cap i fa . . . . . . . . . .103 Stabilirea simetriei feei i a tipului de profil facial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .106 Alctuirea morfogramei . . . . . . . . . . . . . . . . . .108 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .109

Evoluia populaiilor umane (Emilia Severin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .137Caracteristicile evoluiei . . . . . . . . . . . . . . . . . .137 Dovezi ale evoluiei furnizate de paleoantropologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .137 Evoluia aparatului dento-maxilar . . . . . . . . . . .141 Dovezi ale evoluiei furnizate de genetic . . . . .144 Diversitatea genetic uman . . . . . . . . . . . . . . .145 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146 ntrebri recapitulative . . . . . . . . . . . . . . . . . . .147 Topic Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .147 Rspunsuri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .148 Glosar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149 Index alfabetic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .154 Anexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .157

Studiul dermatoglifelor (Crengua Albu) . . .110Ereditatea dermatoglifelor . . . . . . . . . . . . . . . .110 Tehnica analizei dermatoglifelor . . . . . . . . . . .110 Analiza i interpretarea dermatoglifelor digito-palmare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111 Anomalii ale dermatoglifelor digito-palmare . .113 Importana studiului dermatoglifelor . . . . . . . . .114 Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .114 ntrebri recapitulative . . . . . . . . . . . . . . . . . . .115 Topic Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .115 Rspunsuri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120

1

CITOGENETIC UMAN

Citogenetica este o ramur a geneticii care studiaz cromozomii, combinnd metode citologice i genetice. Prin studiul cromozomilor se nelege analiza numrului, structurii i comportamentului cromozomilor n timpul mitozei i meiozei, precum i a anomaliilor cromozomiale i a efectelor lor fenotipice.

TEME-CHEIE: Cromozomii i cariotipul uman normal; Meioza i cromozomii meiotici umani; Cromozomii sexului i cromatina sexual la om; Anomalii cromozomiale i efectele lor fenotipice; ntrebri recapitulative; Topic Test. LUCRAREA PRACTIC 1: Cromozomii i cariotipul uman normalObiectivele lucrrii:nsuirea metodei de evideniere a cromozomilor umani; Recunoaterea cromozomilor dup morfologie i model de bandare; Alctuirea cariotipului uman.

Morfologia cromozomilor umaniCromozomii sau corpusculii colorai (din gr. chroma=culoare; soma=corp): sunt prezeni n toate celulele nucleate; sunt purttori de informaie genetic (conin ADN); asigur continuitatea genetic ntre generaii (se transmit ca o unitate n timpul meiozei i transport informaia genetic);

10

CITOGENETIC UMAN

pot fi vizualizai microscopic, prin tehnici speciale de colorare, numai n perioada n care nucleul se divide, pentru c n acest moment cromozomii sunt contractai, ngroai i mult mai evideni dect n interfaza nuclear; de regul, cromozomii sunt analizai n metafaza mitotic, moment n care ating gradul maxim de condensare i colorare. Cromozomul metafazic este format din dou cromatide ataate una de cealalt la nivelul centromerului. Centromerul este vizibil ca o constricie primar care mparte fiecare cromatid n dou brae: p braul scurt, deasupra centromerului, i q braul lung, sub centromer. Centromerul are o poziie constant pe cromozom i n funcie de aceasta cromozomii pot fi descrii ca: metacentrici centromerul este situat median; submetacentrici centromerul este situat mai aproape de unul dintre capetele cromozomului; acrocentrici centromerul este situat foarte aproape de unul dintre capetele cromozomului i telocentrici centromerul este situat chiar la captul cromozomului. Centromerul are un rol important n micarea cromozomilor n timpul diviziunii celulare. La extremitile cromatidelor se gsesc structuri terminale care le menin integritatea, numite telomere (din gr. telos=capt; meros=parte). Cromozomii difer ntre ei nu numai prin poziia centromerului, ci i prin prezena sau absena sateliilor. Satelitul cromozomial reprezint un segment cromozomial distal separat de braul cromozomului (de regul, braul p al cromozomilor acrocentrici) printr-un filament de cromatin numit constricie secundar (Fig. nr. 1.1.). METACENTRICbra scurt p

SUBMETACENTRIC

ACROCENTRICsatelit constricie secundar centromer

bra lung q 18 21 17 3 Fig. nr. 1.1. Forma cromozomilor umani n funcie de poziia centromerului 22

Numrul cromozomilor umaniNumrul de cromozomi variaz de la o specie la alta, dar este constant n toate celulele unui organism i n toate celulele organismelor care aparin aceleiai specii. Pn n urm cu aproape o jumtate de veac se credea c omul are 48 de cromozomi n nucleul celulelor somatice. Perfecionarea tehnicilor de laborator de ctre Tjio i Levan a permis stabilirea cu exactitate a numrului de cromozomi abia n 1956: n nucleul celulei somatice se gsesc 46 de cromozomi; n nucleul celulei gametice exist doar 23 de cromozomi. Astfel, fiecare nucleu al unei celule somatice conine dou seturi de cromozomi: unul de origine matern i unul de origine patern, motiv pentru care celula somatic este numit celul diploid. Nucleul celulei gametice are un singur set de cromozomi, celula gametic fiind numit celul haploid.

GENETICA UMAN

11

22 de perechi de cromozomi sunt prezente la ambele sexe, fiind formate din cromozomi autozomi sau somatici, n timp ce o pereche se prezint n combinaie diferit la brbai i la femei, fiind numii gonozomi, heterozomi sau cromozomii sexului.

Cariotipul uman normalCariotipul (din gr. karyon=nucleu; typos=model) este complementul cromozomial sau numrul normal de cromozomi ai unei celule, ai unui individ sau ai unei specii. De regul, se refer la aranjarea cromozomilor dup criterii precise: mrime, poziia centromerului, constricii secundare, satelii, model de bandare. Fiecare specie are un cariotip caracteristic. Pentru studiul cromozomilor umani s-a folosit o diversitate de esuturi, dar mai frecvent se utilizeaz limfocitele din sngele periferic, celule din mduva osoas, fibroblaste din piele sau celule din lichidul amniotic. Sunt dificil de descris n detaliu fiecare material i metod folosite n laboratoarele de citogenetic, din cauza numrului limitat de pagini al unui manual de lucrri practice destinat studenilor. De aceea, vom descrie doar modul de efectuare a preparatelor cromozomiale cu care vor lucra studenii. Protocolul de obinere a cromozomilor din limfocite umane: Materiale: 5-10 ml snge venos uman heparinizat; mediu de cultur, antibiotice, ser de viel; fitohemaglutinin (PHA); colcemid (derivat al colchicinei); soluie hipoton (KCl 0,075M); colorani: Giemsa (cel mai folosit colorant pentru analiza cromozomilor); fixator: 3 pri alcool metilic: 1 parte acid acetic glacial; flacoane de plastic pentru cultura celular, eprubete, lame; termostat, centrifug, frigider. Mod de lucru:1. se recolteaz 5-10 ml de snge venos pe heparin (previne coagularea, care ar putea ngreuna separarea ulterioar a limfocitelor); 2. efectuarea culturii pe un mediu de cultur complet mbogit cu ser de viel i antibiotice n care se adaug fitohemaglutinin (substan mitogen care stimuleaz limfocitele T s se transforme blastic i s se divid); 3. incubare la 37C, n condiii sterile, timp de 72 de ore; 4. tratamentul cu colcemid dup 3 zile de proliferare celular activ se adaug n mediu de cultur colchicina (mpiedic formarea fusului de diviziune i oprete mitozele n metafaz); durata tratamentului este de 2 ore; 5. tratamentul hipotonic dup tratamentul cu colcemid, celulele centrifugate sunt transferate ntr-o soluie hipoton timp de 10 min.; n acest mod se provoac ocul hipotonic care servete la umflarea celulei, ruperea nucleilor i dispersarea cromozomilor metafazici (se evit suprapunerea cromozomilor); 6. fixarea se face cu scopul de a omor celulele i de a conserva componentele celulare; 7. efectuarea preparatelor cromozomiale pe lame degresate prin picurarea unei cantiti mici de suspensie celular cu ajutorul unei pipete Pasteur. Frotiurile se usuc la aer;

12

CITOGENETIC UMAN8. Colorarea se poate face o colorare convenional (preparatele cromozomiale se in 7 min. ntr-un vas cu colorant Giemsa 5% ) sau o colorare difereniat n funcie de scopul propus; 9. Examinarea la microscop cu obiectivul cu imersie (100x); 10. Fotografierea metafazelor selectate; 11. Decuparea cromozomilor; 12. Aranjarea cromozomilor n cariotip se poate face manual, dar, recent, un computer ataat microscopului ordoneaz automat, n funcie de mrime i model de bandare, perechile de cromozomi (Fig. nr. 1.2.).

examinare la microscop i fotografierea metafazelor recoltare snge venos

colorare

efectuarea preparatelor prin picurarea de la distan pe lame

fixare

centrifugare (separare limfocite) cultur celular adugare de colchicin

oc hipotonic

centrifugare

Fig. nr. 1. 2. Tehnica de alctuire a cariotipului

ntr-o analiz citogenetic de rutin se examineaz 15-20 de plci metafazice. n practic, se fotografiaz cele mai bune metafaze (cromozomii nu sunt suprapui) i se decupeaz fiecare cromozom n parte. Cromozomii decupai se ordoneaz n perechi n funcie de anumite criterii i se aranjeaz apoi n cariotip, de la cei mai mari ctre cei mai mici. Pn n 1971, anul Conferinei de citogenetic de la Paris, cnd s-a stabilit un sistem standardizat de identificare a fiecrui cromozom, era dificil de recunoscut un anume cromozom numai dup lungime, poziia centromerului sau raportul braelor. Se utilizeaz: Indicele centromeric = p x 100 /p + q; Raportul braelor = q / p.

GENETICA UMAN

13

Identificarea cromozomilor umani bandarea cromozomilorTehnicile iniiale de colorare a cromozomilor au folosit colorantul Giemsa, care produce o colorare uniform a ntregului cromozom uman. n consecin, erau deseori, greu de identificat cromozomii cu forme i dimensiuni similare. Din 1970 s-au introdus noi metode de colorare difereniat a cromozomilor. S-a observat c regiunile cromozomiale fixeaz selectiv coloranii i c apare un model de benzi transversale, alternante, + colorate, unic pentru fiecare cromozom. Benzile intens colorate reprezint zone cromozomiale puternic condensate numite heterocromatin, iar benzile palid colorate reprezint zone cromozomiale mai slab condensate numite eucromatin. Numrul, mrimea, succesiunea i tipul de band sunt particulare pentru un cromozom i sunt identice pentru cromozomii omologi. Astfel, fiecare cromozom uman poate fi identificat i individualizat ntr-un mod sigur, nearbitrar. Benzile Q prima metod de bandare a cromozomilor a utilizat quinacrina , un colorant cu proprieti fluorescente. Preparatele cromozomiale colorate cu quinacrin sunt examinate la microscopul prevzut cu un dispozitiv special pentru fluorescen i vizualizare n lumin ultraviolet. Cromozomii apar difereniai longitudinal, avnd un model constant i caracteristic de benzi alternante mai mult sau mai puin fluorescente. n analizele citogenetice de rutin nu se folosete aceast metod pentru c preparatele nu pot fi conservate, fluorescena pierzndu-se dup scurt timp. Benzile G se obin prin deshidratare, tratarea preparatelor cromozomiale cu enzime proteolitice (tripsin) i colorare cu Giemsa. Apar benzi alternante, colorate i necolorate, ordonate ntr-un model similar bandrii Q: regiunile cromozomiale care apar fluorescente n bandarea Q sunt puternic colorate n bandarea G, iar regiunile ntunecate din bandarea Q apar necolorate n bandarea G. Folosirea acestei metode de bandare faciliteaz identificarea anomaliilor structurale ale cromozomilor. Un cariotip uman tipic pentru bandarea G este reprezentat n Fig. nr. 1.8. Acest sistem de bandare este cel mai utilizat n laboratoarele de citogenetic pentru c este uor de realizat, iar preparatele cromozomiale obinute astfel se pot pstra stabile mai mult timp. Benzile R se obin prin denaturarea termic a cromozomilor i colorarea cu Giemsa. Apare un model de benzi invers (Reverse Banding) modelelor Q i G. Bandarea permite evaluarea benzilor terminale care apar necolorate n bandarea G. Metodele de bandare care vor fi descrise n continuare au aplicaii mai limitate pentru c faciliteaz studierea n detaliu numai a anumitor regiuni cromozomiale, cum ar fi: centromere, telomere, satelii. Se numesc metode de bandare regional. Benzile C sunt utilizate pentru localizarea centromerilor i nu pentru identificarea cromozomilor. Benzile C se evideniaz prin tratarea preparatelor cromozomiale cu acizi i baze, incubare n soluie salin i colorare cu Giemsa. Cromozomii apar slab colorai, cu excepia regiunilor centromerice, care sunt intens colorate. Se mai observ benzi C n regiunile paracentromerice ale cromozomilor 1, 9 i 16, pe braele p ale acrocentricilor i n poriunea distal a braului q al cromozomului Y. Benzile T sunt utilizate pentru observarea extremitilor cromozomilor (telomerele). Se produc n condiii similare celor care determin benzile R. Benzile NOR (Nucleolar Organizer Regions) evideniaz organizatorii nucleolari, adic regiunile satelitice ale cromozomilor acrocentrici (perechile 13, 14, 15, 21 i 22). Se evideniaz prin tratarea preparatelor cromozomiale cu soluie de nitrat de argint.

14

CITOGENETIC UMAN

Tehnicile de bandare sunt utile nu numai pentru recunoaterea cromozomilor, ci i pentru identificarea unor regiuni cromozomiale care difer prin mrimea i intensitatea coloraiei de la un individ la altul. Acest polimorfism structural, cunoscut sub numele de heteromorfism cromozomial, este ereditar i respect un model simplu de transmitere, motiv pentru care este folosit ca marker genetic n studierea motenirii unui cromozom particular de la printe la copil. Aceste variante citogenetice sunt normale i implic secvene de ADN noncodificatoare asociate heterocromatinei. Tip de bandare Plac metafazic sau cariotip

Bandare G

Bandare G

Bandare R

Bandare Q

Bandare C

Bandare NOR

Fig. nr. 1.3. Modele de bandare a cromozomilor umani

GENETICA UMAN

15

Mai recent, cunotinele din domeniul geneticii moleculare au facilitat introducerea n citogenetic a unor tehnici mult mai performante prin care este posibil s localizm secvene specifice de ADN pe cromozomi dispersai. De exemplu, FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) este o tehnic utilizat pentru a analiza o regiune cromozomial de interes. Sonde ADN marcate hibridizeaz cu cromozomi metafazici, prometafazici sau interfazici. Sonda ADN este specific unei regiuni cromozomiale datorit secvenei sale de nucleotide. n mod normal, analiza microscopic i vizualizarea n ultraviolete arat dou semnale fluorescente, cte unul pentru fiecare cromozom omolog al unei perechi din nucleul unei celule somatice. Dac pacientul prezint doar un singur semnal fluorescent nseamn c-i lipsete un cromozom din pereche sau dac apare un al treilea semnal nseamn c prezint un cromozom supranumerar n pereche (Fig. nr. 1.4.). Aceast tehnic este folosit mai mult pentru identificarea anomaliilor structurale care nu pot fi vzute prin bandarea G.

Fig. nr. 1. 4. Analiza citogenetic utiliznd FISH; diagnostic citogenetic: trisomie 21

Simboluri folosite n nomenclatura citogeneticApariia i dezvoltarea citogeneticii au impus introducerea unei nomenclaturi standardizate pentru caracterizarea cariotipului uman normal i patologic. Informaiile acumulate la numeroasele conferine internaionale dedicate cromozomilor umani au fost sintetizate de un Comitet permanent, care a stabilit i a publicat un sistem internaional de notare a termenilor citogenetici (International System of Human Chromosome Nomenclature), care ofer cercettorilor termeni i simboluri standardizate de descriere a cariotipului. Diagnosticul citogenetic stabilit ntr-un laborator din Romnia pentru un pacient poate fi citit i interpretat oriunde n lume pentru c se folosete un sistem comun de descriere a cariotipului. n Tabelul nr.1.1. sunt selectate cteva simboluri utilizate n citogenetica uman.

16

CITOGENETIC UMANTabelul nr.1.1. Simboluri utilizate n nomenclatura citogenetic

Simboluri p q pter qter ter cen mat pat h s A-G 1-22 X,Y

Semnificaie braul scurt al cromozomului braul lung al cromozomului sfritul braului scurt sfritul braului lung terminal sau sfrit centromer origine matern origine patern constricie secundar satelit grupe cromozomiale numrul perechilor de autozomi umani cromozomii sexului la om (heterozomi)

Cariotipul uman standardizatFig nr. 1.6. prezint diagrama celor 22 de autozomi umani i a cromozomilor sexului X i Y bandai G, diagram utilizat ca model pentru alctuirea cariotipului. Fiecare cromozom este format din dou cromatide, iar fiecare cromatid are un bra p i unul q. Fiecare bra este divizat n regiuni i benzi. Regiunile i benzile fiecrui bra cromozomial sunt numerotate de la centromer ctre telomer. Regiunea adiacent centromerului este numerotat cu 1 pentru fiecare dintre brae i avansnd ctre telomer urmeaz regiunea 2, 3 etc. (Fig. nr. 1.5.). Prin acest sistem de numerotare se poate indica o anumit localizare pe cromozom. De exemplu: 2p16 semnific o anume localizare pe cromozomul 2, braul scurt, regiunea 1, banda 6. Cromozomii autozomi sunt aranjai n ordinea descresctoare a mrimii, iar cromozomii sexului sunt aezai separat, la sfritul diagramei. Autozomii numerotai de la 1 la 22 n ordinea descresctoare a mrimii sunt ordonai n 7 grupe: grupa A perechile de cromozomi 1, 2 i 3; grupa B perechile 4 i 5; grupa C perechile 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12; grupa D perechile 13, 14 i 15; grupa E 16, 17 i 18; grupa F perechile 19 i 20; grupa G perechile 21 i 22; iar gonozomii sunt aezai separat, la sfritul cariotipului.

Bra Regiune

Studiul cromozomilor umani poate fi util n mai multe situaii: Prenatal Banda 14q32 sarcin n cazul unei femei cu o vrst care Subbanda q32.3 depete 40 de ani; sexul ftului n cazul unor boli genetice legate de Fig. nr. 1.5. Cromozom metafazic uman. cromozomul X. Fiecare bra este subdivizat n regiuni i benzi.

Band

Indicaii pentru analiza cariotipului

GENETICA UMAN

17

benzi Q i G negative benzi variabile benzi Q i G pozitive

x

Fig. nr. 1.6. Distribuia benzilor cromozomiale Q i G

18

CITOGENETIC UMAN Neonatal moarte neonatal; malformaii congenitale; organe genitale ambigue; suspiciune de sindrom cromozomial. Adolescen amenoree primar, pubertate ntrziat; retard al creterii, statur mic. Adult infertilitate, avorturi spontane recurente; handicap mintal; anumite tulburri maligne (leucemie); screening n cazul persoanelor care au rude cu tulburri cromozomiale cunoscute.

Lucrare practic individualFiecare student primete o plac metafazic cu cromozomi bandai n tehnica G. Dup decuparea cromozomilor se vor recunoate perechile de cromozomi ca omologi dup dimensiune, poziia centromerului, constricii secundare, satelii i modelul de benzi. Apoi se vor aranja n ordinea descresctoare a mrimii, pe grupe, conform modelului standardizat. Cromozomii sexului se vor aranja separat pentru c difer la cele dou sexe i se vor lipi pe o foaie de hrtie notat ca n Fig. nr. 1.8. n final, rezultatul analizei cariotipului va indica n cifre numrul total de cromozomi i, dup o virgul, cei doi cromozomi ai sexului. Diagnosticul citogenetic poate fi: 46,xx - cariotip normal la femeie; 46,xy - cariotip normal la brbat.

Fig. nr. 1. 7. Clasic i modern n alctuirea cariotipului

GENETICA UMAN

19

Fi citogeneticNume: Alexandru Dobre Data naterii: 13 mai 1988 Adresa: Bucureti, strada Ceahlu, nr. 15, Bloc 74, Ap. 17 Diagnostic: Examinare preventiv Material: snge periferic Lama nr. B 32 / a

Cariotip: 46, xy Diagnostic citogenetic: normal Data: 16.03.2001Fig. nr. 1.8. Cariotip uman tipic pentru bandarea G

Bibliografie 1. (2001) Human Cytogenetics: A Practical Approach 3rd. ed., vol. I, pg. 9-30. 2. Bickmore W. (1999) Chromosome Structural Analysis A practical Approach, Oxford, University Press, pg. 37-51. 3. Maroni G. (2001) Molecular and Genetic Analysis of Human Traits, Blackwell, pg. 125-131. 4. Mader S.S. (1991) Human Biology Laboratory Manual, 3 rd. ed., WCB, pg. 180-183. Web site: http: //www.selu.com/bio/cyto/human/

20

CITOGENETIC UMAN

LUCRAREA PRACTIC 2: Meioza i cromozomii meiotici umaniObiectivele lucrrii:identificarea i descrierea fazelor meiozei umane; caracterizarea gametogenezei la brbat i la femeie; explicarea rolului meiozei n meninerea constant a numrului de cromozomi n succesiunea generaiilor i n crearea diversitii genetice la organismele care se reproduc sexuat. cromozom Meioza este un tip particular de diviziune omolog matern celule n celular, care are drept rezultat formarea de cromozom interfaza celule haploide din celule diploide (Fig. nr. 1.9.). omolog patern premeiotic Meioza intereseaz exclusiv organismele care se reproduc sexuat i care produc celule sexuale sau gamei. Gameii au un numr cromozomi haploid de cromozomi (n), astfel c, prin fecromatide omologi replicai cundare, se restabilete numrul diploid de cromozomi (2n) caracteristic speciei. Dac meioza nu ar avea loc, prin fecundaie, s-ar dubla numrul de cromozomi la fiecare generaie. sinapsis Meioza se realizeaz prin dou diviziuni nucleare succesive care preced formarea gameilor: prima diviziune meiotic (diviziunea reducional) i cea de-a doua diviziune meiotic (diviziunea ecvaional, similar mitozei). Meioza primar este precedat de interfaz, cnd n faza S ADN-ul se replic doar o dat, formndu-se cromatida sor a fiecrui cromozom i rezultnd cromozomi diviziune bicromatidici. La sfritul interfazei celula reducional este pregtit s intre n diviziune celular. Meioza primar diviziunea reducional Prima diviziune meiotic, numit i diviziunea reducional, reduce numrul de cromozomi ai unei celule diploide (2n) la jumtate, rezultnd dou celule fiice haploide (n). Reducerea numrului de cromozomi se realizeaz prin separarea cromozomilor omologi i se desfoar n faze succesive (Fig. nr. 1.10.). profaza I este complex, de lung durat i este subdivizat n 5 stadii consecutive: 1. leptoten (gr. leptos=subire; tainia=panglic) stadiul n care cromatina nuclear ncepe s se condenseze, devine vizibil sub forma cromozomilor cu filamente subiri i lungi, cu aspect de reea.

GENETICA UMAN

21

2. zigoten (gr. zygotos=mpreunat) stadiul n care cromozomii omologi se asociaz ca bivaleni. Asocierea se realizeaz pe toat lungimea lor, de la telomer ctre centromer, ntr-o aliniere perfect, prin complexul sinaptonemal. 3. pahiten (gr. pachys=gros) stadiul n care cromozomii devin mai scuri i mai groi; fiecare cromozom este vizibil format din dou cromatide surori; fiecare bivalent fiind format din doi cromozomi bicromatidici omologi, apare o structur alctuit din patru cromatide, numit tetrad. ntre cromatidele non-surori ale bivalentului apar schimburi fizice reciproce de segmente cromatidice prin care se formeaz noi combinaii de gene n gamei. Procesul a fost numit crossing-over i reprezint una dintre sursele variabilitii umane. 4. diploten (gr. diploos=dublu) stadiul n care cromozomii continu s se contracte; ntre omologi apar fore de respingere; complexul sinaptonemal dispare, iar cromozomii unui bivalent ncep s se separe unul de altul, rmnnd nc unii la nivelul unor puncte de contact numite chiasmata (pluralul de la chiasma). Citologic, se observ c fiecare bivalent are patru cromatide. 5. diakinesis (gr. dia= divergent; kinesis=micare) stadiul n care cromozomii omologi continu s se separe, iar punctele de contact (chiasmata) sunt mpinse ctre extremitile bivalenilor (Fig. nr. 1.11.). prometafaza este o scurt faz, caracterizat prin dispariia membranei nucleare i a nucleolului i definitivarea formrii fusului de diviziune. metafaza I este faza urmtoare; n care bivalenii migreaz n zona ecuatorial a fusului de diviziune; cei doi centromeri ai unui bivalent sunt orientai spre polii opui ai fusului de diviziune. anafaza I se caracterizeaz prin dispariia chiasmatei i migrarea cromozomilor omologi spre polii opui ai celulei. Atenie! centromerii nu se divid, deci spre polii opui ai fusului migreaz doar jumtate din numrul iniial de cromozomi. Cromozomii omologi segreg independent, adic, se separ i se repartizeaz ntmpltor la polii opui ai celulei, indiferent de originea lor matern sau patern; n final, la fiecare pol al celulei exist cte un set haploid de cromozomi bicromatidici ntr-o combinaie variat de cromozomi materni i paterni. telofaza I ncepe n momentul n care cromozomii au ajuns la polii celulei. Cromozomii ncep s se despiralizeze i o nou membran nuclear se formeaz. Celulele fiice au un set haploid de cromozomi bicromatidici (cromatidele-surori difer una de cealalt ca rezultat al crossing-over-ului). Dup diviziunea nuclear urmeaz citokineza, care are ca rezultat divizarea citoplasmei. Meioza secundar diviziunea ecvaional Meioza secundar ncepe dup finalizarea meiozei primare i este similar unei mitoze obinuite: centromerii se divid, iar cromatidele-surori migreaz spre polii opui ai celulei. n mitoza obinuit, dintr-o celul-mam diploid rezult celulele-fiice diploide. n meioza secundar, regula se respect, celulele fiice au acelai numr de cromozomi ca i celulamam (diviziune ecvaional), dar n acest caz celula-mam este haploid (Fig. nr.1.10.). Meioza secundar se desfoar n faze succesive: interfaza II este foarte scurt i se deosebete de interfaza I prin faptul c nu are loc replicarea ADN-ului. profaza II ncepe prin condensarea filamentelor de cromatin i se ncheie cu dispariia membranei nucleare i formarea fusului de diviziune.

22

CITOGENETIC UMAN

MEIOZA PRIMAR PROFAZA I

Leptoten

Zigoten

Pahiten

Diploten

Diakinesis

Metafaza I

Anafaza I

Telofaza I

MEIOZA SECUNDARProfaza II Metafaza II Anafaza II Telofaza II

Fig. nr. 1.10. Meioza aspect celular

metafaza II se caracterizeaz prin dispunerea n planul ecuatorial al fusului de diviziune a cromozomilor. - anafaza II se caracterizeaz prin divizarea centromerilor, ceea ce permite separarea cromatidelor surori, care migreaz spre polii opui ai celulei. - telofaza II este iniiat n momentul n care cromozomii au ajuns la polii opui ai celulei. ncepe decondensarea cromozomilor i formarea noii membrane nucleare, care va separa fiecare set haploid de cromozomi. Urmeaz citokineza. n final, apar patru celule-fiice, haploide, cu cromozomi monoFig. nr. 1.11. Diakineza la brbat cromatidici recombinai.

GENETICA UMAN

23

Diviziunea meiotic la mamifere are loc numai n gonade. De regul, studiul diferitelor faze ale meiozei se face pe preparate din esut gonadal matur obinut prin biopsie testicular. Testiculele sunt mai accesibile pentru biopsie comparativ cu ovarele, iar profaza primei diviziuni meiotice la sexul feminin ncepe n perioada embrionar. Protocolul de evideniere a fazelor meiozei la mamifere Materiale: masculi de oareci sau obolani albi; foarfeci, pense, ace, vase Petri, eprubete, lame de sticl, centrifug; eter etilic, alcool metilic, acid acetic glacial, soluie hipoton de citrat de Na 2,2%, soluie Giemsa 10%. Mod de lucru (se folosete o variant rapid a metodei Evans i colab., 1964):1. animalele se injecteaz intraperitoneal cu o soluie de colchicin 0,05%; 2. dup 90 de min., animalele se anesteziaz cu eter etilic, se sacrific i se recolteaz testiculele; 3. testiculele recoltate se introduc 10 min. n ap distilat ntr-un vas Petri i se fragmenteaz n buci mici; 4. se nltur apa distilat, se adaug soluia hipoton de citrat de sodiu i se las n contact 20-30 de min.; 5. coninutul vasului Petri este transferat ntr-o eprubet de centrifug i se centrifugheaz 5 min. la 500 rotaii/min.; 6. se ndeprteaz supernatantul, iar sedimentul se resuspend n 5 ml de citrat de Na; 7. se centrifugheaz 12 min. la 800 rotaii/min.; 8. se arunc supernatantul i peste sedimentul celular se adaug ncet, picurnd uor pe marginea eprubetei, fixatorul (alcool metilic i acid acetic glacial, 3:1); 9. se las la fixat 5 min.; 10. se centrifugheaz 10 min. la 1 000 rotaii/min.; 11. se arunc supernatantul i se resuspend sedimentul n 5 ml fixator proaspt, lsndu-se la temperatura camerei 30 de min.; 12. se centrifugheaz din nou 10 min. la 1 000 rotaii/min., iar sedimentul se resuspend n 1 ml de fixator; 13. din suspensia celular se efectueaz preparate punnd cteva picturi cu pipeta Pasteur pe o lam curat i degresat; 14. preparatele se usuc la aer i se coloreaz cu soluie Giemsa 10% timp de 20 de min.; 15. se examineaz la microscop cu ob.100X cu imersie.

Gametogeneza la omCelulele epiteliului germinal al gonadelor masculine i feminine sufer o succesiune de diviziuni mitotice i meiotice n scopul producerii de gamei maturi. Gametogeneza se produce n urmtoarele stadii: 1.stadiul de multiplicare celular celulele germinale primitive (2n) sufer mitoze succesive care produc la brbat, spermatogoniile (2n) i la femeie, ovogoniile (2n); 2.stadiul de cretere care pregtete goniile pentru meioz formnd spermatocitele (2n) i ovocitele (2n) primare; 3.stadiul de maturaie, n care spermatocitele i ovocitele primare sufer dou diviziuni succesive una reducional i una ecvaional urmate de diferenierea celulei haploide i formarea gameilor maturi.

24

CITOGENETIC UMANSPERMATOGENEZA celul germinal primordial 2n faza de multiplicare 2n (mitoze) OVOGENEZA celul germinal primordial 2n

2n 2n 2n 2novogonie

2n 2n 2n 2n

2n 2n

2n

spermatogonia 2n 2n 2n 2n 2n 2n 2n 2n faza de cretere spermatocit primar cretere

2n 2n 2n 2n 2n 2n 2n 2ncretere

2n

ovocit primar

2nprima diviziune meiotic

faza de maturaie (meioz) prima diviziune meiotic spermatocit secundar

na doua diviziune meiotic

n

ovocit secundar

na doua diviziune meiotic

primul n globul polar

spermatide n

ndifereniere

n

n

novul

nal doilea globul polar

n

nglobuli polari

spermatozoizi

n

n

n

n

Fig. nr. 1.12. Gametogeneza uman

Spermatogeneza spermatogeneza este procesul de formare a gameilor masculini; la pubertate, testiculele ncep s secrete cantiti mari de testosteron. Testosteronul stimuleaz dezvoltarea unor caractere sexuale secundare, maturarea tubilor seminiferi i iniierea spermatogenezei. n tubii seminiferi, celulele germinale primordiale se divid mitotic i apoi se difereniaz n spermatogonii. Dup mai multe mitoze , spermatogonia produce spermatocitul primar. Spermatocitul primar (46,XY) sufer prima diviziune de maturaie (meioza primar) i produce dou celule haploide numite spermatocite secundare (una 23,X i cealalt 23,Y), care sufer cea de-a doua diviziune de maturaie (meioza secundar) i formeaz patru celule haploide numite spermatide. Spermatidele sufer o serie de transformri complexe, devenind spermatozoizi. Procesul se numete spermiogenez. n Fig. nr. 1.12. este prezentat gametogeneza la brbat.

GENETICA UMAN

25

spermatogeneza se desfoar continuu, de la pubertate pn la moarte, dar rata produciei de gamei scade o dat cu naintarea n vrst; fiecare ciclu al spermatogenezei dureaz aproximativ 64 de zile: 16 zile mitozele spermatogoniilor, 8 zile meioza primar a spermatocitului primar, 16 zile meioza secundar a spermatocitului secundar i circa 24 de zile spermiogeneza; numrul mare de replicri care preced mitozele succesive ale celulei germinale primordiale crete riscul de apariie a mutaiilor n gamei.

Ovogeneza ovogeneza este procesul de formare i dezvoltare a ovulului, care include meioza ovocitelor, vitelogeneza i formarea membranelor ovulului; ncepe n perioada intrauterin, cnd ovarul nu este nc difereniat; celulele germinale primitive se divid mitotic de mai multe ori, formnd ovogoniile; dup a 12-a sptmn de via intrauterin, ovogoniile se divid mitotic i formeaz ovocitele primare; o parte dintre acestea ncep diviziunea de maturaie, dar se opresc n profaza primei diviziuni meiotice pentru o lung perioad, care dureaz pn la ovulaie (poate avea loc oricnd, de la pubertate i pn la menopauz); stadiul n care rmn se numete dictioten (ntre diploten i diakinesis), fiind caracterizat prin prezena bivalenilor ai cror cromozomi sunt parial condensai; ovocitul primar este acoperit de un strat de celule foliculare, constituind foliculul primordial; majoritatea foliculilor primordiali degenereaz i numai puini se vor matura; la pubertate, lunar, o parte din ovocitele primare iniiaz procesul de difereniere , dar, de regul, numai una va deveni ovul matur; puin nainte de ovulaie este definitivat prima diviziune meiotic, rezultnd celule-fiice, diferite prin cantitatea citoplasmatic pe care o conin ovocitul secundar (23,X) i primul globul polar (23,X); n momentul expulziei, ovocitul secundar se gsete n metafaza II; a doua diviziune meiotic este finalizat n trompa lui Fallopio numai dac are loc fecundaia; rezult ovulul matur i cel de al doilea globul polar (Fig. nr. 1.12.); ovogeneza este discontinu, ncepe n viaa fetal, urmeaz un stadiu de laten pn la ovulaiile din perioada fertil a femeii; durata mare a stadiului de laten poate crete riscul de nondisjuncie a cromozomilor omologi la femeile cu o vrst mai naintat.

Comportamentul cromozomilor sexuali n timpul meiozei la femeie, cei doi cromozomi X fiind omologi, formeaz un bivalent, care se comport similar oricrui bivalent alctuit din autozomi; la brbat, cromozomii sexului, X i Y, se comport diferit fa de autozomi. n spermatocitul primar aflat n profaza I cromozomul X i cromozomul Y, formeaz vezicula sexual. Ei nu sunt omologi, exceptnd regiuni scurte de la capetele braelor p, numite regiuni pseudoautozomale. Vezicula sexual este reprezentat de un corpuscul dens, vizibil de la sfritul leptotenului pn n diakinesis. Este format prin condensarea precoce a celor doi cromozomi, uneori, nvelii de o pelicul de ARN. Studiile citologice arat c cromozomii X i Y sunt asociai prin capetele lor, formndu-se o sinaps terminal. La nceputul diakinezei vezicula sexual dispare, dar cromozomii sexului pot fi observai ca un bivalent, asociai cap la cap (Fig. nr. 1.11.), pstrnd aceast configuraie i n metafaza I. n anafaza I cromozomii X i Y se separ i migreaz fiecare la unul dintre polii opui ai fusului de diviziune.

26

CITOGENETIC UMAN

Semnificaia meiozei1. meioza menine constant numrul de cromozomi de la o generaie la alta prin formarea gameilor haploizi, care, prin fecundaie, refac numrul diploid de cromozomi caracteristic speciei (Fig. nr. 1.13.);

Organismul matur (2n) testicule (2n) ovare (2n)

MEIOZA spermatozoid (n)

ovul (n)

embrion uman (2n)

zigot (2n)

FECUNDAIEFig. nr. 1.13. Schema reproducerii sexuate la om

2. meioza produce gamei cu combinaii variate de gene datorit crossing-over-ului din profaza I i asortrii independente a cromozomilor n anafaza I (Fig. nr. 1.14.). Astfel, descendenii care rezult din reproducerea sexuat sunt diferii genetic de prinii lor; 3. multe aberaii cromozomiale sunt rezultatul erorilor care apar n meioz (nondisjunciile cromozomilor i procesele de crossing-over inegal).

Plana I Fig. nr. 1.14. Recombinarea genetic din timpul meiozei (plana I): crossing-over

GENETICA UMAN

27

Metafaza I

sau

Anafaza I

sau

Anafaza II

sau

Combinaia genelor n gamei Plana II Fig. nr. 1.14. Recombinarea genetic din timpul meiozei (plana II): asortarea independent

Bibliografie 1. Ford E.H.R (1973) Human Chromosomes, Academic Press, pg. 54-77. 2. Jorde L.B. (2000) Medical Genetics, 2nd ed., Mosby, pg. 25-28. 3. Therman E. (1992) Human Chromosomes: Structure, Behavior and Effects, 3rd ed., Springer. Web site http://www.accessexcellence.org/AB/GG/meiosis.html

28

CITOGENETIC UMAN

LUCRAREA PRACTIC 3: Cromozomii sexului i cromatina sexual la omObiectivele lucrrii:evidenierea corpusculului Barr n nucleii somatici, la persoanele de sex feminin; evidenierea apendicilor perinucleari, la nivelul nucleilor celulelor polimorfonucleare neutrofile din sngele periferic, la persoanele de sex feminin; evidenierea corpusculului F, la nivelul nucleilor celulelor somatice provenite de la persoane de sex masculin. Analiza cromozomilor sexuali se poate efectua pe: frotiuri din mucoasa bucal, frotiuri din sngele periferic, biopsii de piele, celule recoltate din lichidul amniotic. In interfaza ciclului celular, pe aceste categorii de preparate, se evideniaz: la persoanele normale de sex feminin (cariotip: 46,XX) corpusculul sexual X; la persoanele normale de sex masculin (cariotip: 46,XY) corpusculul sexual Y.

Corpusculul sexual XDefiniie: Corpusculul sexual X reprezint unul dintre cei doi cromozomi X la femeie, care este mult condensat i inactiv genetic, n interfaza ciclului celular. Procesul de inactivare a unuia dintre cei doi cromozomi X la femeie, n nucleii interfazici ai celuleor somatice, poart denumirea de lyonizare. Particularitile lyonizrii: debuteaz precoce (stadiul de blastocist tardiv, aproximativ ziua a 16-a de via intrauterin): este aleatorie (n egal msur se poate inactiva att cromozomul X de origine matern, ct i cromozomul X de origine patern); are rol adaptativ, de meninere a echilibrului genetic funcional ntre sexe, pentru genele poziionate pe cromozomul X, care codific i caractere somatice (compensaie de doz). Nomenclatur: Corpusculul sexual X, evideniat la nivelul nucleului celulelor epiteliale, poart denumirea de cromatin sexual sau corpusculul Barr; Corpusculul sexual X, evideniat la nivelul nucleului celulelor polimorfonucleare neutrofile (PMN), din sngele periferic, mbrac aspectul apendicilor perinucleari. Poziie: Corpusculul Barr este ataat de faa intern a membranei nucleare. Apendici perinucleari sunt ataai de faa extern a membranei nucleare. Form: Corpusculul Barr are forma hemisferic sau triunghiular, cu baza orientat ctre periferie i cu vrful la centru.

GENETICA UMAN

29

Apendici perinucleari mbrac forme variate: Tipul A (b de tob sau corpuscul pediculat) se prezint ca o formaiune rotund-ovalar, intens i uniform colorat, ataat de faa extern a membranei nucleare printr-un pedicul fin de cromatin (Fig. nr.1.15.).Fig. nr. 1.15. Apendice perinuclear de tip A

Tipul B (corpuscul sesil) se prezint ca o formaiune rotund-ovalar, intens i uniform colorat, ataat direct de faa extern a membranei nucleare (Fig. Fig. nr. 1.16. Apendice perinuclear de tip B nr. 1.16.). Tipul C are forme variate: b de tob (dar cu corpuscul mai mic i pedicul mai lung), baston sau crlig (Fig. nr. 1.17.). Tipul D ( rachet de tenis) se prezint ca o formaiune rotund-ovalar, intens colorat n periferie i decolorat n centru, ataat de faa extern a membranei nucleare printr-un pedicul fin de cromatin.

Fig. nr. 1.17. Apendici perinucleari de tip C i A

Dimensiune: Corpusculul Barr: 1-2 microni Apendicii perinucleari: tipul A: 1,4-1,6 microni; tipul B: 1,2-1,4 microni; tipul C: 1,2-1,4 microni; tipul D: 2 microni. Numr: Numrul de corpusculi sexuali X din celul se calculeaz dup formula: B = (X-1) x P/2 unde: B = numrul de corpusculi sexuali X din celul; X = numrul de cromozomi X din celul; P = gradul de ploidie al celulei. Pentru celulele somatice, diploide, P = 2. Drept urmare, relaia de mai sus devine: B = (X-1) n cazul apendicilor perinucleari, se consider c doar tipurile A i B reprezint corpusculul sexual X. Tipurile C i D au origine i semnificaie necunoscute. n aceast situaie, indicele corpusculilor sexuali se calculeaz dup relaia Kosenow: I.C. = A + B sau I.C. = A + B/C, dac lum n calcul i apendicii perinucleari de tip C.

30

CITOGENETIC UMAN

Frecvena: Frecvena celulelor purttoare de corpuscul sexual X vizibil la examenul microscopic este influenat de o serie de factori: activitatea mitotic a celulei; activitatea metabolic a celulei; vrsta celulei; vrsta individului; tipul de esut examinat; tehnica folosit; aciunea diferitelor substane medicamentoase. Protocolul de evideniere a apendicilor perinucleari n leucocitele polimorfonucleare neutrofile din sngele periferic: Metoda Davidson - Smith Materiale necesare: Instrumentar: ace de sering sterile; Sticlrie de laborator: lame de sticl sterile cu margini lefuite; pipete Pasteur; Materiale moi: vat, tifon; Soluii, reactivi, colorani: alcool medicinal; soluie May-Grnwald; soluie Giemsa 10%; ap neutr; trus de colorat; Aparatur de laborator: microscop optic (dotat cu obiectiv cu imersie de 90x sau 100x). Mod de lucru: Metoda Davidson - Smith1. Recoltarea i realizarea frotiului de snge se dezinfecteaz pulpa degetului cu alcool etilic; se neap pulpa degetului cu un ac steril de sering; prima pictur de snge se ndeprteaz cu un tampon de vat uscat; urmtoarea pictur de snge se ia cu ajutorul unei lame de sticl cu marginile lefuite; se aaz lama cu pictura de snge pe o alt lam de sticl, ctre extremitatea acesteia, n unghi de 45, i se mpinge uor ctre cealalt extremitate, obinndu-se frotiul de snge. 2. Colorarea frotiului procedeul May-Grnvald Giemsa: se las frotiurile la uscat cteva minute; se acoper cu 2 ml. de soluie May-Grnwald, timp de 2-4 minute; se adaug 2 ml. de ap fr a vrsa colorantul i se las 2 min.; se vars amestecul fr a spla; se acoper cu soluie Giemsa 10%, preparat extemporaneu, timp de 20-30 de min.; se spal frotiul cu jet de ap; se usuc la aer; se examineaz la microscopul optic cu obiectivul de imersie 90x. 3. Aprecierea i interpretarea rezultatelor.

Prin aceast metod, la examenul microscopic al polimorfonuclearelor neutrofile se evideniaz apendicii perinucleari de tip: A, B, C, D. Pentru determinarea sexului genetic celular, la persoana analizat se examineaz cel puin 500 de neutrofile cu nuclei polilobai. Cu ajutorul relaiei Kosenow se calculeaz indicele corpusculilor sexuali.

GENETICA UMAN

31

La o persoan normal de sex feminin, valoarea indicelui corpusculilor perinucleari din celulele polimorfonucleare neutrofile se calculeaz dup formula: I.C. = A+B, este > de 6 sau I.C. = A+B/C, este > de 0,4. Protocolul de evideniere a corpusculilor Barr n celulele mucoasei bucale: Metoda Sanderson - Stewart Materiale necesare: Instrumentar: spatul steril; Sticlrie de laborator: lame de sticl sterile cu margini lefuite; lamele de sticl sterile; pipete Pasteur; Materiale moi: vat, tifon, hrtie de filtru; Soluii, reactivi, colorani: alcool medicinal; soluie de alcool etilic absolut; soluie de eter etilic; soluie orcein acetic 1%; ap neutr; trus de colorat; Aparatur de laborator: microscop optic (dotat cu obiectiv cu imersie de 90x sau 100x). Mod de lucru: Metoda Sanderson - Stewart1. Recoltarea celulelor din mucoasa bucal i realizarea frotiului: se racleaz regiunea posterioar a mucoasei cavitii bucale, cu ajutorul unei spatule sterile; primul raclat de mucoas bucal extras se ndeprteaz; urmtorul raclat se trece pe o lam de sticl i se prepar frotiul. 2. Fixarea celulelor: se realizeaz cu o soluie de alcool etilic absolut i eter etilic (1 :1), timp de 30 de minute. 3. Colorarea frotiului procedeul cu orceina acetic: se acoper frotiul cu soluie de orcein acetic 1%; se acoper frotiul cu o lamel de sticl; se ndeprteaz excesul de colorant cu ajutorul hrtiei de filtru; se spal frotiul cu jet de ap; se usuc; se examineaz la microscopul optic cu obiectivul de imersie 90x. 4. Aprecierea i interpretarea rezultatelor.

n celulele mucoasei bucale, corpusculul Barr apare intranuclear, aderent de faa intern a membranei nucleare, avnd form triunghiular i dimensiune de aproximativ 1 micron (Fig. nr. 1.18.). La o persoan normal de sex feminin, frecvena corpusculilor Barr din nucleii celulelor epiteliale poate oscila ntre 20 i 80% din totalul celulelor examinate.Fig. nr. 1. 18. Corpusculul Barr n celulele mucoasei bucale la brbat (46,xy), la femeie (46,xx) i la femeia cu tetrasomie x (48,xxxx)

32

CITOGENETIC UMAN

Corpusculul sexual YDefiniie: Corpusculul sexual Y reprezint cromozomul Y la brbat, evideniat n interfaza ciclului celular. Analiza corpusculului sexual Y se poate efectua pe: frotiuri din mucoasa bucal, frotiuri din sngele periferic, biopsii de piele, celule recoltate din lichidul amniotic, spermatozoizi. Nomenclatur: Corpusculul sexual Y mai este denumit i corpuscul F (fluorescent), datorit coloranilor specifici utilizai (quinacrin sau atebrin), care confer cromozomului Y un aspect fluorescent. Poziie: se evideniaz la nivelul periferiei nucleului celular sau pericentral. Form: corpuscular, rotund-ovalar. Dimensiune: 0,25 1 microni Numr: egal cu numrul cromozomilor Y din celul. Protocolul de evideniere a corpusculilor F n celulele mucoasei bucale: Metoda fluorescent Materiale necesare: Instrumentar: spatul steril; Sticlrie de laborator: lame de sticl sterile cu margini lefuite; lamele de sticl sterile; pipete Pasteur; Materiale moi: vat, tifon, hrtie de filtru; Soluii, reactivi, colorani: alcool medicinal; soluie de alcool etilic absolut; soluie de eter etilic; soluie de atebrin 1%; ap neutr; trus de colorat; Aparatur de laborator: microscop de fluorescen (dotat cu obiectiv cu imersie de 90x sau 100x). Mod de lucru: Metoda fluorescent1. Recoltarea celulelor din mucoasa bucal i realizarea frotiului: se racleaz regiunea posterioar a mucoasei cavitii bucale, cu ajutorul unei spatule sterile; primul raclat de mucoas bucal extras se ndeprteaz; urmtorul raclat se trece pe o lam de sticl i se prepar frotiul. 2. Fixarea celulelor: se realizeaz cu soluie de alcool etilic absolut i eter etilic (1:1), timp de 30 de minute; se usuc. 3. Colorarea frotiului : se acoper frotiul cu soluie de atebrin 1%, timp de 30 de minute; se acoper frotiul cu o lamel de sticl; se ndeprteaz excesul de colorant cu ajutorul hrtiei de filtru; se spal frotiul cu jet de ap; se usuc; se examineaz la microscopul de fluorescen cu imersie 90x. 4. Aprecierea i interpretarea rezultatelor.

La persoanele normale de sex masculin frecvena corpusculului sexual Y poate oscila ntre 25 i 30% din totalul celulelor examinate.

GENETICA UMAN b

33

a

Fig. nr. 1.19. Corpusculul F n spermatozoid (a) i cromozomul Y marcat fluorescent n placa metafazic la brbat (b)

Importana studiului corpusculilor sexuali X i Y1. Biologic: permite stabilirea sexului genetic al individului analizat. 2. Medical: permite diagnosticarea sindroamelor genetice determinate de existena unor anomalii de numr ale cromozomilor sexuali (sindrom Turner, Klinefelter, Triplo X, supermascul); permite diagnosticarea strilor de intersexualitate (hermafroditism adevrat, pseudohermafroditism); permite diagnosticarea prenatal a sexului produsului de concepie; permite stabilirea etiologiei unor disfuncii gonadice; permite determinarea sexului genetic la sportivii de performan, n medicina sportiv; permite stabilirea sexului genetic al victimei, n medicina legal; se utilizeaz ca marker, n transplantologie i oncologie.

Bibliografie:1. Isvoranu M. (1989) Biologie i genetic lucrri practice, Bucureti, pg. 29-36. 2. Dacie Ju., Lewis Sm (1991) Practical Haematology, Churchill Livingstone, pg. 421-422. Web site: http://www.mcmaster.ca/inabis 98/medicine/chavez 0626/two.html Web site: http://www.grad.ttuhsc.edu/courses/histo/blood Web site: http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jtoc?ID=33129.

34

CITOGENETIC UMAN

LUCRAREA PRACTIC 4: Studiul anomaliilor cromozomiale la omObiectivele lucrrii:identificarea anomaliilor cromozomiale din analiza cariotipului; asocierea anomaliei cromozomiale cu un anume fenotip caracteristic. n patologia cromozomial uman analiza cariotipului este o investigaie citogenetic util pentru c permite evidenierea eventualelor modificri cromozomiale numite anomalii sau aberaii cromozomiale care pot avea efecte fenotipice severe.

Anomaliile cromozomiale reprezint modificri ale numrului i structurii normale ale cromozomilor, clasificndu-se n anomalii numerice i anomalii structurale; pot fi evideniate prenatal (celule fetale) sau postnatal (limfocite); afecteaz 7,5% din totalul produilor de concepie umani; au o frecven de 1/150 printre nou-nscuii vii; sunt o cauz important a morbiditii i mortalitii (50% dintre avorturile spontane n primul trimestru de sarcin); afecteaz att autozomii (perechile 1 22), ct i gonozomii (X i Y); pot fi constituionale sau dobndite.

Anomalii cromozomiale numericeNumrul caracteristic de cromozomi al speciei umane este: 2n = 46 de cromozomi n nucleul celulei somatice (celul diploid); n = 23 de cromozomi n gamei ovule sau spermatozoizi (celule haploide). De regul, orice abatere de la numrul corect de cromozomi ai unei celule se numete anomalie cromozomial de numr. Tipuri de anomalii numerice: poliploidia; aneuploidia; mozaicuri cromozomiale.

PoliploidiaPrezena supranumerar a unor seturi complete de cromozomi ntr-o celul se numete poliploidie. Exemple de poliploidie sunt: Triploidia Un set haploid de cromozomi (n) n plus ntr-o celul somatic uman (2n) determin apariia triploidiei, adic 3n = 69 de cromozomi. Celulele triploide pot fi 69,XXX , 69,XXY sau 69,XYY, n funcie de originea matern sau patern a setului extracromozomial. Triploidia are o frecven de 1/10 000 printre nou-nscuii vii i 15% printre produii de concepie avortai spontan. Surplusul de material genetic produce multiple anomalii, cum ar fi defecte ale cordului i sistemului nervos central. Din acest motiv, feii triploizi sunt avortai (Fig. nr.1.20.) i n mod excepional ajung s supravieuiasc pn la termen, avnd o viabilitate redus.

GENETICA UMAN

35

Fig. nr. 1. 20. Ft triploid avortat. Disproporia dintre extremitatea cefalic i trunchi; mn malformat, sindactilia degetelor III i IV; cariotip 69,xxy

Cauzele triploidiei sunt: dispermia fertilizarea ovulului de ctre doi spermatozoizi, fuziunea ovulului cu un globul polar i fertilizarea de ctre un spermatozoid sau defecte ale meiozei formarea unui gamet diploid (patern sau matern), care mpreun cu gametul normal va genera un zigot triploid.

36

CITOGENETIC UMAN

Tetraploidia Prezena a 4 seturi haploide de cromozomi ntr-o celul somatic se numete tetraploidie i se caracterizeaz prin 4n = 92 de cromozomi. Celulele tetraploide pot fi 92,XXXX , 92,XXYY, 92,XXXY sau 92,XYYY. La om este mult mai rar observat dect triploidia. De regul, este incompatibil cu viaa postnatal, doar indivizii cu mozaicuri 2n/4n sunt viabili. Cauzele tetraploidiei sunt: defectele primei diviziuni mitotice a zigotului sau fuziunea a doi zigoi diploizi.

AneuploidiaUn cromozom dintr-o pereche poate fi absent sau prezent n exces, ceea ce nseamn c numrul de cromozomi ai celulei se modific. Multiplicarea inexact a numrului de cromozomi din nucleul unei celule se numete aneuploidie. ntr-o celul somatic normal exist 23 de perechi de cromozomi, fiecare pereche avnd un cromozom de origine matern i unul de origine patern, condiie numit disomie biparental (2n). Nulisomia Absena ambilor cromozomi dintr-o pereche se numete nulisomie (2n-2), iar la om este o condiie incompatibil cu dezvoltarea normal. Monosomia Absena unui singur cromozom din pereche se numete monosomie (2n-1). Aproape toate monosomiile umane, cu excepia celor care implic cromozomii sexului, sunt letale. Trisomia Prezena unui cromozom n plus ntr-o pereche se numete trisomie (2n+1). Trisomia este una dintre cauzele avortului spontan, totui, exist trisomii care sunt compatibile cu supravieuirea postnatal. S-au observat i trisomii multiple de tipul 2n+1+1+1. Cele mai frecvente trisomii autozomale i gonozomale sunt prezentate n planele de la pag. 42. Efectele fenotipice ale anomaliilor numerice autozomale sunt mai severe comparativ cu cele ale gonozomilor. Tetrasomia (2n+2) i pentasomia (2n+3) sunt extrem de rare i implic, de obicei, cromozomii sexului. Aneuploidia poate fi: complet, caz n care un ntreg cromozom lipsete sau este supranumerar n cariotip; parial, caz n care numai anumite segmente cromozomiale variabile ca mrime lipsesc sau sunt n exces ntr-o pereche; omogen, caz n care toate celulele organismului au acelai tip de aneuploidie; n mozaic, caz n care coexist la acelai organism linii celulare normale i linii celulare aneuploide.ISCN n cazul anomaliilor numerice Simbolul 69,XXX 92,XXYY 45,X 47,XX,+21 47,XY,+18 48,XXXX 49,XXXXY 46,XY,5p46,XX,2q+ 47,XX,+21/46,XX Semnificaia triploidie tetraploidie monosomie X (sindrom Turner) trisomie 21 (sindrom Down) trisomie 18 (sindrom Edward) tetrasomie X pentasomia XXXXY monosomia parial 5ptrisomia parial 2q+ mozaic celular pentru cromozomul 21 (sindrom Down n mozaic)

GENETICA UMAN

37

Cea mai frecvent cauz a aneuploidiei o reprezint nondisjuncia meiotic sau mitotic, adic nesepararea cromozomilor omologi sau nesepararea cromatidelor surori n timpul anafazei. Fig. nr. 1.21. prezint nondisjuncia meiotic i mitotic.Nondisjuncie meiotic Meioza Ovul Fecundaie Zigot

Meioz normal

Normal

Normal

Trisomie Nondisjuncie meiotic

Monosomie letal Nondisjuncie mitotic Mitoz Mitoz

Mitoz normal Normal Mitoz normal Sindrom Down n mozaic Trisomie 21 Nondisjuncie mitotic Monosomie 21

Fig. nr. 1. 21. Consecinele nondisjunciei meiotice i mitotice

38

CITOGENETIC UMAN

Mozaicul cromozomialPrezena a dou sau mai multor linii celulare diferite cromozomial la un individ se numete mozaic cromozomial. Liniile celulare sunt complementare i deriv din acelai zigot. De exemplu: 47,XX,+21/46,XX sindrom Down n mozaic (Fig. nr. 1.21.). Cauza mozaicului cromozomial este nondisjuncia cromatidelor surori n diviziunile mitotice postzigotice, astfel c, n funcie de momentul n care a avut loc aberaia de diviziune, un procent variabil de celule pot fi anormale citogenetic, iar consecinele clinice variate.

Anomalii cromozomiale de structur apar cu o frecven de 1/500 de nateri; cromozomii se pot rupe spontan, dar rata rupturilor poate fi mrit de aciunea agenilor clastogeni (radiaii ionizante, infecii virale, substane chimice) n interfaz sau n timpul meiozei sau mitozei; pot fi balansate succesiunea benzilor cromozomiale se schimb, dar nu se pierde i nu se ctig material genetic, sau nebalansate se pierde sau se ctig material genetic; pot interesa unul sau mai muli cromozomi; pot fi observate folosind tehnici de bandare standard sau FISH; tipuri: deleia, duplicaia, inversia, translocaia, cromozomi inelari, izocromozomi, cromozomi dicentrici. Orice schimbare a structurii fizice a cromozomului reprezint o anomalie structural. Toate anomaliile cromozomiale de structur se datoreaz uneia sau mai multor rupturi care altereaz morfologia cromozomului, iar segmentele cromozomiale rezultate se pot pierde sau rearanja ntr-o combinaie nou, anormal. Deleia (del) Pierderea unui fragment dintr-un cromozom ca urmare a ruperii braului cromozomial se numete deleie. Deleiile pot fi terminale sau intercalare (Fig. nr. 1.22.). Deleia terminal se observ n cazul n care se pierde material genetic localizat la extremitile cromozomului pter sau qter. Dac apare o dubl ruptur la nivelul aceluiai bra cromozomial, segmentul cuprins ntre rupturi se pierde, iar poriunile de cromozom rmase au capete lipicioase care se reunesc. Deleiile sunt vizibile microscopic cu ajutorul tehnicilor de bandare. Mrimea fragmentului deletat determin viabilitatea i fenotipul individului care prezint anomalia structural. Uneori, apar deleii mici, numite microdeleii, care sunt detectate doar prin tehnici moleculare. La om au fost observate deleii pentru toi cromozomii, fie pe braele p, fie pe braele q. Cele mai frecvente sunt 4p- (sindromul Wolf ) i 5p- (sindromul cri du chat) (vezi planele de la pag. 48 i 49). Duplicaia (dup) Prezena n exces a unui fragment cromozomial se numete duplicaie. Fragmentul suplimentar se poate ataa cromozomului omolog sau unui cromozom neomolog pstrnd ordinea originar a genelor duplicaie direct sau n tandem, sau inversnd ordinea normal a genelor duplicaie invers sau n tandem invers. Consecinele fenotipice ale duplicaiei sunt sindroamele de trisomie parial.

GENETICA UMAN

39

Deleie terminal

Deleie interstiial

Inversie paracentric

Inversie pericentric

Translocaie balansat

Translocaie robertsonian

Cromozom inelar

Cromozom dicentric

Izocromozom

Fig. nr. 1.22. Anomalii cromozomiale de structur

40

CITOGENETIC UMAN

Inversia (inv) Inversia se produce n urma apariiei unei duble rupturi pe acelai bra cromozomial sau a cte unei rupturi pe fiecare bra cromozomial, rotirea cu 180 a fragmentului cuprins ntre cele dou puncte de ruptur i alipirea lui aceluiai cromozom. Inversia poate fi: paracentric fragmentul inversat nu include centromerul i pericentric fragmentul inversat include centromerul (Fig. nr. 1.22). Detectarea acestui defect de structur se face prin folosirea tehnicii bandrii, care evideniaz aspectul inversat al ordinii benzilor cromozomiale. Segmentul cromozomial inversat determin schimbarea secvenei ADN, care nu este obligatoriu s aib consecine fenotipice evidente la purttorul de inversie. Dar inversarea secvenei ADN pe unul dintre omologi poate afecta mperecherea cromozomilor omologi n profaza I a meiozei. Unirea defectuoas a cromozomilor omologi poate avea ca rezultat deleii sau duplicaii ale materialului genetic, care, ulterior, vor fi exprimate la descendentul purttorului de inversie. Translocaia (t) Translocaia este un rearanjament structural care apare n urma transferului de segmente cromozomiale ntre cromozomi neomologi. Ambii cromozomi implicai trebuie s sufere cel puin o ruptur pe unul dintre brae pentru ca schimbul de material genetic s aib loc. De obicei, prin schimbul de segmente cromozomiale nu se pierde material genetic, deci purttorul este clinic normal, iar translocaia este echilibrat sau balansat. Purttorii unei astfel de translocaii echilibrate pot produce gamei neechilibrai genetic, iar prin fecundarea acestora cu gamei normali rezult zigoi aberani citogenetic.Aadar, pot aprea consecine severe pentru descendenii lor. Translocaia poate fi: reciproc balansat sau nebalansat; robertsonian; inserional. Translocaia reciproc balansat implic doi cromozomi neomologi care sufer cte o ruptur pe unul dintre brae, iar segmentele cromozomiale se schimb ntre ele (Fig. nr. 1.22.). Dac punctul de ruptur nu afecteaz o gen specific, ci o regiune intergenic, atunci nu apar efecte fenotipice pentru purttor. Translocaia reciproc nebalansat prin schimbul de segmente cromozomiale se poate pierde sau ctiga material genetic, existnd consecine fenotipice pentru individ. Translocaia robertsonian sau fuziunea centric implic numai cromozomii acrocentrici din grupele D i G ale cariotipului uman. Rupturile cromozomiale apar n regiunea centromerului la ambii cromozomi acrocentrici. Fragmentele cromozomiale care corespund braelor scurte sunt lipsite de centromer (acentrice) i se vor pierde n diviziunea celular urmtoare fr s apar efecte fenotipice. Braele lungi ale celor doi cromozomi acrocentrici fuzioneaz n regiunea centromeric (fuziune centric), rezultnd un singur cromozom, numit cromozom derivat. Fuziunea centric a cromozomilor 13 i 14 este cel mai frecvent ntlnit la om, fiind urmat ca frecven de fuziunea centric a cromozomilor 14 i 21 (Fig. nr. 1.22.). Individul purttor de translocaie robertsonian este clinic sntos, dar n gametogenez apar probleme cu consecine pentru descendeni. Translocaia inserional implic doi cromozomi pe braele crora apar trei rupturi: dou rupturi pe braul unui cromozom i una pe braul celuilalt. Un cromozom pierde un segment intercalar (deleie interstiial), segment care este transferat i inserat pe cellalt cromozom la locul de ruptur. Purttorul de translocaie este fenotipic normal, dar poate produce gamei care prezint fie o duplicaie, fie o deleie.

GENETICA UMAN

41

Cromozomi inelari (r) Cromozomul inelar (ring chromosome) apare prin ruperea segmentelor terminale ale ambelor brae ale unui cromozom care se pierd, iar poriunile cromozomiale rmase se unesc, formnd un inel (Fig. nr 1.22). Dac inelarul prezint centromer, atunci se va putea menine n celul, dac este lipsit de centromer se va pierde pe parcursul diviziunii celulare, neputndu-se orienta pe filamentele fusului de diviziune. Cromozomul inelar este instabil i creeaz probleme disjunciei mitotice a cromatidelor, caz n care apar o linie celular monosomic i o linie celular cu cromozom inelar. La om, cromozomi inelari au fost observai pentru aproape toate perechile de cromozomi. Manifestrile fenotipice depind de mrimea segmentelor terminale deletate; cu ct acestea sunt mai mari cu att i fenotipul clinic este mai sever. Izocromozomul (i) n timpul diviziunii celulare clivarea centromerului se poate face greit, dup o ax transversal, rezultnd un cromozom anormal, care prezint unul dintre brae duplicat, iar cellalt lips (Fig. nr.1.22.).De regul, embrionii care au un izocromozom n cariotip sunt avortai spontan n primele stadii ale dezvoltrii. Fac excepie: izocromozomul pentru braele q ale cromozomului X, izocromozomul pentru braele q ale cromozomului 21 i izocromozomul pentru braele q ale cromozomului Y. Cromozomii dicentrici (dic) Orice cromozom care prezint doi centromeri este un cromozom dicentric. De regul, unul dintre cei doi centromeri se inactiveaz, devenind nefuncional, iar dicentricul migreaz normal n timpul diviziunii. Dac ambii centromeri sunt activi, atunci, n timpul diviziunii, acetia pot migra la polii opui ai celulei, fiind legai ntre ei printr-o punte de cromatin.ISCN n cazul anomaliilor de structur Simbolul 46,XY,del(5)(p15) 46,XX,del(2)(q31q33) 46,XY,dup(2)(q14-q21) 46,XY,inv(7)(p15q22) 46,XX,inv(8)(q22q24) 46,XY,t(3;7)(q21;q11) 45,XY, -14,-21,+t(14q21q) 46,XX,-5,+der(5)t(5;14)(p13q32) 46,XY,ins(12;1)(q22;q21q32) 46,XX,r(7)(p21q34) 46,X,i(Xq) 46,X,dic(Y)(q13) Semnificaie deleie terminal a braului p al cr.5 deleie intercalar duplicaie inversie pericentric inversie paracentric translocaie reciproc balansat translocaie robertsonian translocaie nebalansat translocaie inserional cromozom inelar izocromozom cromozom dicentric

Mecanismul producerii aberaiilor structurale ale cromozomilorProducerea aberaiilor de structur ale cromozomilor se datoreaz rupturilor cromozomiale. Cnd braul cromozomial se rupe, capetele libere ale rupturii devin lipicioase. Rupturile apar spontan, iar frecvena lor poate s creasc n prezena agenilor clastogeni (radiaii ionizante, substane chimice, unele virusuri). De regul, ntr-o astfel de situaie mecanismele de reparare a rupturii refac rapid defectul i se restabilete integritatea iniial a cromozomului. Totui, mecanismele de reparare nu disting ntotdeauna ruptura i exist

42

CITOGENETIC UMAN

posibilitatea ca fragmentele cromozomiale rupte s se reuneasc ntr-o variant eronat, alternd structura cromozomului. Dac rearanjamentul cromozomial nu altereaz expresia materialului genetic, atunci nu vor fi observate consecine fenotipice; indivizii purttori de rearanjamente echilibrate produc gamei modificai genetic pentru c n timpul gametogenezei alinierea cromozomilor omologi se face incorect i apare un crossing-over inegal, crescnd riscul pentru descendeni (au dezvoltare ntrziat, retard mintal, trsturi faciale caracteristice, variate tipuri de malformaii congenitale).

Efectele fenotipice ale aberaiilor cromozomialeAnomaliile cromozomiale pot determina apariia avorturilor spontane, a defectelor din natere, a tulburrilor sexuale i a bolii canceroase. n citogenetica uman clinic, defectele cromozomiale majore sunt asociate deseori cu modificri fenotipice caracteristice cunoscute ca sindroame cromozomiale. n funcie de tipul i dimensiunea cromozomului afectat sau de tipul de aberaie produs, modificrile fenotipice pot fi severe sau mai puin severe. Anomaliile autozomale produc efecte fenotipice mai grave dect cele gonozomale, monosomiile sunt mai severe dect trisomiile, deleiile mai severe dect duplicaiile. De regul, anomaliile autozomale sunt asociate cu napoiere mintal, multiple malformaii congenitale, trsturi dismorfice i retard al creterii pre i postnatal, n timp ce anomaliile gonozomale sunt asociate cu tulburri ale diferenierii sexuale.

SINDROM PATAU - trisomie 13Cariotip:47,XY,+13

Incidena: 1/4000-10 000 de nou-nscui vii Sex ratio: M=F (alte statistici arat c sexul F ar fi uor favorizat)

Fenotip clinic: microcefalie, frunte teit, leziuni ale scalpului; microftalmie/anoftalmie, coloboma iridian; nas scurt i lat; urechi malformate, jos inserate; despictur labial i/sau palatin, micrognaie, limb despicat; gt scurt i gros, cu hemangioame pe ceaf;

malformaii viscerale severe, defecte de sept atrial sau ventricular, rinichi polichistic; criptorhidism la biei i uter bicorn la fete; hiperlaxitatea policelui, hexadactilie, degete flectate n palm; calcaneu proeminent, hexadactilie plantar; dermatoglife modificate; retard psihomotor, hipotonie sau hipertonie muscular; durat de via redus.

GENETICA UMAN

43

SINDROM EDWARD - trisomie 18

Cariotip: 47,XX,+18 sau 47,XY,+18 Incidena: 1/5 000-8 000 de nou-nscui vii Sex ratio: F>M

Fenotip clinic: craniu lung i ngust, cu occiput proeminent; hipertelorism, epicantus; nas scurt, cu rdcina larg; urechi malformate, jos inserate; micrognaie, hipoplazie mandibular; microstomie; gt scurt, cu piele lax; malformaii scheletice;

44

CITOGENETIC UMAN

SINDROM DOWN - trisomie 21

Fenotip clinic facies caracteristic mongoloid; brahicefalie; occiput aplatizat; microcefalie; fa mic i rotund; profil aplatizat; fante palpebrale oblice, orientate n sus i n afar; epicantus; strabism; nas mic, avnd rdcina aplatizat; urechi mici, jos situate; gur mic, buza superioar eversat, limba protuberant,

cu aspect scrotal, microdonie i hipodonie, erupie ntrziat, palat ogival i ngust, hipoplazie maxilar; gt scurt cu cute n exces; torace n plnie; mini late, cu degete scurte, picioare scurte i plate, spaiul interdigital dintre haluce i degetul II este mult mrit; dermatoglife modificate (pliu palmar transvers unic); malformaii cardiace, gastroenterale, osteoarticulare; retard mental (IQ deseori sub 50).

GENETICA UMAN

45

SINDROM DOWN - trisomie 21

Cariotip: 47,XX,+21 sau 47,XY,+21 Incidena: 1/700 de nou-nscui vii Sex ratio: 1M:1F

46

CITOGENETIC UMAN

SINDROM TURNER - monosomie X

Cariotip: 45,X Incidena: 1/2 500-5 000 de nateri de sex F

Fenotip clinic: talie mic; fa triunghiular; fante palpebrale antimongoloide, epicantus, ptoz palpebral, hipertelorism; urechi jos inserate; maxilar ngust, palat ogival,erupie ntrziat, dini supranumerari i dini geminai; gt palmat (pterigium coli), implantarea joas a firelor de pr pe ceaf;

torace n scut; limfedeme congenitale la mini i picioare, unghii hipoplazice i convexe; nevi pigmentari; infantilismul organelor genitale externe i interne (disgenezie ovarian, uterul i vaginul au dimensiuni reduse), amenoree primar, sterilitate; IQ n limite normale; durata de via depinde de severitatea malformaiilor organelor interne.

GENETICA UMAN

47

SINDROM KLINEFELTER- trisomie XXYCariotip: 47,XXY Incidena: 1/1 000 de nateri de sex masculin

Fenotip clinic: semnele clinice se observ la pubertate i sunt evidente la adult; atrofie testicular; ginecomastie; pilozitate redus; talie nalt i uneori aspect ginoid; sterilitate; dezvoltare intelectual normal; anomalii dentare: taurodontism; durat de via normal.

48

CITOGENETIC UMAN

SINDROM WOLF - monosomie parial 4p

Defect genetic: monosomie parial 4p (deleie 4p16) Cariotip: 46,XX,4p- sau 46,XY,4pIncidena: sindrom rar, 1/250 000 de nou-nscui vii Sex ratio: F>M

Fenotip clinic: microcefalie; glabel proeminent; coloboma, epicantus; nas diform; urechi jos inserate; palat ogival, micrognaie, despictura buzei i/sau a palatului, aspect de gur de crap; malformaii cardiace; anomalii genitale; retard mintal; ntrziere psihomotorie i hipotonie muscular; greutate mic la natere (n medie 2,015 kg); durat de via redus.

GENETICA UMAN

49

SINDROM CRI DU CHAT monosomie parial 5p

Defect citogenetic: monosomia parial 5p Cariotip: 46,XX,5p- sau 46,XY,5pIncidena: 1/50 000 de nou-nscui Sex ratio: F>M Fenotip clinic: plnsul caracteristic, asemntor mieunatului de pisic (cri du chat) datorat hipoplaziei laringiene; microcefalie; fa rotund sau lunar; hipertelorism marcat; palat nalt i luet bifid; mandibul mic, menton retras; malocluzii dentare; hipotonie muscular ; retard mintal; durata de via destul de lung pentru c malformaiile cardiace i renale nu sunt foarte grave.

50Bibliografie

CITOGENETIC UMAN

1. Human Cytogenetics (2001) A Practical Approach, 3 rd. ed., vol.I. 2. Connor & Ferguson - Smith (1997) Essential Medical Genetics, Blackwell Science, pg. 116129. 3. Hoffe A.P. (1999) Genetics, Fence Creek Publishing, pg. 117-126. Web site: http://www.kumc.edu/gec/geneinfo.html Intrebri recapitulative

1. Un embrion uman testat citogenetic prezint dou treimi celule normale 46,XY i o treime celule tetraploide 92,XXYY. Cum explicai? 2. Cum se comport n timpul meiozei un izocromozom 21 (21q21q) aprut prin fuziune centric i cum vor fi descendenii unui purttor i(21q)? 3. Ce diferene exist ntre meioza masculin i meioza feminin? 4. De ce o persoan care are aceeai inversie pe cromozomii omologi nu produce gamei neechilibrai genetic? 5. Ce anomalie cromozomial v ateptai s gsii mai frecvent printre juctorii de baschet dect n populaia general? 6. Enumerai trei metode de bandare a cromozomilor i precizai ce avantaje confer fiecare analizei citogenetice. 7. Cum putei afla sexul genetic al unei persoane?

TOPIC TESTntrebri la care litera de rspuns corect desemneaz propoziii: A adevrate; B false. 1. Telomerele sunt situate totdeauna n zona pericentromeric a cromozomului. 2. Meioza produce celule fiice identice genetic cu celula-mam. 3. Monosomia este o form de poliploidie. 4.Centromerii sunt necesari pentru segregarea cromozomilor n timpul diviziunii nucleare. 5. Inversia schimb ordinea genelor pe harta genetic. 6. Cariotipul uman are 44 de autozomi i 2 gonozomi. 7. Translocaia crete numrul de cromozomi n celule. 8. Mrimea segmentului cromozomial deletat nu are nici o legtur cu fenotipul. 9. Trisomia i triploidia au mecanisme identice de apariie. 10. Aneuploidia cromozomilor de sex cauzeaz fenotipuri anormale, dar viabile. ntrebri cu un singur rspuns corect: A, B, C sau D. 11. Diakinesis este: A. O tulburare a musculaturii scheletice B. O faz a profazei mitotice C. O faz a meiozei primare D. Una dintre catenele ADN-ului mitocondrial

GENETICA UMAN

51

12. O femeie de 19 ani, cu statur mic, gt scurt, mameloane hipoplazice, ndeprtate, amenoree primar, este diagnosticat citogenetic: A. 47,XX,+18 B. 46,XY C. 47,XXY D. 45,X 13. Care dintre urmtoarele sindroame este caracterizat citogenetic 47,xxy? A. Mola hidatiform B. Sindromul Prader Willi C. Sindromul Klinefelter D. Sindromul Angelman 14. Cromozomii 1,3,19 i 20 sunt: A. Metacentrici B. Submetacentrici C. Acrocentrici D. Telocentrici 15. O persoan cu dou sau mai multe linii celulare rezultate dintr-un singur zigot este numit citogenetic: A. Sindrom B. Heterozigot C. Secven D. Mozaic celular 16. Dac o non-disjuncie afecteaz perechea de cromozomi 21 i are loc n prima diviziune meiotic a celulelor gonadale brbteti, se ateapt ca: A. Numrul de gamei normali i aneuploizi s fie egal B. Numrul de gamei nulisomici i disomici s fie egal C. Numrul de gamei disomici s fie mai mare dect gameii nulisomici D. Raportul dintre gameii normali, disomici i nulisomici s fie 1:2:1 17. Care dintre urmtoarele afirmaii nu este corect pentru meioz? A. ADN-ul se replic dup fiecare diviziune celular B. Fiecare cromozom se asociaz ca bivalent cu perechea sa n meioza primar C. Citokineza are loc dup migrarea cromozomilor la polii opui ai celulei D. Cromozomii omologi pot face schimburi de segmente cromatidice ntre ei 18. Ce evideniaz benzile C ale cromozomilor? A. Regiuni cromozomiale formate din heterocromatin constitutiv B. Regiuni ale cromozomilor active genetic C. Cariokineza D. Regiunile cromozomiale cuprinse ntre centromer i telomere 19. Benzile G sunt benzi cromozomiale: A. Obinute prin FISH B. Obinute prin colorare cu Giemsa C. Caracteristice cromozomilor din grupa G a cariotipului uman D. Obinute prin colorare cu quinacrin 20. Cum se poate vizualiza un defect citogenetic structural? A. Prin analiza direct a genomului B. Prin tehnici de bandare a cromozomilor C. Prin inactivarea genomului D. Prin replicarea ARN-ului ribozomal

52

CITOGENETIC UMAN 21. Ipoteza Lyon se refer la: A. Inactivarea cromozomului 21 B. Inactivarea unui cromozom X C. Inactivarea centromerilor D. Nondisjuncia cromozomilor omologi 22. Fuziunea centric afecteaz numai cromozomii: A. Acrocentrici B. X i Y C. Metacentrici D. X de la femeie 23. Pseudohermafroditismul feminin este caracterizat prin: A. 46,XX i fenotip masculin B. 46,XY i fenotip feminin C. 47,XXX D. 46,X,i(Xq) 24. Care dintre urmtoarele defecte nu cauzeaz triploidia? A. Dispermia B. Non-disjunciile meiotice care produc gamei diploizi C. Fuziunea ovulului cu un globul polar i apoi fecundarea cu un spermatozoid D. Translocaia cromozomial 25. Riscul de recuren pentru trisomia 13 crete dac: A. Unul dintre genitori are translocaie 13/15 B. Se inactiveaz unul dintre cromozomii 13 C. Unul dintre genitori are monosomie 13 D. Unul dintre genitori este triploid ntrebri la care litera de rspuns corect grupeaz cifrele dup cum urmeaz: A-1,2,3; B-1,3; C-2,4; D-4; i E-1,2,3,4. 26. Aneuploidia determin fenotipuri anormale pentru c: 1. indivizii sunt sterili 2. afecteaz numai cromozomii sexului 3. individul are trei seturi de cromozomi n celul 4. dozajul genic este neechilibrat 27. Care dintre urmtoarele afirmaii privitoare la aberaiile cromozomiale este corect? 1. aberaiile structurale sunt influenate de vrsta patern naintat 2. aberaiile structurale nu apar la brbat 3. aberaiile numerice sunt influenate de vrsta matern naintat 4. nici una dintre afirmaii nu este corect 28. Care dintre urmtoarele aberaii cromozomiale structurale ar putea produce o modificare nebalansat a materialului genetic al purttorului? 1. translocaia robertsonian 2. inversia paracentric 3. inversia pericentric 4. izocromozomul 29. Care dintre urmtoarele trsturi fenotipice nu se regsesc n tabloul clinic al sindromului Down? 1. brahicefalia 2. furca simian

GENETICA UMAN

53

3. risc crescut pentru leucemie 4. despictur labio-palatin 30. Un brbat care are trei gonozomi, XXY, este fertil. Ce combinaii ale gonozomilor vom gsi n gameii acestui brbat? 1. X 2. YY 3. XY 4. Y 31. Citogenetica studiaz: 1. variante cromozomiale 2. aberaii cromozomiale numerice 3. rearanjamente cromozomiale 4. efectele fenotipice ale variantelor cromozomiale 32. ntr-o familie s-au nscut doi biei cu sindrom Klinefelter. Ce aberaii cromozomiale ar putea avea prinii? 1. tatl ar putea avea XYY 2. mama ar putea fi 45,X 3. mama ar putea fi 47,XXX 4. nici una dintre aceste variante 33. Ci corpusculi Barr ne ateptm s gsim n celulele : 1. unei femei normale 1 2. unei femei cu sindrom Turner 0 3. unei pseudohermafrodite feminine 1 4. unui pseudohermafrodit masculin 1 34. Cromozomii umani ai sexului, X i Y, se deosebesc citogenetic prin: 1. form 2. mrime 3. model de bandare 4. numr de cromatide n timpul meiozei 35. Care dintre urmtoarele evenimente au loc n timpul meioz? 1. numrul diploid de cromozomi se reduce la un numr haploid 2. ntre cromozomii omologi are loc un crossing-over 3. cromozomii omologi sunt asociai ca bivaleni 4. celulele-fiice sunt identice genetic cu celula-mam 36. Cte cromatide exist ntr-o celul diploid cu 46 de cromozomi aflat n meioza primar n momentul n care dispare membrana nuclear? 1. 46 2. 23 3. 69 4. 92 37. Variabilitatea genetic asociat meiozei normale se datoreaz evenimentelor de recombinare genetic: 1. ntre cromatidele surori 2. ntre cromozomii omologi (crossing-over) 3. de tipul translocaiei robertsoniene 4. de tipul asortrii independente a perechilor de cromozomi

54

CITOGENETIC UMAN 38. Ce sunt autozomii? 1. cele dou seturi haploide ale unei celule gametice 2. toi cromozomii unei celule diploide sau haploide, exceptnd gonozomii 3. cromozomii mitocondriali 4. cromozomii care se asociaz pe toat lungimea lor n meioza masculin 39. n ce condiii este indicat analiza cromozomilor? 1. suspiciune de sindrom Down 2. avorturi spontane repetate 3. amenoree primar 4. ambiguitate genital 40.Translocaia are ca rezultat: 1. scurtarea unui cromozom 2. pierderea unui cromozom 3. alungirea altui cromozom 4. apariia unui cromozom excedentar ntr-o pereche de cromozomi

TOPIC TEST RSPUNSURIAdevrat / Fals 2.B 3.B 4.A Alegere unic 12.D 13.C 14.A 22.A 23.A 24.D Alegere multipl 27.B 28.D 29.D 37.C 38.C 39.E

1.B 11.C 21.B 26.D 36.D

5.A 15.D 25.A 30.E 40.B

6.A 16.B

7.B 17.A

8.B 18.A

9.B 19.B

10.A 20.B

31.E

32.B

33.A

34.A

35.A

2

EREDITATEA CARACTERELOR UMANE

Ereditatea este transmiterea caracterelor biologice n succesiunea generaiilor. Prinii transmit copiilor lor, prin gamei, genele responsabile de apariia caracterelor fenotipice. Genele interacioneaz ntre ele, dar i cu factorii ambientali, i exprim un anumit caracter fenotipic. Aadar, copiii tind s aib n comun cu prinii i rudele apropiate mai multe gene dect cu indivizii nenrudii din populaie. Caracterul biologic reprezint orice trstur fenotipic detectabil a unui organism. Mo