DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR PRODUSE DE GENURILE CORYNEBACTERIUM, LISTERIA

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR PRODUSE DE GENURILE CORYNEBACTERIUM, LISTERIA 13.1. Genul Corynebacteriumtc "13.1. Genul Corynebacterium"Genul Corynebacterium cuprinde un grup heterogen de bacterii n cadrul crora se distinge n primul rnd specia C. diphteriae, specie nalt patogen care produce difteria i o mare varietate de bacili gram pozitivi, nesporulai, aerobi i facultativ anaerobi, imobili, catalazo-pozitivi i cu dispunere caracteristica de litere chinezeti. Specii nalt patogene sunt pe lng C. diphteriae i C. ulcerans i C. pseudotuberculosis, deoarece sunt singurele specii care pot secreta toxina difteric, avnd n comun i unele caractere biochimice.

Semnificaia clinic. Difteria este o toxiinfecie produs de Corynebacterium diphteriae care se manifest n forma ei caracteristic printr-o leziune la poarta de intrare, cel mai frecvent la nivelul amigdalelor, unde produce un exudat fibros aderent (falsa membran) asociat cu fenomene toxice generale, datorit difuzrii n organism pe cale hematogen a toxinei specifice. O form special de difterie este difteria plgilor. Aceasta se observ, rar, la nou-nscui (difteria cordonului ombilical) i la nivel vaginal sau pe rni (n zonele tropicale) etc.

C. ulcerans produce mastite la vite de unde se transmite prin lapte la om, care poate face o boal asemntoare difteriei.

C. pseudotuberculosis este un comensal al animalelor (oi, cai) de unde se transmite fie prin lapte fie prin contact direct la om. Boala are manifestri asemntoare difteriei.La aceste specii se adaug corynebacteriile comensale, care populeaz pielea, mucoasele tractului respirator superior, gastro-intestinal i uro-genital ca, de pild C. xerosis, C. striatum, grupul JK, (un grup de corynebacterii multirezistente la antibiotice care au fost propuse ca o nou specie a genului Corynebacterium sub denumirea de C. jeikeium) C. minutissimum, C. genitalium i multe altele. Aceste specii comensale pot produce infecii n anumite condiii n care ele se manifest ca germeni oportuniti. n ultimii 15 ani incidena infeciilor produse de aceste corynebacterii a crescut considerabil. n consecin, se recomand identificarea lor ori de cte ori sunt izolate din produse natural sterile i posibil implicate n etiologia unei infecii.

13.2. Corynebacterium dyphteriaeRecoltarea. Diagnosticul de laborator urmrete confirmarea diagnosticului clinic de boal i a strii de purttor prin izolarea i identificarea bacilului difteric din produsele patologice i evidenierea potenialului toxigen.Localizarea cea mai frecvent a falselor membrane o ntlnim la nivelul amigdalelor i a faringelui. De aici, din straturile profunde ale depozitului se va recolta secreie cu mai multe tampoane farigiene. La purttori, se va recolta secreia nazal cu tampoane flexibile de alginat, cu care s se poat ptrunde pn pe pereii posteriori ai nazofaringelui. Probele se transport pe medii de transport obinuite Stuart sau Amies. Dac prelucrarea se face dup 24 de ore de la recoltare, se nsmneaz tampoanele n mediu de mbogire cu telurit, ca de pild OCST (ou, cistein, ser, telurit).

Examenul direct. Examenul microscopic al secreiei faringiene nu are valoare diagnostic, ntruct bacilul difteric nu poate fi deosebit pe baza caracterelor sale morfologice de corynebacteriile comensale care populeaz mucoasa respiratorie superioar. El are o valoare orientativ n cazul n care diagnosticul clinic este evident.

Izolarea. Probele recoltate se nsmneaz pe geloz snge i pe medii selective ce conin telurit, cum sunt mediul Tindsdale i Gundel -Tietz. Dac nu avem medii selective, se aplic pe geloz snge un microcomprimat de fosfomicin care va inhiba dezvoltarea florei asociate.

Dac tampoanele nu au fost ntroduse iniial n mediu de mbogtire OCST, se nsmneaz i pe mediul Lffler (conine ser coagulat de bou) pe care bacilul difteric se dezvolt foarte bine. n final tampoanele se introduc ntr-un mediu lichid, ce conine ser i snge, pentru 24h, iar apoi se fac subculturi pe mediile cu telurit.

Identificarea. Examenul microscopic al coloniilor crescute pe mediul Lffler arat prezena corynebacteriilor, care sunt bacili gram pozitivi la limit, drepi sau uor ncurbai, cu capetele mciucate, ntre 2-6 lungime, grupai sau n grmezi cu forme asemntoare literelor chinezeti sau majusculelor. Morfologia poate, ns, s mbrace aspecte diferite, bacili putnd avea capetete ascuite, dimensiuni mai mici etc.

Caractere culturalepe geloz snge bacilul difteric dezvolt colonii albe gri-perlate care uneori sunt nconjutare de o zon mic de hemoliz;

pe mediul Tinsdale C. diphteriae, C. ulcerans i C. pseudotuberculosis apar sub forma unor colonii mici, cenuii-negre care prezint uneori un halou cafeniu, ce se intensific dup 48 ore de incubaie la 37C. Haloul este rezultatul reaciei dintre teluritul de potasiu i H2S produs de aceste corynebacterii din L-cistina din mediu i este constituit dintr-un precipitat de sulfur de telur. Difterimorfii, dac nu sunt inhibai de mediu, dau colonii mari negre, lipsite de halou;pe mediul Gundel Tietz - bacilii difterici apar sub form de colonii friabile de culoare neagr intens (datorit metabolizrii teluritului de potasiu din mediu, n telur metalic). Aspectul coloniilor de pe mediul Gundel-Tietz, examinate la lup, permite orientarea cu privire la biotipul de bacil difteric. Tipul gravis produce colonii negre, plate, cu suprafaa rugoas, ombilicate, cu striuri radiare i margini crenelate (aspect de floare de margaret). Tipul intermedius d colonii negre, plate, cu centrul acuminat i mai nchis la culoare, cu margini regulate. Tipul mitis are colonii negre, rotunde, cu margini regulate, suprafaa neted i lucioas;pe mediul Lffler bacilii difterici produc colonii albe cremoase.

Coloniile suspecte se trec obligatoriu pe mediu Lffler, identificarea efectundu-se pe germenii crescui numai pe acest mediu.

La examenul microscopic pe preparate colorate Del-Vecchio sau Neisser se evideniaz granulele metacromatice sau corpusculii Babe Ernst. n coloraia Del Vecchio, corpul bacterian apare colorat galben deschis iar granulele de volutin n brun-verzui. Bacilii au o dispoziie caracteristic de litere chinezeti sau majuscule, X, L, V etc. Cele trei biotipuri au aspect diferit la examenul microscopic. Tipului mitis i corespunde descrierea de mai sus. Tipul intermedius este foarte pleomorf, bacilii fiind lungi. Tipul gravis prezint de obicei bacili scuri, cocoizi sau piriformi ce seamn mai degrab cu difterimorfii dect cu bacilii difterici.

Identificarea de precizie se face prin teste biochimice, dintre care cele mai importante sunt fermentrile de zaharuri. Se mai cerceteaz prezena cistinazei, care este pozitiv la baciul difteric i a ureazei care lipsete.

testul cistinazei (proba Pisu). Metoda se bazeaz pe proprietatea bacilului difteric de a descompune cistina cu producere de H2S i pe calitatea acestuia de a se nnegri n prezena acetatului de plumb din mediu, prin producerea de sulfur de plumb. Mediul de cultur folosit conine geloz, ser de bou, cistin i acetat de plumb. Se nsmmeaz tulpina de cercetat prin nepare cu ansa dreapt pe mediu (care este repartizat n eprubete de hemoliz) i se incubeaz la termostat 18 ore. Bacilii difterici se dezvolt n profunzime, producnd o nnegrire pe traiectul nepturii i un halou cafeniu n jur datorit eliberrii H2S n prezena acetatului de plumb din mediu. Testul este negativ pentru difterimorfi.testul ureazei se bazeaz pe eliberarea de amoniac de ctre ureaza bacterian, care acioneaz asupra unui mediu cu uree. Reacia este pozitiv pentru difterimorfi i negativ pentru difterici.fermentrile de zaharuri se efectueaz pe mediu Hiss (ap peptonat, ser de bou, indicator Andrade-fuxin acid i soluii de zaharuri) sau prin corynetest n care substratul este reprezentat de microdiscuri impregnate cu zaharuri, avnd ca indicator albastru de bromthymol. Testul se execut n plci de plastic cu godeuri, fiind rapid (se citete dup 4 ore la 37C) i recomandat ca o alternativ la testul pe mediul Hiss, care dureaz 18 ore.

Toxigeneza. Stabilirea potenialului toxigen este obligatorie la toate tulpinile de C. diphteriae, C. ulcerans i C. pseudotuberculosis. Testarea se face cel puin din 10 colonii, deoarece la acelai pacient pot fi prezente i tulpini netoxigene. Toxigeneza se poate evidenia in vivo prin inoculare la cobai, precum i in vitro prin testul Elek.Testul de toxigenez in vivo (boala experimental) se realizeaz pe cobai. Inoculul utilizat se prepar fie prin suspendarea unei culturi de pe mediul Lffler n bulion, fie dintr-o cultur bogat de 24 de ore n bulion. Se injecteaz intraperitoneal unui cobai 1000 UI de antitoxin difteric. La 3 ore dup injectare se noculeaz acestui cobai i unui cobai neimunizat 2-3 ml de suspensie bacterian. Dac tulpina este toxigen cobaiul neimunizat va muri n 24-72 de ore cu semne specifice de intoxicaie difteric: edem gelatinos la locul de inoculare, lichid seros n pleur, congestia capsulelor suprarenale. Animalul imunizat va supravieui. Dac tulpina toxigen este C. ulcerans sau C. pseudotuberculosis, se poate ntmpla ca ambele animale s moar, deoarece aceste dou specii pot produce i alte toxine n afar de toxina difteric.

Testul de toxigenez in vitro(Elek). Testul se efectueaz n plci petri cu mediu Elek (geloz cu ser de bou). Se decupeaz pe diametrul plcii un an n care se introduc 0,5 ml ser antidifteric nefenolat (antitoxin difteric). Dup absorbia serului, anul se plombeaz cu geloz. Se face nsmnarea cu cultur microbian de pe mediul Lffler, perpendicular pe anul cu antitoxin difteric. Concomitent se nsmneaz i o tulpin martor, sigur toxigen. Se incubeaz 24 ore la temperatura de 37C. Tulpina de cercetat este toxigen dac n unghiul format de linia de cultur i an apare o linie de precipitare (imunodifuzie radial dubl), linie obligatorie i la tulpina martor. Liniile de precipitare se intensific prin pstrare la frigider. Spre deosebire de testul in vivo, care deosebete toxinele secretate de cele 3 specii, n testul Elek nu exist interferen.

Toxigeneza se poate cerceta i pe culturi de celule, n care toxina difteric produce un efect citotoxic la 24 de ore.

Sensibilitatea la antibiotice. C. diphteriae este sensibil la toate antibioticele active fa de bacteriile gram pozitive (penicilin, vancomicin, eritromicin etc). Tratamentul difteriei este, ns, imunologic, cu antitoxin care s neutralizeze toxina secretat de germen. Totui, antibioticele se administreaz att bolnavilor precum i contacilor, n scopul limitrii transmiterii infeciei.

13.3. Genul Listeria

Germenii din genul Listeria sunt bacili gram pozitivi, aerobi, nesporulai, cu dimensiuni cuprinse ntre 0,4-0,5 m diametru i 0,5-2 m lungime, cu capetele rotunjite, neramificai, dispui n palisade, sub forma literei V, sau n lanuri. Prezint flageli peritrichi n numr de 1-5, care le asigur o mobilitate caracteristic n piruet.

Genul Listeria cuprinde 7 specii mprite n dou mari grupuri. Mai importante din punctul de vedere al patogeniei la om sunt: L. monocytogenes, L. seeligeri i L. ivanovii.

Semnificaia clinic. Infeciile cu germeni din genul Listeria pot apare sub forma unor cazuri sporadice sau focare epidemice. Ultimele focare epidemice sugereaz faptul c listerioza este de fapt o toxiinfecie alimentar, cea mai frecvent cale de transmitere a bolii fiind n prezent cea alimentar. Alimentele cel mai frecvent implicate n focarele epidemice sunt varza, laptele, brnzeturile, puii, curcanii, laptele, pateul, limba de porc, ciupercile etc.

Cea mai grav form de listerioz este ns cea materno-fetal, nu att pentru mam, ct pentru ft sau nou-nscut. Acesta poate face o form precoce de infecie (la 3-4 zile de la natere, mai ales la prematuri), care se manifest sub forma unei septicemii generalizate cu cca 40-50% cazuri mortale, fie sub forma unui sindrom tardiv (la 7-15 zile de la natere), caracterizat printr-un sindrom meningeal, manifestri digestive i rareori conjunctivit. Alte forme clinice semnalate la aduli i copilul mare (n special la cei cu imunodepresie: leucemii, infecii cu virus HIV) sunt reprezentate de meningite, encefalite, sau chiar septicemii, cu o rat mare a mortalitii, sau cu sechele neurologice printre supravieuitori. Au mai fost raportate listerioze cutanate primare, artrite, osteomielite, abcese intraabdominale, peritonite, infecii pulmonare n special la veterinari i lucrtorii din abatoare (lund caracter de boal profesional), care au venit n contact cu esuturile infectate ale animalelor bolnave.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic i serologic.

Recoltarea produselor patologice. Produsele patologice sunt recoltate n funcie de forma i localizarea infeciei: LCR, snge, lichid amniotic, fragmente tisulare, secreii vaginale, respiratorii, probe tegumentare, probe alimentare, probe de salubritate etc., i nu necesit condiii speciale de transport. n cazul transportului prelungit produsele patologice se vor pstra la 35C n incubator (dar nu peste 48 de ore), iar pentru testri care dz, deseori vizibil doar dup desprinderea coloniei. Hemoliza poate fi pus n eviden prin inocularea n geloz snge a unei colonii despinse cu un ac de pe mediu, cu incubare 48 de ore la 35C. Doar cele trei specii menionate (L. monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii) sunt beta hemolitice. Primele dou prezint o zon discret de hemoliz bine delimitat, iar cea de-a treia o zon larg.

Pe mediul LPM, sau pe alte medii selective fr snge coloniile cresc n 1-2 zile, iar examinarea trebuie fcut la microscop prin transiluminare oblic i oglind concav poziionat la un unghi de 45(tehnica Henry). Listeriile apar de culoare albastr (coloniile mici, tinere) spre alb (cele cele mature, mari), n timp ce coloniile non-listeria apar n general de culoare portocalie.

Pe mediile Oxford, coloniile de listeria apar negre cu halou negru dup o incubare de 24-48 de ore la 35-37C (datorit hidrolizei esculinei i formrii compuilor de fier de culoare neagr). Pe mediile PALCAM coloniile sunt de culoare gri-verzui, cu halou negru.

Caractere biochimice. Un test util cu rol n diferenierea speciilor de listeria este testul CAMP. Pe o plac cu geloz snge se nsmneaz n striuri paralele dou tulpini microbiene de S.aureus i Rhodococcus equi, iar perpendicular pe direcia de nsmnare a celor dou tulpini se nsmneaz tulpinile de Listeria de diferite specii. Plcile se incubeaz 24-48 de ore la 35C, iar apoi se examineaz. Doar n cazul L. monocytogenes, la confluena sa cu cea de S.aureus va apare o zon exacerbat de hemoliz, comparativ cu celelalte specii nevirulente la care acest fenomen nu se constat (acelai fenomen fiind observat i n cazul L. ivanovii la confluena cu tulpina de R. equi).

Protocolul rapid de identificare presupune:

1.caracterul morfologic de cocobacili gram pozitivi,

2.caracterul catalazo-pozitiv,

3.creterea de tip umbrel sau brad cu vrful n jos pe mediile semisolide, la 25-30C,

4.beta hemoliza pe geloza-snge de berbec,

5.testul CAMP pentru L. monocytogenes (pe plac cu S.aureus),

6.hidroliza esculinei,

7.producere de acid prin fermentarea ramnozei i xilozei.

Sensibilitatea la antibiotice. Listeriile sunt sensibile in vitro la penicilin, ampicilin, gentamicin, eritomicin, tetraciclin, rifampicin, cloramfenicol. S-a constatat ns c numeroase din aceste antibiotice au doar efect bacteriostatic, de aceea se prefer asociaia penicilin+ampicilin sau aminoglicozide (experimental s-a constatat o amplificare a activitii antimicrobiene a penicilinei n infecii cu L. monocytogenes). Cefalosporinele s-au dovedit a fi ineficiente n aceste infecii.

Diagnosticul serologic nu are valoare deosebit.