crioconservarea la plante

8/13/2019 Crioconservarea la plante

1/5

CAPITOLUL XIII

13.1 CONSERVAREA MATERIALULUI VEGETAL INVITRO

13.1.1 Consideraii generale

Pstrarea materialului vegetal timp ndelungat se poate face prin maimulte metode, n funcie de posibilitile existente, de tipul explantelor sau de

perioada de conservare. n perioada conservrii trebuie meninut nealteratzestrea ereditar a materialului vegetal. Prin conservare se blocheaz sau sencetinesc procesele fiziologice, iar dup perioada de conservare explanteletrebuie s fie capabile de reluarea activitii ntrerupte.

Elaborarea unor metode de conservare a celulelor, esuturilor iorganelor vegetale este necesar din mai multe motive

!dificultatea obinerii i meninerii anumitor linii celulare"!riscul pierderii unui material valoros datorit erorilor umane sau

defectrii unor echipamente"!reducerea numrului de specii slbatice, ce constituie adevraterezervoare de gene pentru ameliorarea speciilor de interes economic sau care nuau fost nc testate i utilizate n selecie sau pur i simplu ca noi plantecultivate"

!conservarea resurselor de germoplasm, n condiiile extinderiiprogresive a culturilor monoclonale sau a varietilor foarte selecionate.

#e cunosc i se folosesc mai multe metode de conservare a materialuluibiologic vegetal

!conservarea pe termen lung, la temperaturi sczute sau crioconservarea$!%&'o()"!conservarea la temperaturi sczute, dar pozitive"!conservarea pe termen mediu, prin ncetinirea ritmului de cretere"!conservarea prin creterea inoculilor n presiune atmosferic sczut"

13.1. Crio!onser"area

(onservarea pe termen lung, la temperaturi sczute sau crioconservarea,

a fost posibil prin perfecionarea procedeelor de obinere a temperaturilorsczute i meninerea lor n timp fr dificulti. *olosirea temperaturilor

+%


2/5

sczute, negative n pstrarea materialului vegetal este destul de veche, dardescoperirile n domeniu din ultimii - de ani, odat cu introducereacrioprotectorilor, a dat o certitudine n posibilitatea utilizrii materialuluicongelat. Preocuprile actuale sunt legate de pstrarea integritii funcionaledup perioada de pstrare. rebuie fcute studii fundamentale pentru nelegereai controlarea proceselor ce au loc la nivel celular n timpul crioconservrii. Prinscderea temperaturii sub punctul de nghe, se formeaz cristale de ghea ncelule, care n funcie de mrime afecteaz mai mult sau mai puin integritateacelulei put/nd provoca moartea lor.

Pentru evitarea formrii cristalelor mari se folosesc trei metode dereducere a temperaturii

!ngheare lent, n care scderea temperaturii are loc cu -,%!%- o(0min."!ngheare rapid, n care scderea temperaturii are loc cu -!%+-

o(0min."!combinat, metod care prevede scderea lent a temperaturii p/n la

!+- o( dup care temperatura se reduce brusc p/n la !%&' o(, n azot lichid.Pentru crioconservare, temperatura de stocare este cuprins ntre !1- i

!%&' o( i difer n funcie de durata de conservare. Pentru conservare dedurat, temperatura este de !%&' o( $temperatura azotului lichid), pentruconservarea pe timp mediu temperatura este de aproximativ !1- o(, iar pentruconservarea pe timp scurt, de c/teva zile, temperatura este pozitiv, cuprinsntre %!& o(. Efectul temperaturii asupra explantelor depinde de starea

fiziologic a plantei donor, de genotip dar i de condiiile de mediu.(rioconservarea materialului biologic in vitroare o serie de avanta2e!necesit spaiu mic de depozitare"!poate fi oric/nd dezgheat i folosit ca material iniial pentru

micropropagare"!datorit strii lui n perioada de conservare, nu exist riscul infestrii cu

ageni patogeni"!se poate conserva timp nelimitat"!se pstreaz nealterat zestrea ereditar.

Pentru evitarea pierderilor de material biologic, care pot surveni langhearea i dezghearea lui, se folosesc substanele crioprotectoare. 3cesteamicoreaz numrul i mrimea cristalelor de ap, diminueaz efectul negativ

produs de concentrarea sucului endo i extracelular, echilibreaz formarea gheiide ambele pri ale membranei i peretelui celular, determin o pierdere a apeidin celule anterior ngherii prin mrirea permeabilitii celulare.

nghearea rapid n azot lichid fr utilizarea crioprotectorilor provoacdaune mari celulelor, care de regul mor. (a substane crioprotectoare sefolosesc cele care au potenial osmotic mai mare, sunt uor solubile, nu sunt

toxice i ptrund uor n celule. 3stfel de substane sunt urmtoarele glicerolul,etil glicolul, dietil glicolul, dimetilsulfoxidul $45#6), acestea fiind cu eficien

+%'


3/5

maxim. #e mai folosesc, dar cu eficien mai redus glucoza, manoza, riboza,acetamida $(inalt i olar, %&1%).

Pretratamentul sau condiionarea materialului biologic aplicat nainte decrioconservare presupune parcurgerea a dou etape

!precultura, timp de c/teva ore p/n la c/teva zile, n mediu mbogit cumanitol, prolin sau sorbitol"

!impregnarea, la - o(, n mediul de precultur adiionat treptat cu soluiide 45#6 sau glicerol sau cu o combinaie a acestora"

4up aplicarea acestui pretratament se trece la congelare, etap care sepoate parcurge n dou moduri

!treptat i programat, -, o(0min. p/n la 7 8- o("!prin scderea rapid, ntr!un interval scurt de timp, a temperaturii n

incinta n care sunt plasate fiolele.(ongelarea p/n la !8- o( are ca efect deshidratarea parial a celulelor,

ca urmare a diferenei dintre potenialele chimice ale gheii extracelulare, pe de!o parte i lichidelor celulare pe de alt parte. n funcie de temperatura decongelare, se stabilete un echilibru. 6dat atins temperatura de congelare,

probele se plaseaz n azot lichid. n momentul congelrii n azot lichid, ncelule se formeaz cristale minuscule de ghea, care nu pot fi decelate dec/t curaze 9.

(onservarea se face n recipiente speciale n care pot fi stocate mai multesute de fiole. (oleciile se menin timp ndelungat, verific/ndu!se periodic

nivelul azotului lichid.4ezgheareaPrin dezgheare explantele sunt readuse n faza de dinaintea conservrii,

cu posibilitatea de a continua creterea i dezvoltarea de unde a fost ntrerupta.5odul n care se face dezghearea este foarte important pentru pstrareaintegritii celulelor explantului i meninerea viabilitii lui.

4ezghearea sau decongelarea este, n general rapid. *iolele sunttransferate direct din azot lichid ntr!o baie marin, la 8- o(. 4ezghearea rapidare drept scop evitarea recristalizrii intracelulare, care ar putea afecta structurile

celulare. (elulele decongelate pot fi cultivate direct pe mediu de cultur.:eluarea creterii se produce dup 8!1 zile. Primele rezultateexperimentale au demonstrat c prin congelare nu sunt afectate proprietileliniilor celulare

!acumularea pigmenilor antocianici"!sinteza alcaloizilor"!capacitatea de biotransformare"!capacitatea de regenerare a plantelor prin organogenez somatic.Procentul de viabilitate dup dezgheare difer n funcie de modul de

nghe i dezghe i de specie. Procentul de regenerare a plantelor din explanteleviabile, este inferior celui de supravieuire.

+%1


4/5

13.1.3 Te#ni!ile $olosi%e &en%r' es%i(area "ia)ili%*ii !el'lelor

estul 43* $diacetat de fluorescein). 43* este absorbit de celulele viii hidrolizat de esteraze n acid malic i fluorescein, fluorescent n luminultraviolet. (elulele moarte pot fi colorate cu albastru Evans sau fenosafranin,ori decelate n contrast de faz. (elulele vii nu acumuleaz aceti colorani.;iabilitatea, exprimat n procente, este dat de valoarea raportului dintrenumrul celulelor vii i numrul total de celule.

estul ( $trifeniltetrazolium). ( este un compus incolor, solubil nap, ce poate fi redus ntr!un produs de culoare roie, numit formazan, solubil nalcool & sau ?- nm asoluiei alcoolice obinute i este proporional cu numrul celulelor vii.

estul de cretere. (onst n plasarea unei cantiti cunoscute de materialvegetal pe un filtru steril, aezat pe mediu nutritiv. (/ntriri succesive permitstudierea evoluiei greutii proaspete.

13.1.+ Conser"area la %e(&era%'ri s!*,'%e &o,i%i"e

(onst n reducerea proceselor vitale i nu blocarea acestora, ceea ceimpune executarea unor subcultivri periodice pe medii proaspete. Este metodamult mai utilizat pentru conservarea materialului pomicol i viticol. 3sigurareanutriiei plantelor n vase se face fie prin subcultivarea lor pe mediu proaspt, fie

prin adugarea mediului lichid peste cel existent, dac culturile se prezint binei nu necesit ndeprtarea unor lstari necrozai, brunificai sau nglbenii.*aza de cultur n care se face stocarea cea mai potrivit este cea demultiplicare. Prin reducerea temperaturii la 8!& o(, numrul de subculturi sereduce la %!+ pe an, se impune o cretere i multiplicare lent i se dispune astfelde material iniial pentru iniierea unei culturi atunci c/nd este nevoie. @a 8 o( s!a reuit meninerea cpunului n cultur timp de ase ani $5ullin i #chlegel,%&1'). :euita i durata conservrii este cu at/t mai mare cu c/t specia la care selucreaz rezist mai bine la temperaturi sczute n condiii naturale.

13.1.- Conser"area &rin !re%ere len%*

(reterea lent a plantelor in vitrose face prin modificarea factorilor demediu temperatur, cantitate de oxigen i folosirea substanelor inhibitoare decretere sau substane capabile s ridice presiunea osmotic a mediului.

emperatura poate fi redus la %!8 o(, c/nd creterea se diminueazfoarte mult sau se menine la temperaturi normale +'!+> o( cu scderea cantitiide oxigen din vasele de cultur, care reduce mult metabolismul, reduc/nd

corespunztor creterea.

+%>


5/5

+%&

crioconservarea la plante

Documents