curs enzimologie
DESCRIPTION
cursTRANSCRIPT
18
Cursul 2 3. Clasificarea enzimelor. Nomenclatura
Clasificarea enzimelor în funcŃie de reacŃia pe care o catalizeazã
este prezentatã în Tabelul 3.1.
Tabelul 3.1: Clasificarea enzimelor în funcŃie de tipul reacŃiei pe care o catalizeazã
Numele enzimei ReacŃia catalizatã
Dehidrogenaze Dehidrogenarea unui substrat cu
transferul hidrogenului la o moleculã diferitã de oxigen
Hidroxilaze Hidroxilarea unui substrat la care participã oxigen molecular ca donor
Kinaze Transferul unei grupe fosfat de la o trifosfatnucleotidã (ATP) la un substrat
Mutaze Migrarea unei grupe fosfat de la o poziŃie la alta în aceeaşi moleculã
Oxidaze Oxidarea unui substrat cu oxigen molecular ca donor
Oxigenaze Incorporarea unei molecule de oxigen cu ruperea oxidativã a unei legãturi C - C
Fosfataze Hidroliza unui ester fosforic Sintetaze Condensarea a douã molecule simultan
cu hidroliza unei trifosfonucleotide (ATP) Transferaze Transferul unei grupe funcŃionale de la un
substrat la altul Nomenclatura enzimelor se face în mai multe moduri:
a) Denumire comunã
Se pãstreazã denumirile comune deşi acestea nu precizeazã
acŃiunea enzimei într-un anumit tip de reacŃie.
Exemplu: pepsina, tripsina, ureaza, etc.
b) O altã denumire puŃin mai precisã constã în folosirea numelui
substratului + numele reacŃiei catalizate + sufixul “azã”:
Exemplu: malatdehidrogenaza
19
c) In 1961 Comisia de Enzime a Uniunii InternaŃionale de
Biochimie şi Biologie Molecularã a stabilit o clasificare şi o nomenclaturã
sistematicã a enzimelor, mult mai riguroasã, care cuprinde şase clase,
divizate în subclase, care la rândul lor sunt împãrŃite în sub-subclase.
Fiecare enzimã are un numãr de cod format din patru cifre:
EC a b c d, unde: a = clasa; b = subclasa; c = sub-subclasa; d =
numãrul de ordine al enzimei respective în sub-subclasã (nr. propriu
pentru fiecare enzimă).
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme - clasificarea enzimelor Web Version of Enzyme Nomenclature – 1992 Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology
1. Oxido- reductaze (catalizeazã procese de oxido-reducere)
1.1 AcŃioneazã asupra R2CH -OH
1.1.1 cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor de hidrogen
Exemplu:
- EC 1.1.1.1 (alcool dehidrogenaza) este enzima care
catalizeazã oxidarea etanolului, acceptorul de hidrogen fiind NAD+:
+NADH, H+CH3CHO+NAD+CH3CH2OH
Aceastã enzimã nu este specificã pentru etanol, ea putând oxida şi alŃi alcooli.
- EC 1.1.1.27 (L-lactat-NAD-oxidoreductaza sau L-lactat dehidrogenaza) este enzima care catalizeazã transformarea L- lactatului în piruvat:
_ _ +++++CH3CHCOO NAD CH3COCOO NADH H
OH 1.2 AcŃioneazã asupra grupei carbonil ( C =O)
1.3 AcŃioneazã asupra grupei CH – CH
20
1.4 AcŃioneazã asupra grupei CH – NH2
1.5 AcŃioneazã asupra grupei CH – NH, etc.
EC 1.98 Enzymes using H2 as reductant
EC 1.98.1.1 now EC 1.18.99.1
EC 1.99 Other enzymes using O2 as oxidant
2. Transferaze (catalizeazã transferul unor grupe funcŃionale)
2.1 Tranferã grupe monocarbonate
2.1.1 Metiltransferaze
2.1.2 Hidroximetiltransferaze
2.2 Transferã grupe aldehidice sau cetonice
2.3 Aciltransferaze
2.4 Glicoziltransferaze
2.5 Alchiltransferaze
2.6 Transferã grupe azotate
Exemplu:
- EC 2.6.1.2 (alanin aminotransferaza) este enzima care
transferã grupa amino de la alaninã la α-cetoglutarat:
+
_
__
_
__
+COO
+C
CH3
HH3N
COO
CO
(CH2)2
COO
C
CH3
COO
O +
COO
(CH2)2
C
COO
HH3N
2.7 Fosforiltransferaze
3. Hidrolaze (catalizeazã reacŃii de rupere a unor legãturi cu
ajutorul apei)
3.1 Scindeazã legãturi esterice
3.1.1 Scindeazã esteri ai acizilor carboxilici
21
Exemplu:
- EC 3.1.1.3 (glicerol-esterhidrolaza) sau lipaza;
3.2 Scindeazã legãturi glicozidice
Exemplu:
- EC 3.2.1.1 (αααα-1,4-glucan glucanohidrolaza) sau αααα-amilaza
3.3 Actioneaza asupra legaturilor eterice 3.4 Scindeazã legãturi peptidice
Exemplu:
- EC 3.4.21.4 sau tripsina
- EC 3.4.23 cuprinde poteinaze acide care acŃioneazã la pH <5:
- pepsina ( EC 3.4.23.1) care acŃioneazã la pH = 1.5 – 2
-renina (EC 3.4.23.4) din stomacul ierbivorelor – este impli-
catã în coagularea laptelui.
3.5 Scindeazã alte legãturi: C = N
Exemplu:
- EC 3.5.1.5 (ureo-amidohidrolaza) sau ureaza.
4. Liaze sau sintaze(catalizeazã reacŃii de adiŃie sau de eliminare)
4.1 Liaze pentru legaturi C - C
4.2 Liaze pentru legaturi C - O
Exemplu:
- EC 4.2.1.1 (anhidraza carbonicã): este enzima care catalizeazã
transformarea acidului carbonic in CO2 si apa, precum si hidratarea
dioxidului de carbon în celula vie
H2CO3 = CO2 + H2O sau
H2CO3H2O+CO2
4.3 Liaze pentru legãturi C – N, etc.
22
5. Izomeraze (catalizeazã reacŃii de izomerizare)
5.1 Racemaze si epimeraze (enzime care catalizeazã procese de
racemizare sau epimerizare):
Exemplu: - EC 5.1.1.1 (alanin racemaza) catalizeaza transformarea L- alaninei in D-alanina
- EC 5.1.2.1 (lactatracemaza) care catalizeazã reacŃia de
transformare a L-lactatului în D-lactat si invers:
_ _
HC
CH3
COO
H C
CH3
COO
OHHO
5.2 Izomeraze cis – trans
Exemplu: EC 5.2.1.1 maleat cis-trans izomeraza:
_
_
_
_
CH
C
COO
H COO HC
CH
COO
OOC
5.3 Cetoizomeraze intramoleculare Exemplu: EC 5.3.1.1 triose-phosphate isomerase
CO
CH2OPO3
CH2OH
CH2OPO3
H OH
CH=O
C2_ _2
gliceraldehid-3-fosfat dihidroxiacetonfosfat 6. Ligaze sau sintetaze (catalizeazã reacŃii de sintezã prin
condensarea a douã molecule simultan cu hidroliza unei legãturi
23
fosforice din ATP sau din alt compus macroergic din care rezultã energia
necesarã desfãşurãrii acestei reacŃii)
6.1 Formare de legãturi C – O
6.2 Formare de legãturi C – S
Exemplu: EC 6.2.1.1 (acetat-CoA-ligaza) sau acetil-CoA sintetaza :
ATP + acetate + CoA = AMP + diphosphate + acetyl-CoA
6.3 Formare de legãturi C – N
6.4 Formare de legãturi C – C
Exemplu: EC 6.4.1.1 (piruvat-CO2-ligaza) sau piruvat carboxilaza.
ATP + pyruvate + HCO3- = ADP + phosphate + oxaloacetate
Aceasta clasificare functioneaza partial in practica deoarece
toleranta fata de substrate nenaturale este comuna mai multor clase de
enzime (fapt important pentru aplicatiile practice in sinteze organice).
Utilitatea enzimelor din punct de vedere practic este prezentata in
Tabelul 3.2.
3.1 Analiza cantitativă a activităŃii enzimatice
In Sistemul International, activitatea catalitica se masoara in
katal = cantitatea de enzima care transforma un mol de substrat intr-o
secunda: 1 kat = 1 mol s-1
Pentru ca marimea acestei unitati este prea mare, se foloseste
unitatea internationala care reprezinta cantitatea de enzima care
transforma un µmol de substrat intr-un minut.
1 U = 1 µmol minut-1.
In practica se folosesc si subunităŃi ale katalului:
µkat - microkatal (10-6 kat); nkat - nanokatal (10-9 kat); pkat - picokatal
(10-12 kat), precum si nmol/min sau nmol/h.
24
Tabelul 3.2: Utilitatea tipurilor de enzime in biotransformari organice
Numarul enzimelor Clasa de enzime Clasificate Disponibile
Tipul de reactie/Utilitatea in sinteze*
1. Oxido-
reductaze
650
90
Oxidarea legaturilor C-H, C-C, C=C
+++; 25%
2. Transferaze
720
90
Transfer de grupe: aldehidice, cetonice, acil, glicozil, fosforil sau metil
+; 5%
3. Hidrolaze
636
150
Hidroliza/formarea esterilor, amidelor, lasctonelor,
lactamelor, epoxizilor,nitrililor,anhidridelor,
glicozidelor; +++ 60%
4.
Liaze
255
35
Aditie/eliminarea unor molecule mici la legaturi duble
C=C, C=N, C=O ++; ~7%
5.
Izomeraze
120
6
Izomerizari: racemizari, epimerizari, rearanjari de
schelet +; ~2%
6. Ligaze
80
5
Formare/rupere a unor legaturi simple: C-O, C-S,
C-N, C-C cu aport de energie chimica stocata in
adenozintrifosfat (ATP) +; ~1%
• Utilitatea estimata pentru folosirea enzimelor pentru transformarile substantelor nenaturale : +++ (foarte utile), ++ (utile), + (putin utile), valorile procentuale fiind observate in perioada 1987 – 2003.
O unitate de activitate enzimatică este egală cu 16,67 nkat,
valoare care se deduce astfel:
106 µmol
1 kat = 1 mol/s = -------------- = 60 x 106 U
min/60
Deci, U = 1 kat/ (60 x 106) = 106 µkat/ (60 x106) = 1/ 60 µkat
U = 1000/ 60 nkat = 16.67 nkat.
25
Este de remarcat faptul ca activitatile care se observa cand sunt
transformati compusi organici nenaturali sunt adesea mult mai mici
decat valorile observate pentru substrate naturale.
Pentru a face o comparatie intre activitatile unei enzime trebuie
folosita aceeasi cale de reactie atat pentru substratul natural, cat si
pentru cele nenaturale.
Puterea catalitica a (bio)catalizatorului poate fi descrisa foarte bine
de frecventa turnover (TOF), care reprezinta numarul de molecule de
substrat care este transformat de un singur situs catalitic intr-o secunda
(pentru reactii biochimice) sau intr-un minut pentru catalizatorii chimici.
Pentru reactiile biocatalizate TOFs = 10 – 1000s-1.
Productivitatea (bio)catalizatorilor este caracterizata prin numarul
turnover (TON), care reprezinta numarul de molecule de substrat
transformate de un singur situs activ in timpul vietii sale.
Numarul turnover este o masura a durabilitatii sistemului
catalitic.
Eficienta transformarilor microbiene (in care activitatea catalitica a
enzimelor implicate nu poate fi masurata) se exprima prin asa numitul
“numar de productivitate” (PN):
PN = gprod / muscat . t
unde: gprod reprezinta cantitatea de produs; muscat – cantitatea de celule
uscate; t – timpul transformarii.
Acest numar arata atat activitatea specifica pentru o enzima pura, dar
poate include si alti factori importanti: inhibitia, concentratia, fenomene
de transport.
Un PN mare pentru o biotransformare data indica un proces
eficient.
26
4. PROPRIETÃłILE ENZIMELOR
4.1 introducere
Enzimele prezintã situsuri caracterizate de activitate biologicã
(cataliticã).
Situsul catalitic este o parte a moleculei proteinei (loc geometric)
formată din câteva resturi de aminoacizi (de regulă neconsecutivi) care
sunt responsabili de trasformarea propriu-zisă a substratului.
Situsul alosteric este acea parte a proteinei care, în urma legării
specifice a unui modulator (efector alosteric) extern, modifică activitatea
caracteristică a proteinei (care este determinatã de situsul catalitic).
În cazul unei enzime, activitatea enzimatică este controlată în mod
direct de situsul catalitic şi indirect de situsul alosteric (de care se leagă
un efector care poate mări sau micşora activitatea catalitică).
O enzimã (E) acŃioneazã asupra unui substrat (S) cu care poate
forma un complex (ES) prin legarea specificã de situsul sãu catalitic:
+ EP ESS+E Acest complex se va transforma ulterior în produsul de reacŃie
(P) punând în libertate enzima netransformatã (E).
Substratul trebuie sã îndeplineascã urmãtoarele condiŃii:
- sã aibã o conformaŃie bine definitã care sã-i permitã accesul la situsul
catalitic;
- sã aibã particularitãŃi structurale care sã satisfacã necesitatea de
specificitate a enzimei;
- sã se asocieze cu enzima pe baza unei orientãri strict specifice.
Enzima trebuie sã aibã proprietãŃile unui catalizator:
- sã se regãseascã neschimbatã la sfârşitul reacŃiei;
27
- sã nu modifice natura (echilibrul sau bilanŃul termodinamic) reacŃiei pe
care o catalizeazã;
- sã permitã atingerea echilibrului într-un timp foarte scurt, mãrind
vitezele ambelor reacŃii care au loc simultan, dar în direcŃii opuse;
Enzimele au şi proprietãŃi care le deosebesc de catalizatorii
obişnuiŃi:
- acŃioneazã, în general, în condiŃii blânde, la temperaturi de ~ 37oC şi
pH neutru.
Existã însã şi enzime care acŃioneazã la temperaturi ridicate (în
bacteriile termofile) sau la pH-uri acide (pepsina) sau bazice (tripsina,
chimotripsina).
- scad mai mult energia de activare a unei reacŃii comparativ cu
catalizatorii obişnuiŃi.
Exemplu: Descompunerea apei oxigenate:
- energia de activare fãrã catalizator : 18 kcal/mol
- energia de activare în prezenŃa platinei coloidale: 11,7 kcal/mol
- energia de activare în prezenŃa catalazei (EC 1.11.1.6): 2 kcal/mol.
O moleculã de catalazã descompune 5x106 molecule de apã
oxigenatã într-un minut în condiŃii optime de temperaturã şi pH.
- sunt de naturã proteicã şi prezintã o specificitate foarte mare deoarece
situsul catalitic are o geometrie bine determinatã care-i permite fixarea
unui substrat cu structurã complementarã;
- activitatea lor poate fi reglatã şi autoreglatã;
- acŃioneazã în concentraŃie foarte micã (~10-6 moli);
- timp de reacŃie foarte scurt (cele mai rapide reacŃii fiind de ordinul
picosecundelor,10-12 s);
- randamentul reacŃiilor catalizate enzimatic este de 100%.
Enzimele pot acŃiona singure sau în prezenŃa unor cofactori, care
le determinã specificitatea.