FLORIN.DAN IRIMIE

Elemente de

BIOCHIMIE .I.

CLUI-NAPOCA r9 9 B

O 1998. Florin-Dan Irimie Referenfi.

Prof.llniv. Or. i Cawit tUe-alqiu-lProf. Univ. Dr. Carmen Socaciu Pregdtiretipograficd . , Cluj . Kert6szSdndor Tehnoredactare Editat de editura uErddlyi Hfrad6o, Cluj ISBN973 9837492 Tipdrit la S.C.(Atid)) Prodimpex, Cluj

CuprinsCuvint inainte lntroducere ll I

CAPITOLUL r. Glucidef .f . Defini1ie. Clasificare 17

1.2. Chiralitatea ozelor lB 1.2.). eriile ;i L 1B S D 1.2.2.Ciclizareamonoglucidelor 19 1.3. Deriva{i ai rnonoglucidelor gi oligoglucidelor 1.3.1. Esterifosforici 28 1.3.2. Antinoglucide 29 1.3.3. Deoxigluctde :10 1.3.4. Alcooli glucidici :ll 1.3.5.,\cizi glttcidici 32 1.3.6. Glicozide 32 1.4. Poliglucide 38 1.4. Poliglu.ckle rezerud. 39 1. cle 1.4.2.PoLiglucide struL'turd 4l de 1 . 4 . : J .l i c o c o r t j u g a t i ' 1 5 G 28

CAPITOLUL2.Lipide2.1. Clasificarea lipidelor 2.2.Lipide simple 60 2.2.1 Acilgliceroli 60 . 2.2.2.Steriele 6l 2.2.3.Cericle 66 2.2.4. Utolide 67 2.3. Lipide complexe 67 2.3.1.Fosfatide 67 2.3.2.Sfingolipicle 72 2.4. Nte lipide 76 2.4.1.Glicozilglicerolt 76 2.4.2.Terpene terpettoicle 76 ;i 2.4.3.Icosanoizi 79 2.5. Membrane biologice Bz generole 82 2.5.L Caracteristic! 2.5.2.Straturi dubht lipidk:e B4 2.5.3.Asinrctriamentbranelorplasnmtice B7 2.5.4.Distibufia asirnetricaa lipidelor 89 2.5.5.Tranzifii cle acestora 90 fazd ale straturilor dubLttlipidice ;i nzobilitatea 59

Elemente biochimie,l. de

CAPITOLUL Proteine 3.3.1. Clasificarea proteinelor Sz 95 3.2. Conlinutul de proteind al materialelor biologice gZ 3.3. Purificarea proteinelor 3.3.1.Dezintegrarea cehtlara 99 3,3.2.Separarea solid-lichid 102 3.3.3.Precipitarea diferenSiald 103 3.3.4.Metode cromatograficepe coloand 105 3.3.5.Electroforeza 107 3.4. Compozi{ia proteinelor 109 3.4.L Con;inutulde qminoacizidin proteine 109 3.4.2.Identificareaaminoacizilor N - terminali 1I I 3.4. I dentificareaaminoacizilor C-terminali I 12 3. 3.5. Structura proteinelor I f3 3.5.1.Structuraprimard a proteinelor 113 3.5.2.Structurasecund.ard 122 g 3.5.3.Stnrcturi suprasecundare domenii 134 3.5.4.Structura terliara a proteinelor 139 3.5.5.Structuracuaternard 143 generale priuind stabilitateastructwriiproteittelor 143 3.5.6.Considerapii 3.6. Sinteza chimici a catenelor polipeptidice (Merrifield 1963) 147 3.7. Proteine fibrilare 149 3.7.1.a-Keratirn 149 Fibrotna 150 3.7.2. 3.7.3. Colagenul l5l 3.8. Proteine globulare 154 3.8.1. Artticorpi 154 3.8.2.Mioglobina ;i hemoglobina 166 3.9. Proteine membranare l83 3.9.1.N[odalitafi de interacfiunee proteinelorctt straturile dublu llltidce 184 3.9.2.Ilidrofobicitatea catenelorpolipeptidice 189

CAPITOLUL4. Enzime4.1. Specificitateaqi selectivitateaenzimaticd 193 4.2. Clasificareaenzimelor f 95 4.2.1. enzimelor nomenclatura 195 Codificarea ;i 4.3. Cuantfficareaactivitdlii enzimatice l98 4.4. Mecanismul de acfiune al enzimelor lg9 4.4.1 Stabilizarea . std.rii tranzilie 200 rJe de in. 4.4.2. Modalitdli concrete reducere energiei actiuare reacliileenzimattce 206 de a 4.4.3. Interactiunea substrat enzimd 212 4.4.4. holoproteice218 Enzime enzimatici ttitamine 226 4.4.4. si Cofactori

Cuprins.

4.5. Enzimemultimerice 4.6.Abzime 280

278

4.7. No{iuni de cineticd enzimatici 282 parametri 282 4.7.1. Modelulmichaelian, 4.7.2. FactoriicareinfluenSeaza activitatea enzimaticd 291 qctiuittiliienzimatice 307 4.7.3. Reglarea

CAPITOLUL5. Acizi nucleici5.1.Introducere 319 5.2. Constituenfii acizilor nucleici 320 5.3. Structura acizilor nucleici 324 (ADN) 324 5.3.1Aciziideoxiribonucleici . (ARN) 346 5.3.2. secundard;i Structura terSiard acizilor a ribonucleici 5.4. Hidroliza acizilor nucleici 353 5.4.1. Llidrolizaacida;i bazicd acizilornucleici 353 a 5.4.2. Ilidrolizaenzimaticd acizilornucleici 354 a 5.5. Determinarea structurii primare a acizilor nucleici 359 5.6. Sintezape suport solid a oligonucleotidelor 364 (multiplicarea Amplificarea 5.6.3. enzimatica) afragmentelor ADN- metodaPCR (Polimerase enzimatic) 367 ChainReaction policondensarea sau controlatd Bibliografieselectivd 370

inuinte CuvfrniBiochimia seafld Ia confluenla a doud;tiinye extrem de dinamice: biologia ;i chimia. Ea estechematd sd elucidezemecanismelemoleculare ale complexelorproceseuitale ;i deopotriud. ofere modele de strategie sa sintetica ;i alternatiue mai ieftine ;i mai prietenoasecu mediul pentru procesarea, materiilor prtme, subproduselor chiar de;eurilor, tn scopul ;i modificdrii naturii lor substanliale. Direclionarea eforturilor speciali;tilor cdtre acesteobiectiue,confera biochimiei un ritm de dezuoltarefoarte alert, concretizat tn explozia specifice, al numdrului de articole de specialitate, titlurilor de reuiste al ;i coeficientuluide impact al Acestora, mdsurd a gradului audienfa. Sarcina elabordrii unei astfel de cd.rpinu este una dintre cele mai pentru cd trebuie asigurat un raport rezonabil tntre componenta ugoare, biologica;i ceachimicd.a obiectului de studiu. Con;tient de cauzalitatea interacliunilor moleculare tn determinarea latura structurald.tn complexelorproceseuitale, materialul accentueazd prin intermediulfuncyiunilor proprii scopulreliffirii acliunii fiziologice, compu;ilor. in primul uolum, cel defapd, se prezintd,structura;i proprietdtile claselorfitndamentale de biomolecule:glucidele,lipidele, proteinelesi acizii generale,definitorii pentru fiecare nucleici. Se insistd asupra aspectelor clasd tn defauoareaexemplificarilor detaliate. Alaturi de capitolul proteine, materialul dezuoltdpe o tntindere tnare enzimele,principalii biocatalizatori. Motiuul deriud din larga deschidere cdtre caracterul practic, aplicatiu, careface din enzime produse deia comerciale, de mare tonaj, utilizate pe scard largd in industria detergenyilor,farmaceuticd, in industria alimentard, tn scopuri analitice etc. Deqi intitulat ,,Elenrcnte Biochimie", tnlelegereamaterialului prede supune din partea cititorului o familiarizare prealabila cu no{iunile se elementare chimie, tn specialorganicd. Termenul de ,,elemente" rede ferd Ia o introducere sistematicd tntr-un domeniu de granipd ;i nicidecum Ia simplitatea no;iunilor expuse. Materialul esteutil specialistilordin chimte, chimisti gi ingineri chia o mt;ti. Ei uor gdsi tn funcpiile biologiceprezentate, consecinpd, structurii gi reactiuitdfii moleculare.Frumusepea construc;ieisitusului catalitic, perfecliuneaa;ezdrii fiecdrui component, ordnduitd de'a lungul multor

l0

Elemente biochimie.l. de

generalii, oglinditd tn actiuitatea cataliticd, specificitatea ;i selectiuitatea, constituie deopotriud modele dar ;i mijloace utilizabile. Cartea se adreseazdcel pu{in tn egald mdsurd biolngilor, medicilor, agronomilor, farmac$tilor, etc. Insistenla aborddrii aspectelor legate de structura, proprietdlile biomoleculelor Si detalierea mecanismelordupd care decurg interac[iile moleculare, creeazd. bam obiectiud.a tnlelegerii posibilitafii, oportunitdtit ;i modalitd.lii interuenliei factorului uman pentru ualorificareatn interespropriu a potenlialului creat de naturd. Autorul este recunoscdtor referenlilor ;tiinlirtci, pentru rdgazul de a zaboui asupra manuscrisului, pentru sugestiilegi obseruagiile fdcute. Un cuudnt de mulpumire se cuuine profesorului Sorin Mager, decanul Facultdlii de Chimie gi Inginerie Chimicd a Uniuersitdfii ,,Babe;-Bolyai", care a sustinut introducerea liniei biochimice in facultate. Nu pot fi omi;i colegii Si colaboratorii, din disculiile cu care, tn perioada redactd.rii materialului, au rezultat elementeutile autorului. In fine, un rol decisiv tn apari;ia acesteilucrdri, il au studenlii Facultd;ii de Chimie ;i Inginerie Chimica;i cei de Ia Facultatea de Biologie, specializareaBiologieChimie, care prin feed-ba*-ul realizat, au cizelat forma concretd de tr an smitere a info r mali ei. Octombrie 1998 Florin-Dan IRIMIE

Ia tn P.S.in momentele careprezentacartesegdsea procesare ediin tn de turd, lumeabiochimi;tilor clujeni afost miscatd. trecerea nefiin;a a profesorului dintre cei mai pro' doctorGaurilNeamfu,unul uniuersitar referentat cdrSiide fa;d. Ii lifici truditori din biochimia romdneascd, aducemprofundul nostruomagiu.

IntroducereBiochimia este chimia viefii. Ca entitdfi, moleculele sunt lipsite de viafa. Materia vie confine insd.molecule, de la cele mai simple pdnd cele mai complexe.Viafa este o nofiune extrem de dificil de definit. Ea presupune cooperarea intre diferite sisteme biologice prin transferul de substanfi 9i de energiein scopul indeplinirii funcliilor vitale. Sistemele vii (organismele)posedd fatd de sistemelechimice nevii o serie de caracteristici particulare: complexitatea, individualitatea, funcfiile biologice, transferui de energie gi de substanfd,reproducerea,evolufia, migcareasi moartea. Complexitatea organismelor vii constd at6,t in numdrul mare de substanfe care le compun, cdt gi in nivelurile ierarhice (subsistemelor biologice) care pot fi identificate in interiorul organismelor.La cele mai evoluateorganisme,mamiferele, moleculele simple gi macromoleculele sunt confinute in celule, care Ia rdndul lor conlin formafiuni infraceluIare specializatefuncfional, organitele celulare. Un grup de celule cu aceeagi funcfie constituie un tesut. ln Frg. 1.1 se prezintd, dupd Lehninger ierarhizareastructurilor, de la cele mai simple molecule Ei pdnd la celuld, unitatea vitalA esenfiald.Cu toatd aceastecomplexitate, organizareasistemelor vii este caracterizatdprin unitate. Componenfii celulari alcdtuiesco serie continud din punctul de vedere al masei moIeculare. Un numdr relativ redus de substanfe au o masd moleculard mici, fiind formate dintr-un numdr mic de atomi. Menfiondm cdteva monozaharide, 20 de aminoacizi, opt nucleotide, cdfiva alcooli, cdfiva acizi gragi. Majoritatea substanfelorchimice sunt biomacromolecule moleculelor primordioblinute prin transformareagi policondensarea Transformdrile chimice suferite de substanle includ intreaga gama ale. a reacfiilor studiate de chimia organicd.Tot legat de complexitatea sistemelor vii, se cuvine a fi amintit caracterul specific gi nespecific al compugilor chimici. Compugii primordiali existd in toate organismele, la acest nivel deosebirile flind legate de prezenfa sau absenla unui termen comparat. Constituenlii biomacromoleculari, sunt insd specifici de la specie la specie, de la organism la organism. Ei pot exista intr-o varietate practic infinitd. Amprenta individualului apare in particularitatea structurilor macromoleculare confinute. De aceea incdrcdtura informationald continutd intr-o moleculi depinde de specificitatea

t2

Elemented,ebiochimie .1,

acesteia.Dintre tipurile de biomacromolecule existente,gradul cel mai mare de specificitate il au acizii nucleici, urma{i de proteine gi de poligiucide. Funcfionalitatea (biochimicd) a acestor structuri care asigurd posibilitatea transformdrilor specifice este asiguratd de structurile mic entropice, realizate prin intermediul interac{iunilor Va:r der Waals, leg[turi de hidrogen, ionice, covalente.Oricdt ar fi de complexd, structura materiei vii conline adevdrul fundamental cd naturir chimici a substanfelorcare o compun poate fi descrisdgi infeleasi. Chimia celulelor vii nu este altceva decdt chimia: chimia organicd,in primul rdnd, chimia supramoleculard,chimia anorganicd, chimia fizicd, chimia coloidali, chimia... Constituenfii celulari se supun principiilor fizice gi chimice care guverneazd natura. Proceselebiologice, indiferent de complexitatea lor, finalmente pot fi descrisein termeni chimici. Aceastapentru cd logica proceselor fenomenelorbiologiceestechimia. si

Organit c6lulars

Ansambluri suPramole&lare ( M : 1 C- 1 d ) F

Maqomolgculs ( M : 1 c P1 @

Monomeri (M:10s350)

Int6rmediari (M:50-250)

Prcursori din mdlu(M:18-44)

Hto N1

Fig. I. 1. Structura iprarhicd. a substanlelor biaadive

Introducere,

13

I. Individualitatea caracterizeazetoate sistemele vii prin aceea cd existafie o membrand simpld, fie un perete atagatunei membrane, care asigurd separareadintre sisteme asigurdndu-le o autonomie vitald limitatd. 2. Toate structuriiebiologiceale unui organismigi au rafiunea de a fi intr-un rol functional exercitat.De la pirgi ale unui organism, precum frunza sau lesutul adipos gi pdnd la compugii chimici intdlnifi in metabolism, pentru fiecare din acesteelementese poate identifica un scop al existenfeiacestora.caracteristica funclionald este mai degrabdun atribut al structurilor biologice decdt a celor frzice sau chimice, aceasta pentru cd intrebarea ,,ce rol are ?" nu se justificd in cazul sistemelor fizice sau chimice nevii.

r!!

!.

'r',rl1\

Energie solard

.

,'

t-

Apd9i dioxid de carbon riI

I

Glucozd gi oxigen (6narglo chimict)

tTIE ,

_i

vtvlivvEneryie biologicd(ATP) Fig. L 2. Schimbul de energieSi substanld tntre sktemele uii

L4

Elemente biochimie .1, de

3. Schimbul permanent de energie gi substanfd deosebegte asede menea sistemelevii de cele neinsuflelite. Sursafinald de energiepentru tot ce esteviu o constituie radiafia solari. Energiasolard esteconvertitd in plante in energie chimicd prin formarea in decursul fotosintezei a glucidelor.Acestea,prin lanful trofic.trec la ierbivore gi apoi la carnivore, la care energia chimicd se stocheazdgi se transportd sub forma unor legdturi macroergice existente in compugi precum ATP sau NADH. Sintezade substanpd organicd,necesardbunei desfdgur5.ri activit5lilor a. organismelor se face pe baza unei surse de carbon. Organismele fotosintetizatoare folosesc dioxidul de carbon atmosferic, pe care il convertescin glucide gi alte substanfe organice, care sunt preluate de animale gi folosite atdt pentru biosinteza substanfelor proprii cdt gi in scopuri energetice.Produsele de degradarea substanfelor organice in proceselede respiralie sunt dioxidul de carbon gi apa, care sunt preluate din nou de sistemelefotosintetizatoarela inchiderea ciclului carbonului. In interiorul organismului energia estefolositi qi pentru a menfine in stare funcfionald o structurd inalt organizat6,, homeostazicd,mic entropicd, aflati in dezechilibru permanent cu mediul. Numai dupd moarte se poate instaura echilibrul cu mediul. Transformdrile energetice gi de substanfi realizatein interiorul fiecdrui organism sttnt orientate in scopul bunei funcfioniri ale acestuiagi sunt in esenfdreaclii chimice. Sistematizarea acestora in reacfii endergonice de sintezd respectiv exergonicegi de degradaredefinegtemetabolismul de ansamblu cu cele doud laturi ale sale catabolism 9i anabolism. 4. Poate cea mai remarcabili insuqire a materiei vii o constituie capacitatea de autoreproducere. Generalie dupd generalie, organismele produc copii virtual identice cu originalul. Mecanismele sunt diferite, mergdnd de la simpla diviziune la bacterii gi termindnd cu reproducerea sexuatdla plante qi animale, dar in fiecare cazin parte sunt caracte'Iotugi rizate printr-o mare f,delitate. aceastdfidelitate nu este perfectd, ea permitand in decursul generafiilor ca prin selecfiea caracteristicilor celor mai adaptate mediului sd se producd evolufia speciilor. Originea mecanismelor reproductive rezidd.in natura chimicd. a materialului genetic format din dublele catene de acizi deoxiribonucleici.Prin procese de policondensare, care au loc pe matrile preexistente se asigurd fidelitatea copiilor de material genetic, defecteleinregistrate ducdnd la aparilia unor caracteristicicare in procesul exprimdrii in mediu pot remdne sau pot fi eliminate.

Introducere.

15

5. Migcarea organismelor in mediul biologic igi are cauzain deplasareaspre sursa de hrani gi de energie,indepdrtareade surselede pericol gi devine cu atdt mai complex motivatd si realizat5,cu cdt pozifia organismului pe scara evolutivd este mai inalte. Natura miqcdrii este de asemeneachimicd, ea realizAndu-seprin intermediul unor reacfii chimice care implicd structuri moleculare specializate. 6. Moartea este o insuqire a viului, un punct in spirala infinitd a evoluFei. Fiecare organism se nagte dintr-o zestre geneticd acumulatd in mii de generafii, trdiegte,contribuind cu experienfa sa la fondul de informafie mogtenit, dupd care prin moarte, se reinte greazd, mediului, ldsind loc noilor indivizi sd.-gi exercite rolul rezervat in cadrul diviziunii biologice a activitefii in habitatul ocupar. sistematizdnd Ei abstractizdnd la maxim se poate afirma cd.un sistem esteviu dacd: . poate si se menlind in viafd, prin nutrilie, asimilafie,prin reacti_ ile energeticedin respirafie gi fermentafie, I poate si propageviafa prin reproducere, o poate si-.si coordoneze individual 9i optim activitifile prin sincronizareagi reglareareac{iilor chimice de ansamblu.

l. CAPIT0IUI Glucidel. 1. Definitie. ClasificareAceastdclasa de compugi este cunoscutd sub mai rnulte denumiri. general Fiecaredintre acesteaa incercat sd ilustreze o caracteristicd definitorie. Numele de glucide sau zaharide derivd de la gustul dulce care caracterizeazd majoritatea termenilor {glykis- dulce in limba greacd), iar cel de hidrafi de carbon (carbohidra{i). derivd de la compozifia generald(C)-(H2O)..In realitate,nici una dintre acestedenumiri nu pentru cd se cunosc reprezentanlicare nu reflectdo insugiregenerald, au gust dulce, dupd cum se cunosc hidrali de carbon care nu pot fi metil glucidefinili dupd formula (C)*(H2O).precum deoxiglucidele, dele ori aminoglucidele. pofida acestorimperfecfiuni, cele trei deln numiri, sinonime, se utilizeazd curent. Foarte frecvent se foloseqte gi denumirea deoze. Definilia bazatd, pe funclionalitatea chimicb alirmd cd aceste substanle sunt compugi de tip polihidroximonocarbonilic, ori produqi de (poli)condensarea mai multor astfelde structuri. Avdnd in vederedoar pondereamasicdin lumea vie, glucidele ocupd primul loc reprezentd.nd astfel o clasd mare 9i importantd de biomoleculeformate in principal prin fotosintezd. Glucidele,atdt cele monomerice cdt gi poliglucidele, indeplin escfunclii esenfialein organismele vii. Astfel, ele sunt substantede stocarea energiei.Prin oxidare energia se elibereazdintr-o formd utiiizabila de organism. ln al doilea rdnd, multe poliglucide sunt constituenpii majoritari ai perelilor celulari ai bacteriilor gi ai plantelor. ln fine, glucidele intrd in componrenlaunor precum unele coenzimesau acizii nualte tipuri de substanye bioactiue cleici. glucidelor are in vederemai multe criterii: Clasiflcarea 1. dupd natura grupdrii carbonilice distingem: aldoze atunci cdnd existdo grupare aldehidica cetoze atunci cdnd in structurd gasim o grupare cetonicaH

R-C-opl

R-C:O

I

Elemente biochimie .1. de

2. dupd gradul de policondensaredistingem: monoglucide (monomeri) oligoglucide(di_tri_... deca_) poliglucide (cu gradul de policondensaresuperiorvalorii l0) 3. Numdrul atomilor de carbon din structura monoglucielor le subdivide in: tri-, tetr-, pent-, hex-, hept- oze, eventual cu prefixul aldo sau ceto (dupi caz).De exemplu aldohexoze,cetopentozeetc. 4. ln fine, gradul de omogenitate imparte glicanii (o denumire gene, ricd a tuturor poliglucidelor) in homo- gi heteroglicani, dupd cum unitdfile monomere sunt identice sau nu.

1.2.Chiralitatea ozelorcu excepfia dihidroxi-acetonei, toate ozele posedd unul sau mai mul{i atomi de carbon chirali, ceea ce conduce la aparilia izomerilor optici. r.2.1.SeriileD gi LH

to n-rf-o"no*nH-*-oH

H I

c-o

t'o-f nH-tFoH HotH HO-?_HcH2oH L-glucoza

n-{pon cHpHDglucoza

Fig. 1.1.Relafia dintre D- SiL-glucozd

cea mai sirnpli aldozd.,aldehida glicerici, un compus monochiral are cei doi enantiomeri desemnafi prin D gi L. Atribuirea denumirii celor doud substanfea fost f[cuti a]eatoriu,deoarecela data aceeanu era cunoscutd configurafia absolut[ a substanfei. semnificagia iniliald a celor dou6litere a fost: D - dextrogir (rotagiaplanului luminii polarizate la dreapta) $i L - levogir, (rota{ia planului luminii polarizate la stdnga). Pebaza acesteiconvenlii stabilite de Emil Fischer, s-au construit seriile D respectivL ale monozeror, dup6 cum atomul de carbon chiral cel mai indepdrtat de gruparea carbonil, are configurafia identicd cu a celui din

Glucide . Chiralitatea ozelor

r9

D-glicerinaldehidasau cu a celui din L,glicerinaldehidi. De aici rezultd cd monozele din seria D sunt in relatie de enantiomerie cu cele din seria L care au aceeagidenumire. De refinut cd semnificagiainiliali a notaliei D respectivL, referitoare la sensul rotafiei planului luminii polarizate nu s-a pdstrat. Numdrul de izomeri optici ai unei molecule chirale este dat de 2n, unde n este numirul de centre chirale din moleculd. Astfel aldohexozele,de exemplu, posedd patru atomi chiraii, prin urmare vor avea 2a = 16 izomeri, adicd opt perechi de antipozi optici, fiecare pereche fiind formatd dintr-o structurA D- gi una L-(Fig. 1.4.1n cazul cetozelor,numdrul de atomi chirali se reduce cu unu, la acelagi numd,rde atomi de carbon. De aceeacetohexozele vor existasub forma '= B elemente, respectiv cu patru perechi. Diaunei familii cu 23 stereomerii sunt tot izomeri care apar la substanle cu mai multe centre chirale. Diasteromerii diferd intre ei prin conflgurafia unuia sau mai multor centre chirale (dar nu a tuturor). Prin urmare, relafia de diastereomerie exclude antipozii optici. Un caz particular de diastereomerie il reprezintd epimeria. Epimerii sunt izomeri care diferi intre ei prin configurafiaunui centm chiral. Glucozagi manoza sunt in relafie de epimerie. La fel si glucoza cu galactoza,dar galactozagi manoza nu sunt epimeri. 1.2.2.Ciclwareamonoglucidelor Gruparea carbonil este susceptibild atacului nucleofil din partea unui reactant corespunzdtor, cum ar fi o grupare hidroxil. Dupi cum compusul carbonilic este aldehida sau cetond, se obline in primd fazd. fie un semiacetalfie un semicetal. ln conditiile unui excesde alcool se obline acetalsau cetal (Fig. J.3),^'.

R1

Eo T4semi(a)cetal

/

R2/ Ucompus carbonilic

n1t ,ons c \ons nzl(a)cetal

atomi de carbon Fig. I. 2. aldoznle gi cetozeledin seria D, cu pdnd.la gase

20cHoH--{-OH

Elemente biochimie .I, de Aldozele D dinseria cupdnA qase la atomdecarboncHoH(4-H

II

cFhoH Dglicorinaldhida

I

"

H--1-oH

{noo"

H-{FOH CHaOH

II

"i::"H*1-oH Ft-1-oH

clio

no-f" '.-J-o" "-J-o, ICH2OH

*1-"nCH2OH

,,*i:." *-r-,FToH

Dlcors

"o-l-n

"o-fn I

H-1-oH

":i:::"I H-1-oH

*,fl'"o"cHo

*-.1-, I*1-o"H-t-oH H-1-oHCH2OH

H-fox

Ho--1-H

*fo"H-t-oHHo-l--H FlfoHCH2OH Dguloza

"*1-o"H---+--OH

*-1-nH-1-oH H-t-oHCHzOH Dllucoza

'*1-nH-t-oH *1-o"CH2OH D.mano.s

I

Ho-fn H-1-oH

I

HtoH

tt

cHo

Ho+r-H

"-l-on I o",l*on

xo-t-x *-1-" '{-1*oH o-1-o"cl-boHC&OH D{alactoae

Ho-fn

*-t-,

*-1-rH-t-oHCHzOH }taloza

CHzOH

.cH2oH Dhidroxiaclton8 ?FhoHI

I I

Cetozele

dinseria D

cu pinl la Easeatomi de carbon

H-a--oHCH2Oll Dnlruloze

II

cr-hoH jHO--+-H

II

H-+-oH lcfhoh Dxiluloai CHzOH CH2OH ct-hoH

t.

n-I-o" n-I-on i H---!-oH I cFhoHDpsicoza

H+H I

I I

CHrOH

I H-T-oHro-nn@-1 \ilti ii / f@

r$$\acizi biliari

r-^@

\'lipid"

Fig. 2. 9 Stntctura micelard creeatd de acizii bilia.ri cu liptdele

Acestesubstan{eposedd pe ldngd o funcfie acidd gi o func{ie amidicd. Aceasta va forma o legdturd amidicd la nivelul carboxilului din acidul colic respectiv.Prin ionizarea funcliilor acide rezultd grupe puternic hidrofile care vor fi orientate cdtre mediu, in timp ce porfiunile hidrofobe (lipofile) ale nucleului steroidic vor fi orientate catre globula de grdsime formdndu-se astfel structura micelard (Fig.z.9.).

*H3N

c02

*rr*"\-soaTaurina

Glicocolul

care se ataseazfi. Fig. 2, 10.SubstanSe amidic de acizli colici

2.2.3.Ceride Aceste substan(eintrd.in componenfa cerurilor, alAturi de hidrocarburi, alcooli, dioli, acizi, hidrortacfui. Ceridelesunt esteri ai unor alcooli gragi cu acizii graqi.Numele le vine de la consisten{aceroasda acestor substanfe.Sunt intdlnite atAt in regnul animal cdt Ei cel vegetal.La animale menfiondm: ceara de albine care confine in principal palmitat de miricil (C16 - C30), ceara de balend, spermanceti al cdrui component majoritar este palmitatul de cetil (C16-C16),lanolina care este un amestec complex de ceride dar gi de alcooli grapi gi Ianosterol - un alt tip de sterol. La plante, ceridele se intdlnesc pe suprafala fructelor, a frunzelor gi au un rol de protecfie atdt impotriva umiditdlii, prin hidrofobic\zarea suprafefelor,cdt gi impotriva insectelor.

Lipide . Lipide complexe

67

2.2.4.Etolide Au o rispdndire exclusivvegetald,fiind gdsite in cantitd{i ridicate in cerurile coniferelor.Provin din hidroxiacizi prin dubla esteriflcarea cdte doud molecule (Fig.2.11.).Cel mai adeseain compozifia etolidelor se intdlnesc co-hidroxiacizi. rr./-on ) (I Se men{ioneazd. acidul sabinic (to-hidroxilauric HO-(CHz)n'-*oH COzH), acidul iuniperic (ro-hidroll O xipalmitic HO- (CHz) Se rs-COzH). cunosc Ei etolide la a ciror forE Etolidf, mare contribuie mai mult de doi Fig. 2. 11.Fonnarea etolidelor hidroxialcooli. Oricum, structura ciclicdesteesteo caracteristicd esentiala acestei a clase.

ll

"\

i

"\/+

2.3.Lipide complexeLipidele complexe reprezintd o clasa de substante cu mai mult de trei tipuri de atomi in moleculd. Majoritatea confin acid fosforic, legat fosfoesteric. mai rar fosfoanhidridic de alte molecule, 2.3.L.Fosfatide Sunt componentelemajore ale membranelor celulare.Ca termeni sinonimi se utilizeaza:glicerolfosfatide,fosfogliceridesau glicerofosfolipide. Sunt substanle greu cristalizabile,solubile in solvenlii aprotici, cu exceplia acetonei, care ii precipitd. Sunt insolubile in apd cu care pot forma emulsii. Sunt mai reactive decdt acilglicerolii. Caracteristica esenlialSesteparticiparea la structura acestorsubstanfea glicerolului, a acidului fosforic, a acizilor gragigi opfional a altor componente. 2.3.1.1. Acizi fosfatidici Grupul acestorsubstanfe,cel mai simplu structural din clasd,posedd structura de bazd a tuturor fosfogliceridelor flind precursorii acestora. (Fig.z.12.) Sdrurile (fosfatidalii) alcaline, de amoniu, calciu gi magneziu sunt solubile in apd. ln constitufia lor intrd preponderent acizii palmitic, stearic, oleic,linoleicEi linolenic. Au fost identificafi in cantitate apreciabil[ in plante gi bacterii. Derivali ai acizilor fosfatidici, formafi din doud unitdfl de acid

68

Elemente biochimie .1, de

fosfatidic gi una de giicerol, sunt cunoscuti sub numele de cardiolipide (cardiolipine), dupi locul unde au fost izolate prima dati (miocard). (Fig.2.13.)Sunt folosite in unele reacfii serologice (Reaclia Bordet Wassermann).

gH2o@R2 i

Rlcoo-?- t=l

? ot1

CHrO-P-O-il

Fig.2. 12. Fosfatidat

cH2o-P-o-cH2 . rI p'699r,,,,..f.,,,,,rH 6 I

o tl

n4cog o \ .',""CHzocOR3 - O- ll O- Cgrgrr"""'rt' 9nt Hori-H ?-

c

J

H

cHrocon2

Fig. 2, 13. Cardiolipind (cardiolipidd)

2.3. 1.2. Colinfo sfolipid e Termeni sinonimi: Iecitine, fosfatidilcoiine, colinfosfatide.Sunt substanle amfionice, datoritd prezenfei atdt a restului acid al acidului fosforic cAt qi sarcinii pozitive la atomul de azot al betainei 2aminoetanolului (colina) (Fig.2.14.).Sunt extrem de rdspdndite,atdt in regnul vegetalcdt gi in cel animal. Rotescla dreapta planul lumini polarizate.

Lipide . Lipide complexe

69

n'coo-!lijT-o-""' CH -\\o

gH2ocoR2 io

@N(CH3)3

2

Fig. 2. 14. Lecitine (colinfosfatide)

pe Extracfialor se bazeazS. solubilitateain etanol Ei insolubilitatea in acetond.Surseiecele mai comune sunt gd.lbenuqul ou gi seminlele de de soia. Posedi, patru legaturi esterice. Sclndarea legdturii esterice din pozilia 2-(sn)conducela lizolecitine,compugi extremde toxici, cu acfiune puternic hemoliticd. l.izolecitinazele,prezente in veninul de cobrd explica acfiuneamortald a mugcdturii. 2.3.1.3. Colaminfo sfolip ide. Sunt asemdndtoarestructural cu colin-fosfolipidele cu deosebireacd (colamina). in locul colinei se gdsegte 2-aminoetanolul(Fi9.2.15.) QH2OCOR'

Rlcoo-!:: !o^--""'.^,,.rR"' CH2O- P-C \'nz -\\or^ig. 2. I 5. Cefaline (colaminfosfatide)

Deoareceau fost izolate prima data din creier au primit numele de cefaline.lnsolesccolinele,dar au o concentrafiemai redusd,cu excep1iacreierului unde predomina. 2.3.1.4. Serinfosfatidele confin serina legatd fosfoesteric de acidul fosforic. (Fig.2.16.)Au fbst izolate din creier, din frac{iunea cefalinicd. Aici serin-fosfolipidele reprezinta cca 50Vo din totaiul fosfolipideior, fiind prezente sub formd de potasiu. Nu au fost identificate insd in gdlbenugulde ou. Sunt sd.ruride mai acide decdt colinele gi cefalinele gi au o solubilitate mai redusd in alcool etilic. Intervin in metabolismul intermediar ca donori de acid fosforic.

Elementede biochimie .I.

qH2ocoR2

Rlcoo-9-,:l

?"O p,,,fI

cH?o-P_o-cH, -il\-o

coz

ruN@Fig.2. 16.Serinfosfattde 2.3.1.5. Acetalfosfatidele (plasmalogenii). Au o structurd asemdnitoare colaminfosforipidelor,qi mai rar cu a colinfosfolipidelor.s--R2 H \i o--ru :'?

*ato=-i-" \n'cooz-Y\H / :_P-g4.o C|6o..---il'-Oll nnO

*rrrctor--g--H ?n (D n-.--i.--^-cn, " br1-Ntct11' |] nslructurdacetalicd

bn;- Ncttdr

-ac strudu re acetal i Iali cd

Fig. 2. 17. Structuri acetalice Si acetal-acilalice ale plasmalogenilor OHEH

t

nlcooz'l\n I ioo..-|,-e-CHz q ^ . ' br6trtcttrl' ll nstucturd semiacehlicd

;oo

QH2o./'\cHr-*t :

gH2olc\cH-R2

nlcoozY\H I e'to--;--g-cn' ll o

;oo

@ bHf-N(cFl's

stucfurt viniletericd

Fig. 2. 18 Structuri semiacetaliceSi uinil.etericeale plasmalogenilor

Diferenfa constd in faptul cd cel pufin o grupare hidroxil din molecula glicerolului este legatd semiacetalicde o ,,aldehidi grasa".Acegti

Lipide. Lipide complexe

7l

compu$i au fost identificali cu ajutorul reactivului Schiff, specific dupa cum se cunoa$tepentru aidehide. Datorite reactivitdtii structurilor, formele semiacetalice, acetalice,vinileterice gi acetal acilalice, (Fig.2.17.gi 2.18.) sub care au fost identiflcate pot fi rezultatul unor transformdri ce au loc in decursul extrac{iei, deci artefacturi. Certd rdmdne identiflcarea formelor aledehidice (reduse) ale acizilor gragi care explicd toate structurile intdlnite. 2.3.1.6. Ino sttolfo sfatidele.gFt ocof

n'coo-9-H Po

ct-t"o-P-o -tlmonofo{oinoitidd

gFhocof *r.oo.!-s pOcliro-P-o tln

difodoinodtidd

gt-t ocoR,

n'coo'9-H 90 ct-r"o-P-o 'iln

L---./-4-on"' .,/-=Ti--'------,,,^.,t( |

to,*

ffitt'Fig.2. 30. Transformareo rirri]ru, acidutui arahidonic "nooor)*ra PGD difera de PGE prin inversareaOH-ului din pozilia ll cu carbonilul din pozilia g.\\n \\l

t.\

Y-"*

,ry',\>-fI z //"t

----

\-{ JfPGE

-\-\

\\

q,\

I

l-i

"\i( \/^ liPGB

\z\PGc

Fig. 2. 31 Formele deshidratate ale prostaglandinelor deriuate din PGE

,.**_.ffitltromboxanul QTXB2

tnn fucozH

Fig.2.32

PGGqi PGH sunt peroxizi derivafi din PGF. Medicamentele antiinflamatorii (aspirina, indometacinul, ibuprofenul etc.) inhibe acfiunea ciclooxigenazicda prostaglandin endoperoxid sintazei.Mecanismul acesteiinhibitii constd in inactivareaprin ace-

Ehmentede biochimie ,I.

tilare (acilare)a unui rest de serine. In acest mod se inhibe sinteza tu_ turor prostaglandinelor respectiv a tromboxanilor, prin aceasta influenfdndu-se rispunsurile inflamatorii gi trombocitare prostaglandin dependente. In locul ciclului pentanic din prostaglandine, tromboxanii (Fig.2.33.)au in structura lor un ciclu de gaseatomi cu oxigen (ciclu oxanic). Numele le deriv5 de la acest ciclu gi de la directa implicare in agregarea plachetard (formarea trombusului). ln plus tromboxanii provoacdvasoconstricfiecoronariani.

Leucotriena &Fig.2.33

Leucotrienele (Fig.2.33.)reprezintd cea de-a treia mare clasi de icosanoizi. Numele le derivd de la leucocite,unde au fost descoperite gi de la cele trei Iegdturi duble conjugate. Ele se formeazd din acidul arahidonic prin acfiunea lipoxigenazei.Aceastdenzimi nu este afectatd de antiinflamatoarele care inhibd prostaglandin endoperoxid sintaza. Caracteristicaleucotrienelor este cd nu con{in nici un ciclu, fiind doar derivati oxigenali ai acidului arahidonic. Acfiunea lor se manifestd prin crestereapermeabilitdfii vasculare.

2.5. Membrane biologice2.5.1.Caracteristici generale Sunt formafiuni de naturi lipoproteicd care delimiteazd celulele de mediul exterior, organitele celulare de citosol. Funcfionalitatea membranelor, ca rezultat al interacfiunii lipide - proteine nu se limiteazi doar la separareasistemelormicrobiologice (celuli, organite celulare)ci se manifesti prin realizareatransportului selectiv,prin membrani, recepfia unor semnaledin mediu, reacfii chimice specifice.

Lipide . Membrane biologice

83

Spaliu erttacilosolic_fragment oligoglucidic

gticoproteindglicolipidd colesterol

proteind p r otei nd ihrcgra I Perife r i cd membranard filamente ale citoschelehtlui

Citoplasmd

Fig. 2, 34. Structura unui fragment de membrand plasmaticd

ln pofida diversitdlii funcgionaletoate membranele biologice poseda o seriede caracteristicigenerale: | fiecare membrand este un fllm foarte subtire, format din molecule lipidice gi proteice. Integritateamembranei este menlinute prin interacfiuninecovalente. t moleculele lipidice sunt aranjate ca un strat dublu lipidic de 5 l0 nm grosime Ei reprezintd o barierd relativ impermeabild pentru trecereamoleculelor hidrosolubile. t membranele sunt structuri mobile, fluide, ca rezultat al interacliunilor slab energeticeintre catenelehidrofobe din interiorul stratului dublu lipidic. o membranele au o structurd asimetricd regisiti in funcgionalitatea diferitd pe cele doui fefe. Aceastd asimetrie sebazeazd. tipurile pe diferite de lipide Eiproteine care se gdsesc ambele fefe membranare. pe r moleculele proteice inseratein membrani, mediazi majoritatea funcfiunilor membranei, transportdnd specific diferitele substanfe moleculare sau ionice sau catalizdnd reaclii specifice membranei precum sinteza ATP-ului. Raportul masic lipide: proteine este cuprins in piaja 4:1 - 1:4.Existf,membrane cu confinut majoritar de proteine cum ar fi membrana intern[ mitocondriali, membrana perinucieard,,cea a Iizozomilor. Alte membrane au un conlinut aproximativ egal al proteinelor Ei lipidelor cum este cazul membranei mitocondriale externe, a reticulului endoplasmatic, a membranei interne ale bacteriilor Gram-

84

Elemente biochimie .I. de

negative. ln fine unele membrane au un confinut iipidic majoritar: membranele aparatului Golgi, teacamielinicd a nervilor etc. I Marea majoritate a membranelor sunt polarizate electric, cu sarcina negativf, spre interior (de reguld 60 mV). Aceastd polarizare electricd, efect al asimetriei transversale a distribufiei lipidice (vezi mai departe),joacd un rol esenfial in transport, conversiachimic[ de energie gi in excitabilitate. o ln membranele plasmatice ale celulelor organismelor superioare, se gdsescproteine care asigurd legdturi structurale ce conecteazd celulacu alte celule. 2.5.2.Straturi dublu lipidice Constituenfii maj ori ai membranelor celulare sunt /os/o/ipidele. Aqa dupd cum s-a ard,tat la capitolul legat de lipide fosfolipidele sunt substanfecare confin legdturi fosfoesterice, care componenta alcooin licd este fie glicerolul, fie sfingozina (mai rar sfinganina gi i:r regnul vegetal fitosfingozina).

Model micel!

Model dublu- lipidic

Monostnl lipidic superlicial

Fig, 2. 35.Structuri rezulate prin agregarea lipidclor tntr-un med.luhtdrofiI

Acizii gragi care intrd in compozilia fosfolipidelor acoperdun domeniu cuprins de reguli intre 14 gi 24 de atomi de carbon. Acizii gragicare intr6. tn structura membranelor celulelor animale nu sunt rarnifrcafi. Acegtiainsi pot fi atdt saturali cdt gi nesaturafi. Aproape intotdeauna, dubla legdtura are o configurafie cis qi datoritd rigiditifii acesteia,creeazd. o zond de neomogenitate structurale, cu efecte asupra fluiditefii membranei. Caracteristic structurii fosfolipidice este existenla unei zone hidrofile, gi a unei zone hidrofobe biramificate, (FiE.2.35.) determinatA de catenele hidrocarbonate ale resturilor de acizi gragi,respectiv de sfingozind. Aceste zone fac din moleculele fosfolipidice structuri amfipatice, sau amfifilice carele orienteazdatunci cdnd sunt introduse

Lipide . Membrane biologice

85

intr-o solufie apoase sau uleioasd. (simili simile gaudet). Astfel cdnd moleculele iipidice sunt introduse in solu{ia uleioasd. se vor orienta ele cu catenelehidrocarbonate cdtre mediu, iar cele hidrofile cdtre interior. Acesta este totusi un caz intdlnit mai mult in testele experimentale, pentru cd mediul extern celulei respectiv citosolul este hidric. La introducereaintr-o solulie apoasd,in funcpe densitatealipidelor orientarea se poate face in mai multe moduri: formarea de micele monostratificate (aglomerdri ordonate cu simetrie sfericd, orientate cu partea hidrofrld citre exterior - mediu) sau formarea de straturi (pelicule) dublulipidice atunci cdnd densitatea lipidelor este aproximativ aceeagicu a mediului de dispersie. Datoritd lungimii mari a catenelor hidrocarbonate,orientareaspontand,in absenfaunor forfe de intensificarea omogenizarii moleculare are loc de preferinfd dupa modelul stratului dublu - lipidic. Atunci cdnd densitatealipidelor estemai redusd decit a mediului de dispersie se formeaze monostraturi superficiale orientate cu partea hidrofila a lipidelor cdtre mediul de dispersieapos.

Sr

tino.otmoleculd hidrofili

I ;I

_".1.] t,, '.;,l'

lrsau dializd -"--'-'=11----get - ilrrare

l

sontcare saIIUrDOmtxare..-;-__.-->

lxml

fosfolipidd Fig. 2. 36.Formarea liposomilor cu trasori hidrofili incluSi

Prin omogenizare intensd precum cea realizatd cu turboagitatoare sau prin sonicare, moleculele fosfolipidice introduse intr-o solufie apoasdpot forma structuri dublu sau qvadruplu lipidice cu simetrie sferic6, care includ in interiorul lor volume variabile de solulie. Astfel de formafiuni artificiale, care prezinti o stabilitate relativ mare sunt cunoscute sub numele de liposonzisau ueziculemultilamelare (Fig.2.36).

86

Elemente biochimie .1, de

orifclu q,r diarn-1mmdaw [r& d.h

Compadimenle cu solute apoase

Fig. 2. 37. Model experimental pentru determinarea permeabilitdfii straturilor bilipidice

Liposomii se pot obtine gi prin introducerea rapida, printr-un ac de siringd a unei solulii etanolice a unei fosfolipide intr-o soluiie apoase, Liposomii astfel oblinuli au un diametru de ordinul a 50 mp. Diametre mai mari, pdnd la lmm (1000 pm) se pot obline prin evaporareasub agitareintensd a unei suspensiifosfolipidice apoase. Datoritd,asemdndrii acestor agregateartificiale cu membranele biologice naturale liposomii sunt numili qi membrane negre (black membranes) intr-o analogie nu tocmai fericitd cu termenul consacrat de black box atribuit dupd cum se gtie sistemelor cdrora nu li se cunoa$te decdt intrarea gi iegirea,nu gi ceea ce se petrece in interior. Liposomii pot fi manipulafi fdrd modificarea structurii, prin gel-filtrare sau dializd. Ei gi-au gisit o aplicabilitate practicf, prin includerea in interiorul acestora a unor substanfe precum enzime, vitamine, agenfi dermo-activi. De asemenealiposomii sunt utilizaii pentru introducereain organism a unor substanfe de contrast in procedurile imagistice moderne de diagnostic, precum tomografia computerizatd gi rezonanla magneticd nucleard. Datoritfl similaritS.fii structurii cu membranele celulare conlinutul liposomilor poate fuziona cu cel al celulelor, credndu-seastfel condiliile preliminare pentru eliberareaconlinutului liposomilor in celulelefinti. Tot similaritatea structurali cu membraneie celulare fac din liposomi modele experimentale utile pentru studiul permeabiliti,fii membranelor naturale. Astfel pentru dublurile straturi lipidice sferice se stabilegteviteza de eliberare a compugilor inclugi in liposomi, prin determinarea cantitativd in timp a nivelului acestoratntr-o anume solufie. O procedurd elec-

Lipide . Membrane biologice

87

trometricd de determinare a permeabilitd$i dublurilor straturi lipidice utilizeazd, vas bicompartimentat. Pereteledespdrfitor al acestuiaare un prevdzut un orificiu de cca. I mm in diametru. (Fig.2.sV. Stratul dublu Iipidic se formeazi prin pensulare cu o solufie de fosfolipid[ intr-un solvent organic. In ambele compartimente se introduce o solulie apoase. Studiul se poate face mdsurdnd curentul prin circuitul format cu doi electrozi imersafi in cdte un compaftiment, ca raspuns la diferite potenfiale aplicate. Prin astfel de procedee s-a determinat - ,t.; l 0 ' 2 Ap5 P(cm s permeabilitatea membranelor dubiu lipiIndol dice la diferite specii ionice sau molecul0-4 lare agadupd cum se prezintdinFig. 2.38. t-iree(Gicerol) l0'5 Stabilitatea straturilor dublu lipidice, 'fhptoihn Glucozi inclusiv a liposomilor se explicd prin com10-8 pensarea sciderii de entropie la formarea 10.r0 acestora de cdtre scdderea de entalpie datorati interacfiunilor nou apirute (legdturi ionice gi de hidrogen intre zonele hidrofile ale fosfolipidelor gi apa respectiv componenfii ionici existenfi deliberat in Va lo ri I e permeab i Ii ld lii pentru aceastape de o parte gi interacfiunilor hidilerite specii care troversea:d drofobe - forfe Van der Waals de dispersie stratul dublu Iipidic - intre catenele hidrocarbonate ale restuFig.2.38 rilor acil. 2.5.3.Asimetria membranelor plasmatice Cele doud straturi dublu lipidice permit atdt lipidelor componente cdt gi proteinelor integrale sau periferice o circulalie practic liberd. Aceastdcirculalie esterealizatdprin doud tipuri de miEcdri:a) o migcare de translafie in planui membranei gi b) o migcare de rotafie in jurul unei axe normale la suprafafa membranard. Mobilitatea rezultatd in urma acestor migcdri poate fi pusd in evidenld prin utilizarea unor proteine membranare marcate fluorescent. Pe ldngd acestedoud tipuri de migcdri mai sunt posibile gi migcari de rotafie in jurul unei axe aflate in planul de separafie al celor dou5,monostaturi lipidice ale membranei. Aceste miqcdri, cunoscute sub numele de flip-flop sunt defavorizate energetic,iar dacd se petrec totugi ele au o viteze redusd, frind de reguld realizatecu asistenfdenzimaticd.Ponderearedusi a acestormi$cdri gi energia mare necesarase justifice prin obligativitatea ca extre-

88

Elemente de biochimie .1.

mitatea hidrofili a componentei care executa mi$carea sa traverseze zona hidrofobi din centrul membranei. Acest tip de migcare frdnatd impiedicd omogenizareacomponentelor inseratein membrand pe anrbele fele: interni qi extern6.Firesc,asimetria structurald creeazdpremisele asimetriei funclionale. ln Tab.2.2.se redd compozilia ceior doui straturi ale membranei eritrocitare umane. Pe ldngi asimetria transversalddeterminatd de compozilia diferitd a celor doud straturi lipidice mai existd gi o asimetrie klngitudinald. Aceastase manifestd prin aspectul de masd mobild, cu zone diferite ca structure, constituite din asociafii lipidice, proteice sau lipoproteice. Ionii bivalenti de exemplu, pot induce separdri de faz6.in membrane formate din fosfatidilserini, fosfatidilcolina sau/gi fosfatidilcolamind prin forrnarea de asociafii ale fosfatidilserinelor (punfl saline prin in termediul carboxilatilor),

Fig. 2. 39. Gli.coforina A

De asemenea,anumite proteine membranare pot forma asociafii cu anumite lipide care creeazi astfel ,,insule"mobile intr-o mare agitate. Orientarea proteinelor intr-o membrani poate fi determinatd prin utilizarea unor enzirne proteolitice care nu pot traversa membrana. Carboxipeptidaza,de exemplu este o exoproteazl.ce hidrolizeazi leg6turil e p eptidice mar ginale, aferente capdtului C-terminal, GlicoforinaA este un bun exemplu de proteind membranard, constiNumele i-a fost attuent majoritar al membranei eritrocitare (F19.2.39.). umand con{ine 131de amiribuit de c[tre MARCHESIin 1975.Proteina

Lipide . Membrane biologice

noacizi dintre care 38 % se situeaze in portiunea transmembranard, fiind hidrofobi. Capdtul N-terminal se afld in exteriorul celulei, iar cel C-terminal in interior. Porfiunea N-terminale, externe este puternic glicozilata (15 catene oligoglucidice legate O-glicozidic terminate cu acid siaiic, si o cateni legatdN-glicozidic). Acestecatene sunt deci puternic hidrofilice gi anionice. Aceste catene poatd determinanfii antigenici ai grupelor sangvine,flind in acelagitimp gi receptori pentru virusul gripei. 2.5.4.Distribulia asimetricd a lipidelor Lipidele prezintd de asernenea distribufie nesimetricd pe cele doua o fefe ale membranei plasmatice.In cazul rnembranei eritrocitare majoritatea fosfatididil etanolaminelor (cefalinelor)gi a fosfatidilserinelor se gdsesc localizate pe fa{a internd iar fosfatidilcolinele (lecitineie) qi sfingomielinele sunt localizatein specialpe fafa extern[. Aceasti distribufie preferenliali influenfeazdpe de o parte distribufia sarcinii electrice pe cele doud fefe ale membranei, iar pe de altd parte, permite interacfiuni specificecu proteine membranare particulare.Tab. 2.2. Compozifia membranei eritrocitare umane Gomponent Proteineglicoproteine 9i Lipide Fosfolipide Sfingomieline Fosfatidil coline Fosf atidiletanolamine Fosfatidilserine Fosfoinositide Fosfatidilinositol (4-P) Fosfatidil diinositol (4,5-Pz) Fosfatidil triinositol Colesterol Glicolipide gragi Acizi % masi6q AF

procentuald fiecarcstat Distributia oe Stratul extern

28 6,8 7,0 7,4 4,3 1,0 0,34 0,22 0,39 131

80 20 0

20 25 80 100

50 100

50 0

Localizarea diferenliatd a lipidelor, pe tipuri, pe cele doud fele ale membranelor, creeazd asimetria transversal[. Localizarea lor se face spontan prin sintezd pe fala de referinfd, ori dirijat, prin intermediul unor proteine specializate in transferul transmembranar al lipidelor.

Elemente biochimie,I. de

sinteza fosfolipidelor, a glicolipidelor, a colesterolului se realizeazd, de enzime localizatein membranele reticulului endoplasmaticrespectiv al aparatului Golgi. Fluxul acestor compugi cdtre membrane, inclusiv cdtre cea plasmaticd este realizat de c{tre proteinele de transfer al lipidelor, mai sus menfionate. Odati stabilitd, asimetria transversald. mema branelor sementine prin bariera energeticaridicat[ necesardtrecerii lor de pe o fali pe alta a membranei. ln anume condilii, poate avealoc un transfer al lipidelor de pe o fa15pe alta a mernbranei plasmatice.Acest transfer ss lgalizeaza de cdtre proteine specifice numite flipaze. De multe ori aceste flipaze necesitd asistenfa ATP-ului pentru a realiza transferul lipidic. AceastareprezintI o a doua modalitate de mentinere a asimetriei stratului dublu lipidic. 2.5.5.Tranzifii de fazd ale straturilor dublu tipidice gi mobilitatea acestora

fififififi M[[inc6lzire-------------lt

1

Fig. 2.a0. tanzilia de fazd suferitd de strarurile dublu lipidice Ia rnodificarea de temperaturd

La temperaturi relativ scd.zute, mobilitatea carbocateneloreste limitat5, energia liberd fiind redusd. Legdturile carbon sunt in conformalie anti, catenele avdnd lungimea maximd respectiv suprafapa minimd. In aceste condilii, grosimea stratului dublu lipidic este maximd, de asemenea gi rigiditatea acestuia.Prin incdlzire, creqtemobilitatea catenelor care prin modificdri conformafionale igi mdresc suprafafa acoperit5, dar in acela;i timp permit intrepitrunderea catenelor opuse (Fig.2. }.).

CAPITOLUL 3. ProteineDintre cele patru clase de substan(e fundamentale ale materiei vii, proteinele sunt pe departe cele mai importante (in comparatie cu glucidele, lipidele gi chiar cu acizii nucleici). Natura macromoleculard, nemaiintdlnita multitudine a structurilor care se regisegte intr-o funcfionalitate extrem de diversd, le conferd un loc prioritar tn raport cu alte substanfebiologice. Termenul de proteine (derivat de la grecescul proteios- primul), introdus de cdtre Idns I. BEMELIUS in lB3B, subliniazdprimordialitatea clasei. Semnificafia celor afirmate este in acord cu func{iile principale indeplinite: l. Biocatalizd enzimaticd. Marea majoritate a reacliilor petrecute in organismul viu sunt catalizate de macrornolecule de naturd proteicd numite enzime. Domeniul de acfiune al enzimelor se intinde de la cele mai simple reacfii precum ar fi hidratarea dioxidului de carbon, catalizatd, anhidraza carbonicd, gi termindnd cu cele mai complexe, cum de sunt cele implicate in procesele de replicare cromosomiald. Valorile specificitd{ii gi activitdlii enzimelor sunt caracteristici care Ie departajeazd. net de catalizatorii chimici convenfionali, ficdndu-le competitive procesede sintezd organicd. in 2, Biocatalizd hormonald. ln prezent se cunosc o serie de hormoni cu structuri polipeptidicd care, secretafide celule specializate,igi exercitd func1ia biocataliticd la nivelul celulei fintd, dupd transportul pe cdi umorale. Hormonii nu sunt catalizatori in sensul strict al cuvdntului. Prin reglarea nivelului unor anume metabolili, stdri, procese, toate acestea realizate prin controlul unor cdi metabolice, hormonii influenteazd reac{iile chimice, de unde qi atributul de biocatalizatori. Insulina, hormonul homeostaziei glicemi ce, somato statina hormonul de reglare a cregterii, uasopresina, angiotensina,bradikinina, oxitocina etc. sunt alte exemple de hormoni peptidici. 3. Transport gi stocare. Proteinele indeplinesc funcfia de transportori speciflci pentru diferite molecule sau ioni atdt in spaliile intercelulare cdt mai ales prin membrane, realizdnd astfel selectivitatea accesului substanfelor biologic active pdnd in interiorul celulei. Hemoglobina, transportorul de oxigen la nivelul eritrocitelor, mioglobina, substanfa care stocheazS. oxigenul la nivelul celulelor musculare, transferin*, care transportd ionul feros, depozitdndu-l in ficat sub formi de complex cu

92

Elementede biochimie .I.

feritina, o alte proteind, ceruloplasrnina,purtdtorul de cupru, albumina sericdcare transporta lipide\e, citocromii care asigurdtransportul electronilor sunt numai cateva dintre reprezentangiiproteinelor de transport sau stocare. 4, coordonare a migcdrilor. Natura proteici a forma{iunilor contractile ale fesutului muscular, a formafiunilor motile ale flagelilor (cililor) celulelor bacteriene, determini migcdri, ca rdspuns la acfiunea unor stimuli de naturd diferitd. 5. Suport mecanic al diferitor {esuturi. Elasticitateaqi rezistenfapielii este datoratd.colagenului, cea a vaselor sangvineelastinei,iar a fanerelor keratinei. 6. Protecfia imund. La aparigia substanfelor sau corpurilor straine (virusuri, bacterii) celula reactioneazd,in funcfie de pozifia ei pe scara evolutivd,prin sinteza gi secrefiaunor subs;tan1e proteice, anticorpii care neutralizeazd. materialul exogen. 7. Generareagi transmiterea impulsurilor nervoase. Rdspunsul celulelor nervoasela diferifi stimuli este mediat de o serie de receptori de naturi proteicd. Rodopsina, o cromproteidd, este responsabild de recepfia luminii la nivelul celulelor bastonagedin retina. Proteinelereceptoare pot reacliona ia prezenla unor substanfecu masi moleculard redusi precum acetilcolina gi genereazl,semnale la nivelul sinapselor (terminatiilor celulei nervoase),realizdnd comunicareaintre celule. B. Controlul cregterii gi diferenfierii celulare. Se realizeazd,instrAnsi legdtur5, determinismul genetic al proteinelor. Transcriereagi traducu cerea mesajului genetic este coordonata de proteine represoare. orln ganismele superioare factorii de cre;tere, de naturi proteic6, asigur[ cregtereagi diferenlierea celular5,.De asemenea,in organismele superioare, activitatea diferitelor celule estecoordonati de hormoni printre carese disting gi cei polipeptidici.

3.1. ClasificareaproteinelorDin nem: t o t r multitudinea de criterii care ar putea fi luate in considerarerefimasa moleculard numS.mlde catene ale proteinei funcfionale omogenitatea solubilitatea gi legatd de aceastastructura fibrilard sau globulare

Proteine . Clasificarea proteinelor

93

Astfel,dupd.rn&sa. moleculardproteinele se pot sistematizain: r oiigopeptide r polipeptide r proteine propriuzise Distinclia dintre cele trei categorii este arbitrard. Se considerd cd oligopeptidele confin pdnd la zece aminoacizi, polipeptidele intre zece gi 50 de aminoacizi iar proteinele peste aceastd valoare. Numdrul de catene este important pentru proteine deoarece este direct corelat cu complexitatea edificiului proteic. O proteind funcfionald poate fi monomericd saupoate fi multimericd..Proteinelemultimerice pot fi formate din catene de acelagifel ca in cazul proteinelor homomultinterice sau din catene peptidice diferite ca in cazul proteinelor heteromultimerice. Dupd.omogenitate,proteinele se subdivid in: t proteine omogene formate numai din aminoacizi). Acestea se subdivid dupd forma catenei in proteine globulare (diametrul maxim gi minim sunt de acelagiordin de mirime; majoritatea sunt solubile in apd gi/sausolulii saline) ;i in proteinefibrilare (diametrul mare poate fi denumit lungime iar diametrul mic poate fi denumit pur Ei simplu diametru, deci coeficientul de zveltele sau raportui lungime / diametru este mare). Proteinele fibrilare pot fi solubile (fibrinogenul din sdnge, respectivactina si miozina din lesutui muscular) sau insolubile: colagenul, elastina,fibroina, keratinele. I proteine neomogenq conjugate sau heteroproteide. Ele sunt formate dintr-o componentd polipeptidicd (proteice;numitd apoproteind gi dintr-o componentdneproteicdnumitd cofactor.ln functie de natura acestuicofactor distingem: t glicoproteidd(glucidevezi capitolul 1) t nucleoproteide(acizinucleici vezi capitolul S) t lipoproteide (lipide). Aceastd clasd este reprezentatd de conjugafi proteici cu lipidele simple ori complexesau cu produgii lor de hidroliz6. Seintd.lnescatdt in serul gi plasma sangvindcdt gi in constitufia membranelor celulare.Ioncfiunea lipidd-proteind se face prin: I) Iegd' turi coualente(acilareacu un rest de acid gras a grupdrilor aminice sau hidroxil libere din componenta proteicd), 2) prin legdruri ionice, (componenta lipidica participd cu resturi fosfat sau amoniu -din colind- iar componenta proteicd.cu resturi carboxilat ori amoniu, guanidiliu etc).7 componenteleneproteicese vor specificaintre paranteze

94

Elementede biochimie .1,

Pe ldngd acestea,stabilizarea conjugahrlui lipoproteic se poate face gi prin legdturi mai slabe precum 3) legdturile de hidrogen, respectiv 4) forle uan der Waals. Lipoproteidele plasmatice se sistematizeazd. dupa densitate,(corelatdaici cu mobiiitatea electroforeticd)in cinci categorii: chilomicroni, lipoproteide de densitate foarte micd (VLDL8), Iipoproteide de densitate intermediare [DL), lipoproteide de densitate micd (LDL) gi Iipoproteide de densitatemare (HDL). I cromoproteide(pigmenli, coloranfi) t metaloproteide (ioni metalici ) Componenta neproteicd este un ion metalic. De cele mai multe ori, acestion metalic apare asociat,in interiorul apoproteinei cu alti structurd neproteicd,ceeace face ca multe dintre metaloproteide sd apa4inA in acelagitimp gi altor clase de heteroproteide.Exemplui hemoglobinei (vezisubcapitolul hemoglobina) esteedificator. Ionul metalic, care face parte dintre oligo- sau microelemente (Fe,Cu, Zn, Mn. Co, Mo, Ni etc.), se gdsegteatagat prin legdturi ionice, fiind de asemeneacoordinat de atomi electrodonori. Rolul componentei metaiice estediferit qi determind func{ionalitatea proteinei. Vom face referinfd la cdtevaexemple clasice.ln cazul metaloproteidelor care fac parte din lanluri transportoare de electroni, rolul metalului (Cu, Fe) este acela de acceptor de electroni din partea unui component din amonte (in sensulpotengialuluide reducere),care se va oxida gi, succesiv,acela de donor de electroni catre un component din aval, care se va reduce. ln acest mod funcfia transportor de electroni a metaloproteidei se face prin bascularea stdrii de oxidare (in cazul ferului Fez*) Fe3*, cazul cuprului Cu* ) Cuznetc.). ln alte metaloproteide in rolul metalului este catalitic. De reguld metalul acfioneazdprin reducerea densitSlii electronice la un centru de reac{ie,fdcdndu-l mai susceptibil unui atac nucleofil. (Veziin Vol.2. exemplul aldolazeide tip II in care oxigenul carbonilic, aflat in vecindtateaionului Zn?*din enzimi, igi va deplasaelectronii cdtre ionul metalic, crednd astfel o polarizare care va favoriza finalmente clivarea legdturii C3-C4 din esterul Haarden Young). Trebuie menfionat rolul ferului care apare in doui tipuri structurale de metaloproteide: proteidele Fe-heminice gi proteidele Fe-S.Din prio Acronimele provin din denumirea in limba englezd.a acestor compugi Very Low Denisty lipoproteins (VLDL), fntermediate Density Iipoproteins (IDL),Iow Denisty Iipoproteins (LDL), Iligh Denisty Iipoproteins (HDL),

Proteine. Conlinutul de proteind al materialelor biologice

95

ma categorie,care are drept caracteristiceexistenla unui nucleu porfirinic (vezihemoglobina), fac parte substanfecu functie catalitice precum catalazelegi peroxidazele,apoi substanfe transportoare de electroni precum citocromii (vezi lanful mitocondrial al transportului de electroni in Vol. II) gi proteidele de transport gi stocare a oxigenului (vezi hemoglobina gi mioglobina). Din cea de-a doua categorie,caracterizatd prin existen{a legdturii covalente Fe-S, fac parte substanle cu func{ie catalitice precum succinat dehidrogenazagi aconitaza,respectiv componente ale lanlului transpoftor de electroni (vezi lanful mitocondrial al transportului de electroni gi fotosintezadin Vol. II) t fosfoproteide (acid fosforic). Confin grupi.ri fosforice ata$ate estericde resturi de serind sau treonind. Exemple de astfel de substanfe sunt cazeinele din lapte. Acestefosfoproteide sunt prezente sub formd de sdruri solubile de calciu. Ele nu precipiti termic, ci doar prin cobordrea pH-ului. Fermentafia lacticd, prin acidul lactic pus in libertate duce la formarea cazeinei insolubile, din cazeinalii solubili existenli in biomasi. Pe acest proces se bazeazd, tehnologiile de fabricare ale brdnzeturilor. Dupd. solubilitatea in apd.Sisohtlii saline proteinele se impart in: t proteine insolubile (scleroproteine):cum sunt de exemplu: colagenul, elastina,fibroina, keratinele. t proteine globulare sau fibrilare solubile precum: albuminele, globulinele etc. r O categorie particulard surrt proteinele membranare. Aceste proteine (vezi proteine membranare) sunt structuri amflpatice, porfiunea hidrofobd fiind cea transmembranard.Acesteproteine sunt cunoscute ca proteine insolubile, insolubilitatea acestorafiind insd datoratd atagdriide membrand. De altfel extracfialor necesitddistrugereamembranelor celulare, prin utilizarea detergenfilor. Proteinele solubile propriuzise (globulare) sunt structuri tridimensionale, care expun pe suprafafa externd.,in contact cu mediul hidrofil, catene laterale, hidrofrle din aminoacizi.

3.2. Confinutul de proteini al materialelor biologiceO procedurd. comunf, este metoda KIELDAIIL, prin care confinutul de proteind brutd din materialul biologic se estimeazddin determinarea pe azotului total. AceastdmetodS.se bazeaz6. ipoteza validatd cd valoacu rea medie a conlinutului de azot din materialul proteic este de 16To,

96

de Elemente biochimie .1.

precumgi pe neglijilea conlinutuluiin azot o dispersie relativscezute, al celorlallicompugiprezenfiin probd. intregii cantiteli de azot orDeterminarearealizeazd transformarea ganicin NHr* cu ajutorul acidului sulfuric la fierbere,in prezenfaunor in ,,catalizatori", fapt substanle pentru ridicarea temperaturii de (SeOz, cu urmatd de transformarea un KzSOn), fierberea amestecului vapori cu acestuia exces NaOHa ionului NHr* in NHs $i antrenarea de intr-o solu,tie titratade acidclorhidric.H2Soa \ NaoH \ titrarecu IICI

Ntorgl\r_--t-

Nr1- -\r-_--.

\:r{4OH

B[|!'"t

de Complex tip biuret

Complex bicinconinic

Fig,3.1. Euidenfierea proteinelor prin complexare cu ioni de cupru'

O alta metodi, frecvent utilizatd datoritd simplitdfii ei este cea a lui LOWRY,care constd in aparifia unui complex cupric de tip reacfie biuret (Fig.3.1.)gi, simultan, a unor forme oxidate la tirozind, la cisteina gi la triptofan, prin interacfiunea ploteinei cu o solulie alcalinocupricd gi cu o solu{ie fosfowolframicd respectiv fosfomolibdenicd (Nazwor ' ZHzO+ NazMoOa. 2HzO + HsPOr ). Solulia fosfomolibdowolframicd poartd numele de reactiv FOLIN - CIOCALTEU.Formele oxidate genereazd ionul cupros cale reaclioneazd cu complexul fosfomolibdowolframic. complexele cupros gi cupric absorb la 660 nm. Dupd incubareaprobei proteice, timp de 10 min. la 50oC,proba (cu complexele cupro-cuplos formate) se fotometreazela 660 nm fali de apa distilat6. Etalonarease face prin utilizarea unor solufii standard de albumini sericdbovin6, disponibild comercial. Sensibilitateametodei este de cca.l0 mg.l-I.

Proteine, Purificarea proteinelor

97

o*

soi

Fig. 3. 2.. Reactivul CoomasieBlue utilizat la determinarea calitatiud Si cantitativd a protelnelor prin metoda BRADFORD

O varianti imbundtdfitd a metodei Lowry este metoda acidului bicinconinic (acid 2,2' bichinolin 4,4' dicarboxilic), care formeazd un complexfotometrabilcu ionul Cu.r. (Fig'3.1.) Proteinele se mai pot determina printr-o reaclie de culoare datd cu colorantul trifenilmet anic Coomassie@ 3. Brilliant BIue G-250 (Fig. 2.).

3.3. Purificarea proteinelorPurificarea proteinelor se face in scopul determind.rii structurii acestoradar gi pentru evitarea unor interferenfe pe care compugii cu care se gdsesc asocia{iinifial i-ar putea produce in utilizare. Datoritd complexitdfii amestecului in care se gdsegteproteina, procesul de puriflcare prezinti dificulte$ a cdror mdrime cre$te odatd cu gradul de purificare cerut, gi constd intr-o serie de operafii realizate intr-o succesiune logicd".Aceasti succesiune depinde de localizarea proteinelor in materialul biologic. Proteinele se gAsescin microorganisme unde pot fi avea localizare intra- sau extracelulard,precum gi in lesuturi sau organe animale ori celule vegetale.Procedurile de oblinere a proteinelor sunt adaptateparticularitifilor celulelor sursi (F19.3.3.).

98

Elementede biochimie .l-

Celule vegetale fesuturi, organeanimale

l*

I

Celule microbiene

Prot eine \ intrac( ilulare)

Prot erne ( \extrac, =lulare,

lichid solid Separare

dezintegrrecelulard r

Separare chid - solid

Solide

Lichide

lndepdrtare acizi nucleici

Purificare

Concentrare

(Condi{ionare)

/o"ui-

ffiifimll$fr$F,.

S

/prot"in].-#

Ftg. 3, 3. Schemade primipiu de purificare a proteinelar

Proteine . Purificarea proteinelor

99

O restriclie de care se line seama,estelegatd de fragilitatea structurii edificiului proteic care poate suferi cu mare ugurinfd alter[ri. 3.3.1. Dezintegrareacelulard Materialul biologic, care de cele mai multe ori constd dintr-un preparat celular sau tisular, in care proteina se gdsegtesechestratdin interior, trebuie supus inifial operaliei de dezintegrarecelulard,prin care are loc mperea (distrugerea) membranelor si a perefilor celulari. Aceasta se poate realiza prin doud categorii de metode: mecanice gi nemecanice.Aplicabilitatea uneia sau alteia depinde de tipul de celuld utilizat, de sensibilitatea proteinei gi de scarade aplicare(laborator,pilot pdnd la ceaindustriald). 3.3.4.1.Metode mecanicede dezintegrarecelulard Sunt cele mai folosite, datoritd simplitA$i, costului redus gi a lipsei de contaminare cu produse strdine. Intensitatea procesului trebuie sd asigure dupd caz,distrugereaperetelui celular, a membranei celulare sau a membranei structurilor subcelulare.Procedeelefizice utilizate trebuie sd fie suficient de eficace,dar in acelagitimp, sd nu provoace denaturarea proteinei (modificarea structurii sale sub acliunea forfelor care se dezvoltd). In practica uzuald se lucreazd la rece, in prezenfa unor substangeprotectoare. Trebuie avut in vedere Ei faptul cd distrugerea prea avansatda peretelui celular produce resturi de dimensiuni mici ale perefilor sau membranelor, care pot contamina produsul, ingreundnd procesele De ulterioarede separare. aceeauneori se preferd un randament de extracfie mic printr-o omogenare incompletd dar cu avantajul simplific[rii operafiilor ulterioare respectiv al necontamindrii. Rezultatul operatiilor de dezintegrare celulard mecanicd este aga numitul omogenat celular. 3.3.1.1.1.Utilizarea de abraziui Agitareaenergicd,in prezenfa microbilelor de sticld, de ofel, sau a nisipului fin, provoacd dezintegr.ueacelulelor prin ruperea perefilor celulari, a membranelor gi eliberarea constituenfilor citoplasmatici. Dezintegrareaeste datorat[ atdt frec[rii dintre particulele de abraziv gi materialul celular cdt gi ciocnirilor care au loc. Gradul de dezintegrare depinde de viteza gi durata agitArii, de concentralia in celuli, de cantitatea gi de mdrimea microbilelor sau granuleior de nisip. Procesul se poate aplica de ld scard de iaborator (cu ajutorul mojarului cu pistil), la

100

Elemente biochimie,l, de

scare pilot $i pdnd la productia industriald. Aparatele utilizate la scari mare sunt mori cu bile. Pentru mdrirea intensite$i frecirilor, ele sunt previzute cu discuri plasate concentric sau excentric pe un ax central aflat sau nu in migcare relativi fala de corpul morii, sau pur gi simplu axul central mobil, are un diametru care se apropie de diametrul intern al aparatului. 3.3.1.1.2.Dezintegrarea prin destindere (liquid shear)

scaunul ventilului de destindere

intrarea suspensief celulare_------>

-

inel de impact iegirea omogenatulu

Fig. 3. 4. Schema de principiu a unui omogenizator MANTON-GAUIA,IN

Se realizeazdprin trecerea unei suspensii de celule, comprimati la presiuneridicata (de ordinul a 30-125 Mpa) printr-o valvd cu secfiune micd.. Decomprimarearapida care are loc duce la,,explozia"celulelorgi eliberareacon{inutului lor. Alte mecanisme prin care are loc distrugerea peretelui ceiular in acesttip de proces sunt frecareafoarte puternicd de perelii aparatului a componenfilor suspensieicelulare gi de asemenea impactul cu suprafe(elevalvei (Fig. 3.4.) Deoarececomprimarea gi frecarea sunt insolite de incdlziri locale, este necesardprezenfa unui sistem de ricire eficace (circulafie de alcool la -25 "C). Viteza cu care suspensia treceprin valva de destindereestede ordinul a 300-350m.s*t. Omogenizatorul Manton - Gaulin care lucreaz[,pe acestprincipiu poate realiza tratarea in sistem continuu a unui debit de 250 l.h-t. Aceastd tehnici se aplicd in special bacteriior Gram pozitive, al cdror perete are o rezistenti mecanicd remarcabili.

. proteinelor Proteine Purificarea

l0l

3.3.1.1,3. D ezintegrare ultrasonicd Este o operatie aplicabild in laborator. Ea constd in aplicarea unor vibratii de frecvenfd gi energie ridicatd asupra preparatului brut (suspensiei celulare).Sub influenfa vibrafiilor care se produc, au loc comridicatd, in cale variafiile locale primdri gi decomprim[ri cu frecvenlS. de presiune ating valori considerabile.ln fazade decomprimare are loc fenomenul de cauitayie,care constd in vaporizarea instantanee a apei, Prin aceastavolumul ocupat cregte,cu consecinfa distrugerii inveligurilor celulare. Tot prin cavitalie se distrug perefii celulari in cazul dezintegrdriiprin destinderede la presiune ridicatd. 3.3.1.2. Metodele nentecanice componenfilorcelularise poate faln condilii particulare,eliberarea ce prin permeabilizareaperetelui ceiular. Aceastase poate realiza prin tratament chimic sau tratam ent enzimatic. Fata de metodele tnecanicetratamentul chimic prezintd avantajul cd o nu necesit5. aparaturi specializatdia.rresturile de perefi se pot elimina cu suficientd ugurinfa avdnd in vedere cd peretele celular este doar major estecontaminareaprodusului, ceea permeabilizat. Dezavantajul ce complicaoperaliile de purificare din aval,9i in plus, datd fiind sensibilitatea proteinelor,posibilitateadenaturdrii acestoracregte.Cu toate acestea,in cazuri particulare, metodele nemecanice pot oferi satisfactie. 3.3.1.2.1. Metodelechimice agenti p recum : U rilizeazd, solven{ii organici: toluenul, in concentrafii de o,5 - Bvo,laeliberarea enzimeior din Escherichiacoli, t-butanolul, metanolul, 2-propanolul, etanolul la eliberarea enzimelor din spafiul periplasmatic (la bacteriile Gram negative). Detergenfii: ionici, precum Tritonul-lo0, sau anionici precum dodecilsulfatul de sodiu, acfioneazd asupra membranelor plasmatice sau ale formaf iunilor infracelulare destabilizdndu-le. Agenlii chaotropici: precum clorohidratul de guanidind sau ureea. Degi pot produce cu uqurinfa denaturarea proteinelor, in cazul determinarii condiliilor optime de lucru, utilizarea acestor substanfe devine eficientd pentru ca pot fi indepdrta.te cu ugurinfd prin ultrafiltrare, gelf,trare,sau dializ6.

102

Elemente biochimie,l. de

Tratamentul alcalin: este utilizat ca alternativi cu totul particulard de permeabilizare in cazul asparaginazei produse de Erwinia carotouor4, respectival hormonului uman de cregtereexprimat in E. coli. 3.3,1,2.2. Liza eraimaticd

Digestia peptidoglicanic realizati, cele enzimaticAperetelui a in estemai multe cazuri de citre lizozim (vezi cap. 4. secfiunealizozim). Bacteriile Gram pozitive pot fi procesate mai simplu deoarece au stratul peptidoglicanic plasat in exterior. ln cazul bacteriilor Gram negative, deoareceau stratul peptidoglicanic inclus intre cele doud membrane, acfiunea lizozimului trebuie completatd cu acfiunea EDTA, care are rolul de a chelata cationii bivalenli, perrneabilizd.nd membrana externe. Membraneie plasmatice rdrnasefdri consolidareaoferitd de perefi vor fi distruse sub acfiunea presiunii osmotice interne ridicate. 3.3.2.Separareasolid-lichid ln procesul de ob$nere a proteinelor (vezi Fig.3.3.)separarea lichidproteinelor extracelularebacteriene, cind este solid apare fie in cazul necesardseparareafazei lichide (care confine proteina) de biomas5., fie in urma operafiei de dezintegrarecelulard cdnd este necesardindepdrtarea resturilor perefilor gi membranelor celulare de faza lichidd care de reguld contine proteina de interes. Principial se pot utiliza filtrarea gi centrifugarea. Filtrarea este utilizat[ in special la scard mare, industriald. Descriereaoperafiei este fdcutd pe larg in literatura. Specificpentru separdriledin biochimie ;i biotehnologie estecentrifugarea. Omogenatul oblinut confine, pe ldnga o multitudine de proteine Ei organite celulare, resturi de membrane celulare, precum gi aite substante neproteice. lndepdrtarea organitelor celulare gi a resturilor membranare se poate face prin centrifugare diferen;iald. Parametrii procesului sunt forta centrifuga gi durata. Forta centrifugd depinde de diametrul rotorului gi de turafie, se exprimi de obicei prin intermediul accelerafieicentrifugale calculatd ca multiplu al accelerafieigravitafionale.ePentru fiecare centrifugd existd posibilitatea determinirii acceleraliei centrifuge, prin cunoa$tereaturafiei (n) gi a diametrului rotorului (d).

e acceleraliacentrifug{: 8"=rDaR unde

4p

4d1

psz*(spin inalt) (spin Fe2+ coborat) cAmp slab pse* (spin coborAt) intens cAmp

li[il-+f+f+lI

n-n ml-l-l

lT-{iF-l-+lTl WWWM W

FWffW

&w

nT-n

Fig.3. 60. Configuralia electronicd a Fe' tn hem" Explicalii in text.

Legarea oxigenului mai are o consecinld conformafionald: In deoximioglobine, Fd* pentacoordinat (flnl, participarea apei), estedeplasat ugor in afara nucleului protoporfirinic spre histidina proximald. Deplasarea de cca. 0,55 A, este datoratd neechilibrdrii vectoriale a for{elor care leagi ferul, repulsiei dintre electronii n ai inelului porfirinic gi electronii Fezn, repulsiei dintre atomii de azot porfirinici Ei azotul histidinei proximaie FB. In plus, datoritd volumului mai mare al ionului feros de spin inalt aflat intr-un cdmp de liganzi relativ slab, nu incape in interiorul porfirinei. 7n Fig.3.60.se prezintd configuralia elecuonicd a30De altfel CO esteprodus in urme prin metabolism,O legareprea putemicl acestuia ar a pentru blocain timp mioglobina. Chiarin absenla CO, lipsaimpiedicdrii stericear m6ri afinitatea oxigen, lngreundnd eliberarea acestuia nevoie. la

Proteine . Proteineglobulare

L7l

ionului Fe'*, necoordinat gi in stare hexacoordinatd in cdmpuri de liganzi intensitate diferitd. Orbitalii hagurafi sunt ocupafi de electroni de coordinafie. Deplasareaferului in afara planului nucleului porfirinic antreneazddeformareaacestuiplan.

o

Planul porfirinic ffi

I

J. -

Fig,3.61, Deplasarea prin oxigenarea hemului a helixului atasat de histidina proximald

Prin legareamoleculei de oxigen, datoritd echilibrdrii electriceparfiale precum gi reducerii volumului ionului de fer, acestaeste atras cdtre inelul protoporfirinic, (totugi rdmdne o distanli intre centrul nucleului gi centrul atomului de Fe (0,26 A); gi aceastaeste datoratd asimetriei forfelor de legare a Fe din afara inelului porfirinic. Aceastdmodificare conformafionald,lanucleul heminic, se transmite gi la globina prin deplasareaodatd cu ferul heminic a histidinei proximale, gi a helixului FB, care la rdndul lui modificd intreaga structurA Vig.3.61.) Importanfa acestuifapt esteneglijabila la mioglobind, dar estecruciald la hemoglobine. Hemoglobinele (Hb) sunt substanfe care reprezintd cca. 90 % din masa uscatd eritrocitard. Ele au rolul de a transporta oxigenul de la pldmdn pdnd la celulelein care acestaestefolosit in proceseleoxidative. Transportul se face prin forma de oxihemoglobini (HbOr. Ele realizeazd transportul oxigenului prin echilibrele: in dr,edele pJmoncreLIF\ rlu rI n v n7 , *

L72

Elernente biochimie.l. de

Fig, 3. 62, Tetramerul hemoglobinlc

Estimareacapacitdtii de transport a oxigenului de cdtre hemoglobina din sdngese face prin intermediul unui parametru, puterea oxiforeticd (Pox).Aceastaeste definitd ca volumul de oxigen legat de hemoglobina existentdin 100 ml de sdnge.La adultul sanetosvaloarea acestui parametru este 19,6ml oxigen.

Fig 3. 63.Modeluldeoxi- gi oxihemoglobinci

Abaterile de la vaioarea normali pot avea semnifica{ie patologicd. sistemul circulator poartd oxihemoglobina de la alveolelepulmonarr: la lesuturile unde estenevoie de oxigen prin intermediul sdngeluiarterial. Sdngelecare confine hemoglobina fdrd oxigen,se reintoarce la plimdni sub formi de sdngevenos. Sfingelevenos este mai inchis la culoare decdt cel arterial.Aceastamodificare se datoreazddeplasariimaximelor de absorblie in vizibil ale hemoglobinei, ca urmare a deoxigendrii (oxigenarii). Astfel Hb are un maxim la 560 nm, iar HbOz are doud maxime,:la 540,respectiv 580nm. la Hemoglobinele sunt substanle cristalizabile.Forma cristalelor, prermite identificarea sursei de provenienfd, aspect de utilitate in criminalisticI Tab.3.7.:

Proteine , Proteineglobulare Tob.3.7.sisteme d,ecrktaliznre pentru hemoglobine din diferitc surse

173

Sursa H0 de Om CAine CobaiCal

Sisfem cristalizare de Ortorom bipiramidal bic 0rtorombic Tetraedric Monoclinic

Hemoglobinele au structuri cuaternard,tetramericd (Fig.3.62.), fiind formate din doud tipuri de catene polipeptidice, din gasestructuri posibile (cr,F,y,6,eq ). ln cazul omului adult hemoglobinaA (HbA) posedd $i catenede tip c ai B: Hba- cu l4t de aminoacizigi HbB- cu 146de aminoacizi. Fiecare din acesteacontin aceeagicomponentd neproteicf,, hemul. AtaEarea moleculei de oxigen pe fiecare dintre cei patru protomeri se face similar cu ataEareaoxigenului pe mioglobind. procesul este prezentat in Fig.3.63.pentru catena cr.ln Fig.3.6J.A) in structura deoxi- se observdionul Fez*care iese din planul curbat al hemului apropiindu-se de histidina proximali (His B7). ln Fig. 3.63. B) se observd cu atasarea angulard a oxigenului antreneazd deplasareaFe2*in interiorul ciclului porfirinic. cei patru protomeri se dispun in doud subunitdfi identice crB,formdnd structuraglobauol Fl. Tot la adult se mai intdlnegteo hemoglobini secundaraHb&. Aceastaare stoechiometriaol 61, diferind prin catena 6 care inlocuiegte catena de tip B. La embrioni ;i fetu;i se intalnesc catene de tip ( (zeta),care inlocuiegte catena de tip a, de aseme_ nea catenee gi y similarelui 0. ln funclie de pH structura cuaternard a: p: poate disocia simetric sau asimetric in dimeri: Bl + 2aApA (simetric in doud,subunitdli identice) pl + of + Bf (asimetricin doud subunitd;i diferite) "l Fiecaredin cele doud tipuri de protomeri care participd la structura unei hemoglobine, au o structurd similard globinei din mioglobind (opt segmenteq,-helicoidaleA - H). Structura prezintd doar similaritili spa_ fiale, existdnd mari diferenle intre structurile primare (secvenlele acestor catene). cu toate acestediferen{e existd aminoacizi conservati "l

174

Elemente biochimie .1. de

(care pot fi gnsili la toate tipurile de hemoglobind indiferent de sursd). Acegtiasunt redatiinTab.S.B.Tab. 3,8. aminoaciai corceruafi tn diferite hemoglobine

proxinulicare leagd Histidina ferul heminic

Permite apropierea helixurilor E I9i in bucta terminaldhelixului a C

FG Suporl donor leg. hidrcgen segmentul de de cu

,yFig, 3.M, M$carea relatiud a heterodimerilor aB prin oxigenarealdeoxigenarea hemoglobinel

lntre catenele hemoglobinei3r se manifestd o serie de interactiuni. Interactiunile cele mai puternice sunt realizate intre subunit5.file neidentice crBgi Bcr.Din acest motiv cele doud unitafi heterodimerice identice au un mare grad de rigiditate. Ele se pot deplasainsd una fafd de cealaltd,in urma oxigendrii - deoxigen[rii, printr-o mi9care de rotafie cu cca. 15", fati de o axa ce trece printre cele doud perechi cr,B. (Fig3.6 .). Aceastd mi$care de rotalie este realizatd printr-o basculare3r In continuare ne vom referi la hemoglobina de tip A. Celelalte tipuri de hemoglobind au comportament similar

Proteine . Proteine globulare

175

conformafionald care implicd desfacerea unor legdturi ce stabilizeazdo stare gi formarea unor legdturi care stabilizeazi noua stare. ln acest proces sunt implicate legdturi de hidrogen s,ilegdturi ionice. Legarurilede hidrogen carese rup la oxigenaresunt stabilite intre hidroxilul fenolic al penultimului aminoacid al fiecdrei catene tirozina (Tyr a140, respectiv Tyr F 145, plasate in zona nehelicoidald care urmeazd. helixului H adicd Tyr crl40 - T1'rHC2, respectivTyr B 145=HC2) gi gruparea CO din catena principald care aparline unui rest de ualind Val FG5 (pozifiile cr939i B98). Legdturile ionice rupte prin oxigenare sunt in numir de opt. $ase dintre acesteasunt realizate intre catene diferite. Dintre acestea,doud sunt realizateintre capeteleN gi C terminale ale catenelor cr,doud leagd capeteleC terminale (carboxilafii) ale subunitdlilor p, de cdte un rest de lisind Lys 40 din subunitdlile cr,gi doud leagd restul Arg141 dintr-o catend o de restul Asp126 al celeilalte catene cr.Legdturile ionice intracatenare care se rup la oxigenare leagd resturile Asp94 cu His146 din fiecarecatend B. (Flg'3.6O. ln stare neoxigenatd,capeteleC-terminale ale celor patru subunitdfi sunt legate, conformafia corespunzdtoarefiind numita T (de la tense tensiontd).In oxihemoglobind, prin desfacerea celor opt legituri se eligi bereazd, capetele C-terminale astfel incdt acesteadobdndesc o mare libertate de rotafie, din acest motiv conformalia oxihemoglobinei fiind numitd R (de la relaxed- relaxatd).

co;

v

:i"{H3N|j*#lOzC

N fr$ffia:':t:ff:.-=*uTl=ui:,:Ilil H;

Fig, 3, 65.Legdturi ionice din hernoglobind afectate de oxigenare

Legarea oxigenului se face inifial la grupa heminici a catenei G, in atunci cdnd hemoglobina se gdsegte stare T. ln aceastdstare structurile heminice ale catenelor B, sunt inaccesibile,datorite impiedicdrilor sterice exercitate de resturile de aminoacizi ai helixului E. $i legarea

t76

Elemente biochimie .I, de

oxigenului la aceasti subunitate este dificild, din cauza celor opt tipuri de legituri ionice gi a celei de hidrogen mai sus amintite. Prin legarea oxigenului la subunitatea o, hemoglobina va trece in stareaR, iar impedimentul steric dispare astfel devenind posibild, atagarea cu afinitate superioari a oxigenului gi pe subunitdlile B. Modificarea structurald cauzatd de deplasarea histidinei proximale, implicit a helixului F, se transmite la protomerul adiacent, ceeace ii mdregtesusceptibilitateala legareaatomului de oxigen. Din acest motiv constantele de afinitate la legareaoxigenului diferi intre subunitdfi, odatd cu legarea oxigenului. Succesiv, modificarea se transmite gi celorlalli protomeri. Concret, afinitatea hemoglobinei pentru oxigen cregteodatd cu ocuparea succesivd a situsurilor de legare. Acest efect indici o cooperativitate a subunitdfilor. De altfel diagramele de disociere ale mioglobinei Ei hemoglobinei pun in evidenfd acest efect, Diagama de disociere este reprezentareagradului de ocupare al situsurilor in funcfie de presiunea parliale a oxigenului. Mioglobina neposeddnd structure cuaternare va prezenta o alurd hiperbolicd a curbei de disociere,in timp ce la hemoglobind va existao formi sigmiodald (Fig.3.67.). Studiind cantitativ asocierea - disocierea oxigenului putem scrie pentru miogloblnd: Mb + Oz.. MbO2 =* de aici constanta de disociere: Cro' Co,

K,=

c"oo.

t3.ll

definind gradul de saturare Y ca raport al concentraliei situsurilor

la Y ocupate concentrafia totali a situsurilor: = ^ + Co. + K'

c^

2l 13.

qi Elimindnd c r&o,din relalia t3.21 impnrlind prin c w seobline:

Y-

Cr,*^ '''""'

C"*, + Cvo

t3.31

Proteine . Proteineglobulare

L77

po, ( Po, ste sau inlocuind Co, cu presiuneaparfiall a oxigenuluide disociere se va propor{ionald cu Co, - in acesteconditii constanta exprima in torri, K ), gradul de saturareva fi:D^ v - ---:-=Po,+K

t3.41

Evoluliagraduluidesaturarecupresiuneapa4ialeaoxigenuluiareo 66) alurd hiperbolicd (Fig.3'

Fig.3'66.Variafiagrad'uluidesaturare,almioglobincicupresiuneapargiali'a

omarimeimportantdesteP56,definit[capresiuneapar{ial6pentru caregradul de saturareestede 50 To,adicd: P-^ '3u n ttre --P r o + K V = se rezolvhnd ecuaiia in Pso ajunge la P5e l(' Introducdnd aceastdvaloarein expresia[3'4]' se obline: D2 '" ^v'-- P o " * P s o

t3.51

t3.61

se prin transforrnare obline:

L78

Elemente biochimie .1. de

Y _po,1-Y P5o Prin logaritmarea expresiei[3.7.]rzultd:

t3.71

t

( v

\

(v\ In reprezentarea coordonatele pe tO[,, , lgbo,) datele,ro. _ \/ V Idetermina o dreaptd de pant[ unitard. ln cazul hemoglobinei, care este un tetramer, considerdm echilibrul disociatirl2: Hb(Oz)" -Hb + nO2 De aici rezulti, pentru saturafiaY o formd similard expresiei[3.6]:

[JYj

, =rs(Po,)b t%,)

3. Bl

r 5 0- l t o r r '

2

P50- 26 tolri

Fig. 3.67. Curbele de saturalie ale hemoglobinei Si mioglobinei

Reprezentareacurbei de saturafie a hemoglobinei in functie de presiunea parfiala a oxigenului relevd alura sigmoidald a acestei variafii comparativ cu a mioglobinei

Y-

p3,p3,+K

el t3.

Prin rearanjareaecuafiei [3.9] se obline:32Acest tip de echilibru presupune un mecanism de legare de tip ,,totul sau nimic" sau altfel spus un mecanism concertat. (Vezi reglarea activitelii enzimatice modelul MWC)

Proteine, Proteineglobulare

179

(Po, )"

1_YLg (Y/1-Y)

K

t3.l0l

Prin logariftnare ecuafia [3.10]devine:

Fig. 3. 68. Reprezentareaecuasiei [3.11] pentru hemoglobind

b([.+'l' = n,rs(p",lg(K) - 1 -Y )-

lu 13.

La semisaturafie, = 0,5,ceeace duce Ia anulareaexpresiei[3.] I]. De Y aici rezultd K= (pso)"' Prin reprezentareape intreg domeniul presiunilor parfiale a variafiei Y ) ..,( mdrimii l0l " \ . 1 _ YI' nu se obgine o dreaptd, cum ar fl de agteptat, ci o curbd sigmoidala (Fig. 68.) 3. Porliunea centrald din vecindtatea ordonatei nule poate fi asimilatd cu o dreaptd.Panta acesteia reprezintdcoeficientuln din ecuatia [3.11] cunoscut sub numele de coeficientul lui llitl. Domeniul in care acesta ia valori indicd existen{a sau inexistenfa cooperativitdfii, respectiv intensitateaacestuiproces.Un coeficient n=l atestdlipsa cooperativitatii, cu alte cuvinte independenla afinitdgii legdrii unui ligand oarecare,in particular oxigenul, de legarea ligandului Ia alte situsuri din aceeagi structurd multimerici. Un coeflcient supraunitar indici o cooperativitate pozitivd, adicd o cregterea afinit5;ii de legare a ligandului prin atasareaprealabild pe alt situs a ligandului respectiv, sau un ntI* + HCO3-2. Aceastd reaclie este catalizatE. anhidraza carbonicii. de

Proteine . Proteineglobulare

181

(pCO)Z> (pCO2r

Fig.3. 69.Influenla concentraflci d.edioxid de carbon, respectiva pH-ului asupra afinitdsii ansdrii oxigenului de hemoglobind.

Prezenfaabundentd.aCOz este constatatdin fesuturile cu activitate metabolicd intensd, ca rezultat al proceselor oxidative exergonice.Nevoia de oxigen estefireasc[, hemoglobinapreia H* pi CO2gi elibereazd in Oz.Fenomenul a fost pus in evidenla de Christian BOHR34 anul 1904. Fenornenul invers pus in evidenla de I.S. HALDANE, are loc in plimdn gi constd in eliberareaH* gi a CO2concomitent cu preluarea Oz, c& urmare a concentrafiei crescute a oxigenului. Legdtura dintre 02, Hn 9i COzestecunoscuti sub nurnele de efect BOHR. In F4g.3.69. prezintd dependenfa sirnilard se a afinitdgii hernoglobinei de concentrafia COz, protonilor (pH). respectivde concentrafia Protonii nu sunt de fapt nigte efectori alosterici (vezi alosteria la enzime), deoatece nu interac{ioneazdcu un situs specific din structura proteicS.. vor protona resturile suscepEi producAnd astfel modificd.riin numdrul tibile, 9i structura legdturilor ionice gi a celor de hidrogen. Existd insd centre importante, care prin protonare af.ecteaz6.mult stabilitatea Fig. 3. 70.Modelul molecular al 2,3 -difo sfo glicer atului structurii hemoglobinei. Acegtia sunt aminoa(2,3-BPG) cizii N-terminali din catenele o, care in stare3afiziolog danez, talel celebrului flzician Niels Bohr

182

de Elemente biochimie.I.

protonate vor putea menfine legitura ionicd cu cateneleo vecine (FE 3.65.).Similar, nucleele imidazolice ale histidinelor B146,prin protonare, vor putea menline legdturile ionice cu resturile Asp B94din aceleagi catene. Dioxidul de carbon influenfeazd afinitatea hemoglobinei fafd de oxigen nu numai prin dependenla directd asuprapH-ului, ci gi prin legarea chimicd sub formi de carbamat:R-NH2+ COz>R-NH-COO-+ H*. Echilibrul acesteireactii este deplasat spre dreapta odatd cu cre$terea presiunii parliale a dioxidului de carbon. Prin formarea carbamatuIui, grupirile amino, potenlial cationice devin anionice. ReacFa este particular irnportantd pentru capeteleN-terminale ale catenelor cr,care pot stabili legdturi ionice cu resturile cationiceArgo141. Spre deosebire de H" gi COz, 2,3-difosfogliceratul (2,3-BPG) (F1g.3.70.) este un efector alosteric autentic, prin selectivitatealegdrii sale. Observafia lui Ioseph BARCROFTcd afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei in solufie apoasd (pso= I torr) este de cca. 26.de ori mai mare decdt in eritrocit ( p5s = 26 torri), a fost explicatd in 1967 de Reinholdgi Ruth BENESCHpebaza rolului jucat de 2,3-BPG. , ln Tab.3.9.Se reprezintd concentraliileeritrocitarenormale pentru substanleleintermediare ale glicolizei.Tab.3.9. Concentraliile eritrocitare normale ale unor intermediari glicolttlci Component Glucoz6 6Glucozo- P Fructozo- P 61,6Fructozo- P DihydroxiacetonP 3- P Glicerinaldehid1,3-bislosfoglicerat 2,3' bisfosfoglicerat 3 - fosfoglicerat 2 - fosfoglicerat Fosfoenolpiruval Piruvat Lactat

5000OJ

14 31 138 19 1 4000 118 30 23q,t

2900 p-1=-\--l-\\-*\-Rlnositol hexa/bsfat (IHP)

n-\-'-\----t \\\\ \...4--\-on

D -

ll n-D-^ I

v

R lnositol pentafosht (PP)

Proteine, Proteine membranare

183

Concentrafiileeritrocitare ale 2,3-BPGqi ale hemoglobinei sunt egale (aproximativ 44,5 mM). Structura 2,3-BPGconline cca. patru sarcini negativela pH-ul fiziologic. Acest ion se inserd intre cele doud catene beta, ale formei deoxi, unde va fi legat de sarcinile pozitive ale formelor protonate din His2, LysB2gi His143.Prin legareaionicd.a 2,3-BPG,se stabilizeazd forma deoxi, care va aveadeci o afinitate redusd fa!d.de oxigen. ln urma oxigenflrii, cavitatea dintre cele doud subunit[1i B19i B2 devine mai mici si prin urmare, 2,3-BPGva fi expulzat. La alte specii rolul 2,3-BPGpoate fi jucat de substanle diferite, dar care posedd de asemeneasarcini negative, provenite cel mai ades din resturi fosfat. La pegti ca substanfareglatoareacfioneazeATP sau GTP' La reptile gi pdsdri se int6.lnescderivali fosforilafi ai mioinositolului: inositolpentafosfatul(IPP)Eiinositol hexafosfatul(IHP