4

ARTICOLE DE FOND

DIVERSITATEA ŞI PARTICULARITĂŢILE DIAGNOSTICĂRII VIRUŞILOR ALBINELOR (APIS MELLIFERA L.)

Ion Toderaş, Olga Moraru, Alexandru Movilă, Mircea Ciuhrii*, Natalia Munteanu

Centrul de Biologie Generală şi Moleculară, Institutul de Zoologie al AŞM*InsectFarm, Bucureşti, România

Albinele reprezintă o verigă ecologică esenţială dintre oră şi faună. Din păcate, poluarea mediului din ultimii ani a redus dramatic populaţiile multor specii de insecte, inclusiv a albinelor, ca polenizatori principali ai plantelor [20].

Conform datelor din ultimii ani densitatea populaţiilor de albine s-a redus şi din cauza epizootiilor virale, care au apărut frecvent datorita scăderii imunităţii albinelor, cauzând pierderi economice importante [24].

Una dintre cele mai acute probleme care cauzează pierderile în masă ale fami-lilor de albine este apariţia epizootiilor virale, care reduc considerabil densitatea populaţiilor de albine. În ultimii ani, a sporit interesul ştiinţi c faţă de infecţiile virale ale albinelor (Apis mellifera L.). În literatură au aparut mai multe informaţii unde se menţionează manifestări clinice ale infecţiilor virale la albine, care pot in uenţa via-bilitatea populaţiilor de albine. Unele din cele mai des întâlnite afecţiuni ale familiilor de albine sunt: infestarea cu Nosema apis; intoxicaţiile cu insecticide chimice; căpuşa ectoparazită Varroa destructor [10, 25]; Varroa jacobsoni, descrisă pentru prima dată în anul 1904 de către Oudemans ca parazit al albinei Apis cerana Fabricius, 1793 (con-form datelor de pe insula Java). Ulterior, acarianul a fost descoperit şi pe A. mellifera L., aproape în toate ţările lumii (Rusia, Bulgaria, Polonia, România, Turcia, etc.). An-derson şi Trueman [2], în anul 2000, au stabilit că specia V. jacobsoni parazitează doar pe A. cerana şi arealul ei cuprinde regiunea geogra că Indo – Malaieză. În Europa, pe A. mellifera parazitează altă specie de căpuşă – Varroa destructor, pentru prima dată descoperită pe A. cerana în Koreea de Sud, deosebindu-se de V. jacobsoni la nivelul unor caractere morfologice şi, în special, la nivelul secvenţelor genei COI (Citocrom Oxidaza I) a ADN-ului mitocondrial. Astfel, toate datele despre cercetarea V. jacobsonipe A. mellifera din alte ţări din Europa, în general se referă la V. destructor.

Pînă în prezent, au fost depistate 18 specii de virusuri, majoritatea ind reprezen-tate sub formă de virioni de aproximativ 30 nm în diametru, ce conţin o moleculă monocatenară de ARN în calitate de genom. Deşi, de obicei, nu sunt însoţite de simptome clinice, în anumite cazuri virusurile pot cauza infecţii grave, care se termină cu decesul intregii familii [1]. Conform ultimelor date din literatură cel mai frecvent în populaţiile de albine se intâlnesc şase specii de virusuri, care pot provoca epizootii ale familiilor importante de albine. Acestea sunt: virusul puietului în sac (SBV= sacbrood virus), virusul paraliziei cronice (CBPV= chronic bee paralysis virus), virusul botcilor negre de regină (BQCV= black queen cell virus), virusul aripilor deformate (DWV=

5

deformed wing virus), virusul paraliziei acute (ABPV= acute bee paralysis virus) şi virusul de Kaşmir (KBV= Kashmir bee virus) [13].

SBV infectează, în primul rând, puietul albinei, care de cele mai multe ori duce la decesul familiilor de albine. Larva infectată nu se mai dezvoltă pâna la faza de pupă, iar agregatele ectiziale uide din jurul tegumentului formează aşa numitul „sac”, de unde şi provine denumirea afecţiunii. Larva îşi schimbă culoarea de la cea deschisă, spre alb la un galben pal. Imediat după deces, larva se usucă şi capătă o formă asemănătoare unei gondole de culoare maronie. Virusul poate infecta şi formele adulte ale albinelor [20], deaceia răspândirea infecţiilor se efectuează rapid in zonele respective, provocând epizootii imense.

Virusul puietului în sac apare în special primăvara, când coloniile sunt slăbite şi când predomină larvele de vârste mici, care sunt mult mai sensibile la infecţiile virale, [7]. Deşi puietul în sac a fost descris pentru prima dată în 1913 şi determinat infecţiilor cu patru ani mai târziu, agentul cauzal a fost caracterizat abia în 1964 [5]. Datorită proprietăţilor sale bio zice şi prezenţei genomului reprezentat de ARN, SBV este unul dintre virusurile insectelor care se referă, în general, la picorna virusuri. Conform date-lor din literatura de specialitate, particulele de SBV au un diametru de 28 nm, sunt rotunde, fără anvelopă, cu înfăţişare speci că [15]. SBV este primul, dar nu şi ultimul, dintre virusurile albinelor care a fost complet secvenat; ARN-ul genomic este constituit din 8832 nucleotide şi conţine un singur cadru de citire (ORF= open reading frame), în-cepând din poziţia a 179 nt până în poziţia 8752 nt, codi când o poliproteină constituită din 2858 de aminoacizi [19]. După părerea unor autori, puietul în sac este, probabil, cea mai comună boală virală la albine, întrucât este cunoscută pe ecare continent.

În cazul CBPV au fost înregistrate două tipuri de manifestare a infecţiei. Una ar cazul când albinele sunt incapabile de zbor, tremură şi se târăsc având aripile desfăcute asimetric. Deseori, suferă de dezinterie şi mor în câteva zile. Iar alta se manifestă când albinele au înfăţişarea neagră, din cauza căderii rişoarelor de păr. În acest caz, albinele de gardă nu le recunosc şi le resping din cauza înfăţişării lor alterate. Este interesant faptul că, deşi în unele cazuri pînă la 30% din albinele lucrătoare sunt afectate, infecţia cu CBPV uneori rămâne nedetectată şi coloniile, de obicei, se restabilesc spontan [6].

BQCV este caracteristic albinelor adulte; totuşi, din punct de vedere clinic, acesta afectează stadiul de prepupă sau pupă a reginei, în special primăvara sau vara devreme. Simptomele sunt similare celor ale puietului în sac. Pupa reginei infectată moare şi se înnegreşte odată cu pereţii celulei [22].

DWV este detectat cel mai des la albinele infestate cu Varroa [14]. Virusul se propagă lent, şi pupa infectată la faza de dezvoltare de ochi-albi poate avea aripi mal-formate. Majoritatea albinelor infectate nu prezintă nici unul din simptome.

ABPV, de asemenea, apare la albinele aparent sănătoase; cu toate acestea, s-a pre-supus că acest virus este implicat în colapsul coloniilor de albine melifere infestate cu V. destructor. Având în vedere răspândirea căpuşei Varroa în Europa pe parcursul ultimelor decenii, ABPV a căpătat o importanţă din ce în ce mai mare [9].

KBV este strâns legat cu ABPV; însă totuşi acesta este mai rar depistat în Europa. Acesta a fost depistat pentru prima oară pe albina estică (A. cerana), în partea de nord şi vest a Indiei. KBV afectează puietul şi albinele adulte, fără a prezenta careva simptome. Albinele adulte, de obicei, mor în câteva zile după infestare, dar larvele pot supravieţui

6

după ingestia virusului şi unele din ele devin adulte infestate inaparent [1]. KBV este considerat cel mai virulent dintre toate virusurile albinelor cunoscute.

Până nu demult, diagnoza de laborator a virusurilor albinelor se baza pe metode tradiţionale, cum sunt identi carea cu ajutorul microscopiei electronice a particulelor virale, imunodifuziunea în gel de detecţie a antigenului, tehnica radioimună sau teste bazate pe ELIZA, (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) care folosesc anticorpi policlonali. Aceste metode se prestează la mostre grav infectate sau la un număr redus de mostre, dar nu pot aplicate cu uşurinţă studiilor la scară mare sau la detectarea unor niveluri scăzute de virusuri, aşa cum poate cazul unor infecţii neaparente. În plus, metodele serologice sunt greu de aplicat, deoarece multe preparate de virusuri ale albinelor sunt amestecuri; majoritatea coloniilor conţin unul sau mai multe virusuri [20, 17]. Este di cil să se producă antiseruri într-adevăr speci ce pentru ecare virus al albinelor [4]. Aşadar, în prezent, se consideră că majoritatea din aceste metode prezintă sensibilitate şi speci citate scăzută sau chiar reacţii nespeci ce. Luând în consideraţie di cultăţile metodelor clasice de diagnosticare în virologia albinelor (absenţa cultur-ilor de ţesut de albine, dependenţa de sezonul de obţinere a pupelor pentru infestarea experimentală sau cerinţa de ser speci c pentru testele de imunodifuziune în gel), in-teresul ştiinţi c s-a orientat spre tehnicile moleculare. Astfel, disponibilitatea crescută a secvenţelor complete sau parţiale a genomului virusurilor menţionate mai sus, a con-dus la dezvoltarea unor metode de diagnosticare, bazate pe analiza PCR cu revers-transcripţie (RT-PCR= reverse transcription-PCR) pentru detectarea directă, rapidă şi sensibilă a ARN-ului viral în probele de albine [20, 13, 30, 24].

Iniţial orientată pentru diagnosticarea virusurilor ARN la om şi animale, metoda RT-PCR a fost adaptată cu succes pentru identi carea unor virusuri ARN la albine şi la acarienii V. destructor, care sunt paraziţii acestora [20, 12, 27, 29]. Utilizarea acestei tehnici performante necesită cunoaşterea prealabilă a genomului organismului ţintă, sinteza ADNc şi designul primerilor speci ci. În această ordine de idei, prin analiza electroforetică a productelor PCR în gel de agaroză au fost obţinute rezultate care au demonstrat că albinele cu aripile deformate conţin de 10-100 de ori mai multe particule de DWV decât cele cu simptome slab evidenţiate, şi anume prin detecţia virusului în diluţia 107 a probelor de albine fără simptome de deformare a aripilor, şi până la diluţia 109 a probelor de albine cu aripi deformate [30]. În favoarea acestei abordări de detecţie a virusurilor, mai pot adăugate rezultatele obţinute de Miaoquing şi al. [24], în care procentul de detecţie în baza reacţiei RT-PCR (87,2%) a fost cu mult mai mare decât cel obţinut în baza testului ELIZA (20,2-23,8%). Cu toate acestea, oricât ar părea de straniu, în majoritatea lucrărilor de înaltă calitate, detecţia virusurilor se realizează cu ambele metode, în paralel.

Doar în baza rezultatelor obţinute cu ajutorul analizei RT-PCR s-a putut vorbi de-spre variabilitatea virusului puietului în sac ale probelor colectate din focarele diferitor localităţi. A fost demonstrată existenţa potenţială a trei grupe distincte de SBV în lume, care posibil re ectă izolarea geogra că: genotipul European (cu subtipurile Europei Centrale care a inclus probele din Austria şi Germania şi subtipul Englez), genotipul Orientului Îndepărtat (subtipurile Thai care a inclus probele din India şi Nepal) şi al treilea genotip distinct, originar din Africa de Sud. Pentru studierea diversităţii virusului puietului în sac, cercetătorii au utilizat mai multe perechi de primeri dintre care ulterior

7

au propus trei perechi (SB1 f, SB2 r, SB6 f, SB7 r, SB14 f, SB15 r), care s-au dovedit a cei mai utili, ampli când toate tipurile de SBV, accentuând faptul că primele două perechi pot releva mai bine porţiunile speci ce dintre probe, pe cînd ultima este mai utilă în investigaţiile ce se referă la divergenţe [20].

Disponibilitatea crescută a secvenţelor virale depozitate în bazele de date cu acces public, cum sunt GenBank şi EMBL a permis NBU (Nationa Bee Unit din Anglia) să urmeze o altă tehnică de identi care a virusurilor, denumită TaqManR, bazată pe PCR în timp real. Autorii acestui proiect a rmă că detectarea virusurilor prin utilizarea Taq-ManR reprezintă un potenţial uriaş pentru activitatea viitoare atât în Regatul Unit cât şi peste hotare. Astfel, după cum arată studiile, utilizarea tehnologiei TaqManR depăşeşte problemele legate de disponibilitatea reactivului, face posibilă aplicarea de metode RT-PCR cu înaltă sensibilitate şi caracter speci c, urmând să e utilizate cantitativ la un număr mare de mostre, iar utilizarea genei ribozomale 18R a albinei A.mellifera per-mite aprecierea e cienţei extracţiei, asigurând că nu vor interveni rezultate negative false (cum este cazul în care nici un virus nu a fost detectat, ca urmare a eşecului de a extrage ARN din mostrele de albine) [33].

O atenţie deosebită a fost acordată şi distribuirii virusului la nivelul claselor re-productive (regine şi trântori), pe exemplul virusului aripii deformate, ajungându-se la concluzia că DWV nu este strict localizat în tractul digestiv, dar este răspândit în întregul corp, inclusiv în ovarele reginei, în corpul gras al reginei precum şi în vezicile seminale ale trântorilor. Cercetătorii sunt de părerea că concentraţia DWV în ţesuturile reproductive ale reginei şi ale trântorilor sugerează faptul că infecţia poate avea efect negativ asupra capacităţii lor reproductive, ceea ce poate afecta serios activitatea şi productivitatea coloniei. Prezenţa virusului în sperma trântorilor implică o posibilă rută de transmitere pe cale sexuală a virusului respectiv, fapt ce poate avea implicaţii majore în transmiterea virusului între colonii.

În continuarea acestei idei, pe lângă multiplele cercetări cu privire la caracterizarea virusurilor albinelor, s-au înregistrat şi unele aspecte cu ajutorul cărora se va putea crea o noua posibilitate de stopare a răspândirii infecţiilor virale la albine. Informaţiile despre interacţiunea dintre virusuri pot provoca interferenţe între virusuri la insecte [16], care pot stopa multiplicarea virusurilor. Aşa ca şi în cazurile virusurilor albinelor se poate provoca interferenţă dintre picorna virusuri, gazda albina şi căpuşa parazită Varroa. Astfel a fost propusă o ipoteză, care presupune că virusurile albinelor (KBV şi SBV) pot avea, în calitate de vector, căpuşele Varroa şi pot transmise între albine pe două rute, verticală şi/sau orizontală ( g.1). Anderson în lucrarea sa [3] a sugerat că KBV ar putea transmis prin alte mijloace, dat ind faptul că KBV a fost raportat în Canada înaintea introducerii căpuşelor Varroa în această ţară. Rezultatele obţinute de Miaoqing şi al. [24] au demonstrat că virusurile albinelor (KBV şi SBV) ar putea potenţial transmise atât vertical transovarial, de la regină la ouă, cât şi orizontal, de la albinele lucrătoare larvelor sau altor albine prin hrana care conţine secreţii glandulare. Aceste rezultate au fost con rmate prin RT-PCR care a detectat aceste virusuri atât în regine cât şi în ouă. Anterior, KBV a fost detectat şi în fecalele reginelor şi albine-lor lucrătoare, ceea ce ne demonstrează că infecţia ar putea transmisă şi în timpul curăţirii stupului [21]. Nu este exclus că virusurile ar putea transmise de la o colonie la alta prin hrănirea albinelor cu miere sau polen aduse de la colonii bolnave, aceasta

8

ind o practică utilizată de unii apicultori pentru a ajuta coloniile să supravieţiască în perioadele de criză de cules. De asemenea, în timpul furtului mierii sau polenului, de la coloniile slăbite, de către coloniile mai puternice.

Fig. 1. Potenţialele rute de infecţie cu virusurile albinelor (KBV şi SBV).KBV şi SBV pot transmise vertical de la regine la ouă sau de la albinele lucrătoare larvelor sau al-tor albine prin intermediul secreţiilor. Căpuşele Varroa deasemenea pot transmite virusuri în timpul hrănirii.

Pe lângă aceste rezultate, mulţi cercetători susţin că infecţiile virale pot corelate cu infestarea cu Varroa [10, 20, 30, 24, 14, 9, etc]. Răspândirea acarienilor Varroa în coloniile albinelor din întreaga lume a avut o in uenţă semni cativă asupra infecţiilor virale la albine. Înainte de apariţia şi răspândirea V. destructor în Europa, au fost ob-servate manifestările clinice ale unor infecţii virale, care, în acel timp, nu conduceau la pierderi economice serioase [1]. Situaţia s-a schimbat dramatic odată cu infestarea coloniilor de albine cu căpuşa Varroa. În Marea Britanie, înainte de invazia acarianului Varroa, virusul paraliziei acute (ABPV) niciodată n-a cauzat mortalitatea albinei, în timp ce după invazie, mortalitatea albinelor datorită ABPV a crescut [11]. Nu este clar cum căpuşele omoară coloniile, dar presupunerea generală este aceea că ele pot acti-vatori ai replicării unor virusuri în albinele adulte în timpul procesului de hrănire şi/sau vectori ai virusurilor de la albinele adulte la pupe [10, 9], întrucât în numeroase lucrări, a fost demonstrată prezenţa ARN-ului viral (ABPV, DWV, KBV şi SBV) în căpuşele Varroa, ceea ce ne indică că aceste căpuşe de asemenea pot infectate cu virusurile respective. Prin urmare, există mai multe oportunităţi pentru transmiterea virusurilor de către acarieni, dacă luăm în consideraţie asociaţia acarienilor cu albinele melifere. Acarienii Varroa se hrănesc cu hemolimfa pupelor în dezvoltare şi a albinelor mature. Femelele de acarieni intră în celulele puietului la sfîrşitul stadiului larvar şi secretă salivă în gazdă pe parcursul hrănirii. Acesta este potenţialul traseu pentru virusurile

9

albinelor. Dovada directă a capacităţii acarienilor de vectori pentru virusuri a fost de-tectarea KBV (Kashmir bee virus) în saliva acarianului [24]. De asemenea, se presu-pune că Varroa diminuează răspunsul imun la diferiţi patogeni. Parazitul V. destructorreduce rezistenţa puietului în creştere şi a albinelor lucrătoare la o serie de boli şi viroze prin două mecanizme: slăbirea puietului şi albinelor prin sugerea hemolimfei puietului şi albinelor adulte de către progenitura parazitului, care se dezvoltă pînă la faza de adult în celulele de puiet căpăcit consumând substanţele nutritive necesare dezvoltării albi-nei, prin perforarea de către femela Varroa a cuticulei larvei, iar la albina adultă - prin sugerea hemolimfei acesteia de către femela Varroa a ată în perioada de maturitate sexuală, de asemenea producând ori cii în membranele intersegmentale ale albinelor. Interesant a fost cazul cînd Tentcheva şi al. [31] au raportat o priscă izolată geogra c (Ouessant Island, France), lipsită de V. destructor, în care nici unul dintre virusurile investigate nu a putut detectat.

Astfel, toate cunoştinţele, în ansamblu, referitoare la interacţiunile dintre virusurile albinelor şi căpuşele parazite, conduc la presupunerea că aceste relaţii pot sta la baza mortalităţii sporite şi a colapsului coloniilor de albine. Totuşi, trebuie de menţionat că o concluzie de nitivă referitor la legătura dintre infestarea cu căpuşe şi infecţiile virale încă nu s-a stabilit, deşi, în continuare, se fac teste pentru determinarea rolului căpuşelor Varroa în inducerea infecţiilor virale la albine şi interacţiunea acestor viru-suri cu ţesutul căpuşelor.

Pe parcursul ultimilor ani, apariţia, răspândirea şi distribuirea probelor acestor vi-rusuri a fost investigată minuţios în diferite regiuni geogra ce din multiple ţări. De exemplu, în urma unui sondaj amplu, pe întreg teritoriu al Austriei, s-au înregistrat umătoarele rezultate: Cel mai răspândit virus a fost DWV, prezent în 91% de probe, urmat de ABPV, SBV şi BQCV (68%, 49% şi 30%, respectiv). CBPV a fost detec-tat în 10% de colonii, în timp ce KBV nu a fost prezent în nici o probă. În cele mai multe mostre, a fost identi cat mai mult de un virus. Distribuţia probelor de ABPV, BQCV, CBPV şi SBV au variat considerabil în diferite regiuni geogra ce investi-gate, în timp ce DWV a avut o largă răspândire în toate regiunile Austriei. În albinele care au prezentat culoare întunecată şi dezorientare, a fost întodeauna detectat viru-sul CBPV. Infestarea simultatnă cu DWV şi ABPV a fost cel mai frecvent observată în coloniile care sufereau de slăbiciune, depopulare şi dispariţie bruscă. Albinele din coloniile aparent sănătoase din aceleaşi prisăci au prezentat o distribuţie similară a probelor de virusuri; totuşi, povara virusului a fost de la 10 la 126 de ori mai mică decât la albinele din coloniile bolnave [13]. În Europa, cel mai răspândit virus al albinelor deasemenea este considerat DWV (în Franţa DWV a fost detectat în 97% de prisăci [31]). ABPV, al doilea dintre cele mai răspândite virusuri identi cate în Austria este deasemenea răspândit în Europa (58% din prisăcile investigate în Franţa şi 67% din prisăcile investigate în Ungaria [31, 8]). În cazul BQCV şi SBV, densitatea înaltă a coloniilor de albine în anumite regiuni geogra ce, comerţul şi transportul intensiv al coloniilor, reginelor, prisăcilor sau echipamentului trebuiesc, de asemenea, luate în consideraţie ca posibili factori importanţi în transmiterea şi răspândirea acestor viru-suri între prisăci. În Franţa, unde intensitatea apiculturii şi comerţului este înaltă, SBV şi BQCV au fost plasate pe locul doi printre cele mai răspândite virusuri, detectate în 86% de prisăci investigate [31]. CBPV a fost detectată doar în trei state federale din

10

Austria. O importantă observaţie este faptul că coloniile CBPV-pozitive au prezentat constant simptomele bolii. În sondajul francezilor, CBPV a fost stabilit că cel mai puţin frecvent virus în probele investigate, după KBV, dar în alt sondaj al probelor de albine bolnave colectate în prisăcile din sudul Franţei [26], frecvenţa infecţiei CBPV a fost de două ori mai înaltă decît la albinele care au prezentat simptome. KBV nu a fost prezent în nici o prisacă din Austria. Acest virus este pe larg răspândit în Statele Unite şi Australia, însă, până în prezent, rareori a fost depistat în Europa [1]. Apariţia KBV în Hess, Germania a fost raportat recent [28], acest virus a fost depistat în 2002 în cîteva prisăci din Franţa. Deoarece ABVP şi KBV prezintă un nivel înalt de similitudine şi sunt, de asemenea, legaţi antigenic, se presupune că ambele virusuri provin de la un strămoş comun şi au evoluat independent în regiuni geogra ce izolate [23]. Distribuţia largă a ABPV şi lipsa KBV în Austria, presupune de asemenea, ipoteza sa. Recenta apariţie a tulpinilor KBV în diferite zone din Europa este, cel mai probabil, rezultatul recentei introduceri a virusului în aceste regiuni prin import de peste hotare. Astfel, reieşind din cele prezentate, diferenţele remarcabile în distribuţia virusurilor în diferite regiuni geogra ce pot parţial explicate prin diferenţele de climă, relief şi densitatea populaţiilor de albine, deşi, comerţul şi schimbul de animale infectate, echipament şi produse apicole contaminate între prisăci, regiuni sau chiar ţări pot avea o mai mare importanţă în răspândirea virusurilor. Această a rmaţie este, de asemenea, susţinută de faptul că acele ţări care au aderat recent la Uniunea Europeană şi au avut anterior o intensitate mai mică de comerţ internaţional de albine şi produse apicole, răspândirea virusurilor, astfel ca SBV şi BQCV, a fost mai mică decît în „vechile” state membre ale Uniunii Europene. Prin urmare, investigaţiile virologice şi parazitologice ar trebui să e luate în consideraţie de apicultori, înainte de a procura şi importa albinele şi produsele apicole posibil infectate. Tehnica RT-PCR descrisă în prezentul articol s-a dovedit a o metodă adecvată acestui tip de investigaţii, care mai continuă în multe alte state. Dacă e să ne referim la Republica Moldova, recent (2008), în colaborare cu savanţii celui mai prestigios Centru de Excelenţă din Franţa, prin aplicarea metodelor molecular-genetice, în premieră, a fost demonstrată prezenţa a patru ARN-virusuri cu consecinţe nefaste pentru familiile de albine, vectorul transmisibil ind acarianul V. destructor. Dintr-un număr de 47 de probe de albine, originare din diferite zone ale Republicii, au fost identi cate virusurile DWV, SBV, BQCV şi ABPV (62%, 54%, 37% şi 10% respectiv). CBPV şi KBV menţionate mai sus nu au fost detectate [32]. Pe viitor, se preconizează efectuarea unui sondaj mult mai amplu, întrucât, în urma monitorizării stării familiilor de albine din diferite zone ale ţării s-a constatat, în multe stupine cu mortalităţi ridicate, o infestare puternică cu parazitul V. destructor, acesta ind considerat vectorul transmisibil al virusurilor la albine.

Toate aceste informaţii pot stimula dezvoltarea cercetărilor în domeniul virusolo-giei şi a legităţilor epizootiilor la albine. Este o direcţie nouă în descoperirea noilor legităţi de apariţie a epizootiilor virale la albine, care vor permite elaborarea unor noi biotehnologii de manipulare a infecţiilor virale la insecte şi mai ales la familiile de al-bine, produsele cărora au un rol important în alimentaţia Omului.

11

Bibliogra e

Allen, M., Ball, B1. . The incidence and world distribution of honey bee viruses. // Bee World. 1996. Nr.77. p. 141–162.

Anderson, D., Trueman, J.2. Varroa jacobsoni is more then one species. // Exper. Appl. Acarol. – 2000/ - 24, Nr. 3. – p. 165-189.

Anderson, D.3. Innaparent virus infection in honey bee (Apis mellifera Linnaeus) pupae. // In proceedings of the Fourth Australasian Conference on Grassland Invertebrate Ecology. New Zeland. 1985. p. 244-254.

Anderson, D.4. A comparison of serological techniques for detecting and identifying honeybee viruses. // J. Invertebr. Pathol. 1984. Nr. 44, p. 233–243.

Bailey, L., Gibbs, A., Woods, R.5. Sacbrood virus of the larval honey bee (Apis mellifera Lin-naeus). // Virology. 1964. Nr. 23. p. 425–429.

Bailey, L. 6. The incidence of virus diseases in the honey bee. // Ann. Appl. Biol. 1967. Nr. 60. p. 43–48.

Bailey, L.7. The multiplication and spread of sacbrood virus of bees. // Ann. Appl. Biol. 1969. Nr. 63. p. 483-491.

Bakonyi, T., Farkas, R., Szendroi, A., Dobos-Kovacs, M., Rusvai, M.8. Detection of acute bee paralysis virus by RT-PCR in honey bee and Varroa destructor eld samples: screening of representative Hungarian apiaries. // Apidologie. Nr. 33. 2002. p. 63–74.

Ball, B.9. Varroa and viruses, In P. Munn and R. Jones (ed.), Varroa! Fight the mite. International Bee Research Association. // Cardiff, Wales. 1997. p. 11–15.

Ball, B., Allen M.10. The prevalence of pathogens in honey bee (Apis mellifera) colonies infested with the parasitic mite Varroa jacobsoni. // Ann. Appl. Biol. 1988. Nr. 113. p.237–244.

Batuev, Y.11. New information about virus paralysis. // Pchelovodstvo Nr. 7. 1979. p. 10-11.Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S.12. Detection of acute bee paralysis virus and

black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 67. 2001. 2384–2387.

Bere´nyi, O., Bakonyi, T., Derakhshifar, I., Ko¨glberger, H., Nowotny, N.13. „Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian Apiaries”. Applied and Environmental Microbiology. // Apr. 2006. Vol. 72. No. 4. p. 2414–2420.

Bowen-Walker, P.,. Martin, S., Gunn, A.14. The transmission of deformed wing virus between honeybees (Apis mellifera L.) by the ectoparasitic mite Varroa jacobsoni Oud. // J. Invert. Pathol. 1999. Nr. 73. p. 101–106.

Brcˇa´k, J., Kralik, O.15. On the structure of the virus causing sacbrood of the honey bee. // J. In-vertebr. Pathol. 1965. Nr. 7. p. 110–111.

Ciuhrii, M.16. Biologia Baculovirusurilor şi virusurilor poliedrozei citoplasmatice. // Ed. “Stiinta”. Chişinău. 1988. p. 256.

Evans, J., Hung, A.17. Molecular phylogenetics and the classi cation of honey bee viruses. // Arch. Virol. 2000. Nr. 145. p. 2015-2026.

Fievet, J., Tentcheva, D., Gauthier, L., de Miranda, J., Cousserans, F, Colin, .M., Bergoin, M.18. Localization of deformed wing virus infection in queen and drone Apis mellifera L. // Virology Journal. 2006. 3:16.

Ghosh, R., Ball, B., Willcocks , M., Carter, M.19. The nucleotide sequence of sacbrood virus of the honey bee: an insect picorna-like virus. // J. Gen. Virol. 1999. Nr. 80. p. 1514–1549.

Grabensteiner, E., Ritter, W., Carter, M., Davison, S., Pechhacker, H., Kolodyiejek, J., Boeck-20. ing, O., Derakhshifar, I., Moosbeckhofer, R., Licek, E., Nowotny, N. Sacbrood Virus of the Honeybee (Apis mellifera): Rapid Identication and Phylogenetic Analysis Using Reverse Transcription-PCR. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. Jan. 2001. p. 93–104.

Hung, A.21. PCR detection of Kashmir bee virus in honey bee excreta. // J.Apic. Res. Nr. 39. p. 103-106.

Laidlaw, H.22. Contemporary queen rearing. // Dadant and Sons, Hamilton, Ill. 1979.Miranda, J., Drebot, M., Tyler, S., Shen, M., Cameron, C, Stoltz, D., Camazine, S.23. Complete

nucleotide sequence of Kashmir bee virus and comparison with acute bee paralysis virus. // Journal of General Virology. Nr. 85. 2004. 2263–2270.

12

Miaoqing, S., Cui, L., Ostiguy, N., Cox-Foster, D.24. Intricate transmission routes and interactions between picorna-like viruses (Kashmir bee virus and sacbrood virus) with the honeybee host and the para-sitic varroa mite. // Journal of General Virology. Nr. 86. 2005. p. 2281-2289.

Nordstom, S., Fries, I., Aarhus, A., Hansen, H., and S. Korpela.25. Virus infection in Nordic honey bee colonies with no, low or severe Varroa jacobsoni infestations. // Apidologie. Nr. 30.1999. p. 475–484.

Ribie`re, M., Faucon, J., and M. Pe´pin.26. Detection of chronic honey bee (Apis mellifera L.) paralysis virus infection: application to a eld survey. // Apidologie Nr. 31. 2000. p. 567–577.

Ribière, M., Triboulot, C., Mathieu, L., Aurières, C., Faucon, J.P., Pépin, M.27. Molecular diagnos-tic of chronic bee paralysis virus infection. // Apidologie 33, 2002. p. 339–351.

Siede, R., Buchler, R.28. First detection of Kashmir bee virus in Hesse, Germany. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2004. Nr. 117. p. 12–15.

Stoltz, D., Shen, X., Boggis, C., Sisson, G.29. Molecular Diagnostic of Kashmir bee virus infection. // J. Apic. Res. 34. 1995. p. 153–165.

Tentcheva, D., Gautier, L., Jouve, S., Canabady-Rochelle, L., Dainat, B., Cousserans F.,Colin, 30. M., Ball, B., Bergoin, M. Polymerase Chain Reaction detection of deformed wing virus (DWV) in Apis mellifera and Varroa destructor. // Apidologie. Nr. 35. 2004. p. 431–439.

Tentcheva, D., Gauthier, L., Zappulla, N., Dainat, B., Cousserans, F.,. Colin, M., Bergoin, M31. . Prevalence and seasonal variations of six bee viruses in Apis mellifera L. and Varroa destructor mite popu-lations in France. // Appl. Environ. Microbiol. Nr. 70. 2004. p. 7185–7191.

Toderaş, I., Movilă, A., Gauthier, L., Bergoin, M., Munteanu, N., Rudic, V., Oboroc, T., Cous-32. seranans, F., Railean, N. Sos honey bee: Detection of four highly pathogenic bee viruses in apiaries from Republic of Moldova. // Akademos. Nr.3 (10). 2008. p. 82-84.

Waite, R., Thompson, H., Brown, M., Watkins, M., Bew, M.33. Studii preliminare de determinare ai agenţilor patogeni ai albinei melifere, // National Bee Unit, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ, Anglia.