DETERMINAREA AMILAZEI

Căpătan Marta Tamara

An III, Ingineria și Informatica Proceselor Chimice si Biochimice

Amilaza este enzima care hidrolizează macromolecula polizaharidelor până la maltoză, trecând prin stadiul de dextrine. Este produsă de celulele secretoare din pancreasul exocrin. Punerea în evidenţă a amilazei se face,

principial în două moduri:1. Se determină cantitatea de zahăr reducător

care se formează din substrat sub acţiunea enzimei, în unitatea de timp. Acesta este principiul metodelor zaharimetrice.

2. Se determină schimbarea culorii produse prin reacţia amidonului cu iodul. Această metodă este utilizată în mod curent în laboratorul clinic.

Amilaza serica. Se preleveaza 5-10 ml sange venos intr-o eprubeta sterila cu capac rosu. Administrarea anumitor medicamente, precum morfina, demerol, codeina, trebuie intrerupta inainte de test. De asemenea, pacientul trebuie sa evite consumul de alcool timp de 24 de ore inainte de prelevarea sangelui.

Amila urinara. Se colecteaza urina intr-un recipient steril pe o perioada de timp recomandata de medic (2, 6, 8, sau 24 ore). Pacientul trebuie sa evite consumul de alcool timp de 24 ore inainte de test.Recipientul ce contine urina este pastrat la rece. Amilaza este foarte instabila in urina acida

Valori normale

Valorile normale ale amilazuriei (amilaza in urina) sunt:

5000-8000 de unitati internationale sau 8-64 de unitati Wohlgemuth

Valorile normale ale amilazemiei (amilaza in sange) sunt:

20 - 140 UI; provin din pancreas, glandele salivare, ficat.

CREȘTERI PATOLOGICE

Cresteri patologice pentru amilazuriei (amilaza in sange):

cresterea nivelului urinar al amilazei este secundara cresterii la nivelul sangelui, daca functia renala este intacta

de asemenea, cresteri ale amilazei se intalnesc in boli extrapancreatice: calculi salivari, ulcer perforat, parotidite, ocluzie intestinala, insuficienta renala, colecistita acuta

cresteri ale amilazei survin in afectiuni ale pancreasului cum ar fi pancreatita acuta, fazele de acutizare ale pancreatitei cronice, neoplasme ale capului pancreasului.

Boli ale aparatului cardiovascular:hipertensiunea arteriala, insuficienta cardiaca congestiva

Boli ale aparatului respirator: neoplasm bronho-pulmonar

Boli ale aparatului uro-genital:insuficienta renala, chistul ovarian, afectiuni ale prostatei

Boli ale aparatului digestiv:ulcerul perforat, ocluzia intestinala, suferinte ale ampulei lui Vater, peritonite, stari post-operatorii ale abdomenului superior

Boli ale glandelor anexe ale tubului digestiv:insuficienta hepatica, hepatita cronica activa,colecistita acuta cronica,hepatita cirogena.. etc

CRESTERI PATOLOGICE PENTRU AMILAZEMIEI (AMILAZA IN URINA):

Afectiuni: pancreatita acuta, ulcer peptic perforat (posterior), colecistita acuta, obstructie canal cistic, cancer pancreatic, pseudochist pancreatic, ascita pancreatica, ocluzie intestinala, perforatie intestinala, infarct intestinal, peritonita, apendicita acuta, sarcina, sarcina extrauterina, ruptura de chist ovarian, coledocolitiaza, parotidita, oreion, traumatism de gl. salivare sau pancreas, infarct pulmonar, arsuri, cetoacidoza diabetica, insuficienta renala, alcoolism acut, colangiopancreatografie retrograda endoscopica, macroamilazemia, Medicamente (Morfina, Aspirina, diuretice tiazidice, corticosteroizi, Azartioprina, contraceptive orale), ciroza.

SCĂDERI PATOLOGICE

Scaderi patologice pentru amilazuriei (amilaza in sange) apar in afectiuni de tipul: hepatite cronice,cirozele hepatice, carcinomul hepatic, alcoolismul cronic.

Scaderi patologice pentru amilazemiei (amilaza in urina) apar in afectiuni de tipul: pancreatita cronica in stadiu terminal, insuficienta hepatica, hepatita severa.

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII AMILAZEI SERICE

Amilaza 1,4-glucanhidrolaza (E.C.3.2.1.1.) catalizează hidroliza polizaharidelor solubile formate din unităţi de glucoză legate prin legături α 1-4 glucozidice.

Amilaza acţionează asupra amidonului prin scindarea legăturilor 1-4 glucozidice, producând fragmentarea substratului în molecule mai mici: dextrine, maltodextroze, maltoză, glucoză. În funcţie de greutatea moleculară a dextrinelorrezultate, acestea dau cu iodul coloraţii diferite, după cum urmează:

albastru – amilodextrine roşu – eritrodextrine galben – flavodextrine Dextrinele cu mase moleculare mici (acrodextrine) nu

dau reacţii de culoare cu iodul.

Principiul metodei: Amidonul rămas nehidrolizat în urma acţiunii enzimei din proba biologică este dozat colorimetric cu iod.

Reactivi: Substrat tamponat: 13,3 g Na2HPO4 şi 4,3 g acid benzoic. Se dizolvă în 250 ml. apă distilată la fierbere. Se adaugă 5 ml suspensie rece conţinând 200 mg amidon. Se lasă să se răcească. Se aduce la 500 ml cu apă distilată. Se păstrează la 40C (soluţia trebuie să fie limpede). Soluţie stoc iod: 3,56 g KIO3 şi 45 g KI. Se dizolvă în 800 ml apă distilată. Se adaugă prin picurare 9 ml soluţie HCl 12 M agitând continuu. Se aduce la 1 l cu apă distilată. Se păstrează la +40C timp de maxim un an.

Soluţia de iod pentru determinări: se face o diluţie din soluţia stoc 1:10 cu apă distilată. Se păstrează la +40C maxim 2 luni.

Soluţia acid clorhidric 1N.

Soluţie amilază din comprimat: soluţie enzimatică obţinută prin triturarea unui comprimat de Mezym forte în mojar şi extracţia produsului finpulverizat obţinut cu 10 ml tamponat fosfat timp de 30 min. la temperatura camerei, urmată de filtrarea soluţiei. Soluţia filtrată se aduce în balon cotat de 100 ml cu ser fiziologic tamponat.

MODUL DE LUCRU Se folosesc baloane cotate de 25 ml.

Reactivi (ml) Probă Martor

Substrat (amidon 370C)

2,5 2,5

Preincubare 15 minute la 370C

Soluţie amilaza din comprimat

0,05 -

Incubare 7,5 minute la 370C. Răcire pe gheaţă

Acid clorhiddric 1 N 1 1

Apă distilată 15 15

Soluţie iod determinări 2,5 2,5

Soluţie amilaza din comprimat

- 0,05

Se aduc ambele baloane la cotă cu apă distilatăSe citeşte absorbanţa la 660 nm faţă de apa distilatăCalcul: (AM-AP)/AM x 4200 = unităţi amilazice/dl probă

METODA WOHLGEMUTH

Principiu:

Amilaza hidrolizează amidonul transformându-l în glucide mai simple (dextrine, maltoză) care nu mai dau reacţia de culoare ca amidonul. Se determină diluţia maximă la care amilaza din produsul de cecetat hidrolizează complet o anumită cantitate de amidon.

REACTIVI

Soluţie NaCl 8,5 %o

2. Soluţie amidon 0,1% în NaCl 8,5%o

3. Soluţie iod N/10 sau soluţie Lugol diluată 1/2

Lugol diluată 1/2 Soluţia Lugol: Iod ………..….1g Iodură de K …2g 1 Apă distilată.. 50ml (Iodul metalic este foarte puţin solubil în apă.

În amestec cu KI formează un complex -triiodură de K, devenind astfel solubil)

MODUL DE LUCRU

Într-o serie de 10 eprubete mici se face o scară de diluţii de ser de la 1/1 la 1/312, astfel:

Eprubeta nr.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Diluţia formată

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/1281/2561/312

NaCl 8,5%o 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Ser 1ml 1ml

În prima şi a doua eprubetă se pune câte 1ml de ser sanguin

În a doua eprubetă şi în toate cele care urmează se pune câte 1ml de ser fiziologic

Amestecul din a doua eprubetă se omogenizează prin agitare şi, din amestec, se transferă 1ml in eprubeta a treia.

Amestecul din eprubeta a treia se omogenizează prin agitare şi, din amestec, se transferă 1ml în eprubeta a patra. Operaţia se trepetă şi cu eprubetele următoare.

Din ultima eprubetă se îndepărtează 1ml de amestec.

În fiecare eprubetă se adaugă:

Se incubează la 37o C, timp de 30 minute În fiecare eprubetă se adaugă:

Se omogenizează conţinutul fiecărei eprubete.

Eprubeta nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Soluţie amidon

2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

Eprubeta nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Soluţie Lugol (picaturi)

1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

Calculul: Primul tub în care se dezvoltă culoarea

albastră este tubul limită. Se notează diluţia tubului anterior (culoare violetă). Valoare diluţiei din eprubeta care precedă eprubeta limită se înmulţeşte cu 2

Culoarea violetă este dată de prezenţa dextrinelor

Valori normale Amilazemie: 16 - 32 unităţi Wolgemuth Amilazurie: 32 - 64 unităţi Wolgemuth

INTERPRETAREA VALORILOR

Organele în care

este localizată

Afecţiuni în care amilaza este crescută

Creşteri fals pozitive

PancreasGlande salivareMuşchiFicatDuoden

Pancreatită acutăLitiază coledocUlcer septic perforatOcluzie intestinalăParotidită acutăSarcină tubară ruptăMalabsorbţie intestinală

Administrare de morfinăAdministrare de transportori macromoleculari