Genetica moleculara

Genetica moleculara este ramura geneticii care se ocupa cu studiul materialului genetic la nivel molecular,biochimic.Ea studiaza structura chimica a genelor,modul cum acestea afecteaza caracterele organismelor vii,structura chimica a AND-ului,mutatiile si repararea moleculei de AND.

ISTORICIn 1928 Griffith a descoperit transformarea genetica insa nu a putut stabili cauza acesteia.Griffith cauta un vaccin care sa combata pneumonia.Pentru aceasta a facut experiente pe soareci cu doua tipuri de pneumococi (bacterii):-virulenti de tip S -nevirulenti de tip R

La un lot de soareci a injectat pneumococi virulenti si acestia au murit de pneumonie ; La alt lot a injectat pneumococi nevirulenti si acestia au trait ; La alt lot a injectat pneumococi virulenti omorati prin caldura = soc termic si soarecii au

trait ; La un lot de soareci a injectat pneumococi vii nevirulenti in amestec cu pneumococi

virulenti omorati prin caldura,iar soarecii au murit de pneumonie.Din soarecii morti Griffith a extras pneumococi vii virulenti ajungand la concluzia ca pneumococii nevirulenti s-au transformat in pneumococi virulenti sub influenta ‘resturilor’ pneumococilor virulenti.

Multa vreme cauza transformarii genetice a ramas necunoscuta.In anul 1944 Thomas Avery si colaboratorii au descoperit rolul AND-ului in transformarea genetica a pneumococilor.T. Avery a studiat in laborator pe culturi de pneumococi - pneumococii virulenti de tip S prezinta capsula si formeaza colonii netede

- pneumococii nevirulenti de tip R nu au capsula si formeaza colonii rugoase.T. Avery a facut infectii cu diferite componente din bacteriile virulente de tip S in coloniile de bacterii de tip R,transformarea avand loc numai la infectia cu ADN de tip S III in colonia de tip R II obtinandu-se si colonii netede cu capsula de tip virulent stabilind ca ADN-ul este purtatorul de informatie genetica ce a transformat pneumococii nevirulenti in pneumococi virulenti.Rolul ARN-ului in ereditate a fost descoperit de 2 colective de cercetatori :unul in SUA condus de Williams in 1955 si altul in Germania condus de Schramm in 1956.Ambele colective au studiat pe VMT ( virusul Mozaicul Tutunului) al carui material genetic este reprezentat de o molecula liniara de ARN viral.Ei au separat cele doua componente ale virusului - capsida de natura proteica = invelis viral

- genom viral reprezentat de ARNAu facut infectii separate cu cele 2 componente de tutun,boala aparand numai in cazul infectiei cu ARNv.

In 1953 s-a stabilit structura chimica a moleculei de ADN de catre 3 cercetatori Watson, Wilkins si Crick pentru care au primit premiul Nobel in 1962.In 1958 s-a descifrat replicatia ADN dupa modelul semiconservativ.In 1961 a fost demonstrat caracterul triplet al codului genetic(s-a descifrat codul genetic).In 1977 a fost descoperita structura in mozaic a genei la eucariote.In 2001 a fost descifrat genomul uman.

Dezvoltarea geneticii moleculare a fost posibila deoarece: S-au utilizat instrumente si tehnici avansate de investigare: ultracentrifugarea analitica,

microscopul electronic, electroforeza, difractia cu raze X. S-au folosit substante fluorescente si radioactive. S-au folosit tehnici de enzimologie in analiza acizilor nucleici.

ACIZII NUCLEICIAcizii nucleici sunt substante chimice macromoleculare cu masa moleculara mai mare de 10.000 daltoni. Daltonul este o unitate de masura a masei moleculare si reprezinta a 12-a parte din masa unui atom de carbon (1,66*10-24 g).ADN-ul este materialul genetic al tuturor organismelor vii cu exceptia viroizilor si ribovirusurilor la care materialul genetic este reprezentat de ARN. La organismele la care materialul genetic este reprezentat de ADN, ARN-ul are rol in sinteza proteinelor.ADN-ul = acidul dezoxiribonucleicare structura : primara secundara

Structura primara este structura monocatenara fiind alcatuita dintr-o singura catena de polinucleotide. O nucleotida a ADN-ului este alcatuita din :- radical acid fosfat-un zahar = o pentoza care este dezoxiriboza-o baza azotata

Bazele azotate din structura ADN-ului sunt de 2 feluri : Purinice - Adenina (A)

-Guanina (G) Purina este un heterociclu format din 5 atomi de carbon si 4 atomi de azot.

Pirimidinice - Citozina (C) - Timina (T)

Pirimidina este un tip de baza azotata cu structura similara benzenului, la care 2 atomi de azot se inlocuiesc cu atomi de carbon in pozitiile 1 si 3.Prin combinarea unei baze azotate cu zaharul (dezoxiriboza in cazul ADN si riboza in cazul ARN) rezulta o nucleosida. Prin atasarea unui radical fosfat la nucleosida rezulta o nucleotida, unitatea de baza a acizilor nucleici. Prin polimerizarea nucleotidelor rezulta polinucleotide. Doua nucleotide alaturate se leaga prin intermediul unui radical acid fosforic care uneste pentozele a 2 nucleotide comune vecine in pozitiile C5-C3 sau C3-C5 cu eliminarea unei molecule de apa.Structura primara a ADN-ului este foarte rar intalnita.Exemplu : La virusul x174 sau in cazul hibrizilor realizati intre ADN si ARN.

Structura bicatenara a ADN-uluiEste forma normala si cel mai des intalnita a ADN-ului ce corespunde tipului B al ADN-ului a carui structura a fost descifrata de Watson, Wilkins si Crick in 1953.

Conform acestui model macromolecula de ADN este alcatuita din 2 catene de polinucleotide rasucite in dublu helix.Cele 2 catene ale ADN-ului sunt antiparalele si complementare.Sunt antiparalele deoarece pe o catena legaturile dintre nucleotide au directie C5-C3 iar pe catena opusa legaturile au directie C3-C5.Sunt complementare deoarece intotdeauna o nucleotida de pe o catena ce contine o baza purinica se leaga de o nucleotida de pe catena complementara ce contine o baza pirimidinica astfel incat in macromolecula de ADN se formeaza 4 legaturi complementare : A-T ; T-A ; C-G ; G-C.Macromolecula de ADN are forma unei scari rasucita in spirala. Cele doua balustrade ale scarii sunt reprezentate printr-un schelet gluco-fosforic ( alcatuit din dezoxiriboze legate intre ele prin radical acid fosforic). Treptele scarii sunt reprezentate de bazele azotate (care sunt dispuse spre interiorul macromoleculei) intre care se stabilesc punti de hidrogen de natura electrostatica. Puntile dintre A si T sunt duble, iar cele dintre C si G sunt triple.Prin asezarea bazelor azotate spre interiorul macromoleculei si prin puntile de hidrogen ADN-ul este bine protejat de actiunea diferitilor factori de mediu, asigurandu-se stabilitatea moleculei si deci si a informatiei genetice, conferita de ordinea nucleotidelor intr-o catena.Datorita faptului ca in macromolecula de ADN exista numai 4 tipuri de legaturi complementare se asigura reproducerea cu mare fidelitate a informatiei genetice in urma procesului de replicatie.O rotatie completa a celor 2 catene ale ADN-ului in jurul unui ax comun se numeste pas de elice.La ADN-ul bicatenar de tip B exista 10 perechi de nucleotide pe pas de elice,distanta dintre 2 nucleotide comune este de 3,4 Ǻ iar diametrul elicei este de 19 Ǻ. Macromolecula este rasucita spre dreapta, formeaza 2 scobituri( mare si mica) la nivelul carora pot actiona factorii mutageni.

TIPURI DE ADN

ADN de tip A se gaseste la concentratii saline mari si in cazul deshidratarii partiale. In vivo se intalneste in regiunile dublu catenare din molecula ARN si in hibrizii dintre ADN si ARN. Macromolecula este rasucita spre dreapta,are 11 perechi de baze azotate pe pas de elice.

ADN de tip B reprezinta forma clasica de ADN, este bicatenar, este caracteristic zonelor cu eucromatina, are macromolecula rasucita spre dreapta, formeaza 2 scobituri una mare si alta mica. La nivelul scobiturilor actioneaza factorii mutageni. Are 10 nucleotide pe pas de elice.

ADN de tip Z este singurul tip de ADN cu macromolecula rasucita spre stanga. Este o forma compacta avand cele mai multe perechi de nucleotide pe pas de elice, avand 12 pe o rotatie a moleculei. Prezinta o singura scobitura, are forma in zig-zag de aceea se numeste si ADN de tip Z. Este un ADN care poate avea bazele azotate alterate si prezinta baze azotate repetate alaturate. Se intalneste in conditii neobisnuite (cantitate mare de saruri). Se pare ca exista forme de tranzitie intre ADN de tip B si de tip Z care au portiuni de tip B care alterneaza cu portiuni de tip Z.

FENOMENUL DE DENATURARE – RENATURARE

Prin incalzirea solutiei de ADN la temperatura de 85-95oC sau prin mentinerea la o concentratie ridicata de saruri ,macromolecula bicatenara de ADN se desface prin ruperea puntilor de hidrogen, ADN-ul devenind monocatenar, proces denumit denaturare. Puntile de hidrogen dintre A si T se rup mai repede decat cele dintre C si G.Daca racirea solutiei se face brusc, ADN-ul ramane monocatenar pentru ca puntile de hidrogen nu se mai refac. Daca racirea solutiei se face lent, cele 2 catene se unesc prin complementaritate refacandu-se puntile de hidrogen dintre ele, ADN-ul numindu-se renaturat.Renaturarea se produce in 2 etape : in prima etapa o catena din ADN din solutie se imperecheaza la intamplare cu alta catena formandu-se scurte regiuni bicatenare, iar in etapa urmatoare imperecherea bazelor complementare se extinde in intreaga molecula care devine bicatenara.Procesul de denaturare-renaturare are o importanta deosebita in obtinerea de hibrizi de ADN de la specii diferite sau hibrizi intre ADN si ARN.Cu cat speciile sunt mai inrudite cu atat hibrizii de acizi nucleici se realizeaza cu o frecventa mai mare.

MUTAGENEZA

Mutageneza este procesul de aparitie a mutatiilor in materialul genetic.Mutatiile sunt modificari ale materialului genetic sub influenta factorilor de mediu mutageni:

1. Factori fizici -variatiile bruste de temperatura -radiatiile neionizante(razele ultraviolete) -radiatiile ionizante: alfa,beta,gamma,neutronii,Rontgen

2. Factori chimici -agentii alkilanti (iperita,dietilsulfatul) -derivati ai bazelor azotate purinice si pirimidinice -acidul nitros -unele medicamente antibiotice -unii coloranti -drogurile,alcoolul,tutunul

3. Factori biologici -virusurile.Toti factorii de mediu mutageni actioneaza asupra materialului genetic producand rupturi in macromolecula de ADN;leziuni care se repara prin procesul reparator sub influenta unor gene cu rol reparator.Daca procesul reparator nu functioneaza se produc mutatii.Mutatiile reprezinta sursa primordiala a variabilitatii organismelor pentru ca actioneaza asupra organismului inca din stadiul de embrion.Mutatiile se clasifica dupa mai multe criterii :

Dupa modul de manifestare : Dominante, Recesive Dupa cromozomii afectati de mutatii : Autozomale, Heterozomale Dupa importanta : -Utile (foarte putine) -Daunatoare (majoritatea) -Indiferente (sursa evolutiei organismelor vii)

Dupa factorul care le-a indus : - Naturale sau Spontane - Artificiale sau Induse

Dupa celulele in care apar : Somatice si Gametice Dupa cantitatea de material genetic afectat : -GENOMICE -CROMOZOMIALE -GENICE

MUTATIILE GENOMICE sunt mutatiile care afecteaza in totalitate genomul prin 2 procese: -Poliploidie

-AneuploidiePoliploidia reprezinta procesul de multiplicare a seturilor de cromozomi.Poliploidia se realizeaza prin blocarea fusului de diviziune astfel incat cromozomii nu se mai pot imparti in 2 celule si raman in celula mama fiind dublati numeric. Poliploidia se induce natural sub influenta variatiei bruste de temperatura sau artificial prin tratamentul cu colchicina a plantutelor tinere.Multiplicarea seturilor de cromozomi are ca scop fenomenul de gigantism obtinandu-se soiuri mai productive de grau,sfecla de zahar,secara,trifoi.Poliploidia este de 2 feluri :

Autopoliploidia : multiplicarea numarului propriu de genomuri Alopoliploidia : multiplicarea numarului de genomuri dupa hibridare obtinandu-se

specii noi inexistente in natura.Exemplu : prin hibridarea graului (Triticum aestivum cu 2n=42) cu secara (Secale cereale cu 2n=14) rezulta un hibrid steril cu 2n=28 care prin multiplicarea genomului prin tratament cu colchicina s-a obtinut specia fertila Triticale care are 2n=56.

Organismele normale au 2n=2x si se numesc diploide.Organismele poliploide sunt 2n=3x = triploide 2n=4x = tetraploide 2n=5x = pentaploide, etcLa om poliploidia este letala,provocand avortul. Aneuploidia este o mutatie genomica care afecteaza anumite perechi de cromozomi, astfel incat organismele aneuploide au 1 sau mai multi cromozomi in plus sau in minus.Organismele normale cu 2n cromozomi manifesta fenomenul de disomie; daca numarul scade cu un cromozom se numeste monosomie sau cu doi se numeste nulisomie iar daca creste cu un cromozom = trisomie sau cu doi cromozomi = tetrasomie.Organismele aneuploide se obtin prin 2 metode :

1. non-disjunctia cromozomilor omologi in timpul diviziunii meiotice,astfel incat o pereche migreaza intr-un gamet ce va avea un cromozom in plus iar celalalt unul in minus,gameti neechilibrati genetic care fecundati cu gametii normali vor da organisme aneuploide.Acestea au un numar variabil de cromozomi si de material genetic.

2. fenomenul de Fuziune-Fusiune cromozomiala.Fuziunea este procesul de unire a 2 cromozomi acrocentrici rezultand un cromozom metacentric iar fisiunea cromozomiala este procesul invers.In acest caz variaza numai numarul de cromozomi, nu si cantitatea de material genetic de aceea procesul se numeste PSEUDOANEUPLOIDIE.

Aneuploidia prin fuziune cromozomiala a dus la aparitia de noi specii.Exemplu : cariotipul normal primar de la specia Drosophila virilis are 2n=12 din care au evoluat 3 specii : - Drosophila pseudoobscura 2n=10

- Drosophila melanogaster 2n=8 - Drosophila willistoni 2n=6

MUTATII CROMOZOMIALE sunt mutatiile care nu afecteaza numarul de cromozomi ci structura cromozomilor prin diverse procese, cel mai important fiind rupturile macromoleculei de ADN in situsurile fragile reprezentate de portiuni din cromatina care nu se condenseaza in timpul mitozei.Aceste rupturi se repara prin legarea nucleotidelor in ordinea initiala prin procesul reparator celular.Daca acesta nu functioneaza au loc restructurari cromozomiale prin:

1. Deletii (pierderi de segmente cromozomiale) Exemplu : prin deletia bratului scurt din perechea 5 de cromozomi la om se produce boala cri-du-chat (tipatul pisicii) ; prin deletia bratului lung din pereche 15 se produce sindromul Prader-Willi.

2. Aditii (adaugiri la segmentele cromozomiale)3. Duplicatii (dublarea unui segment de cromozom)4. Inversii (un segment cromozomial se ataseaza in pozitie inversa decat cea originala)5. Substitutii (inlocuirea unui segment dintr-un cromozom cu alt segment)6. Translocatii (schimbarea locului unor segmente cromozomiale in cadrul aceluiasi

cromozom sau intre cromozomi diferiti care pot fi reciproce sau nereciproce) MUTATII GENICE sunt mutatiile care afecteaza mai putin material genetic si anume structura unei gene. Mutatiile genice pot afecta numai o pereche de nucleotide din structura unei gene caz in care mutatiile se numesc punctiforme si de cele mai multe ori acestea afecteaza numai structura genei, nu si functia acesteia.Exemplu : genele care contin informatia genetica necesara sintezei hemoglobinei sufera peste 5.000.000 mutatii punctiforme dar numai aproximativ 300 afecteaza si functia genelor provocad hemoglobinopatii (ex: anemia falciforma)Hemoglobina A umana este o proteina alcatiuta din 4 catene polipeptidice: 2 identice de tip alfa formate din cate 141 AA fiecare si 2 identice de tip beta alcatuite din 146 AA fiecare. Hemoglobina fiind o heteroproteina are in structura sa si grupari hem ce contin fier. Cele 2 catene polipeptidice ale hemoglobinei sunt sintetizate datorita informatiei genetice codificata in 2 gene diferite.Printr-o mutatie punctiforma care inlocuieste aminoacidul acid glutamic cu aminoacidul valina din pozitia a sasea din catena beta se obtine o hemoglobina bolnava ce da boala anemia falciforma (hematii in forma de secera) care afecteaza capacitatea hematiilor de a fixa O2.