DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATELA ANTIBIOTICE A SPECIILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAMADatorita specificitatii lor de actiune, antibioticele manifesta eficienta diferita fata de diferite specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic definestespectrul de activitateal antibioticului respectiv. In functie de numarul si diversitatea speciilor microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi :larg(de exemplu, spectrul de actiune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gram-negative, inclusiv chlamidii si rickettsii si specii Gram-pozitive;penicilinele sunt active in special fata de specii Gram-pozitive, dar si Gram-negative, inclusiv chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un numar mare de specii bacteriene Gram-pozitive si Gram-negative si pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente);ingust(novobiocina este activa pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar si pe coci si bacili Gram-negativi, cum ar fi hemofilii si pasteurelele; glicopeptidele, bacitracina, pe bacterii Gram pozitive);limitat(nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe).Chiar in cadrul aceleiasi specii microbiene, pot exista diferente mari de sensibilitate a diferitelor tulpini fata de un anumit antibiotic, astfel ca stabilirea tratamentului cu antibiotice in clinica necesita izolarea tulpinii microbiene care reprezinta agentul etiologic al infectiei respective (mai ales daca acesta apartine unor genuri si specii supuse fenomenului de dobandire a rezistentei clinice) si determinarea spectrului sau de sensibilitate la antibiotice.Evaluarea in vitroa eficientei unui antibiotic se realizeaza prin masurarea a 3 parametri, care variaza in functie de concentratia antibioticului si de timpul sau de actiune:concentratia minima activa(=C.M.A.)- esteconcentratia la care antibioticul poate induce anumite perturbari in activitatea metabolica a microorganismelor, fara a afecta capacitatea de multiplicare si viabilitatea microorganismelor;concentratie minima inhibitorie(=C.M.I.) -este concentratiala care un antibiotic inhibamultiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);concentratie minima bactericida(=C.M.B.) -este concentratia la care un antibiotic are actiune letala asupramicroorganismelor (efect bactericid).Cunoasterea acestor parametri prezinta o importanta clinica deosebita, deoarece, pentru unele antibiotice, concentratia bactericida este foarte greu de atinsin vivo.Din acest motiv, unele antibiotice ca tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate antibiotice bacteriostatice.Pe langa valoarea C.M.I. determinatain vitro, in alegerea tratamentului cu un anumit antibiotic, trebuie sa se tina cont si de calitatile farmacologice ale antibioticului respectiv (de exemplu, posibilitatea realizarii concentratiei active la nivelul focarului de infectie), de eventualele efecte secundare si de starea fiziologica a bolnavului.Tehnica de evidentiere a sensibilitatii la antibiotice a unei tulpini microbiene se numesteantibiograma. Antibiograma trebuie practicata in mod obligatoriu in cazul microorganismelor patogene, supuse fenomenului de dobandire a rezistentei, inaintea inceperii oricarui tratament cu antibiotice.Dupa determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnicicalitative(in care tulpina microbiana de testat este pusa in contact cu diferite antibiotice aflate intr-o anumita concentratie), se pot practica testecantitativepentru determinarea valorii C.M.I. (in care tulpina microbiana este pusa in contact cu concentratii crescatoare ale aceluiasi antibiotic).

1. Metode calitative de determinare a spectrului de susceptibilitate la antibioticeMetoda difuzimetrica (Kirby-Bauer)Este o metoda foarte simpla si rapida, care permite determinarea concomitenta a spectrului de sensibilitate a microorganismului si a valorii C.M.I. in vederea calcularii dozelor terapeutice de antibiotice. Metoda are mai multe variante, in practica folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizata, recomandata de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation).O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbiana studiata (densitatea inoculului, specia, varsta culturii), mediul de cultura (compozitia mediului, pH-ul, densitatea si grosimea stratului de mediu), tehnica folosita si criteriile de interpretare a rezultatelor obtinute, pot influenta rezultatele unei antibiograme. Din acest motiv, tehnica trebuie efectuata in conditii standardizate, reproductibile, conform indicatiilor forurilor internationale in domeniu.Pesuprafata unui mediu agarizat insamantat in panza cu un inocul standardizat, obtinut din tulpina de testat, se plaseaza la distante egale discuri impregnate cu solutii de antibiotice de o anumita concentratie care vor difuza in mediu, realizand un gradient de concentratie invers proportional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distanta fata de disc. Daca tulpina este sensibila la un anumit antibiotic, cresterea microbiana va fi inhibata pe o anumita suprafata in jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv, suprafata denumitazona de inhibitie a cresterii.Citirea rezultatelor se realizeaza prin masurarea diametrelor zonelor de inhibitie a cresterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul uneirigle gradate. In cazuri de urgenta clinica se poate realiza o prima citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face in functie de dimensiunea zonelor de inhibitie a cresterii, exprimand rezultatul cu termenii de tulpinasensibila(S),rezistenta(R) sauintermediarsensibila(I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate si corespunzatoare metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru metoda difuzimetrica recomandata de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards,USA), in prezent CLSI (Clinical laboratory and Standards Institute)Termenii S, I, R definesc de fapt si categoriile de antibiotice, in functie de efectul lor clinic, dupa cum urmeaza:categoriaS, inseamna ca exista o mare probabilitate ca antibioticul, administrat in doze obisnuite, sa elimine infectia determinata de tulpina testata (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentratiilor umorale obtinute in urma administrarii unei doze obisnuite);categoriaI, semnifica probabilitatea ca antibioticul sa fie eficientin vivoprin administrare locala sau prin realizarea in mod fiziologic a concentratiilor mari in organe sau tesuturi (rinichi, ficat, cai biliare), la nivelul carora este localizat procesul infectios;categoriaRinseamna ca, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din organism a agentului infectios, a carui sensibilitate a fost testata sau rezultatul tratamentului este imprevizibil.La citirea si interpretarea rezultatelor se iau in considerare diametrele zonelor de inhibitie, lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber.Aparitia coloniilor la marginea sau in interiorul zonei de inhibitie se poate datora urmatorilor factori: cultura este mixta sau suprainfectata; cultura este pura, dar prezinta celule heterorezistente; aparitia mutantelor rezistente; dezvoltarea tardiva a unor celule, de fapt sensibile, si aparitia coloniilor dupa ce antibioticul s-a diluat prin difuzie in mediu.

2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.Metoda dilutiilor in mediul lichid sau in agarPrincipiulmetodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este insamantat intr-un gradient discontinuu de concentratii ale antibioticului, fie in placi cu mediu agarizat, fie in tuburi cu bulion nutritiv. Dupa incubarea adecvata, se citeste valoarea C.M.I.prin observarea macroscopica atuburilor: in primele tuburi, cu concentratii mari de antibiotic, cresterea culturii nu este vizibila, microorganismele fiind omorate sau inhibate in prezenta antibioticului. Concentratia de antibiotic corespunzatoare tubului cu cea mai mica concentratie, care inhiba cresterea vizibila a culturii microbiene, reprezinta valorea C.M.I. (mcg/ml) pentru antibioticul respectiv. In tuburile urmatoare, inclusiv tubul martor de crestere, mediul se tulbura ca urmare a cresterii microbiene.In tubul martor de sterilitate, obligatoriu mediul trebuie sa ramanasteril(limpede), iar peplacile cu mediu agarizat, coloniile lipsesc.Determinarea C.M.I. se utilizeza pentru stabilirea dozei terapeutice si a caii de administrare in cazul infectiilor severe, supravegherea evolutiei rezistentei bacteriilor la antibiotice, cuantificarea activitatii bactericide a substantelor antimicrobiene.Aceasta metoda permite si aflarea valorii C.M.B. (concentratia minima bactericida) pentru antibioticul testat. Pentru aceasta, se preleveaza 0.01 ml sau 0.1 ml din tuburile utilizate pentru tehnica dilutiilor in mediu lichid (din tubul la care s-a stabilit valoarea C.M.I. si din tuburile anterioare care prezinta concentratii superioare de antibiotic) si se insamanteaza pe suprafata unor placi cu mediu solid nesuplimentat cu antibioticul testat. Dupa incubare, se va observa dezvoltarea microorganismelor la dilutia corespunzatoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este data de cea mai mica concentratie de antibiotic care reduce numarul coloniilor pana la 99.9%. MetodaE-testLa ora actuala, exista variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea valorii C.M.I.. O astfel de varianta esteE-testul(Epsilometer test), ce utilizeaza benzi impregnate cu diferite antibiotice ale caror concentratii variaza exponential si sunt inscrise pe banda respectiva. Zona de inhibitie a cresterii microorganismului testat are aspect de elipsa, al carei diametru variaza direct proportional cu gradientul de concentratie a antibioticului difuzat in mediu, diminuandu-se odata cu scaderea concentratiei astfel ca, la o anumita valoare, zona de inhibitie a cresterii va intersecta banda, concentratia inscrisa pe banda la acest nivel indicand valorea C.M.I.3. Controlul de calitate in testarea sesibiltatii la antibioticeObiective:-QC (quality control)are drept scop sa asigure:- precizia si fiabilitatea tehnicii de testare a sensibilitatii- performanta reactivilor utilizati- performanta personalului care efectueaza testele.Pentru a raspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizeaza antibiograma trebuie sa dispuna de tulpini de referinta :-Escherichia coliATCC 25922CIP 7624-Escherichia coliATCC 35219-Staphylococcus aureusATCC 25923CIP 7625-Staphylococcus aureusATCC 43300-Staphylococcus aureusATCC 25923CIP 76110-Enterococcus faecalisATCC 29212CIP 103214-Haemophilus influenzaeATCC 49247-Haemophilus influenzaeATCC 49766-Neisseria gonorrhoaeATTC 49226-Neisseria gonorrhoaeATTC 49226- Streptococcus pneumoniaeATCC 49619Proceduri de control: Controlul de calitate trebuie sa fie realizat pentru fiecare sarja noua de mediu Mueller Hintonsi / sau antibiotic. Tulpinile de referinta care trebuie sa fie obligatoriu testate sunt:o-Escherichia coliATCC 25922o-Staphylococcus aureusATCC 25923o-Staphylococcus aureusATCC 25923 Aceste tulpini vor fi testate in aceleasi conditii ca si cele bacteriene a caror rezistenta se evalueaza Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre aceste tulpini Principalele surse de eroare sunt: utilizarea unui inocul bacterian de densitate necorespunzatoare, insamantarea(striuri rare) si masurarea neadecvata a diametrelor zonelor de inhibitie. Daca rezultatele nu sunt satisfacatoare, trebuie controlati urmatorii parametri:1. citirea si interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie2. mediul de cultura3. inoculul4. discurile de antibiotice5. tulpinile de referintaCitirea si interpretarea- citirea antibiogramei trebuie realizata cu ajutorul unei rigle precise si sa se evite la maximum erorile, mentinandu-se instrumentul de masura perpendicular pe axa optica;- trebuie verificat daca interpretarile (S, I, R) corespund diametrelor masurate;- trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire.

Controlul mediului:pH:-trebuie sa fie 7,2 - 7,4-variatiile de pH influenteaza activitatea aminozidelor, macrolidelor si fenicolilor- controlul trebuie facut pentru fiecare sarja de mediu Mueller Hinton, cu ajutorul unui pH-metru: se plonjeaza electrodul intr-un flacon de MH semilichid (atentie: temperatura nu trebuie sa fie prea ridicata pentru a evita riscul aprinderii electrodului), geloza trebuie sa se solidifice in jurul extremitatii electrodului; in acest moment se inregistreaza pH-ul.Umiditatea:-placile cu mediu trebuie sa fie uscate iinainte de inoculareConcentratia in timidina sau timina:- o concentratie prea crescuta de timidina determina o reducere a diametrelor zonelor de inhibitie in jurul discurilor de sulfamide si trimetoprim- pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpina de referintaEnterococcus faecalisATCC 29212; diametrul de inhibitie in jurul discului de cotrimoxazol trebuie sa fie>/= 20 mm.Concentratia in cationi divalenti:- o concentratie prea crescuta in ioni bivalenti (in principal de Ca2+si Mg2+) determina o reducere a diametrelor zonelor de inhibitie in jurul discurilor de aminozide (testate pentruP. aeruginosa), in timp ce concentratiimai mici favorizeaza aparitia unor zone de inhibitie prea mari- ionii de Zn influenteaza activitatea carbapenemelor- concentratiile trebuie sa fie :Ca2+= 50 100 mg si Mg2+ = 20 - 35 mg.Controlul inoculului:- etalonul 0,5 Mc Farland -se poate obtineastfel:0,5ml Mg Cl2sol 1% (10 g/l)+95,5 ml H2SO41% (10 ml/ l);etalonul astfel preparat trebuie sa prezinte o DO de 0,08 - 0,1 la 625 nm.- se repartizeaza aceasta solutie in volume de 10 ml, in tuburi identice cu acelea care vor servi la prepararea inoculului- tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adezivetc.)- se marcheaza nivelul lichidului cu un marker si se controleaza periodic masurandu-i DO- se conserva tuburile la temperatura ambianta, ferit de lumina (hartie de aluminiu)- tubul etalon se agita inainte de a-l compara cu inoculul preparat: inoculul si etalonul trebuie sa aiba aceeasi turbiditate atunci cand sunt comparate pe un fond cu dungi.Discurile de antibiotice(tabelul 10, 11):-inainte de utilizare, cartusul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilitatii, mai ales pentru-lactamine, si pentru incarcatura discului;-stocul de cartuse de antibiotice trebuie sa fie pastrat la -20oC; aplicatorul incarcat cu antibiotice trebuie pastrat la + 4oC;-discurile umede sau in contact direct cu gheata, sau care au fost conservate la temperatura ambiantanu trebuie utilizate;-cartusele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h inainte de utilizare.

Tulpinile de referinta:- de la primirea lor, tulpinile de referinta vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecand de la aceasta cultura se fac 12 subculturi care se repartizeaza in 12 tuburi si se conserva prin congelare la - 70 C.Tulpina de referintaMod de conservareObservatii

E. coliATCC 25922,S. aureusATCC 25923,P. aeruginosaATCC 27853- liofilizare- congelare la - 70oC- geloza profunda- conservare pe termen lung- conservare pe termen lung- trecere regulata a tulpinii

S. pneumoniaeATCC 49619- liofilizare- congelare la -70oCAlternativ se poate insamanta o GSC*inclinata, incubata 24 h, apoi conservata la 20oC. Aceasta tehnica permite conservarea pana la 6 luni.

*GSC = geloza sangeColumbiaIn fiecare luna se va scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi testate; se refac 12 tuburi cu culturi pentru congelare, pentru anul viitor, pornind de la al 12-lea tub consevat

Antibiotice de testat pentrucocii Gram-pozitivi

StaphylococcusaureusLista standardPenicilina*EritromicinaLincomicinaPristinamicinaKanamicinaTobramicinagentamicinacloramfenicoltetraciclinacotrimoxazolacid fusidicrifampicina*- se testeaza pe geloza Mueller Hinton cu 4% NaCl si6g/ml oxacilinaStreptococcus spp(altii decatS. pneumoniae)Lista standardpenicilina Gampicilina sau amoxicilinaoxacilinatetraciclinaeritromicinalincomicina sau clindamicinapristinamicnaclindamicinaAntibiotice optionalerifampicinacefotaximcefepimstreptomicinakanamicinagentamicinacloramfenicolspiramicinatelitromicinalinezolidcotrimoxazol*ofloxacinvancomicinateicoplamina* - se testeaza pe geloza Mueller Hinton cu 5% sange de cal hemolizatStreptococcus pneumoniaeLista standardpenicilina Gampicilina sau amoxicilinaoxacilinacefotaxim sau ceftriaxontetraciclinaeritromicinalincomicina sau clindamicinapristinamicinaAntibiotice optionaleimipenem)streptomicinakanamicinagentamicinacloramfenicoltelitromicinalinezolidcotrimoxazol*fluorochinolonefosfomicinavancomicinateicoplamina* - se testeaza pe geloza Mueller Hinton cu 5% sange de cal hemolizatEnterococcus sppLista standard- ampicilina- gentamicina- nitrofuraniAntibiotice optionale-oxacilina*- streptomicina- kaanamicina- cloramfenicol- tetraciclina- eritromicina- lincomicina*sau clindamicina*- pristinamicina(E. faecium)- linezolid- cotrimoxazol- rifampicina- fluorochinolone- vancomicina (Hteicoplamina* - ajuta la identificareaE. faecalis (rezistenta naturala)