Editura Sfântul Ierarh Nicolae

ISBN 978-606-577-071-3 MICROSCOPIE GENERALÃ

Examinarea microscopicã a produselor alimentare şi furajere

Examinarea microscopicã este o metodã aplicatã pentru identificarea, pe baza

caracterelor microscopice caracteristice sau prin compararea cu o mostrã de

referinţã, a componentelor normale sau strãine din produsele alimentare sau

furajere. Aceste produse pot fi materii prime, adjuvanţi sau produse finite.

Prin component strãin se înţelege orice material diferit de structura normalã a

produsului, şi a cãrui prezenţã este condiţionatã de deficienţe de prelucrare,

depozitare sau transport a produsului respectiv. In aceastã categorie intrã materiale

de contaminare, rezultate în urma fenomenelor de descompunere (texturi degradate

în urma unor acţiuni de naturã parazitarã sau a unor fenomene fizico-chimice,

paraziţi sau fragmente ale acestora, etc.), materiale din mediul de prelucrare (nisip,

pamânt, fragmente de sticlă, ruginã, lemn, plastic, textile, metal, etc.) sau alte

corpuri organice sau anorganice (fragmente de insecte, fire de pãr, dejecţii ale

insectelor, pasãrilor sau animalelor, oase, pene, cristale, etc.).

Examinarea microscopicã are ca scop identificarea acestor componente prin

comparatie sau pe baza unor caractere identificabile la microscop. Acest mod de

examinare este facilitat de efectuarea unor teste suplimentare bazate pe reacţii

chimice şi care pot ajuta la confirmarea identitãţii structurilor examinate.

GHID DE EXAMINARE

MICROSCOPIC Ă

Florenţa Albu

Editura Sfântul Ierarh Nicolae

ISBN 978-606-577-072-0

- 2 -

Aparaturã si echipament de laborator

1.1 Microscopul de laborator

Existã o mare varietate de microscoape cu diferite destinaţii. Complexitatea

şi precizia cresc de la microscopul didactic la microscopul universal. Pentru

metodele de examinare microscopicã este utilizat microscopul compus echipat cu

luminã transmisã şi cu putere de mãrire de pânã la 1200 x. În figura 1 sunt

prezentate componentele principale ale unui microscop de laborator de

complexitate medie.

Fig. 1. Componentele principale ale microscopului de laborator

- 3 -

În general, microscopul de laborator este alcãtuit dintr-un suport (talpă) pe

care este fixat un braţ (sau stativ) care susţine tubul binocularului, revolverul

rotativ în care sunt montate obiectivele, o carcasã cu masa port-obiect şi

condensatorul. Carcasa conţine dispozitivele de deplasare fină, micrometrică, şi de

deplasare grosierã a obiectivului faţã de micropreparat (obiect). Cele două

dispozitive sunt controlate de verniere şi pot fi coaxiale sau separate. În funcţie de

tipul microscopului, deplasarea faţã de obiect se poate realiza prin deplasarea

verticalã a stativului (masa fixă) sau a mesei portobiect (stativul fix).

Deplasarea orizontalã a mesei, pe două planuri, se realizează cu ajutorul unui

dispozitiv solidar cu masa portobiect. În talpa microscopului sunt montate, de

regulã, sursa de lumină şi oglinda care direcţioneazã lumina la 900 spre

condensator (fig. 1). La partea superioarã a stativului se gãseşte un corp de legătură

care conţine o prismã deviatoare. Aceastã prismã modificã traseul fluxului

luminos pentru a face legătura între obiectiv şi ocular. La corpul de legãturã este

ataşat tubul binocular şi un ghidaj prismatic sau cu elemente de rostogolire în care

intrã revolverul cu obiectivele (fig. 1).

Preparatul pentru examinare care mai este denumit şi obiect, este aşezat de

regulã, pe o lamă portobiect din sticlă. Preparatul poate fi examinat direct sau poate

fi acoperit cu o lamelă din sticlă, de indice de refracţie (n) şi grosime standardizate

(d)1. Pentru acurateţea examinării este recomandatã numai utilizarea lamelor şi

lamelelor standardizate.

1 Valorile standard sunt d= 0,17 mm şi ni= 1,524 pentru lamele iar pentru lame d = 1 mm.

- 4 -

Fig. 2. Schema de principiu a dispozitivului optic al microscopului

1.1.1. Sisteme de iluminare cu câmp luminos (CL)

Preparatul microscopic (obiectul) poate fi examinat prin luminã transmisã

sau diascopică (în care obiectul este examinat prin transparenţă) sau prin luminã

reflectatã sau episcopică (în care obiectul este examinat prin lumina reflectatã de

cãtre acesta). Aceste metode de iluminare constituie sistemul de iluminare cu

câmp luminos. Dispozitivul de iluminare al microscopului este alcãtuit în

principiu, dintr-o sursã de luminã (S), condensatorul (C), diafragma de câmp (DC),

oglinda (O) şi diafragma de apertură (DA) care se gãseşte în tubul condensatorului.

Schema de principiu a dispozitivului de iluminare al microscopului este prezentată

în figura 2.

Elementele de focalizare a luminii primite de la sursa de iluminare sunt

oglinda (fig. 2) şi condensatorul (vezi fig. 1). Condensatorul este constituit dintr-un

ansamblu de lentile şi poate fi deplasat pe verticală cu ajutorul unui vernier.

Lumina care strãbate condensatorul poate fi reglată ca diametru al fluxului cu

ajutorul unei diafragme reglabile situate la nivelul condensatorului şi care este

denumitã diafragmã de apertură. Condensatorul, la unele microscoape, poate fi

reglat şi prin înclinarea axei verticale, iar de acest lucru se va ţine cont la reglarea

microscopului.

- 5 -

1.1.2. Obiective

Obiectivele (fig. 1) sunt fixate în revolver câte patru sau cinci (în funcţie de

tipul constructiv) şi au puteri de mărire diferite. Puterea de mărire este notatã pe

partea exterioară a tubului obiectivului, alături de apertura numerică

corespunzãtoare (spre exemplu un obiectiv de imersie are notaţia 100 x / 1.25).

Conform standardelor DIN/ISO, puterea de mărire a obiectivelor este codificată

pe tubul extern al obiectivului, sub forma unui inel de o anumită culoare. Codul

culorilor corespunzãtoare claselor de obiective este prezentat în tabelul 1.

Obiectivele pot fi de putere micã sau medie (2-43 x ) sau pot fi obiective de putere

mare (50-120 x). Obiectivele care necesită un mediu lichid între obiectiv si

preparat sunt denumite « obiective de imersie » iar cele obişnuite sunt cunoscute ca

« obiective uscate » (fig. 4). Obiectivele de imersie au un al doilea inel colorat în

funcţie de tipul mediului lichid care poate fi utilizat (sau recomandat) (vezi fig. 4 şi

tab. 1).

Fig. 4. Schema de comparaţie între obiective uscate şi de imersie şi

marcajele acestora.

Pe suprafaţa externã a tubului obiectivului se găsesc marcate indicative

referitoare la tipul obiectivului, lungimea acestuia, distanţa de lucru sau, la unele

tipuri, grosimea lamelei care poate fi utilizată. In tabelul 1 sunt indicate

proprietãţile obiectivelor în funcţie de tipul de corecţie. Acestea pot fi acromate,

- 6 -

semi-apocromate sau apocromate, în funcţie de gradul de corecţie cromaticã.

Lentilele obiectivelor acţioneazã asemănător cu un set de prisme cumulate, astfel

că la trecerea luminii spectrul este divizat în culorile componente. Acest fenomen

conduce la apariţia aberaţiilor cromatice şi implicit la scăderea calitãţii imaginii.

Calitatea imaginii este influenţatã şi de aberaţia sfericã produsã de lentilele care

compun obiectivele

Tipul obiectivului Aberaţie sfericã Aberaţie cromaticã

Pentru corectarea acestor aberaţii existã obiective cu combinaţii diverse de

lentile2 cu grad mãrit de dispersie. Cele mai simple sunt obiectivele plan acromate,

apoi obiectivele fluorit3 (sau semi-apocromate) şi apocromate. Gradul de corecţie

este notat pe tubul obiectivului, sub formã de indicativ (Achro, Apo, Plan, Plan

Apo, etc.).

1.1.3. Puterea de rezoluţie

Performanţele unui microscop sunt apreciate pe baza puterii totale de mãrire

şi a capacitãţii de rezoluţie a obiectivelor. Rezoluţia este un parametru care indicã

capacitatea de vizualizare distinctã a două puncte situate la distanţa invers

proporţionalã cu rezoluţia. Modul de calcul al rezoluţiei are la bazã urmãtoarea

formulã :

2 Aceste lentile sunt construite din sticlă cu compoziţie specialã. 3 Denumirea a fost pãstratã de la fluoritul care a fost utilizat iniţial ca material constructiv al lentilelor.

- 7 -

d = NA)2/1(

(1)

Unde : d = limita rezoluţiei = lungimea de unda a luminii transmise NA = apertura numerica

În tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile unor obiective mici, medii şi mari

(uscate şi de imersie). Pe tubul extern al unui obiectiv de 10 x , spre exemplu, se va

putea vedea notaţia 10 x/0.25 (cu inel galben) care indicã puterea de mãrire şi

apertura numericã corespunzãtoare. Din acelaşi tabel se poate observa distanţa

minimã dintre două puncte separate care pot fi vizualizate (puterea de rezoluţie).

Odatã cu creşterea puterii de mãrire, scade proporţional şi distanţa de lucru dintre

obiectiv şi lama portobiect. Din formula (1) de calcul a limitei rezoluţiei d, se poate

observa cã rezoluţia este invers proporţionalã cu lungimea de undã a luminii

transmise prin obiectul examinat. In acest fel, devine evident cã pentru obţinerea

unei rezoluţii cât mai bune, lungimea de undã a luminii transmise trebuie sã fie cât

mai micã (fig. 5).

Fig. 5. Relaţia dintre capacitatea de rezoluţie şi lungimea de undă

Lungimea de undã a luminii obţinutã de la becurile microscoapelor se

situeazã în jurul valorii de 550 nm. De regulã, pentru examinarea la microscop, se

utilizeazã un filtru albastru (ex. BG 33-BG 38) aşezat în calea fluxului luminos

înainte ca lumina sã ajungã la condensator. Utilizarea unui astfel de filtru ajutã

- 8 -

ochiul observatorului sã perceapã mai detailat

structurile observate la microscop. Existã şi alte

tipuri de filtre care au scopuri diferite. Astfel, filtrul

gri (ex. N 16) atenueazã intensitatea luminii

transmise fara a influenţa temperatura culorii (în

exemplul de mai sus codul filtrului indica capacitatea de reducţie N 16 = 100/16 =

6.3 %). Filtrul verde (ex. VG 9) mãreşte contrastul color al imaginii, ceea ce duce

la obţinerea unor detalii mai bune în special pentru microfotografii sau la

examinarea în fluorescenţã. Tab. 1

OBIECTIVE PENTRU MICROSCOAPE

Tipul de corecţie

Putere de mãrire (magnificaţie)

Apertura numericã (NA)

Distanţa de lucru (mm)

Codul de culoare al

obiectivului

Codul de culoare

suplimentar (imersie)

4 x 0.10 30.00 Rosu - 10 x 0.25 6.10 Galben - 20 x 0.40 2.10 Verde - 40 x 0.65 0.65 Albastru deschis - 60 x 0.80 0.30 Albastru cobalt -

Acromat

100 x 1.25 0.18 Alb - 0.5 x 0.02 7.00 - - 1 x 0.04 3.20 Negru - 2 x 0.06 7.50 Maron - 4 x 0.10 30.00 Rosu - 10 x 0.25 10.50 Galben - 20 x 0.40 1.30 Verde - 40 x 0.65 0.57 Albastru deschis -

50 x (ulei) 0.90 0.40 Albastru deschis Negru 100 x (ulei) 1.25 0.17 Alb Negru

40 x 0.65 0.48 Albastru deschis -

Plan acromat

100 x 0.90 0.26 Alb - 4 x 0.13 17.10 Rosu - 10 x 0.30 16.00 Galben - 20 x 0.50 2.10 Verde - 40 x 0.75 0.72 Albastru deschis -

40 x (ulei) 1.30 0.20 Albastru deschis Negru 60 x 0.85 0.30 Albastru cobalt -

100 x 0.90 0.30 Alb -

Plan fluorit

100 x (ulei) 1.30 0.20 Alb Negru 2 x 0.10 8.50 Maron - 4 x 0.20 15.70 Rosu - 10 x 0.45 4.00 Galben -

Plan apocromat

20 x 0.75 1.00 Verde -

- 9 -

40 x 0.95 0.14 Albastru deschis - 40 x (ulei) 1.00 0.16 Albastru deschis Negru

60 x 0.95 0.15 Albastru cobalt - 60 x (ulei) 1.40 0.21 Albastru cobalt Negru 60 x (apa) 1.20 0.22 Albastru cobalt Alb 100 x (ulei) 1.40 0.13 Alb Negru

1.1.4. Microscopul cu contrast de fazã (CF)

Pentru identificarea structurilor componentelor examinate este util

microscopul echipat cu contrast de fazã (fig. 6). In principiu, dispozitivul de

contrast de fazã introduce un inel de fazã, în calea fluxului luminos care ajunge la

preparat. In acest caz obiectul nu mai este iluminat prin transparenţă iar obiectul

apare iluminat intens pe un fond întunecat. Principiul contrastului de fazã prevede

cã lumina directã capãtã un defazaj

de 900 , intensitatea luminii directe

este micşoratã aproape comparabil

cu intensitatea luminii difractate şi

lumina difractatã interfereazã cu

lumina directã a cãrei intensitate

este micşoratã şi deplasatã în fazã.

La microscopul de acest tip,

condensatorul poate fi reglat şi ca

înclinaţie, în aşa fel încât lumina ajunge la obiect sub un anumit unghi de

incidenţã.

Un aspect deosebit de important pentru acurateţea observaţiilor la microscop,

este reglarea sau centrarea fluxului luminos care trebuie sa ajunga la obiectiv

perfect centrat. Aceasta se realizeaza prin ajustarea inclinaţiei oglinzii din talpa

microscopului cu ajutorul şuruburilor de ajustare.

- 10 -

Fig. 6. Reprezentare schematică a dispozitivului de contrast

Centrarea fluxului luminos se realizează prin îndepãrtarea geamului mat din calea

luminii şi vizualizarea4 filamentului (la becuri cu incandescenţã) sau a reţelei (la

becuri cu halogen sau fluorescente) (fig.7) :

a b

Fig. 7. a) Diferite tipuri de lãmpi : A-halogen B–Hg 50 C- Hg 100

b) Imaginea filamentului (bec cu incandescenţã) Oc 7 x –Ob 10 x

Pentru centrarea cu dispozitivul CF se regleazã condensatorul pentru

înclinaţie în plan vertical. In acest scop se foloseşte în locul unuia dintre oculare o

lunetã specialã cu care se poate vizualiza poziţia inelului de fazã. Reglarea se face

pânã la fixarea acestui inel în centrul câmpului vizual.

4 Aceasta reglare se efectueazã cu un ocular de 7 x şi un obiectiv de 10 x

- 11 -

1.1.5. Microscopul cu dispozitiv polarizant

În anumite situaţii, este necesarã examinarea cu luminã polarizatã. Faţã de

microscopul obişnuit, microscopul polarizant

simplu conţine un dispozitiv polarizor situat în

faţa condensatorului şi o lamă compensatoare ().

Cu ajutorul luminii polarizate se pot observa

materiale anisotrope organice sau anorganice, se

pot diferenţia cristale (fig. 8 A) sau fragmente de

sticlă (fig. 8 B). Substanţele anisotrope se caracterizeazã prin apariţia în câmpul de

examinare a culorilor de polarizare iar cele isotrope prezintã transparenţă

(extincţie) completã. De notat cã examenul cu lumina polarizatã se poate combina

cu observarea în contrast de fazã.

Fig. 8. A) Cristal în luminã polarizatã, B) Fragment de sticlă

- 12 -

1.2 Stereomicroscopul

1.3

Stereomicroscopul este compus, în principiu, din aceleaşi piese ca şi

microscopul, cu deosebirea cã examenul obiectului se face prin iluminare

reflectatã. Practic, este o lupã de examinare dar care are capacitatea de mãrire

mult mai mare.

Fig. 9 Stereomicroscopul de tip Wild

- 13 -

Stereomicroscopul poate avea o putere de mãrire de la 10 la ~250 x în funcţie de

aplicaţia la care este folosit. Puterea totalã de mãrire se calculeazã în mod identic

prin multiplicarea puterii ocularului cu cea a obiectivului. In cazul în care sunt

montate obiective suplimentare, puterea de mãrire a acestora se multiplicã cu

puterile ocularului şi obiectivului principal. La stereomicroscop, spre deosebire de

microscopul compus, piesa care este schimbatã este ocularul (10-32 x) în timp ce

puterea obiectivului este, în general, fixă5 (0.5-5.0 x). Ca şi în cazul microscopului,

obiectivele stereomicroscoapelor pot fi codificate color6 dupã puterea de mãrire a

acestora. Codurile si specificaţiile obiectivelor sunt prezentate în tabelul 2 : Tab. 2

OBIECTIVE PENTRU STEREOMICROSCOAPE7 Tipul de corecţie

Putere de mãrire (magnificaţie)

Apertura numericã (NA)

Distanţa de lucru (mm)

Codul de culoare al obiectivului

0.5 x 0.045 155 Roşu 0.75 x 0.68 117 Galben

1 x 0.09 84 Alb 1.5 x 0.14 50 Verde

Plan acromat

2 x 0.18 40 Albastru 0.5 x 0.066 136 - 1 x 0.13 54 - Plan apocromat

1.6 x 0.21 24 -

În figura 9 este reprezentată structura principală a stereomicroscopului de tip

Wild. La unele stereomicroscoape este prevãzutã şi posibilitatea iluminãrii

obiectului prin transparenţă, situaţie în care sursa de luminã este aşezatã sub masa

portobiect, într-un sistem asemãnãtor celui de la microscop. În acord cu cele

prezentate mai sus referitor la capacitatea de rezoluţie, la dispozitivul de iluminare

externã se va ataşa un filtru albastru care va facilita observarea detaliilor de pe

suprafaţa obiectului de examinat. Pentru examenul pe placa de sticlă este de

preferat sã se aşeze sub placã o hârtie de culoare neagrã pentru componente

deschise la culoare, sau una de culoare albã în cazul componentelor colorate sau

5 Existã stereomicroscoape la care se obţin magnificaţii în trepte prin rotirea unui cursor. 6 Existã şi producãtori care nu folosesc sistemul de codificare al obiectivelor. 7 Sunt prezentate specificaţii pentru obiective obişnuite, folosite în laboratoarele biomedicale.

- 14 -

negre8. Iluminarea se face de preferinţã cu o sursã de cel mult 30 W iar sursa poate

fi configuratã lateral, frontal sau combinat. Rezultate optime se obţin la iluminare

simultanã lateralã şi frontalã (fig. 10) :

Fig. 10. Schema de configurare a surselor de iluminare externã (combinatã)

Identificarea microscopicã

2.1 Pregãtirea examinării

Este esenţialã omogenizarea foarte atentã a probei de analizat. Examinarea

pentru identificare microscopică se realizează în câteva etape. Într-o prima etapă

are loc separarea fragmentelor pe baza dimensiunii acestora. Aceasta se realizează

prin separarea mecanicã prin filtrare, sitare, flotaţie sau selectarea vizualã. În cazul

în care este necesarã mãrunţirea mecanicã a unor granule sau conglomerate, se

poate face mojararea manualã sau mãcinarea în moara electricã. În acest caz,

trebuie însã ţinut cont de turaţia aplicatã pentru a nu fragmenta prea fin

componente care pot fi recunoscute macroscopic (se începe cu o turaţie micã

~1000-2000 r.p.m. timp de 5-10”). Fragmentele mai mari sunt apoi examinate la 8 Stereomicroscoapele sunt prevãzute cu un disc opac cu două suprafeţe (alb/negru) care acoperã masa. portobiect

- 15 -

stereomicroscop unde vor fi observate caracterele macroscopice (detalii de

suprafaţã, texturã) consistenţã (se încearcã fragmentarea prin presare), culoarea

particulelor, dimensiunile acestora, etc., aspecte care vor fi notate alãturi de

dimensiunea fracţiei analizate (ex. nr. sitei pe care s-a facut separarea).

2.1.1 Sitarea

Pentru separarea diferitelor componente prin sitare se folosesc două tehnici :

sitarea uscatã şi sitarea umedã. In primul caz se face sitarea amestecurilor uscate,

alcãtuite din componente de dimensiuni

diferite sau a amestecurilor obţinute prin

mãcinare şi uscare. In cazul sitãrii umede

se folosesc site cu diametrul de cel puţin

15-20 cm (cu ochiuri de 60, 100, 150

m)9. Sitarea se efectueazã sub curent de

apã caldã (50-600 C) menţinând sita la

~300 înclinaţie. In funcţie de natura componentelor separate, este opţionalã

adãugarea de detergent10, caz în care spãlarea se efectueazã pânã la îndepãrtarea

completã a spumei rezultate. Reziduul rãmas pe sitã este uscat şi apoi transferat

cantitativ cu o soluţie alcoolicã într-un pahar curat. Dupã separarea şi uscarea

reziduului obţinut, acesta poate fi supus unei etape de hidrolizã acidã sau bazicã.

2.1.2 Filtrarea

Filtrarea este utilizatã pentru separarea

suspensiilor fine din soluţii sau rezulate prin

umectarea reziduului rãmas la sitare. Pentru filtrare

se foloseşte hârtie de filtru de porozitate medie,

corespunzãtoare pentru majoritatea aplicaţiilor. In pentru iluminare externã şi un disc din sticlă matã, semitransparent, pentru iluminare transmisã. 9 Vezi Anexa 3. 10 In mod uzual se foloseşte un detergent anionic.

- 16 -

anumite cazuri, când sedimentul este foarte fin iar filtrarea dureazã prea mult, se

poate aplica filtrarea sub vid în pâlnie Hirsch sau în filtru ceramic. In situaţiile

când conţinutul de substanţe grase sau coloizi îngreuneazã filtrarea, se foloseşte

apa fierbinte pentru spãlarea filtrului11, iar în situaţiile când amestecul conţine

substanţe amidonoase se foloseşte soluţie fierbinte de HCl 1-2%.

2.1.3 Sedimentarea şi flotaţia

Separarea fragmentelor pe baza densitãţii acestora, se face utilizând tehnica

sedimentului de concentrare. Aceasta constã în separarea fragmentelor prin

suspendarea amestecului într-un volum de solvent cu densitate mare (cloroform,

clorura de metilen, tetracloretan). Pentru separarea sedimentului, proba este

suspendatã în solvent într-o pâlnie de separare. Dupã omogenizare fragmentele

uşoare (cu densitate mai micã) vor flota iar fragmentele mai grele vor rãmâne în

sediment. Prin îndepãrtarea solventului cu elementele flotante va ramâne

sedimentul concentrat care va examinat sistematic pentru identificarea

componentelor sale. Partea flotantã este examinatã dupã îndepãrtarea solventului

prin uscare. În general componentele pãrţii flotante sunt reprezentate de structuri

cu densitate micã : ţesuturi vegetale, fire de pãr, ţesut muscular deshidratat,

fragmente de elitre ale unor insecte, etc. Separarea

fragmentelor pe baza dimensiunii se poate face atât

din proba ca atare sau din fracţiile de la

sedimentarea cu solvent. Aceastã separare se

efectueazã cu ajutorul sitelor standard cu

dimensiuni diferite ale ochiurilor. Numerotarea

sitelor poate fi fãcutã dupã standardul ISO sau

standardul USA. În Anexa 3 sunt prezentate

11 In funcţie de metoda utilizatã se pot folosi şi solvenţi organici care dizolvã grãsimile şi uşureazã filtrarea.

- 17 -

deschiderile nominale ale sitelor standard corespunzãtoare celor 2 standarde de

numerotare12.

2.2 Examinarea microscopica13

Dupã obţinerea fracţiilor prin diverse metode de separare, pentru completarea

observaţiilor, se va face apoi examinarea la stereomicroscop şi/sau la microscop.

Pentru obţinerea unui preparat microscopic obiectul trebuie secţionat sau

fragmentat la dimensiuni de ~0.1-0.3 mm. Fragmentele astfel obţinute pot necesita

apoi un tratament chimic pentru clarificarea structurii.

Fig. 11. Sigilarea lamelei peste preparatul microscopic.

Agenţii de clarificare utilizaţi au proprietăţi diferite (vezi Anexa 2- reactivi),

cei mai utilizaţi fiind cloralhidratul, glicerina sau parafina. Aceste substanţe au în

general densitate şi vâscozitate mare, ceea ce face ca porii şi canaliculele sã nu

poata fi penetrate prin capilaritate, devenind astfel mai vizibile (rãmân umplute cu

aer şi apar negre) fapt care ajutã la identificare. Pentru clarificarea texturilor mai

dure (ex. cu celuloza, lignina) este necesar un tratament prin hidrolizã acidã iar în

cazul substraturilor proteice, un tratament prin hidrolizã bazicã. Dupã clarificare se

executã preparatul între lamă şi lamelă şi care poate fi apoi examinat la microscop.

12 Vezi pagina 37. 13 Aplicatia nu se refera la examenul histologic cu preparat obtinut la microtom

- 18 -

Pentru fixarea14 lamelei atunci când se efectueazã examinarea repetatã, se poate

prepara un amestec15 de ulei de parafina cu parafină solidã (1 :1) se încãlzeşte la

700 C pe baie de apã pânã la lichefiere şi apoi se aplicã pe marginile lamelei (vezi

figura 11). Pe o lamă pot fi delimitate 2 câmpuri la care se pot aplica agenţi de

clarificare sau colorare diferiţi (de exemplu un câmp pentru reacţia cu iod, etc.) sau

unul dintre cãmpuri va fi cu un preparat de referinţã.

2.3 Reacţii chimice de confirmare

În foarte multe situaţii este utilă colorarea preparatului (vezi Anexa 2 şi

metodele de lucru). Colorarea16 se face pentru deosebirea matricelor cu proprietăţi

diferite, cum sunt grăsimile, cerurile, glucidele complexe, ţesuturi osoase. Pentru

sãrurile minerale existã o serie de teste chimice ale cãror rezultate sunt reacţii

vizibile sau coloraţii specifice ionilor care reacţioneazã. Rezultatul unui singur test

chimic nu va putea fi considerat aplicabil decât în corelaţie cu alte teste şi cu

caracterele microscopice observate. Pentru maximã acurateţe, un reactiv nu va fi

aplicat unui grup de fragmente şi reacţiile vizibile sunt urmãrite sub

stereomicroscop pentru observare imediatã. În acest scop, se pune pe o lamă de

sticlă o picatura de reactiv şi apoi sub stereomicroscop se împinge particula în

picãtura de reactiv (fig. 12) cu ajutorul unei spatule sau pense. Reacţia se noteazã

şi se comparã cu un rezultat cunoscut.

Fig. 12. Efectuarea reactiilor chimice pe lama de examinare

14 Existã mai multe tipuri de montanţi disponibili comercial. 15 Un alt amestec util este combinaţia de glicerina –gelatina. 16 Sunt excluse aici coloratia vitala sau alte tipuri de colorare utilizate în histopatologie

- 19 -

2.4 Numãrãtori efectuate la microscop (stereomicroscop)

Numãrarea presupune trecerea sistematicã peste preparat. În microscopie

acest lucru se realizeaza prin utilizarea lamelor care au câmpuri delimitate pentru

numãrare. Aceste câmpuri au forma de pãtrat (sau câmpuri dreptunghiulare) la

care se cunoaşte exact dimensiunea laturilor. Numãrarea începe de regulã de la

colţurile câmpului şi se face o trecere succesivã în zig-zag pentru evitarea

numãrãrii repetate a aceleiaşi particule (fig. 13) :

Fig. 13. Numãrarea prin trecerea succesivã prin fiecare câmp

2.5 Mijloace de mãsurare

Mãsurarea structurilor, vizualizate la microscop sau la stereomicroscop, este

utilã atât pentru caracterizarea acestora, cât şi

pentru compararea cu preparate de referinţă. Pentru

mãsurare existã oculare care au prevăzut un

micrometru de mãsurare a cãrui scalã gradatã este

vizualizatã prin ocular. Pentru calibrarea acestor

micrometre oculare se utilizeaza micrometrele de masă (sau de câmp). Un astfel de

micrometru este construit sub forma unei plãcuţe metalice (pentru

stereomicroscop) sau din sticlă transparentã (pentru microscopul cu luminã

- 20 -

transmisã) pe care se gãseşte o scalã de 10 mm gradatã la 0.1 mm. Privind prin

ocularul cu micrometru se suprapune imaginea micrometrului peste cea a

micrometrului de masã. Prin comparare se mãsoarã echivalenţa în gradaţii a

micrometrului ocular (fig. 14). Dacã, spre exemplu, s-au numãrat 3 gradaţii de 0,1

mm de pe micrometrul de masã corespunzătoare prin suprapunere la 1 gradaţie pe

micrometrul ocular, rezultã cã pentru fiecare gradaţie de pe micrometrul ocular

corespund 0,3 mm în câmpul vizual.

Fig. 14. Ajustarea micrometrului ocular cu micrometrul de masã

Pentru microscop, o modalitate simplã de calibrare a micrometrului ocular

este utilizarea unei camere de numãrare, care poate fi gãsitã în majoritatea

laboratoarelor medicale. Camerele de numãrare sunt prevãzute cu o reţea de

precizie, la care se cunosc exact dimensiunile orizontale ale ochiurilor reţelei ( de

la 0,05 la 0,25 mm) şi adâncimea (de la

0,1 la 1 mm) ceea ce asigurã

posibilitatea de numãrare pe unitatea

de volum. Cele mai cunoscute camere

de numãrare sunt hemocitometrele

utilizate pentru numãrarea celulelor

sanguine. Hemocitometrele sunt utilizate, în general, pentru mãsurarea şi

numãrarea de particule cu dimensiuni mai mici de 50-100 m. In figura de mai jos

sunt prezentate reţelele de la trei modele de camere de numãrare utilizate pentru

- 21 -

numãrarea şi mãsurarea celulelor, bacteriilor, granulelor de polen, sau a altor

particule de mici dimensiuni.

Fig. 15. Aspectul şi dimensiunile reţelelor la diferite tipuri de hemocitometre

Ocularele de microscop specializate pot fi cu micrometru simplu sau cu reţea.

Micrometrul ocular, la majoritatea modelelor, constã dintr-o scalã de 10 mm

subdivizatã în 8, 10 sau 100 diviziuni. Micrometrele specializate pentru mãsurarea

particulelor sau fibrelor pot avea marcaje ajutãtoare pentru mãsurãtori

bidimensionale. In lipsa micrometrelor se

poate utiliza dimensiunea relativã a câmpului

vizual observat de utilizator, ţinând cont de

puterea de mãrire a obiectivului ales. Cu un

obiectiv de 10 x şi un ocular de 10 x ( total 100

x) diametrul câmpului vizual este de

aproximativ 1600 m (fig. 16). În cazul în care vom trece la un alt obiectiv se

poate face un calcul rapid : spre exemplu la un obiectiv de 40 x (400 x) se va

calcula 100/400 x 1600 = 400 m. În acest caz diametrul câmpului vizual va fi de

~400 m.

- 22 -

Fig. 16. Diametrul aproximativ al câmpului vizual la microscop. Mãsurarea poate fi efectuatã şi pe verticalã (în adâncime) pentru aprecierea

grosimii sau înãlţimii structurii examinate. În acest caz trebuie însã ca partea cea

mai înaltã şi partea cea mai joasã a preparatului sã poatã fi bine focalizate.

Diferenţa de înãlţime se apreciazã pe baza gradaţiilor de pe viza fină ( ~ 3 m)

(vezi fig. 16). Pentru mãsurarea exactã (realã) trebuie cunoscut şi indicele de

refracţie al obiectului, folosind formula de mai jos :

n0

d (real) = d’ (2)

ni

unde : d (real) = grosimea realã a obiectului d’= diferenţa de focalizare (gradaţia de pe viza fină) n0= indicele de refracţie al obiectului ni = indicele de refracţie al mediului dintre lama portobiect şi obiectiv (aer= 1)

Fig. 16. Elementele de mãsurare pe orizontalã şi în adâncime (la două modele de microscop).

- 23 -

În mod particular, structuri de mai mari dimensiuni pot fi mãsurate şi cu

ajutorul vernierelor gradate ( 0,01-0,02 mm) care sunt dispuse pe cele două axe ale

mesei port obiect (fig. 16). Pentru stabilirea reperului vizual în câmpul microscopic

trebuie folosit un ocular cu scalã. Prin deplasarea reperului faţã de obiectul

examinat, se stabilesc puncte pe vernierele gradate ale mesei port-obiect, obţinând

astfel valori de mãsurare.

2.5.1 Mãsurarea microfotograficã

În cazul microscoapelor la care se pot realiza imagini digitale ale preparatelor,

existã posibilitatea efectuãrii de mãsurãtori cu ajutorul programelor dedicate

acestui scop. Atunci când se utilizeazã imaginile digitale trebuie sã se ţinã cont de

puterea de mãrire a ocularului şi respectiv a obiectivului dar mai ales de valoarea

de zoom optic sau digital utilizatã. De preferat este sã se utilizeze capturi de

imagine direct, fără a utiliza capacitatea de mãrire a camerei. In figura 17 este

exemplificat modul de obţinere al imaginii digitale utilizate pentru mãsurare.

Microscoapele la care se ataşeazã camere foto digitale sunt prevãzute cu un un al

treilea tub ocular configurat pentru acest scop. Existã diverse programe pentru

captura şi prelucrarea microfotografiilor. Pentru obţinerea imaginilor utile este

esenţialã stabilirea raportului contrast/luminozitate iar în cazul în care imaginile

trebuie sã fie color este necesar un obiectiv de tip apocromat (vezi tab. 1).

Fig. 17. A –imagine corectã ; B -imagine la care s-a utilizat puterea de mãrire a obiectivului camerei de luat vederi.

- 24 -

2.6. Etapele examinării simple la microscop

Pentru utilizarea mai facila a microscopului, sunt recomandaţi urmatorii pasi de

execuţie :

1. ALEGEREA OCULARULUI ( 7 x 10 x 16 x )

2. ALEGEREA OBIECTIVULUI ( se începe cu un obiectiv mic - obiectiv de 10 x )

3. FIXAREA LAMEI CU PREPARAT PE MASA PORT-OBIECT

4. FIXAREA CONDENSORULUI LA PUTERE MAXIMA

5. SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA ¾

6. PRIVIND IN BINOCULAR SE APROPIE OBIECTIVUL CU VIZA GROSIERA

7. IMAGINEA APARUTA SE CLARIFICA CU VIZA FINA

8. SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA 1/1 (COMPLET)

9. SE REGLEAZA INTENSITATEA LUMINII DIN CONDENSOR (VERTICAL)

10. SE SCHIMBĂ OBIECTIVELE PE RÂND LA 20 x, 40 x

11. IMAGINEA SE CLARIFICĂ CU VIZA FINĂ

- 25 -

GHID DE IDENTIFICARE MICROSCOPICĂ

3.1 Identificarea seminţelor de buruieni şi plante toxice

3.1.1. Cereale şi seminţe furajere întregi

Seminţele de buruieni şi plante toxice constituie impuritãţi botanice

care pot constitui un risc pentru producţia şi sãnãtatea animalelor, atunci

când se gãsesc în dieta acestora. După standardele de stat17, impurităţile sunt

catalogate ca şi corpuri strãine care sunt clasificate în corpuri inerte

(pãmânt, praf, paie, pleavã, etc.) şi amestec de alte seminţe de culturã şi

seminţe de diferite buruieni, etc. Corpurile strãine se determinã cantitativ,

trecând proba printr-un sistem de cel puţin 4 site cu ochiurile de 3.0-2.0-1.0-

0,5 mm în diametru, cantitãţile obtinute prin sitare se cântãresc şi se

exprimã procentual, ca total corpuri strãine şi separat pe tipuri şi mărimi.

Proba luatã în analizã depinde de mãrimea seminţelor (grãunţelor):

pentru cele mari (porumb, mazãre, soia, etc.), proba va fi de 100-200 g,

pentru cele mijlocii (orz, ovãz, secarã, etc.) de 50 g, iar pentru cele mici

(mei, in, etc.) de 10-25 g. Pentru a determina semintele (grãuntele) atacate

de dãunãtori, se asazã proba pe o coala de hârtie, examinând integritatea lor

(cu ochiul liber sau cu stereomicroscopul); cu aceastã ocazie se constatã si

17 Vezi Anexa 5 –Standarde pentru seminte.

- 26 -

prezenta insectelor (si fragmente ale acestora) sau a diferitelor larve in

probã.

Cereale atacate de dãunãtori

In general, se admit urmãtoarele proporţii de corpuri strãine (%), pe clase de

puritate, în functie de tipul seminţelor : Ovaz Orz Porumb Secara

Clasa de

puritate

Corpuri

inerte

Al t e

seminte

Corpuri

inerte

Alte

seminte

Corpuri

inerte

Al te

seminte

Corp uri

inerte

Al t e

seminte

I

1

2

2

2

1

2

1

2

II

1-3

2—4

2—4

2-5

1—2

2-3

1-2

2—3

III

3

4

Article I.

5

2

3

2

3

Seminţele speciilor de plante toxice sau dãunãtoare nu sunt acceptate decât

- 27 -

în limitele maxime indicate in Anexa DC 32/2002/EC. Semintele de

buruieni se vor indica procentual, dupa felul lor (se indicã specia) ca si

proportia de seminţe seci, sistave, sparte, etc., care aparţin culturii de

provenienţã a probei. Acestea din urmã au caracter limitativ ca impuritãţi

vegetale (organice).

3.1.2. Uruieli si amestecuri mãcinate

În general, uruielile au aceleasi însuşiri ca si grãunţele (seminţele) din

care provin, dar uneori survin cauze care le depreciazã, de exemplu, în

timpul uruirii pot pãtrunde în ele corpuri strãine (praf, corpuri metalice,

etc.), pot fi pãstrate in conditii necorespunzatoare, sau chiar pot fi falsificate

prin adãugare de produse calitativ inferioare18. Corpurile strãine (%) indică

puritatea probei. Corpurile metalice pot fi separate şi cu ajutorul

electromagnetilor. In general, suspendarea probei măcinate într-un solvent

(cloroform, tetracloretan) cu densitate mare conduce la separarea sedimentului

concentrat constituit in principal din partea grea a probei care contine corpurile

straine minerale, metalice şi ţesuturile vegetale lignificate. Seminţele de

buruieni, de plante toxice, sporii de mucegai (scleroti, etc.) se identificã prin

examinarea directã, la stereomicroscop, a probei asezatã pe un fond alb.

18 Spre exemplu, adaosul de tarâte sau coji mãcinate.

- 28 -

Mod de lucru general

Domeniu de aplicare

Aceasta procedurã se poate utiliza acolo unde detectarea si identificarea

semintelor, fragmentelor acestora si a altor componente vegetale din amestecuri

furajere, se efectueaza prin examen macro/microscopic pe baza caracterelor tipice.

Echipament si accesorii (Vezi Anexa 1).

Reactivi (vezi Anexa 2).

A. Pregătirea probei

Este necesarã, în prealabil, o foarte bunã omogenizare a probei. Se iau cel putin

500 g de probã care se omogenizeazã cu ajutorul omogenizatorului-divizor.

Din cantitatea omogenizată, o fractie de 5-10 g se întinde în strat subţire pe o foaie

de hârtie si se examineazã cu ochiul liber (de preferinţã in lumină naturalã). Pentru

o examinare mai atentă, se poate utiliza o lupã de birou. În cazul dispersiei de

componente foarte diferite (corpuri străine foarte mari) se efectuează sitarea probei

pe site cu ochiuri cu Ø de la 3-0,1 mm. Fragmentele mari (vizibile cu ochiul liber),

de forme sau culori diferite se selecteazã cu penseta pentru examinarea ulterioara la

stereomicroscop19. Fracţiile de pe site se cântaresc (0.001g) si se noteazã alãturi

de numãrul sitei corespondente (diametrul ochiurilor) pentru a putea fi exprimate

19 Aparatura este listata in Anexa 1.

- 29 -

procentual. În lipsa omogenizatorului20, se iau 200 g proba care se întinde în strat

uniform de cel mult 1 cm înãlţime, pe o coalã de hârtie albã. Proba se

uniformizează cu ajutorul unei rigle sau spatule şi se formatează în formã de pãtrat.

Cu ajutorul riglei se împarte în 16 pãtrăţele aproximativ egale. Se aleg 8 pãtrate în

« sah » care se separã de restul grãmezii si se amestecã. Se repetã operaţiunea pânã

la obţinerea unei probe de aproximativ 200 g.

B. Examinare generalã

Proba omogenizatã se întinde în strat subţire21 pe o tãviţã şi se examinează cu

ajutorul lupei. Seminţele identificate sunt apoi examinate la stereomicroscop unde

se noteazã dimensiunile, culoarea, forma şi aspectul capsulei. La foarte multe

specii ornamentaţia capsulei permite identificarea. Este utilã secţionarea seminţei

longitudinală/transversalã cu ajutorul unui bisturiu sau lame şi separarea stratului

aleuronic ataşat capsulei. Examinarea la microscop22 a capsulei poate da indicaţii

asupra speciei in funcţie de forma şi dispunerea celulelor în straturi. Pentru

fragmentele de seminţe, o micã porţiune de probã (sau fracţia de pe sită) se

amestecă cu puţină apã şi se examinează la stereomicroscop in lumină normală. 20 Sau in prezenta corpurilor straine mari. 21 Stratul nu trebuie sa fie mai gros decât inaltimea a trei seminte suprapuse.

- 30 -

Aceasta examinare poate da informaţii generale despre compoziţia amestecului. De

multe ori se pot identifica astfel fragmente de ţesuturi vegetale, seminţe întregi mai

mici, fragmente lemnoase, etc. În cazul unor componente care necesită

identificare, se face la stereomicroscop caracterizarea generalã prin notarea

dimensiunilor, culorii, texturii şi a consistenţei. Este esenţială cunoaşterea

caracterelor seminţelor plantelor de culturã pentru a putea face diferenţierea între

acestea şi seminţele nedorite.

Teste chimice orientative23

Prezenţa seminţelor toxice se poate stabili şi prin probe de culoare

orientative: o probã mãcinatã (sau uruialã) se introduce intr-un balon

Erlenmeyer, iar peste ea se introduce un amestec de 100 parti alcool etilic

(70°) si 5 parti acid clorhidric; amestecul se fierbe, se agitã si se lasa apoi în

repaus pentru sedimentare ; culoarea lichidului se va modifica dupa felul

semintelor de plante toxice continute; dacã proba nu contine seminte toxice,

lichidul de deasupra este incolor sau slab gãlbui, dacã contine cornul secarii,

lichidul are culoarea cãrnii, dacã conţine seminte de Agrostema githago, sau de

Lolium temulentum, lichidul de extracţie are culoarea oranj. Se mai poate

efectua şi examenul de flotaţie cu cloroform, în care semintele se stratificã

diferit, dupã greutatea lor. Pentru aceasta, se introduce o cantitate de 2-5 g

proba într-o eprubetã, se trateazã cu cloroform, se agitã eprubeta, apoi se lasã

pentru sedimentare; neghina (Agrostema githago), fiind grea, cade la fundul

eprubetei sub formã de particule de culoare neagrã; cornul secãrii (Claviceps

spp.) rãmâne la suprafatã, tot sub formã de particule de culoare neagrã; alte

seminte se situeaza la nivele diferite, avind culori diferite, astfel cã pot fi

separate si identificate.

22 Cu coloratie sau pentru examen in lumina polarizata. 23 Vezi Anexa 3.

- 31 -

Pentru a determina nisipul, praful sau alte particule de origine mineralã, se

trateazã proba, într-o eprubetã, cu solutie de clorura de zinc, apoi se agitã.

Corpurile inerte vor cadea la fundul eprubetei, iar particulele organice rãmân la

suprafata ; dupa decantare se separã depozitul de nisip, se usuca, se cântãreste

si se exprimã procentual. Nisipul se mai poate determina astfel : se ia o.proba

de circa 20 g uruieli, se introduc într-un pahar înalt si îngust, se trateazã cu apã,

pâna la înãltimea de 3/4 din pahar; se agita apoi continutul cu o baghetã de

sticlã si dupã decantare se îndepãrteazã cu atentie apa tulbure; se repetã

operatia de spãlare pânã se obtin ape limpezi, reziduul mineral se usuca, se

cântãreste si se exprimã procentual.

În cazul particulelor de mici dimensiuni sau a celor rezultate din fragmentarea

unei piese mai mari se fac preparate pe lama pentru examenul la microscop. In

acest caz dimensiunea particulelor trebuie sa fie ajustata la mai putin de 0.1-0.3

mm. Examenul la microscopul compus se face în luminã normalã (filtru albastru)

si cu dispozitivul de contrast. Textura observată (celule, formaţiuni structurale,

etc.) se poate caracteriza suplimentar prin teste chimice efectuate pe preparat.

Pentru identificarea amidonului, pe lama de examinare la microscop se aşează la

una dintre margini (la nivelul îmbinării cu lamela) o picătură de soluţie de iod(5) si

se examinează din nou preparatul. Granulele de amidon vor fi colorate in albastru-

albastru inchis, celuloza din fragmente in galben iar proteinele in galben –maroniu.

Identificarea amidonului, spre exemplu, intr-o probă mãcinatã de seminţe de

oleaginoase24, indicã prezenţa altor seminţe. Toate detaliile observate sunt notate.

În acelasi mod se face testul cu solutie de KOH(10). Tratamentul alcalin produce

gelatinizarea granulelor de amidon, dizolvă proteinele şi saponifică grăsimile. În

acelaşi timp accentuează coloraţia roşietică produsă de taninul din ţesuturi şi

clarifică preparatul. Dacă acest tratament nu este suficient pentru clarificarea

preparatului, se utilizează tratamentul cu agent de clarificare I (3) pentru 2-3 ore sau

o cantitate redusă de probă se amestecă cu agentul de clarificare II (4) se încãlzeşte 24 Semintele de oleaginoase nu contin amidon.

- 32 -

uşor pe lamã şi apoi se examineazã. Pentru separarea substanţelor celulozice, se

macerează proba cu amestec de clorat de potasiu-acid azotic (11) şi se încălzeşte

timp de 20-30’. Celuloza brută se deosebeşte de substanţele de infiltrare (lignina,

suberina) prin adãugare de soluţie proaspãt preparată de iod (13) unei fracţii de

probă umezită in prealabil. Substratul celulozic se va colora în albastru iar

substanţele de infiltrare in galben.

Substantele grase, răşinile, uleiurile, cerurile din componenţa celulelor

vegetale, vor fi colorate în roşu prin tratarea probei cu soluţie de Sudan IV(14) si 2-

3 picături de soluţie de cloral-hidrat(4) urmată de o uşoară încălzire. Un test

suplimentar constă in tratarea separată a probei cu eter de petrol şi cu alcool etilic.

Eterul dizolvă grasimile, cerurile sau răşinile. Alcoolul dizolva, de regula, uleiurile

esentiale si rasinile dar are efect redus asupra grasimilor si cerurilor. Pentru

evidentierea taninurilor sau a tesuturilor impregnate cu tanin, se efectueaza testul

cu acetat de fier(12) sau clorura ferica(12). In ambele cazuri culorile dezvoltate sunt

verde sau albastru.

Examenul în fluorescenţă

Pentru examenul în fluorescenţă se utilizează stereomicroscopul şi

microscopul compus. Tehnica de iluminare a preparatului poartă numele de epi-

fluorescenţă şi se rezumă la observarea culorii fluorescente după excitarea

preparatului cu o lumină ultravioletă incidentă. Utilizarea tehnicii de examinare in

fluorescenţă poate fi foarte utilă pentru stabilirea originii ţesuturilor examinate sau

identificarea tipurilor de seminţe. Foarte multe structuri ale ţesuturilor vegetale, în

special cele de depozitare, prezintă fenomenul de autofluorescentă la tratamentul

cu reactiv Schiff25. Este foarte importantă alegerea corecta a colorantilor utilizati

tinând cont de structurile care vor fi evidentiate. Astfel, pentru colorarea

proteinelor sunt utilizate safranina, eozina, fucsina acida, acridin orange,

acriflavina, pentru colorarea lipidelor se utilizeaza Rosu si Albastrul de Nil, Sudan, 25 Col. PAS -Vezi anexa cu reactivi.

- 33 -

verde luminos, iar pentru colorarea amidonului Rosu de Congo, acidul periodic,

solutia Lugol, etc. Culorile obtinute la colorarea acestor structuri trebuie sa fie bine

cunoscute pentru a putea face caracterizarea corectă a preparatului.

Porumb- sectiune endosperm colorata PAS-Verde luminos (CL26, 200 x)

Detalii -structura endospermului (in stanga) are colorate granulele de amidon (fuchsia) intr-o

matrice proteica (verde inchis) in timp ce embrionul (dreapta) contine majoritatea lipidelor

miezului si foarte putine proteine

26 CL= examen in câmp luminos

- 34 -

Ovãz - secţiune endosperm colorată Roşu de Congo (FL27, 200 x)

Detalii -se remarcă autofluorescenţa compuşilor fenolici în stratul aleuronic (dreapta-albastru) si

coloraţia roşie a endospermului datorată ß-glucanilor (stânga)

Ovãz - secţiune endosperm colorata acriflavina-HCl (FL, 200 x)

Detalii -acidul fitic care se găseşte predominant în stratul aleuronic generează coloraţia roşie-

portocalie (stânga)

27 FL =examen in fluorescenta

- 35 -

Orz - secţiune endosperm colorată PAS-albastru Evans (CL, 400 x)

Detalii -granulele de amidon din endosperm sunt colorate în roşu-închis iar pereţii celulari sunt

coloraţi în albastru

- 36 -

Caractere morfologice identificabile

În cazul seminţelor întregi, nedecorticate, este esenţială compararea

caracterelor morfologice generale. Aceste caractere sunt: dimensiunea (lungime,

latime, diametru), forma seminţei, aspectul şi tipul ornamentatiilor28 de pe

suprafaţa cuticulei. După stabilirea atentă a acestor caractere se poate face

compararea cu mostre sau imagini ale preparatelor de comparaţie29.

Dacă se lucrează cu fragmente de seminţe trebuie stabilit gradual dacă este

vorba de un ţesut vegetal30 şi nu de un artefact, apoi se face şi examinarea la

microscop. Pentru examinarea la microscop este utilă examinarea în lumina

polarizată sau, ca alternativă, efectuarea unei coloraţii. Cele mai multe informaţii

sunt obţinute de la fragmentele de cuticulă, respectiv din epidermă, mezocarp şi

stratul aleuronic. Distribuţia şi forma celulelor care constituie aceste straturi oferă

28 La unele specii datorita ornamentatiilor caracteristice identificarea poate fi facuta direct. 29 Ghid de identificare a semintelor de buruieni (CD-R). 30 Vezi si testele chimice

- 37 -

mai multe informaţii decât examinarea structurilor, de cele mai multe ori amorfe,

ale endospermului sau cotiledonului.

Structura seminţei la monocotiledonate - în dreapta imagine la microscop a

endospermului şi a embrionului (200 x , CL, PAS - Verde luminos)

- 38 -

Structura seminţei la dicotiledonate – in dreapta secţiune transversală a seminţei la

stereomicroscop (12,5 x)

Bob de orz– aspectul in secţiune transversală si detaliu al endospermului şi

stratului epidermic (col. PAS)

- 39 -

Bob de orez– aspectul în secţiune transversală şi detaliu al endospermului şi

stratului epidermic (col. PAS)

Bob de grâu – aspectul in secţiune transversală şi detaliu al endospermului şi

stratului epidermic (col. PAS)

- 40 -

Bob de ovãz – aspectul în secţiune transversală şi detaliu al endospermului şi

stratului epidermic (col. PAS)

- 41 -

Examen în lumină polarizată (100 x)-cuticula (familia Euphorbiaceae) Stânga –Ricinus communis dreapta – Jatropha curcas

Examen în lumină polarizată (200 x)-cuticulă (şi strat aleuronic) Stânga –Crotalaria spp. dreapta – Camelina sativa

Examen in lumina polarizata (100 x)-cuticula (fam. Brassicaceae)

- 42 -

Stânga –Brassica juncea dreapta – Brassica nigra

Examen microscopic -cuticula si strat aleuronic

Stânga –lolium temulentum (200 x) dreapta – Lolium remotum (100 x)

Examen in lumina polarizata (400 x)-Claviceps purpurea

(Periteciu cu asce)

- 43 -

Speciile de buruieni si plante toxice (impuritati botanice) din Anexa DC

2002/32/EC1

1. Ricinul (Ricinus communis L.)

Ricinul este o plantă originara din India şi face parte din familia Euphorbiaceae.

Are o mare variabilitate de areal si aspect, astfel cã poate fi gãsit sub formã de

arbore, de 10-12 m înãltime în zone

tropicale sau de 3-5 m în ţările

mediteraneene, în timp ce în zonele

nordice, unde este cultivat mai mult ca

plantã de ornament, are aspect de arbust.

Fructele sunt trilobate, cu suprafata

tepoasã, de culoare verde sau rosie. In

fiecare lob se dezvolta o samânta mare cu

suprafata cu aspect marmorat. Ricinul

1 Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n° L 140 of 30/5/2002,

- 44 -

este cultivat si in scop comercial pentru uleiul nevolatil (90% acid ricinoleic)

extras prin extractie cu solventi din seminte sau prin presare.

Producţia de seminţe de ricin în scopuri industriale (1,05 Mt) este

preponderentă în

India şi China şi

mai puţin

importantă in

Brazilia. Uleiul2 de

ricin este folosit de

foarte mult timp ca

purgativ dar are si multe alte utilizări comerciale, cum sunt fabricarea maselor

plastice, textile, vopsele sau cosmetice. Ricinul are toxicitate ridicata din cauza

continutului în ricin, o glicoproteină hidrosolubilă foarte concentrată in

endospermul semintelor3 dar prezenta in cantitati mai mici si in celelalte portiuni

ale plantei. Este considerat unul dintre cele mai puternice toxice naturale4. Există o

mare variabilitate în privinţa sensibilitătii la toxină.

2 Uleiul ca atare nu este foarte toxic, semintele macinate intregi contin toxina. 3 Insotita de un alcaloid (ricinina). 4 Actioneaza prin inactivarea ribozomilor .

- 45 -

Cabalinele prezintă cea mai mare sensibilitate, cu

doza letală (p.o5) de 0.1 g/kg mc, apoi celelalte

specii de fermă cu doza letalã de 1-2 g/kg mc

(p.o) cu exceptia caprinelor la care aceastã dozã

ajunge la 5,5 g/kg mc. Toate animalele de fermã

si cele de companie, sunt vulnerabile. Seminţele

sunt toxice numai dacă învelişul extern (cuticula)

este îndepărtată. Seminţele înghiţite intacte trec prin tubul digestiv, în general, fără

incidente. Simptomele pot apare chiar şi după 18-24 ore de la ingerare. Acestea

debutează cu stare depresivă, uşoară hipertermie, după care predominã tulburãrile

gastrointestinale, voma, diaree profuzã, colica abdominalã. Animalele afectate

manifestă apoi convulsii, colaps circulator si apoi moartea la aproximativ 36 ore de

la consum. Mecanismele principale sunt iritatia gastrointestinala, anafilaxia şi

socul.

2. Purghera (Jatropha curcas L.)

Jatropha curcas este o plantă din familia

Euphorbiaceae, ca şi ricinul, cunoscută

pentru potentialul toxic. Este originara

din America centrala dar este cultivata pe

scara larga in tarile tropicale. Creşte sub

formă de arbust sau arbore de 5-6 m

înaltime. Fructele uscate complet se desfac

in trei valvule dintre care cel putin doua

contin câte o singura samanta alungita, de

culoare neagra. Planta, inclusiv semintele,

este utilizata pe scara larga pentru diferite

5 Administrare orala (per os)

- 46 -

scopuri casnice si in medicina traditionala. Utilizarea comerciala a uleiului prezinta

un interes mai scazut, desi proprietatile sunt similare celui de palmier. Semintele

contin ca principiu activ, curcina, care este o glicoproteina similara ricinului si are

un mod de actiune asemanator. La om

simptomatologia consecutiva ingerarii semintelor

este asemanatoare celei asociate iritatiei

gastrointestinale. Debutul este brusc cu dureri

abdominale puternice, senzatii de arsura la circa

30 minute dupa ingerare, urmate de diaree

(uneori hemoragica) si deshidratare accentuata. In unele cazuri apar si tulburari

cardiovasculare si ale sistemului nervos central. Se considerã cã 2 seminte pot avea

un puternic efect purgativ in timp ce 4-5 seminte pot produce moartea subiectului.

Intoxicatiile produse la animale sunt cunoscute în practica veterinara in zonele

unde creste planta. Studiile efectuate asupra toxicitatii orale ale J. curcas au aratat

ca exista diferente de sensibilitate între speciile de rumegatoare. Vacile care au

primit 0.25-1 g/kg furaj au murit in interval de 19 ore de la administrare, in timp ce

caprele care au primit aceeasi doza au murit in intreval de 7-21 zile. Nu a fost

stabilita o relatie directa cu capacitatea citotoxica in aceste cazuri sau posibilitatea

de metabolizare a substantei active, continuta de seminte, in metaboliti mai mult

sau mai putin toxici. Furajarea pasarilor cu seminte fierte de J. curcas produce

întârziere in crestere, pierdere in greutate, modificari metabolice (cresterea

nivelului de creatinina serica) si mortalitate proportionala cu cresterea procentului

de seminte în dietã.

3. Croton (Croton tiglium)

Este o planta din familia Euphorbiaceae, cu un areal larg, din India pânã în Noua

Guinee, nordul Indoneziei si China. Poate fi gasita sub forma de arbust sau arbore

de peste 12 m. Fructele au forma triangulatã (trilobata) si contin 3 seminte. Este

mai putin toxica decât genurile descrise mai sus.

- 47 -

Substanta toxica majoritara din compozitie este reprezentata de crotin6 cu un mod

de actiune asemanator cu cel al ricinului. Simptomatologia este determinata de

actiunea iritanta gastrointestinala si purgativa. Uleiul de croton este produs

comercial în cantitãti reduse, în special in India, sursa principala de seminte

comercializate fiind regasita în nordul Indiei.

Planta are si unele proprietati terapeutice folosite în medicina traditionala. In

Europa poate fi gãsita ca plantã ornamentalã.

6 Nume generic pentru un grup de glicoproteine cu toxicitate variabila.

- 48 -

4. Crotalaria spp7. (Crotalaria spectabilis, Crotalaria giant)

Denumita şi buruiana „plesnitoare”8, este o

plantă anuală, perenã, de 1,5-2 m, cu fructe

asemănătoare cu mazãrea, cu multe seminţe

care, atunci când sunt uscate, produc zgomotul

de unde şi denumirea plantei. La începutul

secolului trecut, mai multe specii9 de

Crotalaria au fost duse din Africa în SUA

pentru a fi utilizate pentru controlul eroziunii

solului, ca îngrasamânt vegetal, ca sursa de

azot, etc10.

Aceasta activitate a fost discontinuă dar în acest mod plantele au fost diseminate pe

teritoriul tãrii, iar semintele care patrund in culturile de cereale pot produce

intoxicatii animalelor de ferma.

Dintre acestea, cel mai puternic afectate sunt pãsãrile. Crotalaria spp. nu creste in

Europa decât ca rezultat al cultivarii. Posibilitatea de a contamina soia (respectiv

fãina de soia) importata din SUA in Europa este motivul includerii acestui gen in

anexa Directivei.

7 Laur porcesc (pop.) 8 In engleza rattlebox sau rattleweed (rattle=sunãtor, zanganit) 9 De fapt peste 600 de specii dintre care au fost identificate 6-7 specii cu potential toxic pentru animale. 10 In India sunt folosite in medicina traditionala pentru tratarea scabiei

- 49 -

Dintre speciile existente, Crotalaria giant striata si Crotalaria spectabilis au un

potential toxic mai ridicat. Plantele si semintele sunt toxice in egalã mãsurã prin

continutul de monocrotalinã11, un alcaloid hepatotoxic prezent în întreaga plantã.

Consumul de C. spectabilis de catre gãinile ouãtoare duce la scaderea rapida a

ouatului si cresterea mortalitatii

Clinic, intoxicaţia se manifestă prin mişcări dezordonate şi dezorientare. La

examenul necropsic se constată rupturi hepatice (sau hemoragii de suprafaţă în

stadiile incipiente), hemoragie internă şi acumulare de lichid în cavitatea

abdominală12. In cazul hrănirii experimentale cu seminţe măcinate s-au putut

11 Este alcaloidul (pirozilidinic) majoritar alaturi de fulvina si crispatina 12 In unele cazuri apare ciroza hepatica.

- 50 -

observa efecte adverse la un conţinut de 0.01-0.1 % în dietã, în timp ce la un

continut de 0.3 % apare mortalitate. Procente in dietă mai mici de 0.05 % reduc

sever ouatul şi procentul de eclozionare.

5. Camelina sativa (L.) Crantz (in fals, lubit)

Camelina este o plantă din familia Brassicaceae, cultivata in Europa încã din epoca

bronzului pentru uleiul extras din seminte si ca sursa de fibra vegetala. A fost

cultivata pe scara larga dar productia comerciala a fost înlocuitã cu introducerea

uleiului de rapita. Uleiul are proprietati asemanatoare cu ale uleiului de in13 si are

un continut mai scazut de glucozinolat14 decât speciile de Brassica. Acest din urma

aspect favorizeaza chiar utilizarea semintelor (faina) in hrana animalelor15. Nu este

foarte clar motivul pentru care aceasta planta, tinând cont de cele de mai sus, a fost

inclusa in anexa Directivei. Unul din motive ar putea fi faptul că atunci când inul

(Linum usitatissimum) era cultivat pe scară largă in Europa, această plantă era o

buruiana comună atât în culturile de in cât si in cele de cereale. In consecintă,

Camelina sativa a fost considerată nedorită in amestecurile de cereale si probabil

acesta este unul dintre motivele includerii in anexă.

13 Contine acid linolenic 30-40%, acid eicosenic 15% si acid erucic <4% compozitie asemanatoare celui de in 14 Referitor la speciile alimentare. 15 In afara glucozinolatilor (care se gasesc in mai multe specii de Brassica) nu contine alte substante cu potential toxic pentru animale.

- 51 -

6. Semintele de mustar16

Familia de plante cunoscute sub numele generic de „mustar” cuprinde mai multe

specii si subspecii17 ale acestora. In aceasta grupa sunt incluse rapita18 (canola) si

mustarul dar acestea sunt denumiri comerciale si nu stiintifice. Familia

„mustarului” este de fapt Brassicaceae19 (Cruciferae) si este una dintre cele mai

bogate, cu peste 40 de genuri si peste 200 de specii salbatice si cultivate.

Taxonomia speciilor listate in anexa a fost revizuitã, astfel cã în prezent, nu existã

distinctie între diversele subspecii de Brassica juncea. In consecinta, subspeciile

denumite „Indian”, „brun”, „chinezesc” sunt considerate simple varietati de

Brassica juncea iar mustarul „sareptian” apare ca un termen a cãrui existentã este

legatã doar de contextul directivei.

6.1. Brassica juncea (L.) –(mustar indian, chinezesc sau brun)

16 In directiva : „mustard seeds” 17 Unele dintre acestea sunt considerate varietati in cadrul speciei. 18 Brassica rapa.( sin. B. campestris) si Brassica napus 19 Genul reprezentativ este Brassica spp.(spre exemplu mustarul salbatic Sinapis arvensis face parte din aceeasi familie)

- 52 -

Este o plantă perenã de 1-1,5 m provenită din incrucisarea Brassica nigra cu

Brassica rapa. Locul de origine este considerat sud-vestul Indiei si Asia unde

distributia naturala a celor doua specii s-a suprapus. Inainte de 1940 B. juncea a

fost considerata inferioara B. nigra pentru obtinerea mustarului dar din 1940 a fost

importata din China o noua varietate20 de B. juncea care a devenit larg cultivata21.

Continutul de substante toxice este reprezentat, ca importantă, de sinigrina (2-

propenil-glucozinolat) care după hidroliza enzimatică (mirozinaza) se transformă

în alil-izotiocianat22. Sinigrina se regãseste în întreaga plantã cu variaţii de continut

in timpul diferitelor faze de vegetatie si culminând cu acumularea in seminte pe

timpul formării si maturării acestora.

Conţinutul mediu de alil-izotiocianat din B. juncea este de 0,9 % (0,25-1.4 %). In

urma hidrolizei enzimatice rezultã şi alti compuşi volatili (metil, butil, benzil) dar

20 Cu seminte galbene 21 Spre deosebire de B. nigra, aceasta putea fi recoltata mecanizat. 22 Lichid volatil cunoscut ca “ulei de mustar”

- 53 -

în concentratii foarte mici. Alil-izotiocianatul este foarte iritant si are efect

rubefiant si vezicant asupra tesuturilor. In experientele pe celule ovariene (linie

celulara de hamster chinezesc) s-a demonstrat un efect citotoxic de 1000 de ori mai

mare23 decât glucozinolatul. Izotiocianatii produc hipotiroidism24 la animalele de

experienta iar sinigrina induce aberatii cromozomiale in vitro. In exeperientele de

furajare, efectuate pe oi, cu concentratii de 10 mmol/ zi, administrate in furaje

granulate la discretie, s-a constatat reducerea consumului dietei si cresterea

nivelului de -glutamil-transpeptidazã, ceea ce indicã leziuni hepatice.

6.2. Brassica nigra (mustar negru)

Este o plantã cu crestere rapida, atingând dimensiuni de pânã la 4 m care produce

seminte de culoare brun închis pânã la negru (~1 mm ). Originea speciei nu este

cunoscutã exact dar se presupune cã provine dintr-un nucleu mediteranean. Este

larg rãspânditã în sudul si centrul Europei si este o buruianã frecventã atât în

culturi cât si în locuri virane. O treime din masa semintelor de mustar negru este

constituitã din ulei al cãrui continut mediu de acid erucic este de 40%.

Ca si celelalte specii, contine sinigrinã si implicit alil-izotiocianat ca principii

toxice. In afara sinigrinei contine si o proteina termostabila cu rol de factor

antitriptic.

23 Are activitate citotoxica semnificativa la mai putin de 1 g/ mL 24 Gusa endemica sau hipotiroidismul se manifesta prin hipertrofia tiroidei.

- 54 -

6.3. Brassica carinata (mustar etiopian)

Este un hibrid natural rezultat din B. nigra si B. oleracea25, originarã din Etiopia

unde este cunoscutã ca sursa verde si pentru uleiul obtinut din seminte. Este o

plantã foarte rezistenta la seceta si temperaturi înalte. Ca si celelate specii descrise

anterior, semintele au un continut important de glucozinolat. Planta a reprezentat la

un moment dat o sursa de ulei de uz nealimentar, în Europa si Canada. Uleiul din

semintele de B. carinata are un continut ridicat (~50 %) de acid erucic.

7. Madhuca26 (Madhuca longifolia (L.) Machr.)

Madhuca longifolia este un arbore cu coroana largã si foarte densã, cultivat în zone

cu clima caldã pentru uleiul continut de semintele sale. Din punct de vedere

taxonomic, nu se mai face distinctie, conform

anexei din directiva, între Madhuca longifolia

si Madhuca indica, astfel cã, acum, acestea

sunt considerate sinonime. Uleiul din seminte,

care este un ingredient uzual în grasimile

hidrogenate utilizate în India, contine acid oleic

(46.3 %) si acid linoleic (17.9 %) ca si acizi

grasi nesaturati alãturi de acid palmitic (17.8

%) si acid stearic (14.0 %) dintre cei saturati.

Semintele degresate contin 29.4 % proteina si

9.8 % saponine27. La acest nivel de

concentratie, saponinele sunt componenta toxicã actionând iritant asupra mucoasei

digestive si prin hemolizã. Detoxifierea prin tratament termic reduce foarte mult

digestibilitatea, nefiind o metodã practicã. In schimb, prin macinare si extractie cu

solventi (2-propanol) se reduce foarte mult concentratia de saponine iar fãina astfel

25 B. oleracea – exista 3 varietati : varza, conopida si gulia. 26 Alte denumiri : Mahua, mowrah, bassia. 27 Termenul este derivat de la Saponaria officinalis plantã utilizata din vechime pentru calitãtile sale de sãpun. Saponinele sunt glicozizi care se gãsesc în multe alte plante (Agrostema githago, Helleborus niger, Aesculus hippocastanum, Asparagus officinalis, etc.)

- 55 -

rezultatã constituie o valoroasã sursã proteicã28. Includearea turtelor neprocesate în

proportie de 20 %29 în hrana vacilor lactante nu afecteazã consumul hranei,

digestibilitatea, productia de lapte, compozitia acestuia.

Fãina de seminte neprocesate este de asemenea bine toleratã de cãtre vacile

lactante. Nu existã suficiente date despre furajarea cu seminte netratate sau fãina

acestora, a altor specii de fermã în afara rumegãtoarelor. In orice caz, prezenta

saponinelor toxice este nedoritã si ca atare si prezenta semintelor de Madhuca

longifolia nu trebuie sa depãseasca nivelele de tolerantã ale rumegãtoarelor.

8. Prunus armeniaca (cais, zarzãr) si Prunus dulcis var. Amara (migdal)30

28 Pentru alimente si furaje. 29 Din total substanta uscata 30 Inclusiv Prunus virginiana

- 56 -

Familia Rosaceae include multi copaci fructiferi inclusiv caisul si migdalul, la a

cãror sâmburi face referire anexa. Plantele din aceasta familie contin în frunze,

seminte si radacini, glicozide cianogenice, dintre care, amigdalina31 este cel mai

frecvent si mai important din punct de

vedere cantitativ. Amigdalina are o

toxicitate proprie destul de redusã. Aceasta

se manifestã numai când sâmburii fructelor

sunt zdrobiti pentru ca sã fie posibilã

activitatea enzimelor care hidrolizeaza

amigdalina. In prima fazã a hidrolizei, care

este efectuatã de o ß-glicozidazã specificã,

rezultã prunasina32 iar apoi prin

intermediul altei ß-glicozidaze specificã prunasinei, rezultã mandelonitril si

glucozã. Mandelonitrilul (aglicon) este mai apoi metabolizat cu o liazã specificã la

4-hidroxi-benzaldehidã si HCN33. Nu s-a putut încã stabili un nivel sigur pentru

cantitatea de glicozide cianogenice34 ingeratã, în mare parte datoritã lipsei de

informatii toxicologice, cu exceptia HCN pentru care existã mai multe studii

efectuate si informatii. In principal, HCN conduce la scãderea nivelului de

utilizare a oxigenului tisular, provocând anoxia histotoxicã35. Toate mamiferele

sunt sensibile la intoxicatia cu HCN, doza minimã letalã fiind de ~ 2 mg/kg mc36.

In general rumegatoarele sunt mai sensibile decât monogastricele.

31 D-mandelonitril- gentobiozid (agliconul este mandelonitrilul) 32 D-mandelonitril-D-glucozid 33 Migdalele pot contine peste 250 mg HCN/100 g seminte. 34 Aceste substante (inclusiv acidul cianhidric) se gasesc de altfel si in multe nutreturi care compun obisnuit dieta animalelor de ferma (anumite furaje verzi, leguminoase, sorg, etc.). In acest sens, in anexa este mentionat un nivel permis de concentratie pentru HCN in anumite materii prime si nutreturile combinate. 35 Anoxia rezultã din inactivarea citocromoxidazei de cãtre HCN, care se combinã cu Fe3+/Fe2+ din enzimã. 36 Unitate de masã corporalã.

- 57 -

Subprodusele industriale de la prepararea

fructelor uscate, conservate, producerea de

gemuri, erau utilizate pentru adaus în hrana

animalelor. Crescãtorii, nutritionistii si

producãtorii de nutreturi combinate cunosc

riscurile utilizãrii de astfel de subproduse

la care, s-a renuntat în prezent.

9. Fagus silvatica37 – (ghindã si jir)38

In aceastã categorie sunt incluse fructele si semintele arborilor de pãdure cum sunt

fagul (Fagus silvatica) sau stejarul (Quercus robur) utilizate pentru hrana

traditionalã a porcilor. Aceste produse erau folosite prin administrare în ratie sau

pãsunare directã, în sistem de crestere traditional, pentru porcii la îngrasat, pentru

pãsãri sau cãprioare.

Resturile rãmase dupã extragerea uleiului din ghindã erau utilizate pentru

fabricarea de turte pentru furajarea animalelor. Semne de intoxicatie au fost

raportate atunci când s-au utilizat turte cu un continut ridicat de coji, administrate

la discretie.

37 In anexa directivei apare doar Fagus silvatica dar pentru ca se mentioneaza ghinda si jirul împreunã, am facut referire si la Quercus robur (stejar). 38 In anexa sunt mentionate fructele întregi (nedecorticate)

- 58 -

Cauza realã a intoxicatiilor nu este cunoscutã dar se presupune a fi datoratã

prezentei saponinelor. In mod special, caii sunt mai sensibili, dar majoritatea

cazurilor semnalate au implicat rumegãtoare. In amestecurile furajere se verificã

existenta fructelor nedecorticate.

10. Lolium temulentum L. (raigras, zâzanie)

Intoxicatia cu aceasta specie este cunoscutã la animale39 încã din secolul XIX prin

contaminarea fãinii. Extractele de seminte administrate experimental pe cale oralã

si intraperitonealã la soareci produc sindrom de depresie gradualã a sistemului

nervos central, cu comã si moarte prin sincopã respiratorie. Semintele de Lolium

temulentum contin lolina40 (alcaloid pirolizidinic), 6-metil lolina si lolinina41.

39 Se cunosc cazuri si la om 40 In 1985 a fost identificata temulina care s-a dovedit mai târziu un artefact de izolare. 41 Studiile de toxicitate individualã asupra alcaloizilor au demonstrat o slabã toxicitate iar efectele asupra SNC se obtin prin efect cumulat al mai multor alcaloizi.

- 59 -

Partea aerianã a plantei contine lolina si un alcaloid cu nucleu fenantrenic,

perlolina. Originea alcaloizilor a fost un timp necunoscutã dar acum se stie cã

lolina (alcaloid insecticid) este invariabil produsã în simbiozã42 cu fungi din genul

Neotyphodium. Astfel, a fost demonstrat cã Neotyphodium uncinatum produce, în

mediu minimal si în absenta plantei, lolina, N-acetil-norlolina si N-formil-lolina si

cã acesti alcaloizi nu sunt sintetizati ca rãspuns al plantei la infestare43.

11. Lolium remotum Schrenk

Introducerea acestei specii în anexa se datoreazã unui sindrom de pãsunat,

predominant neurologic, care apare în sudul si vestul Australiei. Acesta debuteazã

ca urmare a consumului de cantitãti mari de seminte cu gale44 de L. remotum

infestat cu un nematod (Anquina agrostis) si o specie de bacterie Clavibacter

toxicus45. Amestecul de toxine cuprinde 8 glicolipide a cãror actiune se manifestã

si exeprimental, la miei, cu simptome clinice si leziuni ale creierului. Dozele mai

mici, care nu produc intoxicatia, au efect asupra productiei oilor, în special asupra

dezvoltãrii lânii. L. remotum în absenta semintelor infestate nu prezintã pericol

pentru animale iar relevanta in Europa a sindromului

australian este nedemonstratã.

12. Datura stramonium (ciumãfaie)

Aceastã specie este cunoscutã de foarte mult timp pentru

proprietãtile sale toxice46,47. Principalele substante active

din compozitia plantei sunt alcaloizi tropanici: atropina,

hiosciamina si scopolamina48. Continutul maxim de

alcaloizi se regãseste în tulpinã si frunzele plantei

(majoritar hiosciamina) si mai putin în seminte. Actiunea 42 Valabil pentru genurile Lolium spp. si Festuca spp. 43 Un exemplu similar este cazul Festuca spp. in cazul infestãrii cu Acremonium coenophialum 44 Noduli infestanti formati pe suprafata semintelor 45 Initial a fost descrisã ca o tulpina de Corynebacterium. 46 Una dintre denumirile traditionale americane face referire la moartea unor soldati britanici in sec XVII intoxicati cu D. stramonium. 47 Si datorita proprietatilor halucinogene (sunt mentionate si cazuri de delir datorate consumului de miere toxicã provenitã din specii de Rhododendron, Datura stramonium şi Hyoscyamus niger ) 48 Se gasesc si în Atropa belladonna si Hyoscyamus niger.

- 60 -

toxicã este datoratã antagonismului competitiv cu acetilcolina la nivelul

receptorilor muscarinici centrali si periferici. Receptorii periferali sunt la nivelul

glandelor exocrine, muschilor netezi si cardiac. In urma intoxicatiei se produc

paralizii iar consecutiv efectului asupra sistemului nervos central (ca amine

tertiare) rezultã sindromul anticolinergic central, manifestat cu psihozã acutã si

delir. Aceste substante se absorb rapid prin mucoasa gastricã si intestinalã. Timpul

de înjumãtãtire al atropinei este de ~ 4 ore, prin metabolizarea hepaticã (hidrolizã)

se reduce jumãtate din cantitatea initialã iar restul este eliminat nemodificat prin

urinã. Intoxicatia prin pãsunare directã este mai rar întâlnitã la animale pentru cã

din cauza gustului neplãcut, rareori animalele consumã suficient material vegetal

ca sã producã intoxicatia. La rumegãtoare mari se manifestã prin excitabilitate

nervoasã, tremor si dezorientare. La rumegãtoarele mici (oaie si capra) pe lângã

simptomele de la rumegãtoarele mari, se mai constatã instabilitatea trenului

posterior si cãderi bruste.

Cele mai multe cazuri de intoxicatie se produc prin administrarea de fân sau alte

furaje cultivate pentru masa verde, care contin D. stramonium.

- 61 -

Ocazional a fost detectatã ca si contaminant în soia49 din recolte provenite din

America de Sud.

13. Claviceps purpurea (ergot50, cornul secarei)

Genul Claviceps51 cuprinde specii de fungi foarte specializati care paraziteazã

partea floralã a unor pãioase. Pe timpul parazitãrii, ovarul52 florii este înlocuit cu o

structurã fungalã numita sfacelã din care în timp se dezvoltã sclerotul53. In timpul

dezvoltãrii acestuia, sporii, denumiti conidii, sunt amestecati cu un lichid de

secretie siropos, cu continut ridicat de zaharuri, asemanator cu mierea, care atrage

insectele si poate realiza în acest fel diseminarea sporilor. Majoritatea speciilor de

Claviceps paraziteazã specific o specie de plantã cu exceptia C. purpurea care se

poate dezvolta pe mai mult de 200 specii de plante. Sclerotii multor specii de

Claviceps contin alcaloizi toxici pentru om si animale. Unele substante sunt

utilizate si in scop farmaceutic54 (ergotamina, ergometrina) datoritã efectelor

exercitate asupra vaselor sanguine, asupra musculaturii netede, etc. Este larg

rãspândit în lume, în special în zonele temperate unde sclerotii se pot dezvolta mai

bine55. Impactul economic asupra culturilor este de mai micã importantã. Dintre

toate speciile cel mai bine cunoscut este C. purpurea cu denumirea comunã de 49 Se mai poate întâlni Datura ferox L. care are acelasi continut toxic. 50 Ergot este un termen general utilizat pentru toate speciile de Claviceps. 51 Claviceps purpurea, Claviceps africana, Claviceps sorghi, etc. 52 Ovarul se afla situat la partea inferioara a pistilului (pistilul are doua componente :stigmatul si ovarul) 53 Sclerotul este un tesut fungic dur si compact (dimensiunile sale sunt de câteva ori mai mari decât samânta gazdã (dimensiunea sclerotului este diferentiata in functie de dimensiunile semintelor).. 54 Inaintea obtinerii de culturi pure in scopuri industriale, ergotul a fost cultivat pe secarã (Secale cereale) 55 Sclerotii nu se dezvoltã bine in zone cu clima foarte caldã (nu germineaza).

- 62 -

ergot (cornul secarei). Limita toleratã în culturile de cereale variazã de la 0.3 %

pentru secarã, la 0.1 % în grâu sau ovãz. Concentratii mai mari influenteazã

calitatea recoltelor. Sclerotii de C. purpurea au aspect alungit, drept sau curbat, de

1-4 ori dimensiunea semintei gazdã, cilindrici pe sectiune si cu capete rotunjite.

Culoarea tipicã la exterior este neagrã, cu variatii de la rosu-închis la negru. In

interiorul sclerotului culoarea peretilor este de la alb la gri cu aspect rugos. Pe

suprafatã se pot observa conidii uscate de culoare gri deschis. Conidiile sunt ovale,

hialine si au dimensiuni de 4-6 x 2-3 m.

- 63 -

- 64 -

- 65 -

14. Seminte de buruieni, fructe nemãcinate si nedecorticate

Aceastã categorie, care poate cuprinde multe specii de plante, este inclusã în anexa

directivei si oferã o anumitã flexibilitate în cuprinsul listei impuritãtilor botanice,

dar este deschisã unor interpretãri. Asa cum am mentionat anterior, spre exemplu,

în cazul saponinelor56 sau acidului cianhidric57, chiar unele ingrediente obisnuite

ale nutreturilor contin astfel de substante iar în altã ordine de idei, toate plantele

vasculare contin „glicozide”. In consecintã, în aceastã categorie generalã se pot

include buruieni si plante toxice care sunt specifice florei locale58. In acest scop,

trebuie întocmitã o listã de plante care se pot regãsi în mod obisnuit printre furajele

verzi si semintele de culturã si care pot constitui un factor toxic sau un factor

limitativ pentru sãnãtatea si nutritia animalelor. Aceastã listã trebuie sã fie la

dispozitia fiecãrui laborator oficial care executã analiza botanicã sau decelarea

impuritãtilor botanice microscopic identificabile. La punctele 1-13 sunt descrise o

serie de specii, cu continut toxic, specii dintre care unele exotice. Pe plan local

existã însã si unele buruieni, unele nocive, altele nedorite (necomestibile) ca

impuritãti în culturi sau furaje verzi si care vor fi incluse la acest punct.

Plantele necomestibile sunt cele cu tulpini lignificate, cu diametru de peste 5

mm, aspre, cu ghimpi, cu ariste, etc., cum sunt: Xanthium spinosum, Cyrsium

56 Vezi si pct. 7 –Madhuca longifolia si notele de subsol 57 Vezi si pct. 8 –Prunus armeniaca si notele de subsol 58 In afara impuritatilor listate in anexa directivei exista si alte plante (intregi sau seminte ale acestora) specifice tarii, care sunt considerate nedorite in standardele de calitate interne.

- 66 -

arvense, Sonchus oleraceus, Rumex sp., Salvia sp., Lepidium sp., Equisetum sp.,

ca si cele care provoacã leziuni sau ulceratii, cum sunt Bromus tectorum, Setaria

verticillata, Holcus lanatus, Stipa pennata, Stipa capillata, etc.

Aceste genuri si specii trebuie identificate si cuantificate ca plante întregi

sau portiuni ale acestora în furajele verzi sau uscate. Ocazional, se pot gãsi si

semintele acestora în cereale59. Unele plante influenteazã negativ calitatea

productiei animalelor, prin modificarea gustului si mirosului normal, cum sunt

Arthemisia absinthium, Matricaria chamomilla, Alliaria officinallis, Lepidium

draba, pentru lapte sau Allium ursinum pentru carne.

Plantele nocive contin substante toxice (alcaloizi, toxalbumine, etc.) care pot

provoca uneori chiar moartea animalelor. Unele dintre acestea contin substanta

activã în tulpini, frunze si flori, cum sunt Veratrum album si V. nigrum, Datura

stramonium, Hyosciamus niger, Solanum nigrum, Xanthium strumarium, Cicuta

virosa, Colchycum autumnale, Euphorbia sp., etc. iar altele au fructe si seminte

otrãvitoare, cum sunt Lolium themulentum, Papaver rhoeas, Agrostemma githago,

Delphinium consolida, etc.

59 De regulã sunt specii care se gãsesc în fânete si nu în culturile de cereale.

- 67 -

ANEXA 1.1

TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI VEGETALE

Test Reactie vizibila Rezultat posibil Observatii Agent de clarificare I şi II (3,4)

Prin incalzire uşoara este clarificată structura matricei

Diferenţiere tesut vegetal/osos

Parafina (ulei) (16) Prin flotaţie porii răman umpluţi cu aer Structuri reticulare cu spaţii mari, secţiuni medulare, etc.

Este util pentru retele sau canale capilare

1. coloraţia matricei albastru –violet

Amidon

2. coloraţia matricei galbenă Celuloza

Testul cu iod/iodura(5)

3. coloraţie galben-portocaliu/maron Proteine

Natura proteinelor nu se poate preciza

Hidroliza cu clorat/acid azotic(11) şi testul cu iod(13)

1. Coloraţie albastră 2. Coloraţie galbenă

Celuloza Substanţe de infiltrare –lignina, suberină

Testul cu floroglucinol(20) Coloraţie rosie Lignina

1. Gelatinizarea substructurilor

Granulele de amidon sunt gelatinizate

Favorizează examinarea altor structuri

Hidroliza cu KOH(10)

2. Preparatul se clarifică şi capată coloraţie rosietică

Taninuri din substrat

Testul cu actat sau clorura ferica(12)

Coloraţie verde / albastră Taninuri din substrat

Coloratie cu Sudan IV(14) Coloraţie rosie Substante grase, raşini, ceruri, uleiuri

- 68 -

3.2 ŢESUTURI ANIMALE şi MINERALE DIN FURAJE

Domeniu de aplicare

Acest ghid se va utiliza acolo unde este necesara identificarea şi diferenţierea

componentelor minerale şi animale (fragmente de oase, cristale de sare, fosfaţi,

carbonaţi, etc.) din amestecuri furajere, prin examen microscopic pe baza

caracterelor tipice sau testelor de confirmare.

Echipament şi accesorii (Vezi Anexa 1) .

Reactivi (vezi Anexa 2)

A. Pregatirea probelor

Este necesara o buna omogenizare a probei globale inainte de examinare. Se

cantăresc cca. 10 g (± 0.001 g) de furaj într-un pahar Berzelius de 100 ml şi se

completeaza la 1/3 cu CHCl3(1). Se amesteca conţinutul cu o bagheta şi se lasă în

repaus 1 minut. Fracţia flotabila (care poate conţine fragmente de ţesuturi, fibre

musculare, păr, pene, etc.) se separă cu o spatulă de pe suprafaţa lichidului intr-o

placa Petri ( Ø = 9 cm) şi se evapora solventul pe o baie de apa. In funcţie de

aspectul probei se poate filtra şi apoi se concentreaza solventul. Dupa uscare se

siteaza reziduul pe site de dimensiuni adecvate dimensiunilor particulelor (0,4, 0,6,

0,8, 1,0). Dupa separarea fracţiei flotabile, sedimentul concentrat (care contine

fragmente de oase, minerale sau fragmente vegetale lignificate) este reluat cu

CHCl3 şi trecut cantitativ pe o hartie de filtru uscata şi tarata în prealabil. Hartia de

filtru cu reziduul se usucă la aer şi apoi la etuva la 103 ±20 C timp de ½ - 1 oră.

Dupa acest interval se răceşte în exsicator şi se cantăreşte ((± 0.001 g). Prin

diferenţa fată de tara hartiei goale se determina masa reziduului.

B. Examinare

B.1. Particule organice

Fracţiile individuale de pe site se examineaza la stereomicroscop (25 x -50 x)

cu iluminare frontală sau laterală la unghi de cca. 450 cu filtru albastru. Suportul

- 69 -

de examinare poate fi sticla mata sau hartie albastră. Se noteaza aspectul

particulelor, forma, culoarea, consistenta, rezistenta la presiune. Pentru comparare

se recomandă folosirea mostrelor de referinţa.

Fragmentele mici din reziduul trecut prin site, se examinează şi la microscop

(100 x -400 x) cu condensatorul reglat la putere mica şi cu filtru albastru. Pe lama

de examinare, cu un strat foarte fin de reziduu se adauga 2 picaturi de agent de

clarificare (I) (3) şi se examineaza sistematic (vezi anexa 2.1). Se adaugă apoi pe

lama 1 picatura sol. iod (5) şi se reexaminează :

- particulele de amidon sunt colorate în albastru-pal pana la negru,

- drojdiile sau alte celule proteice sunt colorate pânã la maro inchis.

Daca este necesar se poate incălzi o mica cantitate din reziduu cu cca. 5 ml agent

de clarificare (II)(4) . Dupa răcire se pun 1-2 picaturi pe o lama microscopica, se

acopera cu lamela şi se examinează la microscop.

B.2. Particule minerale

Din preparatul obţinut la pct. A se colectează fracţia care sedimenteaza (care

conţine particulele minerale), se indepartează solventul prin uscare şi se trece

sedimentul uscat pe site de dimensiuni diferite (pct. A).

Se face examinarea la stereomicroscop (50 x). In general oasele de animale,

peşte, solzi de peşte şi fragmente de cochilii sunt identificabile. Formaţiunile

anorganice (minerale) pot fi recunoscute pe baza formelor acestora.. De exemplu,

cristalele de sare sunt de regula cubice şi pot fi colorate, calcitul (CaCO3) are

forma romboedrică, ( vezi anexa 2.2). Deoarece forma cristalelor nu este

intotdeauna identificabilă (stare amorfa) se efectuează şi teste chimice de

recunoastere.

C. Teste de confirmare60

Particulele de origine necunoscută (neidentificabile vizual) se aşeaza cu o

pensetă pe o placa Petri şi se sparg cu atenţie prin presarea usoară pe o suprafaţă

planã. Lucrând sub stereomicroscop, se separă fragmentele la 1-2 cm distanţa intre 60 în funcţie de natura particulelor pot fi efectuate teste adiţionale de recunoaştere

- 70 -

ele. Lânga fiecare fragment se aşează o picătură de reactiv iar apoi se împinge cu

penseta fragmentul în mijlocul picăturii, urmărind modificările (vezi anexa ) care

au loc la contactul cu reactivul. De preferinţa, sub placa se aşeaza o foaie de

culoare neagra pentru o mai buna vizibilitate. Lumina este preferabil sã fie naturală

sau se utilizează filtrul albastru, în cazul iluminării laterale. Testul preliminar

trebuie efectuat cu AgNO3 (6) care poate indica prezenţa clorurilor şi a fosfaţilor şi

face diferenţa de structurile osoase. Este preferabil ca testele cu soluţii de acizi sã

fie efectuate ca variantă suplimentară.

D. Calcul şi evaluare

In cazul în care estimarea cantitativă este necesară se va proceda conform acestui

punct. Estimarea cantitativă se poate face global (% de oase şi minerale) sau pe

grupe de componente ( ex. % de particule minerale sau % de particule osoase) :

R x 100

(a) Reziduu de …………. ( %) =

M

unde : R = masa fracţiei (g) de reziduu din sedimentul concentrat

M = masa probei (g)

- 71 -

ANEXA 2.1 TESTE DE CONFIRMARE PENTRU MINERALE2

61 ( toti fosfaţii reactionează dar fosfaţii mono- şi dicalcici se evidenţiază cu AgNO3)

Test Reactie vizibila Rezultat posibil Observatii

1. Cristalele devin albe şi au tendinţa de

expansiune

probabil sare (clorura)

2. Cristalele capată culoarea galbenă şi apar

excrescenţe aciculare galbene

fosfat dicalcic

3. Se formează ace de culoare albă, solubile

sulfaţi de Mn sau Mg

Testul cu AgNO3 (6)

4. Particulele devin incet negre fragmente de oase

1. Efervescenţa puternică CaCO3 Testul cu HCl (2)

2. Lipsa efervescenţei sau de mica intensitate se efectueaza testele

următoare

Testul cu molibdat (7)

1. Formare de cristale galbene la mica distanţa

de particulã

fosfat tricalcic, orice os sau

roca fosfaticã 61

1. Particulele dezintegrate flotează şi devin de

culoare roz-rosietica

proteine

2. Particulele dezintegrate flotează şi devin de

culoare roz-rosietică şi se decolorează în cca. 5

min.

fosfaţi din os

3. Particulele se umflă dar ramân în partea

inferioară

rocă fosfatica defluorinată

Testul Millon (8)

4. Particulele se dizolva incet rocă fosfatică

Testul cu H2SO4 (9)

1. Se formeaza cristale aciculare, lungi la

adăugare de acid sulfuric la soluţia acidă

(HCl) a particulei

prezenţa calciului.

Testul cu

CH COOH(17)

1. Particulele se dizolva cu efervescenţa CaCO3

2. Particulele nu se dizolva (dar se dizolva în

HCl)

Oxalat de calciu

Testul cu

KOH/KClO3(10,11)

1. Particule rezistente la acţiunea reactivilor Cărbune sau cochilii

calcinate

- 72 -

ANEXA 2.2

MODELE CRISTALINE CaCO3 (Calcit) CaCO3 (Aragonit) NaCl Oxalat de calciu Fosfat monocalcic Fosfat tricalcic

MgSO4 CaSO4

- 73 -

3.3 ŢESUTURI ANIMALE DIN FURAJE Domeniu de aplicare

Această metodă se va utiliza acolo unde detectarea constituenţilor de origine

animală (definiţi ca produse de la procesarea carcaselor sau părţilor acestora, de la

mamifere, pasãri sau peşti) din furaje, se efectueaza prin examen microscopic.

Constituenţii de origine animală sunt identificaţi pe baza caracterelor microscopice

tipice ( ex. fibre musculare, părţi de oase sau cartilaje, fire de păr, sânge, coaja de

ou, oase de peşte ,etc.). In cazul în care se cere şi o apreciere cantitativă a acestor

constituenţi, se vor urma instrucţiunile de la subcapitolul Calcul al acestui material.

Sensibilitate

In funcţie de natura constituenţilor (< 0.1 %)

Echipament şi accesorii (Vezi Anexa 1) .

Reactivi (vezi Anexa 2)

A. Pregătirea probei

Este necesară o foarte bună omogenizare a probei globale. Aglomerarile sau

granulele se mojarează usor sau se mărunţesc în moară cu cuţit la turaţie mică

(1500-2000 r.p.m.) timp de ~10 sec. In funcţie de natura materialului ( numai dacă

este necesar se mărunţeste) se iau cel putin 10 g de probă care se impart în două

fracţii, una de cel puţin 5 g pentru partea filtrată (pe site) şi una de cel putin 5 g

pentru sedimentul concentrat. Colorarea şi clarificarea cu reactivi este

recomandată pentru identificare (vezi anexa 3.1)

B. Examinare:

Identificarea constituenţilor de natură animală în filtrat

O cantitate de min. 5-10 g din probă este trecuta prin site ( 0,1-2 mm) în cel puţin

două fracţii. Fracţia cu dimensiuni >0.5 mm (sau o parte reprezentativa din fracţie)

se intinde în strat subţire pe un suport adecvat şi se cauta componenţii de origine

- 74 -

animală la stereomicroscop cu diferite puteri de mãrire (cel mult 50 x). In stratul(-

urile) cu <0.5 mm se caută componenţii de origine animală la microscopul compus

cu obiective diferite . Preparatul se execută prin fragmentarea şi clarificarea

particulei selectate iar examinarea se face intre lamă şi lamela. Clarificarea se face

iniţial cu parafină lichidă sau glicerină iar daca nu este suficient pentru

identificarea structurilor, clarificarea se efectueaza cu soluţie de cloralhidrat (3-4).

Identificarea constituenţilor din sediment concentrat

Se iau cel puţin 2 g (cântarite cu precizie 0.001 g) din proba se introduc într-un

flacon sau intr-o pâlnie de separare şi se adauga 15 ml de CHCl3. Dupa

omogenizare, se agită conţinutul de mai multe ori şi apoi se lasă în repaus (cel

puţin 1’ şi nu mai mult de 2-3’) pentru depunerea sedimentului.

Se decantează supernatantul şi sedimentul este uscat la etuva şi cântarit repetat

pâna la masa constantă (0.001g). Cântarirea este necesara numai în cazul în care

se face o apreciere cantitativă. Sedimentul se examineaza în intregime sau cota

parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop şi la microscop .

C. Calcul şi evaluare

În cazul în care estimarea cantitativă este necesară, se va proceda conform

acestui punct. Calculul poate fi făcut doar dacă constituenţii conţin fragmente de

oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere şi pasãri)

pot fi deosebite de oasele de peşte prin examen microscopic, pe baza vizualizării

lacunelor tipice. Proporţia de constituenţi de origine animală se poate calcula

ţinând cont de :

-proporţia estimată (masa %) de fragmente osoase din sediment, şi

-proporţia (masa %) de oase în constituenţii de origine animală identificaţi.

Estimarea se face pe bază a cel putin trei (daca este posibil) pâna la cinci câmpuri

pentru un strat. In nutreţurile combinate, de regula, sedimentul nu conţine numai

fragmente de oase, dar şi alte componente cu greutate specifica mare, de exemplu

minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate sau alte componente asemănătoare.

Calculul procentual al fragmentelor de oase

- 75 -

S x c

(b) Fragmente de oase % =

(animale terestre) W

S x d

(c) Fragmente de oase şi solzi % =

(peşte) W

(S =masa sedimentului [mg], c62= factor de corecţie [%] pentru

estimarea procentului de oase animale în sediment, d= factor de

corectie [%] pentru estimarea procentului de oase de peşte şi solzi în

sediment, W=masa probei prelucrata pentru sedimentare {mg).

Estimarea valorii pentru constituenţi de origine animală

Proporţia de oase în produsele animale este variabilă. In cazul făinii de oase

procentul este de 50-60% iar în cazul făinii de carne de 20-30%; la făina de peşte

procentul de oase şi solzi este variabil în funcţie de specie, în general de 10-20%.

Daca se cunoaste specia de la care provine produsul, se poate calcula conţinutul

estimat:

Conţinut estimat de constituenţi de la animale terestre (%)

S x c

= x 100

(i) W x f

Conţinut estimat de constituenţi de peşte (%)

S x d

= x 100

- 76 -

(ii) W x f (S =masa sedimentului [mg], c63= factor de corecţie [%] pentru

estimarea procentului de oase animale în sediment, d64= factor de

corecţie [%] pentru estimarea procentului de oase de peşte şi solzi în

sediment, f = factorul de corecţie pentru proporţia de oase din

constituenţii de origine animală din probă, W=masa probei prelucrată

pentru sedimentare [mg]).

Exprimarea rezultatelor :

Pot exista urmatoarele situaţii :

La capacitatea de identificare la microscop, nu există constituenţi de origine

animală (asa cum sunt definiţi la pct. în proba analizată

La capacitatea de identificare la microscop, există constituenţi de origine animală

în proba analizată. In acest caz , raportul examinarii poate fi specificat astfel:

In funcţie de experienţa analistului :

-Exista constituenţi de origine animală. Continuţul de fragmente de oase

(peşte/animale terestre)

-In cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de la

pasãri sau mamifere, este estimat un ordin de mãrire de ….%, egal cu ….%

constituenţi animali când se calculeaza în baza a ….% oase în constituenţi animali

utilizând factorul de corecţie f,

-sau, au fost gasiţi constituenţi de origine animală în cantitaţi măsurabile.

Pentru situaţiile când oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuie

sa conţină date suplimentare, astfel :

-Posibilitatea ca următorii constituenţi sã fie derivaţi de la mamifere, nu poate fi

exclusă;

Aceasta clauza nu este necesară daca fragmentele de oase de la animale terestre au

fost identificate ca aparţinând pasãri lor sau mamiferelor.

63 Factor de corecţie estimat de către analist în sediment 64 Factor de corecţie estimat de către analist în sediment

- 77 -

Recomandări

Se recomandă ca, în cazul constituenţilor voluminoşi şi în cantitate mare,

sedimentul obţinut la filtrare sã fie împărţit în doua fracţii (de exemplu utilizarea

unei site cu ochiuri de 250 m [ 0.3]). Fracţiunea cu constituenţi voluminoşi poate

fi examinată ca preparat cu ulei de parafină iar fracţiunea cu particule fine trebuie

examinată la microscop.

Sedimentul concentrat, dacă este necesar, poate fi divizat mai departe utilizând un

agent de concentrare cu densitate mai mare sau poate fi examinat prin spălari

succesive cu apă şi cloroform (sau clorură de metilen).

În funcţie de experienta analistului, identificarea originii poate fi fãcutã utilizând

un preparat specific histologic, prin care se face compararea cu preparatul probei.

ANEXA 3.1

TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI ANIMALE65

Test Reactie vizibila Rezultat posibil Observatii Agent de clarificare I şi II (3,4)

Prin incalzire usoară este clarificata structura matricei

Diferenţiere ţesut vegetal/osos

Parafina (ulei) (16) Prin flotaţie porii raman umpluţi cu aer

Structura osoasa

Testul Bradford(15) Reactiv specific pentru proteine –coloraţie albastră

Structuri proteice (ţesut muscular/osos)

1. coloraţia matricei albastru –violet

Amidon

2. coloraţia matricei galbenă Celuloza

Testul cu iod/iodura(5)

3. coloraţie galben-portocaliu/maron

Proteine

Testul Millon(8) Coloraţie roz la incălzire usoară Componente osoase

Testul pt. cistina(18) Coloraţie neagra/maronie la incălzire usoară

Constituenţi cu cistina –păr, fanere

65 A se compara şi cu Anexele 1.1 , 2.1, şi 2.2 pe timpul lucrului

78

ANEXA 1

APARATURA SI MATERIALE PENTRU MICROSCOPIE

Stereomicroscop cu iluminare ( 15-20 W) laterala/frontală şi transmisă cu filtre pentru

vizualizare –albastru (pentru culoarea naturală), verde (pentru fluorescenţă), alb mat

(antireflexie). Oculare necesare : 10 x (cu rigla de măsurare), 16 x, 32 x. Obiective

stereo: 1 x şi 1,6 x.

Microscop compus, binocular inclinat , lumina transmisă (30-100 W), condensor

reglabil, dispozitiv contrast. Oculare necesare : 7 x, 10 x. Obiective apocromatice : 6 x,

10 x, 20 x, 40 x şi pentru imersie 90-100 x.

Balanţa analitică ( 0,001 g)

Site circulare inoxidabile cu diametrul ochiurilor de la 5 mm – 0,1 mm şi vas de captare.

Moara electrică de laborator cu cuţit ( turaţie utila de la 1000 la 5000 rpm)

Mojar cu pistil pentru omogenizarea probelor cu solvenţi

Placi Petri de Ø = 90-150 mm

Lame de sticla standard pentru microscopie şi lamele

Placi de plastic transparent (55 x 100 mm) pe care se traseaza cu un vârf ascuţit linii

paralele (4,5 mm) la distanţa de 2 mm.

Spatula şi microspatule

Pensete –dreapta şi curba cu vârfuri ascuţite şi plate, bisturiu sau cutter

Micropipete ( volum util 5-200 L)

Pipete cu volum util de 1, 5, 10 mL

Centrifuga de laborator ( 6 x 10 mL) 1000-7000 rpm

Lampa UV -365 nm (15-30 W)

Lampa de examinare (150 W mat).

Sticlărie de laborator : eprubete, pahare Berzelius ( 100, 300, 800 mL), pahare

Ehrlenmeyer (100, 300 mL cu slif şi dop), pâlnii de separare (100-500 mL), pâlnii de

filtrare.

Hârtie de filtru (porozitate medie şi mica) Watman nr. 40-42.

- 79 -

ANEXA 2

REACTIVI66 PENTRU MICROSCOPIE 1) CHCl367 p.a.

2) HCl diluat (1:1) : 1 parte HCl + 1 parte apă

3) Agent de clarificare (I) : amestec de 10 g cloralhidrat/ 10 ml apa/ 10 ml glicerina

4) Agent de clarificare (II) : amestec de 160 g cloralhidrat în 100 ml apa + 10 ml HCl

5) Iod solutie: 0,75 g KI + 0,1 g I2 în 30 ml apă la care se adaugă 0,5 ml HCl (1:1)

6) AgNO3 soluţie 10 % în apă

7) Molibdat de amoniu soluţie : 10 g molibdat + 100 ml HNO3 se completează la 1000 ml.

8) Reactiv Millon (conţine azotat mercuric)

9) H2SO4 diluat (1:1) : 1 parte H2SO4 + 1 parte apa

10) KOH soluţie 5 %

11) KClO3 : se amestecă 0,5 g KClO3 cu HNO3 (diluat 1:1)

12) Fe(CH3COO)3 sau FeCl3 soluţie 1 % în apă (se prepară extempore)

13) Iod soluţie : ZnCl2 100 g se amestecă cu 60 ml apă în flacon cu dop la care se adaugă 20 g

KI şi 0.5 g I2. Se adaugă cateva cristale de I2 în amestec pentru saturare şi se lasă în repaus

14) Sudan IV soluţie alcoolică aprox . 0.09 %

15) Reactiv Bradford (utilizat pentru detectarea proteinelor)

16) Parafina (ulei)

17) CH3COOH diluat (1:1) : 1 parte CH3COOH + 1 parte apa

18) Reactiv pentru cistină ( 2 g acetat de plumb + 10 g NaOH se dizolva în 100 ml apa)

19) Rodamina 6G soluţie alcoolică 0,5 %

20) Floroglucinol soluţie : se amestecă 8 g floroglucinol cu 20 ml HCl concentrat şi se

completeazã la 100 ml cu alcool etilic.

21) Medii utilizate pentru obiectivele de imersie (recomandate glicerina şi uleiul de cedru)

66 In funcţie de natura componentelor identificate se pot folosi şi alţi reactivi care pot servi la identificarea matricei. 67 Se poate utiliza şi tetracloretan (d= 1,62)

Mediu lichid nd Apertura Glicerina 1.47158 1.35 Ulei de cedru 1.51525 1.40 Anisol 1.5163 1.40 Monobrom-naftalena 1.65820 1.60

- 80 -

ANEXA 3

STANDARD

ISO

STANDARD USA

DESCHIDERE NOMINALA

Ø (inch)

DIAMETRU NOMINAL AL FIRELOR SITEI

Ø (mm) 12.5 mm a 68 ½ in.a 0.500 2.67

11.2 mm 7/16 in 0.438 2.45 8.5 mm 3/8 in 0.375 2.27 8.0 mm 3/16 in 0.312 2.07 6.7 mm 0.265 in. 0.265 1.87 6.3 mm ¼ in.a 0.250 1.82 5.6 mm Nr 3½ 0.223 1.68 4.75 mm Nr 4 0.187 1.54 4.00 mm Nr 5 0.157 1.37 3.35 mm Nr 6 0.132 1.23 2.80 mm Nr 7 0.111 1.10 2.38 mm Nr 8 0.0937 1.00 2.00 mm Nr 10 0.0787 0.900 1.70 mm Nr 12 0.0661 0.810 1.40 mm Nr 14 0.0555 0.725 1.18 mm Nr 16 0.0469 0.650 1.00 mm Nr 18 0.0394 0.580 850 m Nr 20 0.0331 0.510 710 m Nr 25 0.0278 0.450 600 m Nr 30 0.0234 0.390 500 m Nr 35 0.0197 0.340 425 m Nr 40 0.0165 0.290 355m Nr 45 0.0139 0.247 300 m Nr 50 0.0117 0.215 250 m Nr 60 0.0098 0.180 212 m Nr 70 0.0083 0.152 180 m Nr 80 0.0070 0.131 150 m Nr 100 0.0059 0.110 125 m Nr 120 0.0049 0.091 106 m Nr 140 0.0041 0.076 90 m Nr 170 0.0035 0.064 75 m Nr 200 0.0029 0.053 63 m Nr 230 0.0025 0.044 53 m Nr 270 0.0021 0.037

68 Aceste dimensiuni nu sunt standardizate dar sunt incluse pentru cã sunt utilizate frecvent

- 81 -

BIBLIOGRAFIE

1. *** Council Directive 1999/29/EC of 22 April 1999 on the undesirable

substances and products in animal nutrition (E.C.O.J. n° L 115 of 04/05/1999,)

2. *** Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7

May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n° L 140 of

30/5/2002, p. 10).

3. Abdel-Fattah, M., Rizk, A.M. and Hussiney H.A. 1991. Chemistry and toxicity

of Lolium species. In: Poisonous Plant Contamination of Edible Plants (eds. Rizk

A.F.M. and Hussiney H.A.), pp. 95-106. CRC Press Inc, Baton Rouge, USA.

4. Adeyemi, O.A., Balogun, M.O. and Fasina, 2001. Response of finishing

broilers to graded levels of boiled Jatropha seeds , Ind. J. Anim. Sci. 71, 800-803.

5. Ahmed, O.M.M. and Adam, S.E.I. 1979. Effects of Jatropha curcas on calves.

Vet. Pathol. 16, 476-482.

6. Astwood E.B., Greer, M.A, Ettlinger, M.G. (1949): J. Biol. Chem. 181, 121.

7. Basu, A.K., Ghosh, A. and Dutta, J. 1973. Fatty acid composition of mustard

(Brassica nigra) seed oil by gas-liquid chromatography. J Chromatogr.86, 232-

233.

8. Berkov, S. and Philipov, S. 2002. Alkaloid production in diploid and

autotetraploid plants of Datura stramonium. Pharm. Biol. 40, 617-621.

9. Blankenship, J.D., Spiering, M.J., Wilkinson, H.H., Fannin, F.F., Bush, L.P.si

Schardl, C.L., 2001. Production of loline alkaloids by the grass endophyte,

Neotyphodium uncinatum, in defined media. Phytochem. 58, 395-401.

10. Budin, J.T., Breene,W.M. and Putnam, D.H. 1995. Some compositional

properties of camelina (Camelina sativa L. Crantz) seeds and oils. J. Am. Oil

Chem. Soc. 72, 309-315.

- 82 -

11. El Dirdiri N.I., Wasfi I.A., Adam S.E.I.. Toxicity of Datura stramonium to

sheep and goats. Vet. Hum. Toxicol. 23, 242-246, (1981)

12. Fenwick, G., Heaney, R. and Mullin, W. 1983. Glucosinolates and their

breakdown products in food and food plants. CRC, Crit.Rev. Food Sci. Nutr. 18,

123-201.

13. Gao, Z.C., Jiang,Y.X., Li, J.F., Hou, S.S., Li, J. and Liu, X.M. 1989.

Performance of growing-fattening pigs fed with glandless cottonseed meal.

Chinese oeJ.Anim. Sci. 25 , 13-16.

14. Rangkadilok, N., Nicolas, M.E., Bennett, R.N., Premier, R.R., Eagling, D.R.

and Taylor, P.W.J. 2002. Developmental changes of sinigrin and glucoraphanin

in three Brassica species (Brassica nigra, Brassica juncea and Brassica oleracea

var. italica). Scientia Horticulturae, 96, 11-26.

15. Dini Luciana , Food microscopy/microstructure, Dipartimento di Scienze,

Universita de Lecce, 2000.

16. B. Herman and J. J. Lemasters (eds.), Optical Microscopy: Emerging Methods

and Applications. Academic Press, New York, 1993,