Download - Prezentare PCR
Reactia de polimerizare in lant si aplicatiile ei
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Decembrie 2011
DefinitiePCR- sinteza exponentiala in vitro a unui fragment de ADN tinta.
Dr. Kary Mullis a descris tehnica pentru prima data in 1983 si a primit Premiul Nobel in Chimie in 1993.
Primul termen: polimeraseDenumirea de polimerase este datorata enzimei implicata in aceasta reactie: DNA polimerase.
Chain?Chain- in lant, deoarece produsii primei reactii devin substrat pentru urmatoarea si pasul se repeta.
Componentele Reactiei: Reactiei:1) ADN tinta - contine fragmentul ADN care trebuie amplificat. 2) Set de primeri- secvente de oligonucleotide, care incadreaza fragmentul care trebuie amplificat. 3) Amestec de dNTP deoxynucleotidetrifosfat. 4) ADN polimeraza termostabila- enzima care catalizeaza reactia. 5) Ioni de Mg++ - cofactor enzimatic 6) Solutie tampon mentine pH si taria ionica a amestecului de reactie astfel incat enzima sa actioneze.
Reactia
Tub PCR
THERMOCYCLER
1. Denaturarea ADN (~95oC)
2. Hibridizare primeri (~56oC)
3. Renaturare ADN (72oC)
2500000
DNA copies vs Cycle number
2000000
1500000
1000000
DNA copies
500000
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Cycle number
Aplicatii ale reactiei Clasificarea organismelor Genotipare Mutageneza Detectarea de mutatii Secventiere Detectarea patogenenilor Inginerie genetica Diagnostic prenatal
Aplicatii PCRIdentificare molecularaEx.: Clasificarea organismelor Epidemiologie moleculara Genotipare Diagnostic prenatal Mutation screening Detectarea patogenilor
Secventiere Bioinformatica Clonare moleculara
Inginerie genetica Mutageneza situs directionata Studii de expresie genica
IDENTIFICARE MOLECULARA:Secventa ADN este unica pentru fiecare tip de organism Secventa ADN poate fi utilizata pentru identificarea unui organism
Oragismele pot fi identificate prin PCR . PCR permite manipularea relativ usoara a ADN.
METODE DE IDENTIFICARE MOLECULARA: 1. RFLP 2. RAPD 3. AFLP 4. MLPA 5. Detectare patogeni 6. Genotipare 7. Secventiere 8. Clasificarea organismelor
RFLP- Restriction fragment length polymorphism, tehnica care exploreaza diferenta dintre secvente de ADN omoloage.Etape: PCR- digestie cu enzime de restrictie- gel electroforezainterpretare.
RAPD- Random amplification of polymorphic DNA, tehnica prin care fragmente de ADN sunt amplificate aleator random, rezultand un profil semi-unic al reactiei.
AFLP- Amplified fragment length polymorphismEtape: restrictie enzimatica pentru digestia ADN genomic - ligarea adaptorilor la capetele coezive ale fragmentelor de digestie. Amplificarea unui subset din fragmentele de restrictie.
MLPA- Multiplex ligation-dependent probe amplification este o varianta a unei reactii PCR multiplex.
Etape ale reactiei MLPA
Detectarea de patogeniReactie PCR pozitiva
Prezenta patogenului
O proba ADN care poate contine agenti patogeni
Reactie PCR negativa
Absenta patogenului
Detectare de patogeni
Senzitivitatea reactiei PCR-amplificarea M. tuberculosis DNA.
Genotipare cu markerii STRRepetitiile scurte in tandem (short tandem repeat) - repetitii de 2 pana la 5pb, ex. (CATG)n intr-o regiune genomica noncodificatoare. Polimorfismele STR (STRP) se produc cand loci omologi difera ca numar de repetii. Prin identificarea repetiilor unei secvente cunoscute intr-un locus specific se poate creea profilul genetic al unui individ.
SECVENTIERE - determinarea ordinii nucleotidelor intr-un fragment ADN.-metoda dezvoltata de Sanger (1958, 1980) Nucleotide (dNTP) Dideoxynucleotide (ddNTP) Dupa incorporarea unei ddNTP, numai are loc polimerizare!
Fragmente ADN de diferite dimensiuni care difera printr-o nucleotida Nucleotidele pot fi sau
Gel de secventiere clasic
Identificarea de mutatii prin secventiere
Clasificarea organismelor1) Inrudirea dintre specii * Fosile 2) Similaritati 3) Diferente * Cantitati mici de tesut * Organisme mici Date insuficiente
! ADN !
Pe scurt...Manipularea fragmentelor ADN amplificateDigestie enzimatica, Secventiere...
Sursa ADNsange, chorionic villus, fluid amniotic, par, saliva
Fragmente ADN dorite in cantitate mare 68,719,476,736 copii
ConcluziiPCR este o tehnica rapida, relativ usor de utilizat, caracterizata de senzitivitate si specificitate, care a revolutionat biologia moleculara.
PCR este tehnica cu un spectru larg de utilizare in cercetare si cu aplicabilitate in diagnostic.