Download - Studiul genelor
-
7/24/2019 Studiul genelor
1/46
Sindrom plurimalformativ
Dismorfie cranio-facial Hidrocefalie Despictur palatin, an. mandibulei
Erupie congenital a dintelui Anomalii sceletice
Scolio! "ertebre sacrale concrescute Anomalii ale oaselor ba!inului,
#icior str$mb congenital, polidactilie Hirsutism #seudoermafroditism Anomalii viscerale
-
7/24/2019 Studiul genelor
2/46
-
7/24/2019 Studiul genelor
3/46
-
7/24/2019 Studiul genelor
4/46
-
7/24/2019 Studiul genelor
5/46
Sindrom plurimalformativ
Dismorfie cranio-facial Hidrocefalie Despictur palatin, an. mandibulei Erupie congenital a dintelui
Anomalii sceletice
Scolio! "ertebre sacrale concrescuteAnomalii ale oaselor ba!inului, #icior str$mb congenital, polidactilie
Hirsutism #seudoermafroditism Anomalii viscerale %ariotip &',((
) *bservaie de sindrom Cornelia de Lange
-
7/24/2019 Studiul genelor
6/46
Sindrom Cornelia de Lange
Gena NIPBL 5p13.1-14.2 Mutaii diferite
del Missens ra!es"ift Non-sens
#efe$te de spli$ing %ste ne$esar un test N pentru a identifi$a
!odifi$area geni$' $are a produs sCdL sau ae($lude sCdL
-
7/24/2019 Studiul genelor
7/46
%um identificm gena +#
#ire$t !olarea AD+-ului pacientului /i secvenierearegiunii genomice 0p12.1-1&.3
#%4 cu primeri specifici fiecrui tip de mutaie
cunoscut a genei +# 45#s cu E4 specifice secvenei genei +# /idepistarea mutaiilor ce afectea! S4
5SH cu sonde complimentare genei +#
Anali!a A4+m /i6sau proteinei +#Indire$t #%4 cu primeri specifici mini- sau microsateliilor
7nvecinai cu gena +#
45#s
-
7/24/2019 Studiul genelor
8/46
Metode deMetode de anali)'anali)'a genelora genelor
-
7/24/2019 Studiul genelor
9/46
&nali)a genelor
*e$+eniere
PC,
*out"ern-lot
iridare in situ
N Proteine&,N
Nort"ern-lot
,/0PC,
iridare in situ
estern-lot
*e$+eniere
&nali)a fun$iei
&nali)a"isto$"i!i$'
-
7/24/2019 Studiul genelor
10/46
tili)area te"ni$ilor de anali)' atili)area te"ni$ilor de anali)' aa$i)ilor nu$lei$i n !edi$in'a$i)ilor nu$lei$i n !edi$in'
&nali)a N depistarea mutaiilor genice 8 diagnostic precis al bolilor genetice
9prenatal, postnatal precoce:;
identificarea polimorfismului individual 8 depistarea predispo!iiei
la anumite boli;
identificarea polimorfismului individual 8 dactiloscopie genomic9anali!a filiaiei:;
depistarea AD+ strin 9bacterian, viral: 8 diagnosticul bolilor
infecioase /i gradului de infectare.&nali)a &,N!
anali!a e
-
7/24/2019 Studiul genelor
11/46
inerea , 0 frag!entelor de restri$ie prin a$iuneaspe$ifi$' a %, 6en)i!elor de restri$ie7
-
7/24/2019 Studiul genelor
12/46
RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z
-
7/24/2019 Studiul genelor
13/46
8i)uali)area N
Colorarea spe$ifi$' 8i)uali)are $u sonde !ar$ate
u(in'a)i$'
6in situ7
Bro!ur' de
etidiu69n geluri7
luores$ente6re$i7
,adioa$ti+e6$alde7
Sunt necesare
cantiti mari de AD+
Este necesar de /tiut
structura secvenei
AD+ de cercetat
-
7/24/2019 Studiul genelor
14/46
/e"ni$i de anali)' a genelor/e"ni$i de anali)' a genelor
PC,PC, *out"ern - lot*out"ern - lot *e$+enierea N*e$+enierea N
Prin$ipii de a)'Prin$ipii de a)'
%tapele prin$ipale%tapele prin$ipale Co!ponente ne$esare 6la general7Co!ponente ne$esare 6la general7 Indi$aii :i li!iteIndi$aii :i li!ite
-
7/24/2019 Studiul genelor
15/46
PC,PC,
rrea$iaea$ia $$i$li$' dei$li$' de ppoli!eri)areoli!eri)arePrin$ipiile PC,Prin$ipiile PC, $lonarea$lonarea in vitroin vitro; a!plifi$are; a!plifi$are ,epli$are se!i$onser+ati+',epli$are se!i$onser+ati+'< repetat'< repetat'
*pe$ifi$itatea*pe$ifi$itatea pri!erilorpri!erilorsinteti$i pentrusinteti$i pentru gena0gena0int'int' iridi)areairidi)area N-int' 0 pri!erN-int' 0 pri!er =
$o!ple!entar$o!ple!entar #enaturare ter!i$' a N - de $er$etat#enaturare ter!i$' a N - de $er$etat
Modifi$area $i$li$' a te!peraturiiModifi$area $i$li$' a te!peraturii #enaturare#enaturare ,enaturare,enaturare *inte)'*inte)'
-
7/24/2019 Studiul genelor
16/46
%omponentele necesare pentruclonarea in vitro9#%4:=
- AD+ de cercetat- #rimeri specifici secvenei de clonat complimentari secvenelor flancante
- >a?-polimera!a AD+-polimera! termostabil- De!o#:
- Instalaie de !odifi$are $i$li$' a te!peraturii- t> de denaturare N
- t> de renaturare 6N?pri!er7- t> de poli!eri)are 6elongarea $atenelor
noi de N7
-
7/24/2019 Studiul genelor
17/46
-
7/24/2019 Studiul genelor
18/46
%(tragerea N Preg'tirea $o!ponentelorpentru PC,
&!plifi$area N-int'
%le$trofore)a
produ:ilor PC,
Colorarea :i +i)uali)area
produ:ilor PC,
&utoradiografia :iinterpretareare)ultatelor
-
7/24/2019 Studiul genelor
19/46
&+antaEele PC,&+antaEele PC,
Metod' rapid'Metod' rapid'Metod' ieftin'Metod' ieftin'tili)area $antit'ilor !i$i de !aterial anali)attili)area $antit'ilor !i$i de !aterial anali)atNu ne$esit' i)otopi radioa$ti+iNu ne$esit' i)otopi radioa$ti+i
Interpretarea u:oar' a re)ultatelorInterpretarea u:oar' a re)ultatelor#e)a+antaEele PC,#e)a+antaEele PC,
Ne$esitatea $unoa:terii se$+enei nu$leotidi$eNe$esitatea $unoa:terii se$+enei nu$leotidi$ea!plifi$atea!plifi$ateNe$esitatea pri!erilor sinteti$i< spe$ifi$iNe$esitatea pri!erilor sinteti$i< spe$ifi$ise$+enei anali)atese$+enei anali)ate
-
7/24/2019 Studiul genelor
20/46
tili)area PC,tili)area PC,Identifi$area inseriilorFdeleiilor nu$leotidi$eIdentifi$area inseriilorFdeleiilor nu$leotidi$eIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e 6sustituiileIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e 6sustituiile
nu$leotidi$e7nu$leotidi$e7Identifi$area e(presiei geni$e 6Identifi$area e(presiei geni$e 6RT-PCRRT-PCR77#a$tilos$opia geno!i$' 6filiaie7#a$tilos$opia geno!i$' 6filiaie7Identifi$area agenilor infe$io:iIdentifi$area agenilor infe$io:iIdentifi$area gradului de infe$ie 6Identifi$area gradului de infe$ie 6quantitative PCRquantitative PCR77
#iagnosti$ pre$is :i rapid a olilor !onogeni$e
#epistarea predispo)iiei geneti$e la olile $o!une
&nali)a filiaiei
#iagnosti$ul pre$is :i rapid al olilor infe$ioase :i
stailirea gradului de infe$tare a pa$ientului
-
7/24/2019 Studiul genelor
21/46
Identificarea inseriilorIdentificarea inseriilor //deleiilordeleiilor
-
7/24/2019 Studiul genelor
22/46
Identificarea mutaiilor punctiformeIdentificarea mutaiilor punctiforme
-
7/24/2019 Studiul genelor
23/46
Identificarea agenilor infecioiIdentificarea agenilor infecioi
-
7/24/2019 Studiul genelor
24/46
Stabilirea paternitii filiaiei!Stabilirea paternitii filiaiei!
-
7/24/2019 Studiul genelor
25/46
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
"ependena cantitii de produse amplificate de concentraia #"$ genomic utili%at &n P'R(S)a utili%at #"$ &n cantitate de* + ,-. g- 0 ,-0. g- 1 ,-+ g- 2 ,-,0 g
Con$entraiile $riti$e ale sustanelor pentru in"iarea a$ti+it'ii /a-poli!era)ei
Substana 'oncentraia critic
SDS >0.005% m!"#
$enol >0.% "!"#
&tanol >'% "!"#
(sopropanol >'% "!"#
C)*COO+a >5 m,
+aCl >5 m,
&D- >0.5 m,
-
7/24/2019 Studiul genelor
26/46
Optimizarea condiiilor de desfurare
a PCR
Cara$teristi$a pri!erilor utili)ai n PC,
3ena Sec4ena Lungimea- ba%e 5 36' 7m- o'
#'85/C-111CCC-CCC-CC---C-*/ 2 52 53
5/1-1-11CC-CC--C1-C1-*/ 5 24 54
#7+ R5/C-11C-CC--1C-11-1-11*/ 0 5 54
5/111C1C1------C-11-1*/ * 24 55
$9S5611C111C1-11-11*6 55 57
56CCC1-C-CCC---11-1C-C*6 2 52 53
"ependena cantitii produselor P'R de temperatura de renaturare a primerilor(:n condiiile P'R s)a utili%at* + to' optimal ).o'; 0 to' optimal; 1 to' optimal 6.o'(
-
7/24/2019 Studiul genelor
27/46
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
"ependena cantitii produselor P'R de concentraia ionilor
-
7/24/2019 Studiul genelor
28/46
naliza polimorfismului (!D pentru 8ena C&
#nali%a electroforetic &n gel de agaro% de 05 a produselor P'R re%ultate din amplificarea #"$ umancu primeri corespun%tori genei #'8(
< marc=er al lungimii; + genotip I/"; 0 genotip "/"; 1 genotip I/I(
I
D
-
7/24/2019 Studiul genelor
29/46
naliza polimorfismului 1!- pentru 8ena +OS
, ' % *
Re%ultatele amplificrii #"$ uman cu primeri corespun%tori genei $9S(< marc=er al lungimii; + genotip 3/3; 0 genotip 7/7; 1 genotip 3/7(
G
T
-
7/24/2019 Studiul genelor
30/46
naliza polimorfismului !C pentru 8ena -' R
Re%ultatele amplificrii #"$ uman cu primeri corespun%torigenei #7+ R digerate cu a>utorul en%imei "de I(
< marc=er al lungimii; + genotip #/#; 0 genotip #/'
A
C
-
7/24/2019 Studiul genelor
31/46
-e9nica RealtimePCR
-
7/24/2019 Studiul genelor
32/46
/e"ni$a
*out"ern-lot a!at pe 45#s
Hibridi!are cu sonde marcate %u transferul 54 din gel-electrofore!
pe un suport solid 9pe membrane de
nitrocelulo!:
-
7/24/2019 Studiul genelor
33/46
iridarea a$i)ilor nu$lei$iiridarea a$i)ilor nu$lei$inirea $o!ple!entar' a frag!entelornirea $o!ple!entar' a frag!entelor6!ole$ulelor7 de a$i)i nu$lei$i6!ole$ulelor7 de a$i)i nu$lei$i
N de $er$etat $uN de $er$etat $usonda oligonu$leotidi$'sonda oligonu$leotidi$'
9n rea$ie parti$ip' !ole$ule !ono$atenare9n rea$ie parti$ip' !ole$ule !ono$atenareMole$ulele N-int' sunt fi(ateMole$ulele N-int' sunt fi(ateMole$ulele-sonde sunt !ar$ate radioa$ti+ sauMole$ulele-sonde sunt !ar$ate radioa$ti+ sau
fluores$entfluores$entIdentifi$area $o!ple(elor "iride se reali)ea)'Identifi$area $o!ple(elor "iride se reali)ea)'prin inter!ediul autoradiografieiprin inter!ediul autoradiografiei
-
7/24/2019 Studiul genelor
34/46
7e=nica Sout=ern)blot7e=nica Sout=ern)blot
8?tragerea #"$8?tragerea #"$ Restriia #"$Restriia #"$ 8lectrofore%a #"$8lectrofore%a #"$
"enaturarea i"enaturarea itransferul #"$transferul #"$pe membranepe membrane
#utoradiografia#utoradiografia@ibridare cu sonda@ibridare cu sonda
Ai%uali%area iAi%uali%area iinterpretareainterpretarea
re%ultatelorre%ultatelor
tili t " i iitili t " i ii
-
7/24/2019 Studiul genelor
35/46
tili)area te"ni$iitili)area te"ni$ii*out"ern-lot*out"ern-lot
Identifi$area inseriilor F deleiilor !ariIdentifi$area inseriilor F deleiilor !ariIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e $eIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e $eafe$tea)' *,afe$tea)' *,#a$tilos$opia geno!i$' ,LPs#a$tilos$opia geno!i$' ,LPs
45# i li ti l i
-
7/24/2019 Studiul genelor
36/46
45#s /i anali!a genotipului
Electrofore!a 54 a 2 persoane A, /i %
Alela +ormal cu 2 S4 Alela mutant cu 3 S4, mutaie 7n S43
B 6N!7B 6N!7C 6!!7C 6!!7
& 6NN7& 6NN7
-
7/24/2019 Studiul genelor
37/46
Ne$esit' $unoa:terea "'rii de restri$ie aNe$esit' $unoa:terea "'rii de restri$ie agenei int'genei int'
Ne$esit' $antit'i !ari de !aterial iologi$Ne$esit' $antit'i !ari de !aterial iologi$Metod' ndelungat'< $u !ulte etapeMetod' ndelungat'< $u !ulte etapeNe$esit' i)otopi radioa$ti+iNe$esit' i)otopi radioa$ti+iNe$esit' !ateriale $ostisitoareNe$esit' !ateriale $ostisitoare
#e)a+antaEele *out"ern-lot#e)a+antaEele *out"ern-lot
&+antaEele *out"ern-lot&+antaEele *out"ern-lot
%ste !etod' foarte pre$is'%ste !etod' foarte pre$is'Nu ne$esit' $unoa:terea se$+enei nu$leotidi$eNu ne$esit' $unoa:terea se$+enei nu$leotidi$eanali)ateanali)ateNu ne$esit' pri!eri sinteti$iNu ne$esit' pri!eri sinteti$i
/ " i/ " i
-
7/24/2019 Studiul genelor
38/46
/e"ni$a/e"ni$aNort"ern-lotNort"ern-lot
%(tragerea &,N din esutul int'%(tragerea &,N din esutul int'
%le$trofore)a &,N n $ondiii de%le$trofore)a &,N n $ondiii dedenaturaredenaturare
/ransfer pe !e!ran' de/ransfer pe !e!ran' denailonnailon
iridarea $u sonda !ar$at'iridarea $u sonda !ar$at'
&utoradiografia&utoradiografia
-
7/24/2019 Studiul genelor
39/46
7e=nica $ort=ern)blot7e=nica $ort=ern)blot
8?tragerea #R$8?tragerea #R$ 8lectrofore%a #R$8lectrofore%a #R$
transferul #R$transferul #R$pe membranepe membrane
#utoradiografia#utoradiografia@ibridare cu sonda@ibridare cu sonda
Ai%uali%area iAi%uali%area iinterpretareainterpretarea
re%ultatelorre%ultatelor
-
7/24/2019 Studiul genelor
40/46
tili)area te"ni$iitili)area te"ni$iiNort"ern-lotNort"ern-lot
Identifi$area e(presiei geni$e n anu!iteIdentifi$area e(presiei geni$e n anu!iteesuturi< anu!ite $ondiiiesuturi< anu!ite $ondiii
Identifi$area +ariantei deIdentifi$area +ariantei de splicingsplicinga pro&,N!a pro&,N!
Identifi$area ni+elului de e(presieIdentifi$area ni+elului de e(presie
Identifi$area agenilor infe$io:i 6rio+irusuri7Identifi$area agenilor infe$io:i 6rio+irusuri7
-
7/24/2019 Studiul genelor
41/46
Identifi$area ni+eluluiIdentifi$area ni+eluluide e(presie :i a +arianteide e(presie :i a +arianteidede splicingsplicing
-
7/24/2019 Studiul genelor
42/46
*e$+enierea N*e$+enierea N*tailirea se$+enei de nu$leotide*tailirea se$+enei de nu$leotide
Metoda $"i!i$' 6te"ni$a Ma(a!-Gilert< 1@7Metoda $"i!i$' 6te"ni$a Ma(a!-Gilert< 1@7
Metoda dideo(i 6te"ni$a *inger< 1@7Metoda dideo(i 6te"ni$a *inger< 1@7
Metoda auto!at' 6$u utili)area agenilor fluores$eni7Metoda auto!at' 6$u utili)area agenilor fluores$eni7
-
-
7/24/2019 Studiul genelor
43/46
@
9@: 0/&&&/GGC/&/&&&/GGC/&.......29-:
-
7/24/2019 Studiul genelor
44/46
iridareairidareain situin situ
Preg'tireaPreg'tireapreparatelor depreparatelor de$ro!o)o!i$ro!o)o!i
#enaturarea N#enaturarea Niridarea $u sondairidarea $u sonda!ar$at'!ar$at'
8i)uali)area la8i)uali)area la!i$ros$opul opti$!i$ros$opul opti$
-
7/24/2019 Studiul genelor
45/46
iridareairidarea in situin situ $u$uutili)area preparatelorutili)area preparatelor
de $ro!o)o!i !etafa)i$ide $ro!o)o!i !etafa)i$i
iridareairidarea in situin situ $u$uutili)area preparatelorutili)area preparatelor
$u nu$lei interfa)i$i$u nu$lei interfa)i$i
iridareairidarea in situin situpentrupentrudepistarea se$+enelor Ndepistarea se$+enelor N
-
7/24/2019 Studiul genelor
46/46
,olul pra$ti$ al te"ni$ilor de anali)' aa$i)ilor nu$lei$i
1. Cer$etare 0 se$+enierea N< for!area iliote$ilor degene< studiul e(presiei geni$e< studiul !e$anis!elor dereglare< studiul $onse$inelor !utaiilor.
2. #epistarea persoanelor purt'toare de !utaii - prenatal
sau postnatal< $u s$op de pre+enire a na:terii $opiilor $uano!alii geneti$e sau !anifest'rii unor patologii se+ere.
3. /erapie geni$' 6alegerea genei int'< $onstruirea+e$torilor de gene et$.7.
4. #epistarea N str'in 6+iral sau a$terian7 ndiagnosti$ul olilor infe$ioase.
5. Identifi$area poli!orfis!elor indi+iduale n anali)a