Inginerie citotisulara Inginerie citotisulara si organe artificialesi organe artificiale

Ingineria tesuturilor moiIngineria tesuturilor moi

Sistemul vascular al corpului uman este alcătuit dintr-un mare număr de vase care asigură transportul sângelui prin întregul sistem circulator. Numai prin intermediul acestei reţele extinse de artere, vene şi capilare este posibilă:•menţinerea funcţionalităţii celulare (creşterea şi dezvoltarea),•absorbţia nutrienţilor esenţiali (vitamine şi minerale), •reglarea homeostaziei celulare (îndepărtarea produşilor de metabolism).

Ingineria tisulara a vaselor de sange

Sistemul vascular, în ciuda unor diferenţe complexe regionale şi de organ, prezintă o organizare histologică unitară. La modul general, marea majoritate a vaselor sangvine este alcătuită din trei regiuni histologice distincte. Fiecare regiune conţine proporţii variabile de celule musculare netede şi elastină.

Staturi din care este constituit tesutul vascular:-intima, in constitutia careia se gasesc celule endoteliale;-media, care contine celule musculare;-adventicea

Schema unei artere musculare

Tunica internă, de obicei cea mai subţire dintre cele trei tunici, este alcătuită dintr-un singur strat de celule endoteliale aşezate pe o membrană bazală (lamina bazală). Sub aceasta există un strat de ţesut de legătură subendotelial, fibro-elastic şi un strat organizat al laminei elastice interne care asigură stabilitatea şi flexibilitatea celulelor endoteliale. De asemenea în strânsă legătură cu celulele endoteliale se află celulele perivasculare denumite pericite.

Figura 2. Descrierea schematică a direcţiei de curgere a sângelui în sistemul circulator. În partea de jos a figurii sunt prezentate diferenţele structurale generale dintre artere şi vene. Ambele vase sangvine prezintă tunica internă, tunica medie şi tunica externă dar proporţia relativă de celule musculare netede, fibre elastice şi colagen prezintă variaţii semnificative

Celule endoteliale (contactul direct cu sângele) îndeplinesc un rol critic în toate aspectele homeostaziei tisulare. Celulele endoteliale :

-Reglează tonusul vascular interacţionând cu componentelesistemului nervos periferic- sunt implicate în procesele de tromboliză şi coagulare. -sunt implicate în procesele inflamatorii şi imunologice având astfel un rol important în patogenia aterosclerotică precum şi în afecţiunile vasculare ocluzive.

Membrana celulelor endoteliale este alcătuită la exterior dintr-un strat glicoproteic (glicocalix). Acesta asigură, în condiţii fiziologice, formarea unei bariere locale încărcate electric care previne migrarea transendotelială a celulelor din sânge precum şi a proteinelor plasmatice.

Tunica medie este alcătuită preponderent din celule musculare netede şi fibre de elastină. -Straturile celulare prezintă tendinţa de a fi din ce în ce mai organizate în arterele mari datorită rolului pe care-l îndeplinesc în mişcarea unor volume mari de sânge. - Un strat comun acestei regiuni a vasului sangvin este lamina elastică externă care asigură suportul structural.

Stratul extern al unui vas sangvin este reprezentat de tunica externă (adventicea). Acest strat este alcătuit aproape în totalitate din ţesut de legătură fibro-elastic.

Componenta arterială şi venoasă a sistemului cardiovascularSângele oxigenat care se întoarce de la plamâni este ejectat din

ventricolul stâng al cordului în reţeaua arterială. Arterele pot fi clasificate, funcţie de diferenţele histologice, în două tipuri distincte: elastice şi musculare.

Arterele elastice (conducătoare) sunt prezente în apropierea cordului şi a altor organe asociate cu deplasarea unor volume mari de sânge. Aceste tipuri de artere, cum ar fi aorta, sunt alcătuite din mai multe straturi de membrană elastică perforată fiind în consecinţă adaptate într-un mod particular modificărilor pe care le presupun deplasările unor volume mari de sânge. Natura elastică a pereţilor acestor vase sangvine asigură amortizarea oscilaţiilor mari care apar în curgerea sângelui fiind responsabilă astfel de omogenizarea mişcării sângelui la distanţă de cord.

Funcţia arterelor musculare (distribuitoare) este de a asigura distribuţia rapidă şi completă a sângelui către toate organele şi ţesuturile. În timp ce natura pereţilor acestor artere este predominant musculară, studiile histologice au pus în evidenţă faptul că acestea conţin fibre elastice discontinui în interiorul stratului de celule musculare netede.

Bifurcarea continuă a arterelor conduce la formarea arteriolelor. Funcţia acestora este de a reduce viteza de curgere a sângelui din arterele mai mari. Această reducere este necesară pentru a preveni afectarea capilarelor (vase fragile care realizează conexiunea dintre arborele vascular areterial şi sistemul venos).

Capilarele la rândul lor realizează reglarea microcirculaţiei prin intermediul unor interacţiuni complexe cu hormoni şi neurotransmiţători eliberaţi din sinapsele simpatice. Aceste interacţiuni au drept rezultat modificarea tonusului musculaturii netede din peretele arteriolar.

Tranziţia de la arborele vascular arterial la sistemul vascular este realizată prin intermediul reţelei capilare. Din punct de vedere histologic capilarele sunt lipsite de prezenţa musculaturii netede. În alcătuirea lor intră un singur strat de celule endoteliale (cu grosimea de 0,25 μm) care se află pe o membrană bazală. Capilarul este înconjurat de pericite sau celule Rouget. Acestea variază ca distribuţie în paturile vasculare.

Suprafaţa totală generată de capilarele din corpul uman este de 1000 m2 (suprafaţa unui teren de tenis). La nivelul acestei suprafeţe mari a patului capilar are loc schimbul de nutrienţi, substanţe solubile şi apă între sânge şi ţesuturile înconjurătoare.

Schimbul de apă şi substanţe are loc de obicei ca urmare a difuziei simple conform gradientului de concentraţie, presiunii hidrostatice şi osmotice. Pot fi deosebite mai multe tipuri de capilare: continui, fenestrate şi discontinui.

Capilarele continui prezintă un endoteliu continuu şi stratul membranei bazale. Sunt întâlnite în marea majoritate a organelor cum ar fi: cord, plaman, rinichi şi creier.

Capilarele fenestrate sunt de obicei mai rar întâlnite şi se găsesc la nivelul organelor endocrine precum şi la nivel glomerular. Aceste capilare sunt perforate de pori cilindrici, stabili din punct de vedere anatomic, cu diametrul între 75 şi 100 Å. Aceşti pori restricţionează transferul proteinelor dar permit transferul relativ liber al apei şi al soluţilor.

Capilarele discontinui (sinusoide) sunt întâlnite numai la nivelul organelor înalt specializate cum ar fi ficatul şi organele formatoare de sânge cum ar fi măduva osoasă şi splina. Porii mari dintre celulele endoteliale din cazul acestor capilare (1500-2000 Å) permit realizarea schimbului de constituenţi celulari între sânge şi ţesuturi.

Returul sângelui spre cord prin sistemul venos începe prin mişcarea sa prin venulele postcapilare care concresc pentru a forma vene mai mari. Tranziţia de la capilare la vene este marcată de reapariţia graduală a celulelor musculare netede în tunica medie a peretelui vascular precum şi a unui strat de colagen şi fibre elastice în adventice. Diametrul venelor variază între 1 – 10 mm şi unele vene, cum ar fi cele localizate la nivelul membrelor inferioare ale corpului, conţin valve semilunare unidirecţionale care previn acumularea sângelui în extremităţi. Atât venele mici cât şi cele mijlocii prezintă un nivel ridicat al celulelor musculare în tunica medie în timp ce venele mari conţin o cantitate ridicată de ţesut de legătură în acest strat.

Proprietăţi fizice ale vaselor sangvineUtilizând dinamica fluidelor se poate descrie scăderea vitezei de curgere a sângelui

odată cu scăderea diametrului vaselor sangvine. Daca se consideră că sângele curge printr-un vas sangvin cu raza r, la presiunea P pe unitatea de lungime L şi ţinând cont de faptul că odată cu scăderea razei vaselor sangvine suprafaţa de secţiune a sistemului vascular creşte se poate scrie relaţie matematică:QB = VC x A

unde QB este debitul sangvin, VC este viteza de curgere şi A este aria secţiunii.

Totuşi curgerea sângelui prin vase nu este uniformă (nu este laminară). Din acest motiv, într-o situaţie ideală în care curgerea sângelui este uniformă de-a lungul vasului, confrom mecanicii fluidului (legea Newton) viteza are tendinţa să fie mai mare de-a lungul axei centrale a vasului şi mai mică la nivelul pereţilor. Datorită faptului că viteza de curgere vaiază de-a lungul sistemului vascular, în determinarea rezistenţei la curgere sunt implicaţi mai mulţi factori. Aceşti factori includ: diferenţa de presiune ΔP inregistrată la capetele vasului sangvin, raza r şi lungimea L ale acestuia, vâscozitatea sângelui η. Astfel debitul sangvin printr-un vas poate fi exprimat (legea Poiseuille) conform ecuaţiei:

LQB 8/Pr4

Conform legii Starling curgerea fluidului de-a lungul endoteliului este rezultatul echilibrului realizat între forţele hidrostatice responsabile de deplasarea fluidului spre spaţiile extravasculare şi presiunea oncotică ce se opune mişcării fluidului din capilare. Astfel această ipoteză implică faptul că diferenţa dintre presiunea capilară (PC) şi presiunea hidrostatică tisulară (PT) este echivalentă cu diferenţa dintre presiunea oncotică a plasmei dizolvate (πp) şi a proteinelor tisulare (πT):PT - PC = πp - πT.

Boala aterosclerotică cardiovasculară ramâne principala cauză de mortalitate în lumea occidentală. Această boală produce reducerea localizată a fluxului sangvin prin artere, evoluând până la obstrucţia completă a vasului afectat.

Solutie: utilizarea unei grefe artificiale sau a venei safenă. În mod curent, în operaţiile care presupun restabilirea fluxului sangvin printr-un vas cu diametrul mai mic de 6 mm se utilizează autogrefe de venă safenă. În cazul arterelor coronare se utilizează grefa arterială autologă (artera toracică internă, artera gastroepiploică, artera epigastrică inferioară, artera radială).

Alogrefele crioconservate au fost de asemenea utilizate pentru by-pass-ul arterelor coronare dar ratele mari de ocluzie şi problemele legate de apariţia anevrismelor au condus la limitarea utilizării lor la situaţiile în care nu sunt disponibile grefe autologe. Funcţionarea corespunzătoare a acestor grefe naturale este pusă pe seama prezenţei celulelor endoteliale viabile pe suprafaţa luminală. Deşi utilizarea autogrefelor venoase sau arteriale conduce la obţinerea celor mai bune rezultate, ea nu este lipsită de prezenţa câtorva dezavantaje:necesitatea efectuării unui număr ridicat de proceduri chirurgicale care sporesc riscurile şi costurile operaţiei în ansamblu. În plus, grefele venoase prezintă pereţi subţiri şi pot fi deteriorate în cursul transplantării în sistemul arterial. Există totuşi situaţii în care, funcţie de natura bolii vasculare, prezenţa amputaţiilor sau a recoltarilor anterioare de ţesut, pacienţii nu prezintă vene corespunzătoare grefării.

Biomateriale utilizate pentru realizarea protezelor vasculare

Poliuretanii

Cea mai simpla reprezentare a PU este liniara fiind de forma:

unde R2 reprezinta un lant hidrocarbonatat iar R este o hidrocarbura care contine gruparea OH.

Proteze vasculare nebiodegradabileÎn ultimii ani au fost dezvoltate mai multe proteze vasculare din PU

modificati în scopul prevenirii biodegradarii, reducerii caracterului trombogenic si pentru a le îmbunatati proprietatile legate de ingineria tisulara. Acestea includ Chronoflex®, Chronoflex® modificat, Thoratec® (grefa de acces vascular), PU acoperit

cu L-lactida, PU policarbonat, Thoratec-ePTFE, Corvita®, Pulsetec®.

Proteza MyoLink ramforsata (a); modificarile diametrului intern al unei grefe MyoLink

de 4 mm pe parcursul uni ciclu

cardiac

Poli(etilentereftalatul) si poli(tetrafluoretilena)

Cele mai utilizate materiale în chirurgia cardiovasculara

moderna sunt poli(etilentereftalatul) (denumirea comerciala

Dacron) si poli(tetrafluoretilena) (denumirea comerciala Teflon).

Complicatiile cele mai severe legate de utilizarea acestui tip de

biomateriale sunt formarea trombilor si infectiile bacteriene.

Grefe sintetice– Functioneaza pentru

diametre mari(6-10 mm)– Dificultati la inlocuirea

diametrelor mici(3-5 mm)

de ce???– Tromboza

Inginerie tisularaInginerie tisulara??

Celule Celule endoteliale Celule musculare Fibroblaste & miofibroblaste Celule modificate genetic Celule stem

Suport• Sintetic (PET, ePTFE, PGA, PLA, PU)

• Natural (colagen)

• Matrice biologica decelularizata

Stimulare mecanica• Sisteme de curgere pulsatile

• Deformatie longitudinala ciclica

Factori de semnal• Factori de crestere (bFGF, PDGF, VEGF)

•Citokine

StructuraStructura

Celule se pot modela si reorganiza in gel colagenic Colagen – crestere rezistenta prin diferite tehnici

(prealiniere magnetica, glicare, antrenare mecanica)

Solicitari mecanice ciclice Solicitari mecanice ciclice (antrenare mecanica)(antrenare mecanica)

Straturi autoansamblabileStraturi autoansamblabile

Arhitectura 3D adecvata Rezistenta mecanica buna Dezavantaje: sursa de celule,

necesita> 2 luni pentru realizare

Principiul de realizare a autogrefelor de vase de sânge

Suport colagenic

Celulele endoteliate se dezvolta mult mai usor pe materiale colagenice sau compozite cu laminina decât pe alte tipuri de produse, asa cum se poate observa din datele prezentate in tabelul 3.

Tabelul 3. Durata de formare a structurii tubulare endoteliale pe diferitesubstraturi

Tip celule Substrat Timp de formare ObservatiiSEC Matrigel 6h Nici o invazie in gelSEC Colagen I +laminina 8h factor de crestere suplimentar

HUVEC Matrigel 8hHUVEC Matrigel + trombina 18h Efect al trombinei numai la

concentratii mai mici de 2%HUVEC Fibrinogen proteolizat 1 sapt.BAEC Copolimer cu grupe de

acid fenilboranic4 sapt. Nu se formeaza structura

tubularaBAEC Alchil-celuloza 10zile Necesitatea unoi hidrofobicitati

avansateBAEC Colagen I 4zileSEC- celule endoteliale sinusoidale; HUVEC- celule endoteliale umane; BAEC- celuleendoteliale provenite din aorta bovina.

S-au efectuat de asemenea studii de imobilizare a colagenului pe materiale sintetice, în scopul îmbunatatirii adeziunii celulelor endoteliale si cresterii hemocompatibilitatii materialelor sintetizate. Literatura de specialitate considera ca cea mai performanta metoda de hemocompatibilizare este acoperirea corpurilor straine cu celule endoteliale, generând astfel suprafete hibride

Fixarea celulelor endoteliale pe implant prin intermediul

colagenului

Ingineria tisulara in sistemul nervos

Eforturile ingineriei tisulare in sistemul nervos au ca obiective:o inlocuirea functiei unui component neuroactiv lipsa;o salvarea sau regenerarea unui tesut neural vatamat;o stimularea elementelor de cuplare neurale.

Furnizarea de molecule neuroactive sistemului nervosExista câteva modalitati de proiectare a unor sisteme care pot furniza acesti factori. Pentru aceasta trebuie luate in considerare:

stabilitatea factorilor;dozajul necesar;solubilitatea;tesutul tinta;posibilele efecte secundare.

Principalele modalitati utilizate sunt:Pompele – prezinta inconveniente legate de faptul ca trebuie reâncarcate la fiecare 4 saptamâni si sunt susceptibile la formarea de “depozite” de substante neuroactive, la infectii si apar probleme la difuzie.

Sisteme polimere cu eliberare lenta a moleculelorAcestea sunt matrici polimerice ce include moleculele necesare

si pe care le elibereaza lent prin difuzie o anumita perioada de timp.Exemple de sisteme polimere utilizate:-poli(etilen vinil acetat);-elastomeri siliconici;-poliesteri;-microsfere din poli(acid lactic-acid glicolic)

Dezavantajul acestor sisteme il reprezinta faptul ca permit incarcarea cu o cantitate limita de molecule neuroactive precum si faptul ca ritmul de cedare este ajustat de catre polimer.

Transplantul de celuleAcest mod de eliberare a moleculelor neuroactive se poate

realiza in urmatoarele maniere:1) transplantul celulelor primare autologeAceasta tehnica presupune procurarea celulelor primare de la gazda, proliferarea lor daca este necesara generarea unei cantitati de tesut, modificarea prin inginerie genetica(daca este cazul) si apoi transplantate inapoi la ”donor”, intr-o zona apropiata.Dezavantajul principal il constituie faptul ca nu intotdeauna este posibil sa se procure tesut autolog.

2) Transplantul de tesut fetalUnul dintre avantajele unui astfel de sistem il reprezinta abilitatea acestuia de a supravietui si de a se integra in creierul adultului gazda. Transplantul de tesut neural fetal alogen poate fi util in tratarea bolii Parkinson.

3)Transplantul de tesut xenogenic (exogen) incapsulat- realizarea unor capsule cu pori suficient de mari pentru ca nutrientii sa ajunga la tesutul transplantat si sa permita eliberarea factorilor neuroactivi, dar cu o marime suficient de mica pentru a impiedica patrunderea in tesutul transplantat a moleculelor si celulelor

Incapsularea tesutului xenogenic in membrane polimere semipermeabile

Implicarea inginerie tisulare in optimizarea tehnicii de incapsulare presupune:

a) tipul si configuratia membranei de incapsulare.Un factor important ce determina marimea dispozitivului il reprezinta difuzia oxigenului spre celulele incapsulate, astfel incât distanta dintre sursa de oxigen si miezul intern al tesutului transplantat sa fie minima. Marimea si configuratia dispozitivului influenteaza si cinetica de eliberare a moleculelor neuroactive, „timpul de raspuns” fiind mai mic in capsulele mari cu peretii membranei mai grosi.Avantajul principal al acestor sisteme il constituie faptul ca nu au nevoie de un solvent organic in formarea capsulelor si pot fi mai putin citotoxice, insa rezistenta mecanica si stabilitatea lor in mediul ionic fiziologic este discutabila.

b) Alegerea celulelor si tesuturilor pentru incapsulare. Se utilizeaza trei tipuri de celule: postmitotice, liniare si care se divid lent.

c)

b) Matricile pentru incapsulare pot fi clasificate in urmatoarele tipuri:- polielectroliti reticulati, solutie de colagen sau granule poroase;- derivati ai matricii extracelulare, cum ar fi Matrigel;- hidrogeluri biosintetice.

Matricea are ca functii:- prevenirea formarii unor mari agregate celulare care conduc la dezvoltarea necrozelor centrale ca o consecinta a insuficientei oxigenului si a accesului de nutrienti;- permit ancorarea celulelor;- pot induce diferentierea celulelor.

Reconstructia tisulara. Regenerarea nervuluiIn studiul mecanismului de baza al regenerarii nervilor periferici s-

au utilizat canale sintetice de ghidare a nervilor pentru intensificarea procesului de regenerare. Canalele de ghidare pot simplifica „repararea” capetelor(terminatiilor) si pot fi utile in intreruperile lungi ale nervilor.

Exemplu de canale de ghidare a nervilor

Canalele de ghidare au rolul:-reduc tensiunea pe linia suturii;

- protejeaza regenerarea nervului de infiltratii;- directioneaza axonii spre tintele periferice(distale).

Optimizarea si intensificarea regenerarii nervului se pot realiza prin: proprietatile canalului, matricea care umple canalul, celulele insamântate in lumenul canalului si „sudarea” axonilor indusa polimeric.

Canalele de ghidare a nervilor pot fi:1) peretele canalului:- polimeri inerti: elastomer siliconic, PVC, polietilena.- polimeri permeabili: copolimer de acrilonitril si clorura de vinil, colagen, PTFEe;- polimeri resorbabili: acid poliglicolic, acid poli-L-lactic, colagen;- polimeri incarcati electric: poliviniliden fluorura(piezoelectric), PTFE;- polimeri cu eliberare a factorilor trofici: copolimer etilena-acetat de vinil.2) Matricea lumenului poate fi:- fibrina;

- suport colagen-glicozoaminoglicani.3) Celule insamântate pentru suportul trofic:-celule Schwann.

Utilizarea eficienta a proprietatilor canalului de ghidare ia in considerare:1)Suprafata canalului- microgeometriaMorfologia nervilor periferici care se regenereaza este modelata de catre microgeometria suprafetei canalelor polimerice de ghidare. Canalele cu peretii interiori netezi dau nastere la matrici de fibrina longitudinale, organizate, rezultând lanturi nervoase mobile cu numerosi axoni mielinizati. Canalele cu suprafata interna rugoasa dau nastere unei matrici de fibrina neorganizata cu fascicule nervoase difuze intr-un tesut conjunctiv slab ce umple intregul lumen. 2) Proprietatile electrice.Regenerarea in vivo urmeaza sectiunea leziunii in sistemul nervos periferic si poate fi sporita prin curenti galvanici produsi in canalele siliconice prevazute cu mansoane de electrozi.3) Eliberarea factorilor bioactivi din peretele canaluluiCanalele polimere de ghidare pot fi incarcate cu diferiti factori care sporesc regenerarea nervilor. Factorul de crestere al fibroblastelor, eliberat dintr-un canal de ghidare pe baza de copolimer etilena- acetat de vinil faciliteaza regenerarea nervilor periferici de-a lungul nervului afectat.4)Peretele canalului resorbabilOdata cu terminarea regenerarii, canalul dispare fara interventie chirurgicala. Astfel de comportament au cele obtinute din acid poliglicolic si, respectiv, din poli-L-lactic acid. Aceste canale trebuie insa sa-si mentina proprietatile mecanice timp de 4-12 saptamâni, iar produsele lor de degradare sa nu interfere cu procesul de regenerare a nervului.