carte lp genetica 2003

INTRODUCERE

Orice lucrare care se respectă debutează cu definirea domeniului cunoaşterii abordat. În cazul geneticii definiţia este simplă: “genetica este ştiinţa eredităţii şi a variabilităţii”. Totuşi, această definiţie ascunde o complexitate extraordinară, ale cărei limite nu sunt, încă, nici măcar întrevăzute. De altfel, genetica, cea mai nouă dintre ştiinţele biologice, a avut cea mai explozivă evoluţie, fiecare an al ultimei jumătăţi de secol fiind marcat de anunţarea a cel puţin unei noi descoperiri majore în acest domeniu. Această evoluţie a fost confirmată, printre altele, şi de acordarea în ultimele trei decenii a majorităţii Premiilor Nobel pentru Medicină unor cercetători, care au abordat teme de genetică.

Genetica umană este pe de o parte disciplină fundamentală, înţelegerea fenomenelor genetice fiind obligatorie în pregătirea studenţilor de astăzi, iar pe de altă parte o disciplină clinică şi medicală, neexistând domeniu al medicinei în care să nu existe cel puţin câteva afecţiuni ereditare sau condiţionate genetic. Genetica umană este, de asemenea, şi disciplină medico-socială, programele sale de profilaxie fiind importante pentru societate deoarece asigură prevenirea apariţiei şi transmiterii bolilor genetice.

Lucrarea se adresează în primul rând studenţilor Univeristăţii de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi, dar ea poate reprezenta un punct de plecare în descifrarea tainelor geneticii şi pentru medici rezidenţi în diverse specializări, în contextul absenţei, în ultima perioadă, a unor cărţi în domeniul abordat şi al existenţei în orice articol ştiinţific valoros al unei componente genetice. Lucrarea se bazează pe programa analitică a disciplinei de Genetică umană a Facultăţii de Medicină Iaşi, reprezentând o completare necesară a problematicii abordate la cursul predat studenţilor în cadrul aceleiaşi discipline.

Acest manual se doreşte a fi un îndrumar util pentru deprinderea unor aptitudini practice, utile medicilor din oricare domeniu medical. Astfel, orice viitor medic care va practica în mileniul III trebuie să ştie să întocmească o anchetă familială şi să realizezea un arbore genealogic, să înţeleagă importanţa acordării sfatului genetic şi să fie capabil să evalueze riscul de recurenţă al unei afecţiuni. De asemenea, medicii din ziua de astăzi trebuie să ştie care sunt analizele genetice, începând cu banalul test al cromatinei sexuale şi terminând cu cele mai sofisticate metode de analiză genetică moleculară, dar mai ales să cunoască situaţiile când aceste determinări sunt utile, precum şi să fie capabili să interpreteze rezultatele furnizate de laboratoarele de specialitate.

Lucrarea este elaborată în 14 capitole distincte, fiecare dintre acestea fiind în conexiune cu tematica lucrărilor practice ale disciplinei de Genetică umană. Fiecare capitol este structurat în trei părţi: noţiuni teoretice, elemente cu aplicabilitate practică, respectiv exerciţii şi probleme care vizează întărirea cunoştinţelor acumulate de studenţi. Ponderea celor trei categorii de probleme este diferită, existenţa în anumite capitole a unei prezentări mai ample a datelor teoretice fiind determinată de necesitatea înţelegerii depline a noţiunilor, importantă pentru abordarea aplicaţiilor practice şi a evaluării cunosştinţelor dobândite.

Primele cinci capitole ale lucrării abordează elemente de citogenetică umană normală şi patologică, fiind prezentate noţiuni referitoare la aparatul genetic al celulei, ciclul celular, diviziunea celulei, cromatina sexuală, cromosomii umani, anomaliile cromosomice, respectiv bolile cromosomice. Următoarele trei capitole vizează probleme de ereditate normală şi anormală, fiind axate pe studiul caracterelor monogenice, respectiv al celor poligenice

Introducere 2

(multifactoriale). Ultimele şase capitole ale lucrării prezintă elemente de patologie genetică, fiind prezentate noţiuni de: genetica populaţiilor, consultul genetic, diagnosticul molecular al afecţiunilor genetice, sfatul genetic, respectiv modalităţile de profilaxie a maladiilor genetice, prin screening populaţional şi diagnostic prenatal.

În completarea acestei lucrări, autorii pregătesc o culegere de probleme, teste şi cazuri clinice, utilă pentru autoevaluarea şi ameliorarea activităţii individuale a fiecărui student. Sperăm ca această culegere să apară cât mai curând, pe parcursul anului 2004.

În contextul dezvoltării fulminante a Geneticii umane, necesitatea apariţiei acestui cărţi este de la sine înţeleasă. Datorită dinamicii deosebite a domeniului abordat, elaborarea lucrării a fost deosebit de dificilă, reprezentând rodul unor strădanii depuse pe parcursul a mai mult de un deceniu, iar majoritatea capitolelor au fost revizuite de mai multe ori, în conexiune cu cele mai noi descoperiri ale geneticii. De altefel, actuala formă a lucrării constituie o armonizare a viziunii autorilor, la elaborarea ei fiind luate în considerare observaţiile oricărui membru al colectivului de autori. În plus, formatul actual al cărţii a fost “testat” pe generaţiile anterioare de studenţi, dovedindu-şi valoarea şi actualitatea. Un alt element, care a îngreunat munca colectivului de autori, a fost legat de încercarea, sperăm noi reuşită, de abordare concisă, exactă şi cât mai completă a acestui domeniu fascinant care este Genetica umană.

În încheierea acestei scurte prezentări, exprimăm mulţumirile şi consideraţia noastră celor care ne-au îndrumat continuu la elaborarea acestui manual. Astfel, ne exprimăm recunoştinţa Domnului Profesor Doctor Mircea Covic, iniţiatorul acestui proiect şi cel care a fundamentat catedra şi şcoala de Genetică medicală ieşeană, precum şi Doamnei Conferenţiar Doctor Ortansa Felicia Stoica, care a fost întotdeauna alături de noi cu un sfat bun şi o încurajare.

Autorii Iaşi, septembrie 2003

1. APARATUL GENETIC AL CELULEI

I. DATE TEORETICE

A. GENETICA - ŞTIINŢA EREDITĂŢII ŞI VARIABILITĂŢII

1. DEFINIŢII

a. EREDITATEA

Ereditatea reprezintă capacitatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale personale, precum şi pe cele ale speciei căreia îi aparţine. Deoarece copiii nu sunt niciodată identici cu părinţii lor, ereditatea este procesul prin care se realizează similitudinea biologică între părinţi şi descendenţi. Părinţii, însă, nu transmit la copii caractere, ci informaţiile necesare pentru realizarea lor. În acest context, ereditatea este un proces informaţional care presupune stocarea, transmiterea şi expresia informaţiei ereditare pentru formarea caracterelor morfofuncţionale specifice unui individ.

b. VARIABILITATEA

Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre indivizii unei populaţii precum şi dintre populaţii diferite. Principalele surse de variabilitate genetică sunt: mutaţiile, recombinările genetice şi migraţiile. Datorită acestor procese, fiecare individ are o structură genetică unică.

2. ADN - SUBSTRATUL BIOCHIMIC AL EREDITĂŢII

Ereditatea este o funcţie care are ca substrat molecular acidul deoxiribonucleic (ADN). ADN-ul îndeplineşte trei funcţii majore, care reprezintă esenţa eredităţii (figura 1.1.): ADN-ul deţine informaţia genetică codificată pentru realizarea caracterelor specifice unui

organism. Unitatea de informaţie ereditară este gena, un segment de ADN ce deţine informaţia necesară pentru realizarea unui caracter ("o genă un caracter"). Alterarea accidentală a structurii genei se numeşte mutaţie şi poate duce la modificarea caracterului respectiv (caracter mutant).

ADN-ul exprimă informaţia genetică, prin sinteza unor proteine specifice care determină caracterele organismului ("o genă o proteină") (figura 1.1. A). La realizarea acestor caractere participă însă şi factorii de mediu. Ansamblul de caractere manifeste şi specifice unui organism, determinate de ereditate şi mediu, se numeşte fenotip.

ADN-ul transmite informaţia genetică în succesiunea generaţiilor de celule sau organisme, prin replicare (biosinteza, pe baza informaţiei conţinute de cele două catene ale moleculei de ADN iniţiale, a două molecule noi de ADN identice) urmată apoi de distribuirea egală a moleculelor de ADN în cursul diviziunii celulei (figura 1.1. B).

Aparatul genetic al celulei 4

A B

Figura 1.1. Reprezentarea schematică a funcţiilor ADN A. Gena este un segment de ADN care deţine codificat, sub forma unei secvenţe de nucleotide, informaţia genetică pentru realizarea unui caracter. Această informaţie este copiată (pe bază de complementaritate) în ARNm şi apoi decodificată (translată) sub forma unei secvenţe specifice de aminoacizi, constituind o proteină care stă la baza unui anumit caracter fenotipic. B. Transmiterea informaţiei genetice prin biosinteza ADN-ului (replicare semiconservativă) şi diviziunea celulei.

Genetica este ştiinţa eredităţii şi variabilităţii Ereditatea este proprietatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale

personale, precum şi cele de specie. Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre

indivizii unei populaţii şi dintre populaţii diferite.

Cat

enă

sens


Substratul molecular al eredităţii este ADN. ADN-ul conservă, exprimă şi transmite informaţia genetică

B. APARATUL GENETIC AL CELULEI Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile) precum şi cele care

intervin în realizarea funcţiilor sale (ribosomii – implicaţi în sinteza proteică – respectiv centriolii – participă la diviziune prin formarea fusului de diviziune) alcătuiesc aparatul genetic al celulei (figura 1.2.).

Microscop electronic Microscop optic

Figura 1.2. Schema morfologiei nucleului interfazic

1. NUCLEUL

Elementul principal al aparatului genetic este nucleul; el conţine 99,5% din ADN celular şi este centrul de comandă şi control al tuturor activităţilor celulare. În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază specific cu anumite proteine (histonice şi nehistonice) şi formează, prin spiralizări succesive, fibrele de cromatină. La începutul diviziunii fibrele de cromatină se condensează şi formează cromosomii, substratul morfologic al eredităţii.

Numărul şi forma cromosomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om, în celulele somatice sunt 46 cromosomi (2n = set diploid). Informaţia genetică conţinută de genele din cei 46 de cromosomi este denumită genotip.

În celulele sexuale mature (ovulul şi spermatozoidul) numărul de cromosomi este redus, prin meioză, la 23 cromosomi (n = set haploid)1. Informaţia genetică dintr-un set haploid de cromosomi se numeşte genom. Cantitatea de ADN a genomului nucleului haploid este denumită valoare C şi este caracteristică şi constantă pentru fiecare specie. Conţinutul de ADN al celulelor diploide poate fi 2C sau 4C în funcţie de stadiul ciclului celular (figura

1 Termenul de genom este folosit pentru a descrie totalitatea informaţiei genetice din celula umană. El este alcătuit din genomul nuclear şi din genomul mitocondrial. Pentru o mai bună distincţie se folosesc termenii de genom diploid şi genom haploid

Mb.c membrana celulară R ribosomi RE reticul

endoplasmatic M mitocondrii L lizozom C centriol Mb.Nc membrană nucleară Nc nucleol CR cromocentri CRT.X

cromatina X

CRM cromonemă


1.3.). Anumite celule diferenţiate din organismul uman sunt tetraploide (hepatocitele, cardiomiocitele) sau chiar poliploide (celulele musculare scheletice) în timp ce altele sunt lipsite de nucleu şi de cromosomi (hematii mature, trombocite) ca fenomen adaptativ pentru o mai bună realizare a funcţiilor celulare caracteristice.

2. MITOCONDRIILE

Mitocondriile conţin 0,5 % din ADN-ul celular, responsabil de ereditatea citoplasmatică. Informaţia genetică din ADN mitocondrial se numeşte plasmotip şi provine exclusiv de la mamă (zigotul moşteneşte mitocondriile ovulului).

Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile) precum şi cele care participă la realizarea funcţiilor sale (ribosomii şi centriolii) alcătuiesc aparatul genetic al celulei.

Elementul principal al aparatului genetic este nucleul, care conţine 99,5% din ADN şi a cărui morfologie depinde de fazele ciclului celular.

Cromosomii reprezintă substratul morfologic al eredităţii.

C. CICLUL CELULAR

1. DEFINIŢIE. PERIOADE. DURATĂ

Ciclul celular reprezintă succesiunea de evenimente biochimice şi morfologice care se produc în viaţa unei celule, din momentul formării şi până la sfârşitul diviziunii sale. Ciclul celular are două mari perioade: interfaza şi diviziunea (figura 1.3.).

a. INTERFAZA

Interfaza reprezintă perioada cuprinsă între două diviziuni succesive, în care se desfăşoară activităţile specifice unei celule. Evenimentul cel mai important al interfazei este sinteza de ADN prin procesul de replicare. Interfaza poate fi subdivizată în trei etape succesive: faza G1 (presintetică), faza S (de sinteză) şi faza G2 (postsintetică sau premitotică).

b. DIVIZIUNEA CELULARĂ

Diviziunea celulară sau faza M ("mitotică") este alcătuită dintr-o serie de procese secvenţiale prin care materialul genetic (ADN) replicat în interfază, se distribuie egal şi total (segregare cromatidiană) formând doi nuclei distincţi, iar celula se împarte în două celule fiice (citokineză); identice genetic cu celula din care provin (figura 1.1.B). Prin replicarea ADN-ului şi diviziune se asigură transmiterea fidelă a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare.

c. DURATA CICLULUI CELULAR

Durata ciclului celular poate varia mult între diferite ţesuturi, datorită duratei fazei G1, celelalte faze fiind relativ constante ca durată. În celulele eucariote, duratele aproximative ale fazelor interfazei sunt: G1 = 10 ore, S = 9 ore, G2 = 4 ore, M = 1 oră.

2. FAZELE CICLULUI CELULAR MITOTIC

a. FAZA G1

În faza G1 (engl. gap - interval) sunt sintetizate intens substanţe (ARN, proteine) necesare creşterii şi funcţionării celulei (tabelul 1.1.). Fiecare cromosom (despiralizat) este


monocromatidian, fiind alcătuit dintr-o moleculă de ADN. Cantitatea de material genetic este 2C molecule de ADN, sub forma a 2n (46) cromosomi despiralizaţi (figura 1.3.).

2C

Figura 1.3. Ciclul celular mitotic (adaptat după Strachan şi Read, 1999)

În prima parte a fazei G1 (G1A), celulele acumulează ARN şi proteine până la o concentraţie prag, numită punct de restricţie "R", după care trec în subfaza G1B, fiind pregătite să intre în faza S (figura 1.4.).

În anumite condiţii (lipsa factorilor de creştere, a aminoacizilor sau prezenţa unor inhibitori ai sintezei proteinelor etc.) celulele aflate în subfaza G1A trec într-o fază de activitate metabolică redusă, numită faza G0 sau G1Q (engl. "quiescent" - inert, liniştit) în care rămân viabile şi pot supravieţui timp îndelungat.

Dacă condiţiile restrictive dispar, celulele G0 pot reveni în G1 şi apoi pot progresa spre faza S, deoarece îşi păstrează capacitatea de diviziune. Fazele G1 şi G0 sunt două stări fiziologice distincte ale celulei. Unele celule aflate în subfaza G1A părăsesc definitiv ciclul celular şi trec în faza G1D, ce corespunde celulelor diferenţiate; ele nu se mai divid şi mor după un anumit timp.

46 cromosomi despiralizaţi

4 catene de ADN per

cromosom

46 cromosomi condensaţi

bicromatidieni

2 catene de ADN per cromosom

92 de cromosomi monocromatidieni, ce vor fi împărţiţi la cele două

celule fiice

4 catene de ADN per

cromosom

Sinteză de ADN

2 catene de ADN per cromosom

46 cromosomi monocromatidieni


Tabelul 1.1. Caracteristicile principale ale fazelor ciclului celular mitotic2

PERIOADA FAZA ŞI DURATA

(ore)

EVENIMENTE CANTITATE ADN

ASPECT LA MICROSCOPUL ELECTRONIC

Interfază G1 10h Sinteză intensă de ARN şi proteine

2C 2n cromosomi monocromatidieni

S 9h Sinteză de ADN şi histone

4C

G2 4h Sinteza proteinelor fusului de diviziune Sinteza factorului de declanşare al mitozei

4C 2n cromosomi bicromatidienidespiralizaţi

Diviziune M 1h Profază Metafază Anafază

4C 4C

Cromosomi bicromatidienicondensaţi (vizibili la microscopuloptic)

Telofază 2C 2C Cromosomi monocromatidieni

Figura 1.4. Fazele ciclului celular mitotic şi evoluţia celulelor rezultate prin diviziune

b. FAZA S

Faza S (engl. "synthesis" - sinteză) se caracterizează prin sinteza de ADN (realizată prin replicare semiconservativă) şi sinteza de histone; se produce astfel o dublare a cantităţii de material genetic (4C), condiţie obligatorie pentru desfăşurarea diviziunii celulare. Numărul de cromosomi rămâne 46, dar fiecare cromosom va fi bicromatidian, alcătuit din două cromatide identice ("surori") ce conţin două molecule identice de ADN.

Replicarea ADN în faza S este asincronă: unele segmente de ADN (bogate în perechi de baze G-C) se replică precoce, la începutul fazei S, iar alte segmente (bogate în perechi de baze A-T) se replică tardiv, la sfârşitul fazei S.

2 Ciclul celular meiotic are o serie de particularităţi (vezi capitolul 2)


c. FAZA G2

Faza G2 se caracterizează prin sinteza unor proteine specifice şi a unor mici cantităţi de ADN (necesar în procesul de "corectare" a erorilor de replicare). Fiecare cromosom este bicromatidian (cantitatea de ADN este 4C) dar despiralizat. Spre sfârşitul fazei G2 se activează/ sintetizează "factorul de declanşare a mitozei" (MPF) ce determină condensarea filamentelor de cromatină în cromosomi şi formarea fusului de diviziune. În lipsa factorului de condensare, celulele se opresc în faza G2 şi pot abandona ciclul celular, formându-se celule tetraploide (4n cromosomi); unele dintre ele devin prin amitoză, celule binucleate (de exemplu, o parte din cardiomiocite adulte) (figura 1.4.).

d. FAZA M

Faza M corespunde mitozei şi durează aproximativ 1 oră. Ea începe cu diviziunea nucleului (mitoză) şi se termină cu diviziunea citoplasmei (citokineză). În această etapă, materialul genetic dublat în interfază (4C molecule ADN - 46 cromosomi bicromatidieni) segregă, adică se distribuie în mod egal şi total celulelor "fiice" (2C molecule ADN - 46 cromosomi monocromatidieni) care vor fi identice cu celula din care provin.

Procesul de "distribuţie" (segregarea cromatidelor surori) a materialului genetic prin diviziune se desfăşoară, de obicei, cu mare precizie asigurând fidelitatea transmiterii informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule (vezi capitolul 2).

3. EVOLUŢIA CELULELOR REZULTATE PRIN DIVIZIUNE

Celulele rezultate după diviziune pot evolua în trei direcţii: proliferare, diferenţiere şi trecerea în stadiul de repaus.

a. PROLIFERAREA

Celulele parcurg un nou ciclu celular şi se divid repetat; aceste "celule ciclice" alcătuiesc compartimentul proliferativ al organismului şi se găsesc în ţesuturile embrionare, măduva hematogenă, stratul bazal al epidermului ş.a.

b. DIFERENŢIEREA

Celulele părăsesc definitiv ciclul celular şi se transformă în celule specializate, cu anumite structuri şi funcţii, care nu se mai divid şi mor după un timp determinat. De exemplu: neuronii, celulele musculare, granulocitele, hematiile mature etc.

c. STADIUL DE REPAUS

Unele celule părăsesc ciclul celular în faza G1 şi rămân în faza G0, având o activitate metabolică minimă, dar păstrându-şi capacitatea de diviziune. Aceste celule formează compartimentul neproliferativ. În condiţii speciale, ele reacţionează la anumiţi stimuli din mediu (factori de creştere, unii hormoni, substanţe mitogene etc.) şi pot reintra în ciclul de diviziune. Un exemplu edificator îl reprezintă activarea limfocitelor T din sângele periferic sub acţiunea fitohemaglutininei (PHA); ele se transformă în limfoblaste, celule tinere, care se divid intens. Acest fenomen este utilizat pentru studiul cromosomilor prin culturi de limfocite (vezi capitolul 3).

4. CONTROLUL CICLULUI CELULAR

Progresia ordonată şi desfăşurarea normală a ciclului celular sunt realizate prin reacţii biochimice în care multiple kinaze dependente de cicline (CDK)(1-7) sunt activate, prin fixarea unor proteine numite cicline (A-H). După activare, fiecare complex proteic CDK-ciclină fosforilează anumite proteine sepecifice, necesare pentru reacţiile care au loc într-o


anumită fază a ciclului. Apoi, complexul CDK-ciclină poate fi inactivat, fie prin degradarea proteolitică a ciclinei (de către ubiquitină) fie prin intervenţia unor molecule inhibitoare CKI (p27, p21 ş.a) .

Interacţiunea dintre activarea şi inactivarea activităţilor CDK, în diferite momente cheie, asigură progresia normală şi reglarea ciclului celular. Fiecare fază a ciclului are un control specific (figura 1.5.) realizat în G1 de complexul CDK4-ciclina D, la tranziţia G1/S de complexul CDK2-ciclină E, în faza S de complexul CDK2-ciclină A, iar în fazele G2 şi M de complexul CDC2-ciclină B.

Figura 1.5. Reprezentare schematică a reglării fazelor ciclului celular prin intermediul complexelor CDK-ciclină

(adaptat după Jameson et al., 1998)

Tranziţia de la o fază la alta a ciclului celular este controlată prin mecanisme specifice, care acţionează în anumite puncte de control şi verifică dacă anumite procese sunt terminate corect sau dacă nu există erori; în cazul identificării unor defecte se blochează progresia în ciclul celular (prin inactivarea CDK) şi se induce ”repararea” sau, dacă aceasta nu este posibilă, apoptoza (moartea celulară programată).

Pe parcursul ciclului celular se produc următoarele evenimente: Celulele aflate în faza “de start” G1 reacţionează la stimuli externi (mitogeni, factori de

creştere) formându-se complexul CDK4-ciclină D, care fosforilează şi deci activează diferite proteine ce funcţionează în această fază. Printre acestea, un rol important îl are proteina Rb, care (după fosforilare) eliberează un factor activator (E2F) al transcripţiei genelor ce funcţionează în faza S şi realizează replicarea ADN.

Ciclină D

CDK4

Ciclină E

CDK2

Rb E2F

P

P

CAK (ciclină H/CDK7)

P

Mitogeni, factori nutriţionali, factori de creştere

p21, p27, p57

p21, p27, p57

p15, p16, p18, p19

p21, p27, p57

MPF

G0

2C

G1 2C

G2 4C

Mitoză 4C/2

Faza S2C

puncte de restricţie sau de control CDK2

Ciclină A

CDK2

Ciclină A

Ciclină B

CDC


Intrarea în faza S este determinată de un semnal activator, complexul CDK2-ciclină E. Formarea acestui complex este însă blocată de inhibitorul p27 al CDK; trecerea în faza S implică mai întâi degradarea p27 (de către ubiquitină)

În punctul de control G1/S are loc o verificare a parametrilor de evoluţie normală a celulei: orice alterare a ADN, depleţie de oxigen / metaboliţi / energie sau pertrurbare fiziologică declanşează sinteza proteinei p53 (“gardianul” genomului uman) care activează transcripţia genei ce codifică proteina p21, un inhibitor al complexelor CDK-ciclină. Celulele sunt oprite în G1, oferindu-li-se timp de corecţie; dacă alterările (în special cele din structura ADN) nu sunt reparate, celula va fi direcţionată spre apoptoză

Progresia ulterioară prin faza S şi replicarea ADN sunt reglate de către CDK2-ciclina A. În faza G2, la punctul de control G2/M, se decide dacă celula intră în mitoză; acest lucru

este determinat de activarea bruscă a complexului CDC2-ciclină B (numit anterior şi factorul MPF). Celulele cu aberaţii cromosomice sau defecte ale aparatului mitotic sunt oprite să intre în mitoză (prin acţiunea p53 p21, care blochează formarea complexului CDC2-ciclina B)).

În cursul mitozei, în metafază, mai există un punct de control M în care diviziunea se opreşte şi este verificată alinierea perfectă a cromosomilor, înaintea separării cromatidelor surori. Acţiunea este realizată de către o proteină inhibitoare ISS; degradarea proteolitică a acestei proteine (determinată de ubiquitină) declanşează anafaza prin separarea cromatidelor.

La sfârşitul mitozei are loc degradarea bruscă a ciclinei B (produsă de către ubiquitină) şi inactivarea CDC2, fenomene ce permit celulei să treacă într-o nouă fază G1.

Proliferarea celulară este reglată pe o durată limitată de factori extracelulari (hormoni, factori de creştere etc.) precum şi de anumite gene de proliferare sau "mitogene" (ce codifică cicline, receptori ai factorilor de creştere, proteine necesare sintezei de ADN, etc.). Deoarece prin mutaţia şi activarea lor anormală se produce o proliferare celulară anormală şi cancer, aceste gene normale mai sunt numite şi proto-oncogene. O altă categorie de gene, numite antiproliferative, au rolul de a inhiba proliferarea celulară. De aceea aceste gene mai sunt numite gene supresoare de tumori sau antioncogene.

În cancer se produce o perturbare a desfăşurării normale a ciclului celular. Celulele canceroase, purtătoare de mutaţii, "scapă" de controlul mecanismelor care reglează proliferarea normală, parcurg rapid şi repetat ciclul celular, multiplicându-se permanent şi anarhic. Multe medicamente anticanceroase (citostatice) determină "blocarea" proliferării celulelor, prin oprirea evoluţiei lor în diferite faze ale ciclului celular.

Ciclul celular reprezintă o succesiune de evenimente biochimice şi morfologice care se produc în viaţa unei celule. El prezintă două perioade: interfaza şi diviziunea.

Interfaza, perioada cuprinsă între două diviziuni, este alcătuită din trei faze succesive: G1, S, G2; în faza S, se produce sinteza de ADN, prin replicare semiconservativă, iar cantitatea de material genetic se dublează (4C).

Prin diviziune (faza M) conţinutul nuclear dublat în interfază se distribuie egal şi total celulelor fiice. Prin aceasta se asigură transmiterea fidelă a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare.

Celulele rezultate după diviziune pot evolua în trei direcţii: proliferarea (printr-o nouă diviziune) diferenţierea (specializarea celulelor), trecerea în stadiul de repaus G0 (celule cu activitate metabolică redusă).


Ciclul celular este reglat prin intervenţia genelor proliferative (proto-oncogene) şi a genelor antiproliferative (gene supresoare de tumori) a căror mutaţie produce cancer.

D. NUCLEUL Elementul principal al aparatului genetic este nucleul, centrul de comandă şi control

al tuturor activităţilor celulelor eucariote. În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază specific cu anumite proteine (histonice

sau nehistonice) şi constituie un complex supramolecular deoxiribo-nucleoproteic. El formează prin spiralizări succesive fibre de cromatină (cromoneme) din care, printr-o condensare progresivă, se formează la începutul diviziunii cromatida unui cromosom (figura 1.6.).

Fiecare cromatidă a unui cromosom bicromatidian este alcătuită dintr-o singură moleculă de ADN. La sfârşitul diviziunii se produce fenomenul invers, de despiralizare a cromosomilor. Cromosomii sunt structuri permanente ale nucleului, dar ei sunt vizibili la microscopul optic numai în diviziune. În interfază cromosomii sunt despiralizaţi şi nu se observă la microscopul optic.

Figura 1.6. Relaţia ADN - fibre de cromatină - cromosomi

(după Strachan şi Read, 1999)

1. NUCLEUL INTERFAZIC

Nucleul interfazic este alcătuit din membrana nucleară, nucleoplasmă, cromatină şi nucleol(i) (figura 1.2.). Constituentul cel mai important este cromatina, forma interfazică a materialului genetic.

Cromatide surori 80 Mb de ADN

80 Mb de ADN

Centromer 2 nm

600 nm

600 nm 600 nm

Dublu helix

Zonă inter-nucleoso-

mală 10 nm

Filament cu nucleosomi

Nucleosomi

30 nm Fibră de cromatină

10 nm

300 nm

Fibre de cromatină pliate în bucle laterale

(75 kb)


a. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CROMATINEI

Cromatina este alcătuită din ADN, proteine histonice, ARN, ioni bivalenţi etc. Dintre acizii nucleici predomină ADN, care se evidenţiază histochimic prin reacţia Feulgen (ADN se colorează în roşu-violet) sau coloraţia cu verde de metil pironină (ADN se colorează în verde, iar ARN din nucleol şi citoplasmă, în roşu cărămiziu).

b. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL OPTIC

La microscopul optic cromatina se observă sub forma unor granule mici, fine, slab colorate, printre care se găsesc corpusculi mari, condensaţi şi intens coloraţi bazofil, numiţi cromocentri; ei reprezintă părţi din cromosomi care nu s-au despiralizat în interfază. Cromatina se prezintă sub două forme sau stări morfo-funcţionale: eucromatină şi heterocromatină, diferenţiate prin gradul de condensare, intensitatea coloraţiei, momentul replicării.

Heterocromatina poate fi de două feluri: heterocromatină constitutivă, prezentă în toate celulele în poziţii identice la ambii

cromosomi omologi, fie la centromer, fie în diferite segmente cromosomice; heterocromatină facultativă, este prezentă fie numai în anumite celule sau ţesuturi, fie numai

la un anumit sex (de exemplu cromatina sexuală X la femei şi cromatina sexuală Y la bărbaţi - vezi capitolul 3).

Tabelul 1.2. Caracteristicile eucromatinei şi heterocromatinei

CARACTERISTICI EUCROMATINĂ HETEROCROMATINĂ Condensare Fin dispersată Puternic condensată (cromocentri) Colorare Slabă Intensă Replicare în faza S Precoce Tardivă Activitate genetică Activă Inactivă Compoziţie chimică Predomină p.b. C-G şi

ADN nerepetitiv Predomină p.b. A-T şi ADN repetitiv

c. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL ELECTRONIC

La microscopul electronic cromatina apare ca o aglomerare de filamente de grosimi diferite, spiralizate şi condensate neregulat3. Filamentele cele mai groase, din care la începutul diviziunii se formează cromosomii, se mai numesc cromoneme (figura 1.6.).

2. NUCLEUL ÎN DIVIZIUNE

Nucleul în diviziune îşi pierde aspectul interfazic. Materialul genetic este organizat în cromosomi. Ei rezultă printr-o accentuare a spiralizării cromonemelor, care se condensează, se scurtează şi se "acoperă" cu un înveliş proteic, devenind vizibili la microscopul optic (figura 1.6.).

a. NUMĂRUL CROMOSOMILOR

Numărul şi morfologia cromosomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om în celulele somatice sunt 46 de cromosomi (2n = număr diploid). Celulele sexuale mature (gameţii) au 23 de cromosomi (n = număr haploid); după fecundarea gameţilor, la zigot se reface numărul diploid de 46 cromosomi.

3 Relaţia ADN → fibre cromatină → cromosomi va fi discutată la curs


În celulele somatice cromosomii se găsesc în perechi de omologi, identici ca mărime şi formă, dar diferiţi ca origine (unul matern, altul patern). Din cele 23 de perechi de cromosomi, 22 sunt identice la cele două sexe - autosomi - iar o pereche diferă la cele două sexe, XX la femeie şi XY la bărbat, numindu-se gonosomi (heterosomi sau cromosomi sexuali). Cromosomii X şi Y, deşi au "omologie" funcţională (în determinismul sexual) se prezintă morfologic diferit: cromosomul Y este mult mai mic decât cromosomul X.

b. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR

Morfologia cromosomilor poate fi uşor analizată în metafază, când cromosomii ajung la condensare maximă, sunt bine individualizaţi şi se găsesc în acelaşi plan.

Cromosomul metafazic (figura 1.7.) este alcătuit din două cromatide paralele, identice ca mărime şi formă (“cromatide surori"), unite într-o regiune, mai slab colorată, numită centromer. El conţine două structuri specializate numite kinetocori, prin care cromosomul se fixează pe filamentele fusului de diviziune (vezi figura 2.2.A).

Telomer

Metacentric Submetacentric Acrocentric

Figura 1.7. Morfologia şi clasificarea cromosomilor după poziţia centromerului (după Thompson, 2001)

În zona centromerului se realizează o îngustare pe traiectul cromosomului numită constricţie primară. Centromerul împarte cromatidele în două braţe, egale sau inegale, notate convenţional cu "p" - braţul scurt - şi "q" - braţul lung.

Poziţia centromerului (figura 1.7.) poate fi: mediană, la cromosomii metacentrici (M); submediană, la cromosomii submetacentrici (SM) aproape terminală, la cromosomii acrocentrici (A).

Pe unii cromosomi se observă şi constricţii secundare (h), produse prin îngustarea cromatidelor; ele conţin heterocromatină. Părţile terminale ale cromatidelor sunt denumite telomere. Cromosomii acrocentrici prezintă constricţii secundare aproape de extremitatea braţelor scurte; ele determină separarea unor mici mase de heterocromatină, cunoscute sub numele de sateliţi.

În nucleul interfazic materialul genetic se găseşte sub formă de cromatină, alcătuită din ADN, proteine şi ARN. La microscopul optic cromatina se prezintă sub două forme: eucromatină (activă genetic) şi heterocromatină (inactivă genetic). La microscopul electronic cromatina apare formată din fibre de ADN şi proteine.

Satelit

Centromer

Cromatide


La începutul diviziunii fibrele de cromatină se condensează, transformându-se în cromosomi. În celulele somatice se găsesc 46 de cromosomi (2n = număr diploid).

Celulele sexuale mature (gameţi) au 23 de cromosomi (n= număr haploid). După fecundarea gameţilor, la zigot se reface numărul 2n = 46 de cromosomi. De

aceea, în celulele somatice, cromosomii se găsesc în perechi de cromosomi omologi, identici ca mărime, formă şi conţinut genetic, dar diferiţi ca origine (unul matern şi altul patern).

Din cele 23 de perechi de cromosomi omologi, 22 sunt identice la cele două sexe şi se numesc autosomi; o pereche este diferită: XX la femeie şi XY la bărbat, numindu-se cromosomi sexuali sau gonosomi.

Cromosomul metafazic este alcătuit din două cromatide, unite prin centromer; acesta împarte cromatidele în braţe scurte (notate cu "p") şi lungi (notate cu "q").

II. APLICAŢII PRACTICE

A. ASPECTUL CELULELOR PE PARCURSUL CICLULUI CELULAR

Analizaţi (la microscop sau pe fotografii) preparate obţinute din culturi de limfocite şi stabiliţi în ce faze ale ciclului celular se găsesc diferite celule din seria limfocitară. Precizaţi criteriile pe care se bazează opţiunile Dv.

B. SCHIMBURILE DINTRE CROMATIDELE SURORI Uneori, în faza S se produce un "schimb egal de material genetic între cromatidele surori"

(SCE - engl. ”sister chromatides exchanges”) care poate fi evidenţiat prin tehnici speciale aplicate în metafază. Acest fenomen are importanţă practică, deoarece frecvenţa schimburilor (normal 7-10 per metafază) creşte în anumite boli sau după expunerea organismului la substanţe mutagene. Astfel SCE reprezintă o metodă de evaluare a acţiunii mutagene a diferiţilor agenţi din mediul ambiant.

1. PRINCIPIUL METODEI SCE

Celulele în cultură efectuează două cicluri de replicare în prezenţa unui analog al timinei, numit 5-bromodeoxiuridină (BrdU). BrdU se încorporează, în locul timinei, în moleculele de ADN nou sintetizat, modificând proprietăţile de colorare ale cromatidelor. Folosind soluţia Giemsa sau colorantul fluorescent Hoechst 33258 se colorează exclusiv cromatida în a fost încorporat BrdU (figura 1.8.). În zonele în care se produce SCE se observă aspectul particular ("arlechin") al cromatidelor, cu zone colorate alternând cu zone necolorate.

2. IDENTIFICAREA SCE

Identificaţi pe fotografii şi/sau preparate cromosomice "schimburile între cromatidele surori"; calculaţi numărul de schimburi per metafază şi evaluaţi dacă rezultatul obţinut este normal sau nu.

C. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CROMATINEI Observaţi la microscop sau pe fotografii preparate celulare colorate prin reacţia Feulgen şi

reacţia cu verde de metil pironină. Precizaţi diferenţele observate şi explicaţi-le ţinând cont de specificitatea acestor reacţii.


Figura 1.8. Principiul metodei BrdU Săgeţile indică cromosomii la nivelul cărora există schimburi între cromatidele surori

(după Emery’s, 1998)

D. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL OPTIC Examinaţi la microscop şi pe fotografii aspectul nucleului interfazic la diferite tipuri de celule.

Precizaţi tipurile de cromatină care se observă şi caracterizaţi-le morfologic.

E. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR Analizaţi la microscop şi pe fotografii morfologia cromosomilor umani în metafaze obţinute

prin culturi de limfocite. Desenaţi o metafază şi identificaţi elementele principale descrise în morfologia cromosomilor,

precum şi diferitele tipuri de cromosomi după poziţia centromerului.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - Ereditate - Interfaza - Cromatină - Genotip - Faza G1 - Eucromatină - Genom - Faza S - Heterocromatină - Plasmotip - Faza G2 - Cromosomi - Fenotip - Faza G0 - Cromatidă - Ciclu celular - Diviziune - Centromer

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Părinţii transmit la descendenţi caracterele lor (adevărat/fals?) 2. De ce un individ are o structură genetică unică, specifică? 3. Nucleul, mitocondriile, centriolii şi ribosomii alcătuiesc aparatul genetic deoarece conţin ADN

(adevărat/fals?) 4. Genotipul este informaţia genetică a celulei somatice. (adevărat/fals?)


5. Genomul constituie ansamblul genelor din cromosomii gameţilor. (adevărat/fals?) 6. Contribuţia maternă la ereditatea copilului este reprezentată de genomul ovulului

(adevărat/fals?) 7. Ce eveniment major are loc în faza S a ciclului celular? 8. Celulele din faza G0 se pot divide (adevărat/fals?) 9. Cancerul poate fi considerat o boală produsă prin perturbarea mecanismelor de control ale

ciclului celular (adevărat/fals?) 10. În eucromatină se găseşte ADN inactiv genetic. (adevărat/fals?) 11. Câţi cromosomi se găsesc în nucleul celulelor somatice? Câţi provin de la mamă? Câte

cromatide se observă la cromosomii metafazici? 12. Gonosomii sunt cromosomii celulelor sexuale. (adevărat/fals?) 13. Toţi cromosomii au o constricţie primară. (adevărat/fals?)

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"):

1. Care din următoarele organite celulare NU face parte din aparatul genetic al celulei: A. Nucleul; B. Centriolii C. Mitocondriile; D. Lizozomii; E. Ribosomii.

2. Care este cea mai scurtă fază a ciclului celular: A. Faza G1; B. Faza G0; C. Faza S; D. Faza G2 E. Faza M.

3. Cromocentrii reprezintă: A. Corpusculi de cromatină cu replicare precoce a ADN; B. Porţiuni de cromatină mai condensată şi mai intens colorată; C. Zona cu care cromosomul se fixează pe filamentele fusului de diviziune; D. Organitele care formează fusul de diviziune; E. Zonele terminale ale cromosomilor.

II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4.

4. Care din următoarele organite celulare conţin ADN: 1. Nucleul; 3. Mitocondriile; 2. Centriolii; 4. Ribosomii. 5. În ce faze ale ciclului celular o celulă somatică umană normală are 92 de molecule de ADN: 1. Sfârşitul fazei S şi faza G2; 3. Profaza şi metafaza; 2. Fazele S şi anafază; 4. Fazele G2 şi G1.

6. Heterocromatina facultativă este: 1. Prezentă numai în anumite celule; 2. Prezentă numai la sexul feminin; 3. Inactivă genetic; 4. Constituită din ARN şi proteine.

7. Care din următoarele afirmaţii privind centromerul sunt corecte: 1. Formează constricţia secundară; 2. Împarte cromosomul în două braţe; 3. Separă sateliţii de telomer; 4. Poziţia sa clasifică cromosomii în trei categorii.

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"):


A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false.

8. ADN este substratul material al eredităţii deoarece conţine informaţia genetică codificată.

9. În faza G2 cromosomii sunt bicromatidieni, deoarece a apărut factorul de condensare al cromosomilor.

10. Cromosomii submetacentrici au sateliţi deoarece, centromerul realizează o constricţie aproape de extremitatea braţelor scurte.

IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere:

Asociaţi structurile celulare din coloana din stânga cu definiţiile sau caracteristicile (funcţiile) care le corespund, din coloana din dreapta: 11. Nucleul A. Formează fusul de diviziune 12. Mitocondriile B. Aspectul materialului genetic în interfază 13. Ribosomii C. Elementul principal al aparatului genetic 14. Cromatina D. Participă la sinteza proteinelor 15. Centriolii E. Conţin 0,5 % din ADN-ul celulei

2. DIVIZIUNEA CELULEI

I. DATE TEORETICE

A. GENERALITĂŢI Diviziunea celulei reprezintă ansamblul evenimentelor prin care se produce

multiplicarea celulară şi se asigură, prin intermediul cromosomilor, transmiterea informaţiei ereditare în succesiunea generaţiilor de celule sau organisme (figura 1.1.B). Prin diviziune, materialul genetic se transmite: de la o celulă somatică la celulele fiice, prin mitoză, rezultând celule noi identice cu celula

din care provin; de la un organism adult la descendenţi, prin intermediul gameţilor haploizi, rezultaţi în urma

meiozei.

B. MITOZA Mitoza este o diviziune caracteristică celulelor somatice ale organismului. Ea asigură

creşterea organismului, reînnoirea celulară şi repararea unor leziuni tisulare. Prin mitoză, materialul genetic, dublat în interfază, se distribuie total şi egal celulelor fiice. Mitoza este o diviziune ecvaţională, deoarece din celula iniţială (celula “mamă”) cu 46 cromosomi rezultă două celule “fiice” care au, de asemenea, 46 cromosomi (celule diploide). Mitoza permite transmiterea cu mare fidelitate a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule, ceea ce asigură stabilitatea proceselor ereditare.

1. FAZELE MITOZEI

Mitoza se desfăşoară în cinci etape succesive: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza (figura 2.1.).

a. PROFAZA

La începutul profazei, în nucleu are loc condensarea fibrelor de cromatină, numite şi "cromoneme", prezente sub forma unor filamente fine, care se scurtează şi se îngroaşă, devenind intens colorate şi vizibile sub formă de cromosomi.

Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide surori, datorită replicării materialului genetic în faza S a interfazei. Fiecare din cele două cromatide conţine în regiunea centromerului o secvenţă specifică de ADN repetitiv, unde cromatidele sunt unite prin intermediul unor proteine. La acest nivel se asamblează complexe proteice specializate, numite kinetocori (figura 2.2.A) cu care cromosomul se va fixa pe filamentele fusului de diviziune.

În citoplasmă, centrosomul (un organit citoplasmatic perinuclear) se divide; cei doi centrosomi rezultaţi se deplasează în direcţii opuse, formând polii fusului de diviziune. Ei sunt uniţi prin filamente alcătuite din microtubuli (figura 2.2.B). Nucleolii diminuă ca mărime şi în cele din urmă se dezintegrează.

Diviziunea celulei

20

Figura 2.1. Fazele mitozei

Reprezentare diagramatică pentru o celulă ipotetică cu două perechi de cromosomi: 1 - Profaza; 2 - Prometafaza; 3 - Metafaza; 4 - Anafaza; 5 - Telofaza

(adaptat după Thompson, 2001)

A B

Figura 2.2. Microtubuli kinetocorici A. Fixarea microtubulilor la cromosomul metafazic.

B. Diferite clase de microtubuli. Fusul mitotic

b. PROMETAFAZA

Prometafaza este un stadiu intermediar între profază şi metafază, caracterizat prin: fragmentarea membranei nucleare, ataşarea cromosomilor (prin kinetocori) la filamentele fusului de diviziune, condensarea cromosomilor şi deplasarea lor spre ecuatorul celulei.

Diviziunea celulei

21

c. METAFAZA

În metafază cromosomii bicromatidieni îşi continuă procesul de spiralizare şi condensare. Ei se aliniază independent unul de altul la ecuatorul fusului de diviziune, în acelaşi plan, formând aşa-numita placă metafazică.

Metafaza este stadiul optim pentru studiul cromosomilor, deoarece aceştia sunt contractaţi, bine individualizaţi morfologic şi dispuşi într-un singur plan.

d. ANAFAZA

În anafază se produce “clivarea” longitudinală a centromerului şi separarea celor două cromatide, proces numit disjuncţie (segregare) cromatidiană. Din fiecare cromosom bicromatidian se formează doi cromosomi monocromatidieni (figura 2.3. A).

Figura 2.3. Disjuncţia (A) şi nedisjuncţia (B) cromatidiană în mitoză

După separare, cromosomii monocromatidieni sunt traşi spre polii fusului de diviziune prin scurtarea fibrelor kinetocorice4. Deplasarea cromosomilor spre poli se face simultan, cu aceeaşi viteză. Astfel, se produce împărţirea totală şi egală a materialului genetic între celulele fiice.

e. TELOFAZA

Se caracterizează prin evenimente opuse celor din profază. Cromosomii suferă un proces de decondensare şi despiralizare, îşi pierd structura vizibilă la microscopul optic, devenind cromoneme subţiri, vizibile doar la microscopul electronic. Fusul de diviziune se dezasamblează, se reface membrana nucleară şi reapare nucleolul. Începe diviziunea citoplasmei (citokineză) şi, în final, cele două celule fiice se separă, fiecare conţinând 2n cromosomi monocromatidieni cu aspect interfazic.

Diviziunea este de două tipuri: mitoza - în celulele somatice şi meioza - în celulele sexuale.

Mitoza este o diviziune ecvaţională deoarece dintr-o celulă diploidă (2n=46) rezultă două celule fiice tot cu 2n=46.

4 Funcţia microtubulilor este demonstrată prin tratament cu colchicină, care inhibă formarea lor şi

împiedică aranjarea cromosomilor în plan ecuatorial, precum şi migrarea lor anafazică.

Diviziunea celulei

22

Mitoza cuprinde cinci faze: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza

În profază, cromosomii bicromatidieni se condensează, se formează fusul de diviziune şi nucleolii dispar.

În prometafază, membrana nucleară se dezasamblează şi cromosomii se ataşează prin centromer la filamentele fusului de diviziune.

În metafază, cromosomii dispuşi la mijlocul celulei formează placa ecuatorială; este stadiul optim pentru studiul cromosomilor.

În anafază, materialul genetic se împarte total şi egal prin fenomenul de disjuncţie cromatidiană; are loc migrarea cromosomilor spre polii celulei, simultan şi cu aceeaşi viteză.

În telofază, se produc evenimente opuse celor din profază şi se formează în final, prin citokineză, două celule fiice diploide (2n).

2. ERORI DE DISTRIBUŢIE A MATERIALULUI GENETIC ÎN MITOZĂ

Pentru a înţelege mai bine consecinţele unor erori de distribuţie a materialului genetic este necesară clarificarea unor termeni (caseta 2.1.).

Caseta 2.1. Set diploid de cromosomi (2n) = semnifică prezenţa a câte unei perechi din fiecare

cromosom în celulele somatice; la om 2n = 46 cromosomi. Set haploid de cromosomi (n) = prezent în celulele sexuale mature, caracterizat prin

existenţa a câte unui singur cromosom din fiecare pereche; la om n = 23 cromosomi. Aneuploidie = starea de dezechilibru genetic produsă prin existenţa în plus sau prin lipsa

unor cromosomi. Monosomie = absenţa unui cromosom dintr-o pereche de cromosomi omologi (2n-1=45). Nulisomie = absenţa ambilor cromosomi ai unei perechi (2n-2=44). Trisomie = prezenţa unui cromosom în plus faţă de cei doi cromosomi omologi care se

găsesc normal într-o celulă diploidă (2n+1=47). Tetrasomie = prezenţa în plus a doi cromosomi din aceeaşi pereche (2n+2=48). Pentasomie = prezenţa în plus a trei cromosomi din aceeaşi pereche (2n+3=49).

Principalele erori de distribuţie a materialului genetic în mitoză sunt: nedisjuncţia cromatidiană, întârzierea anafazică şi clivarea transversală a centromerului.

a. NEDISJUNCŢIA CROMATIDIANĂ

Nedisjuncţia cromatidiană apare când cele două cromatide ale unui cromosom nu se separă în timpul anafazei mitozei, ci rămân unite şi migrează împreună în una din cele două celule fiice (figura 2.3. B).

Consecinţa acestei erori este apariţia unor celule anormale: una cu un cromosom în plus (2n+1) = trisomică (47 cromosomi) alta cu cromosomul respectiv lipsă (2n-1) = monosomică (45 cromosomi). Dacă celulele rezultate sunt viabile şi se multiplică ulterior, rezultă o clonă (grup de celule ce au o particularitate comună şi provin prin mitoze repetate dintr-o celulă iniţială modificată) iar în organism apar mozaicuri cromosomice, cu trei linii celulare, de tipul 2n-1/2n/2n+1 (la om = 45/46/47) cromosomi, numite mixoploidii (Figura 2.4.). După tipul de cromosomi implicaţi în producerea lor, mozaicurile cromosomice pot fi: autosomale, gonosomale sau mixte.

Diviziunea celulei

23

Figura 2.4 Mecanismele de producere a mozaicurilor cromosomice prin nedisjuncţie cromatidiană în mitoză

A. Diviziune mitotică normală; B. Nedisjuncţie în prima diviziune a zigotului - rezultă un mozaic 45/47; C. Nedisjuncţie în diviziunile ulterioare - rezultă un mozaic 46/45/47 (viabilitatea şi dezvoltarea

depind de cromosomul implicat)

b. ÎNTÂRZIEREA ANAFAZICĂ

Întârzierea anafazică constă în migrarea cu întârziere a unuia sau mai multor cromosomi monocromatidieni, care vor rămâne în afara nucleilor celulelor fiice, în momentul formării membranelor nucleare. Ei formează “micronuclei” care dispar la următoarea diviziune. Rezultă linii celulare cu 2n-1/ 2n, adică 45/46 cromosomi (figura 2.5.).

Figura 2.5. Apariţia unui mozaic cromosomic prin întârziere anafazică mitotică Micronucleii se găsesc în citoplasma celulei. Ei se formează din cromosomi sau

fragmente de cromosomi care nu au migrat şi care nu au fost incluşi în nici unul din nucleii fii. Prezenţa lor, evidenţiată prin aşa numitul test al micronucleilor, indică tulburări ale

crs

cromosomi

Diviziunea celulei

24

desfăşurării mitozei. Testul este utilizat pentru depistarea mutaţiilor cromosomice induse de radiaţiile ionizante sau alţi factori mutageni (vezi aplicaţii practice).

c. CLIVAREA TRANSVERSALĂ A CENTROMERULUI

Clivarea transversală a centromerului produce isocromosomi (“cromosomi cu braţe egale”) alcătuiţi numai din braţe scurte (p) sau braţe lungi (q) (figura 2.6.). Ei sunt anormali, deoarece au duplicate genele de pe braţul prezent şi le lipsesc genele de pe braţul pierdut.

Figura 2.6 Mecanismul formării isocromosomilor A. Clivarea normală (longitudinală) a centromerului. B. Clivarea transversală a centromerului cu formarea unui isocromosom de braţ lung (q) şi unui isocromosom de braţ scurt (p); (adaptat după Friedman, 1992)

d. ABSENŢA CITOKINEZEI

După duplicarea ADN-ului în interfază (2n cromosomi bicromatidieni = 4C) celulele somatice se divid mitotic formând celule diploide (2n cromosomi monocromatidieni = 2C). Dacă citokineza nu se produce rezultă o celulă cu 4n cromosomi monocromatidieni (4C) - celulă tetraploidă. Acest proces, numit şi endomitoză, se observă în mod normal în procesul de regenerare hepatică.

e. CONSECINŢELE ERORILOR MITOTICE

Erorile de distribuţie a materialului genetic în mitoză determină apariţia unor anomalii de număr şi structură ale cromosomilor din celulele fiice. Ele vor influenţa evoluţia celulelor, modificând viabilitatea şi capacitatea de multiplicare. Celulele cu monosomie autosomală sunt, de obicei, eliminate, iar celulele cu trisomie pot fi păstrate (funcţie de cromosomul implicat), formând un mozaic de tipul 46/47. Dacă se pierde cromosomul X dintr-o celulă 46,XY aceasta este eliminată, în timp ce prin eliminarea cromosomului Y apare o linie celulară aneuploidă (45,XO) potenţial viabilă.

Apariţia unor clone celulare anormale la un organism, prin oricare din erorile amintite, determină efecte diferite în raport cu momentul ontogenetic în care s-a produs accidentul şi cu proporţia celulelor anormale care se formează. Perturbarea precoce şi apariţia unui număr mare de celule anormale în primele stadii de dezvoltare are consecinţe negative majore asupra fenotipului purtătorilor de anomalii cromosomice.

Importanţa genetică a mitozei constă în transmiterea cu mare fidelitate a informaţiei ereditare de-a lungul generaţiilor de celule; prin ea se asigură creşterea organismului, reînnoirea celulară şi repararea unor leziuni tisulare.

În mitoză se pot produce erori de distribuţie a materialului genetic: nedisjuncţia cromatidiană (rezultă mozaicuri cromosomice 45/46/47),

Diviziunea celulei

25

întârzierea anafazică (rezultă mozaic 45/46) şi clivarea transversală a centromerului (rezultă isocromosomi de braţe scurte şi lungi). Mozaicurile cromosomice sunt caracterizate prin prezenţa în acelaşi organism a unor linii celulare cu număr diferit de cromosomi.

Erorile de distribuţie a materialului genetic în mitoză produc anomalii de număr sau structură ale cromosomilor, cu consecinţe asupra viabilităţii şi capacităţii de multiplicare a celulelor.

C. MEIOZA Meioza este un proces complex care are loc în gonade şi care se realizează prin două

diviziuni succesive: meioza I (diviziunea meiotică primară, heterotipică, reducţională) şi meioza II (diviziunea meiotică secundară, homotipică, ecvaţională) neseparate de interfază.

Meioza I este o diviziune reducţională, caracteristică spermatogenezei şi ovogenezei. Caracteristica principală a meiozei constă în înjumătăţirea numărului de cromosomi, gameţii haploizi rezultaţi conţinând numai câte un cromosom din fiecare pereche (la om n = 23). Astfel, meioza, urmată de fecundare, contribuie la menţinerea constantă a numărului de cromosomi caracteristic speciei la fiecare individ. În meioză au loc însă şi fenomene de recombinare cromosomică, care sunt o sursă importantă de variabilitate genetică.

1. MEIOZA I

Este foarte complexă şi are o durată lungă, în special la organismele feminine. Prezintă patru etape: profaza I, metafaza I, anafaza I, telofaza I, fiecare cu anumite particularităţi (figura 2.7.A).

a. PROFAZA I

Profaza I este foarte lungă (90 % din durata meiozei I) şi cuprinde cinci stadii. Leptoten. Prin condensarea fibrelor de cromatină, cromosomii devin vizibili ca

filamente subţiri şi lungi, ataşate prin telomere la membrana nucleară. Astfel, datorită lungimii mari şi grosimii mici a cromosomilor, deşi cromosomii sunt bicromatidieni, ei apar monocromatidieni la examinarea la microscopul optic.

Zigoten. Cromosomii omologi (matern şi patern) se apropie, se dispun paralel de-a lungul cromatidelor, fenomen numit sinapsă sau conjugare cromosomică; se realizează astfel o aliniere "genă la genă" rezultând structuri numite bivalenţi (în realitate fiecare unitate este o tetradă, deoarece prezintă patru cromatide). Cromosomii omologi sunt uniţi (lipiţi) în anumite regiuni la nivelul complexului sinaptonemal, vizibil la microscopul electronic.

O excepţie de la acest model de sinapsă, este prezentă la sexul masculin, la care cromosomii X şi Y, nefiind omologi, fac sinapsă "cap la cap", printr-o mică regiune omologă ("regiune pseudoautosomală") aflată la capătul braţelor scurte, şi formează o structură specifică - vezicula sexuală.

Pahiten. Cromosomii se scurtează şi se îngroaşă. Din loc în loc devin vizibile nişte puncte mai intens colorate numite cromomere, a căror număr şi poziţie sunt caracteristice fiecărui cromosom5.

În faza de pahiten are loc fenomenul de încrucişare cromosomică între cromosomii omologi - crossing-over - care constă în "ruperea" cromatidelor nesurori în anumite puncte şi schimbarea reciprocă (încrucişată) a unor fragmente egale; astfel, un fragment de

5 Dispoziţia cromomerelor coincide cu cea a benzilor G (vezi capitolul Cromosomii umani)

Diviziunea celulei

26

cromatidă de pe un cromosom matern se transferă pe omologul său patern şi invers, realizând o nouă combinaţie genică.

Figura 2.7.A. Fazele meiozei I

Reprezentare diagramatică a două perechi de cromosomi şi a unui crossing-over 1-4 profaza; 5 (a,b) posibilităţile de aranjare a celor două perechi de cromosomi în metafază;

6 (a,b) anafaza; 7 (a,b) telofaza; 8 (a,b) combinaţiile posibile ale cromosomilor parentali.

Diviziunea celulei

27

Figura 2.7. B Fazele meiozei II 9a1, 9a2, 9b1,9b2 metafaza; 10a1, 10a2, 10b1,10b2 anafaza;

11a1, 11a2, 11b1, 11b2 cele 8 combinaţii cromosomice posibile în gameţi. (modificat după Thompson, 2001)

Recombinare implică numai două din cele patru cromatide, care vor conţine gene de la ambii părinţi; se realizează astfel o recombinare intracromosomică, care reprezintă o sursă de variabilitate genetică, datorită noilor combinaţii de gene care apar şi se transmit la descendenţi. Rareori, crossing-over-ul este inegal, determinând deleţia sau duplicaţia unor segmente cromosomice (figura 2.8.).

La om se produc 1-3 recombinări per cromosom, dependent de dimensiunea cromosomului. În meioza masculină totalul recombinărilor este de circa 50/ celulă, în timp ce meioza feminină se caracterizează printr-un număr mai mare de recombinări (aproximativ 70/celulă). Reducerea numărului de recombinări în meioza feminină a fost corelată cu o incidenţă crescută a anomaliilor cromosomice numerice la descendenţi, datorită favorizării nedisjuncţiei meiotice.

Diviziunea celulei

28

Figura 2.8 Fenomenul de încrucişare cromosomică şi recombinare genică

Diploten. Cromosomii omologi încep să se separe longitudinal, ca şi cum "s-ar respinge" reciproc. Cromatidele lor rămân în contact la nivelul chiasmatelor6, care marchează localizarea crossing-over-ului.

Diakineza. Cromosomii devin mai scurţi şi mai groşi, omologii se separă aproape complet, iar chiasmatele se observă numai la capetele lor (terminalizarea chiasmatelor).

În această fază se observă clar că fiecare bivalent conţine patru elemente: cromatidele surori sunt unite prin centromer, iar cromatidele nesurori sunt unite prin chiasmatele la nivelul cărora s-a produs crossing-over-ul.

b. METAFAZA I

Membrana nucleară dispare complet şi se formează fusul de diviziune. Bivalenţii, formaţi din cromosomi bicromatidieni, se fixează cu centromerul pe filamentele fusului la ecuatorul celulei formând placa metafazică. Metafaza I este etapa optimă de studiu a cromosomilor în meioză.

c. ANAFAZA I

Cuprinde un fenomen genetic foarte important: disjuncţia cromosomilor. Cei doi cromosomi bicromatidieni ai fiecărui bivalent se separă şi se repartizează câte unul la fiecare celulă fiică. Spre deosebire de mitoză, cromatidele surori nu se despart, ci rămân ataşate la nivelul centromerului. Urmează migrarea anafazică prin deplasarea cromosomilor (bicromatidieni) simultan şi cu aceeaşi viteză, spre polii opuşi ai celulei. În final, se produce o reducere a numărului de cromosomi, de la 2n la n şi fiecare celulă va avea numai un exemplar din perechea de omologi. Acest fenomen stă la baza primei legi a lui Mendel, legea segregării. Segregarea sau separarea aleatorie a fiecărei perechi de cromosomi omologi determină asortarea independentă a omologilor, fenomen enumit recombinare intercromosomică. Deoarece fiecare pereche de cromosomi se separă independent de celelalte, rezultă un număr mare de combinaţii cromosomice în gameţi, în raport direct cu numărul de perechi de cromosomi ai speciei. Se formează 2x tipuri de gameţi (x = numărul de perechi de cromosomi) (figura 2.9.). La om existând 23 perechi de cromosomi se formează 223 (peste 8,3 milioane) de tipuri de gameţi diferiţi, la fiecare din cele două sexe. Asortarea independentă a cromosomilor omologi, prin fenomenul de recombinare cromosomică, asociată cu recombinarea intracromosomică prin crossing-over, explică marea variabilitate a gameţilor. Ea confirmă cea de a doua lege a lui Mendel, referitoare la combinarea liberă a "factorilor ereditari" (genelor) astfel că fiecare gamet, care rezultă în urma meiozei, are un set unic de gene, diferit de al celorlalţi. Prin combinarea, pe bază de

6 Chiasma (pl. chiasmate) – punctul cromosomic în care se produce crossing-over-ul

Diviziunea celulei

29

probabilitate, a gameţilor masculini cu cei feminini în procesul de fecundare are loc formarea unor zigoţi diferiţi din punct de vedere genetic, iar indivizii rezultaţi vor fi unicate genetice.

d. TELOFAZA I

Are loc reasamblarea nucleilor; citokineza se realizează fără separarea completă a celulelor fiice, care rămân ataşate printr-o punte citoplasmatică, formând o diadă. După meioza I urmează o scurtă interfază, lipsită de replicarea ADN-ului, în care cromosomii nu se decondensează.

2. MEIOZA II

Se aseamănă cu o diviziune mitotică dar care se realizează în celule cu număr haploid de cromosomi. Este o diviziune homotipică, ecvaţională. Ea cuprinde, de asemenea patru stadii: profaza II, metafaza II, anafaza II şi telofaza II (figura 2.7. B).

a. PROFAZA II.

În profaza II cromatidele surori ale cromosomilor bicromatidieni devin vizibile distinct, iar membrana nucleară dispare.

b. METAFAZA II.

Cromosomii se condensează şi se ataşează fiecare pe câte un filament al fusului de diviziune, formând placa ecuatorială.

c. ANAFAZA II.

Prin diviziunea centromerelor - disjuncţie cromatidiană - fiecare cromosom se separă în două cromatide; acestea devin cromosomi independenţi şi se deplasează spre polii opuşi ai celulelor.

d. TELOFAZA II.

Din cele două celule fiice se formează patru seturi haploide de cromosomi monocromatidieni (câte două pentru fiecare celulă). În final, prin reorganizarea nucleilor şi

Figura 2.9 Recombinarea intercromosomică - sursă de

variabilitate genetică

Diviziunea celulei

30

separarea celulelor rezultate apar patru celule haploide, care prin maturare se transformă în gameţi fecundabili. Gameţii rezultaţi nu sunt identici, fiecare având o altă combinaţie de gene datorită fenomenelor de crossing-over şi segregare independentă a cromosomilor.

Meioza prezintă două diviziuni succesive: meioza I - reducţională şi meioza II - ecvaţională; se desfăşoară în gonade şi are ca rezultat formarea gameţilor haploizi.

Rolurile meiozei constau în: menţinerea constantă a numărului de cromosomi caracteristic speciei, conservarea însuşirilor ereditare la descendenţi şi variabilitatea genetică în populaţie, prin recombinări intra şi intercromosomice.

Meioza I are profaza foarte lungă, cu cinci stadii: leptoten, zigoten, pahiten, diploten şi diakineză.

În zigoten, prin conjugarea cromosomilor omologi genă la genă se formează bivalenţi; excepţie fac cromosomii X şi Y la bărbat, care fac sinapsă prin braţele scurte, formând vezicula sexuală.

În pahiten, prin schimbul reciproc de segmente cromatidiene între cromosomii omologi - crossing-over - are loc un fenomen de recombinare intracromosomică.

În metafaza I cromosomii bicromatidieni formează placa metafazică la ecuatorul celulei.

În anafaza I cromosomii omologi se separă şi migrează spre polii celulei - disjuncţie cromosomică (recombinare intercromosomică).

Fiecare pereche de cromosomi se separă independent de celelalte, fiind posibilă formarea unui număr de 2x combinaţii gametice, unde x este numărul de cromosomi caracteristic speciei;

La sfârşitul meiozei I se formează doi nuclei fii, fiecare având un set haploid de cromosomi (n).

În metafaza II, cromosomii se fixează pe filamentele fusului de diviziune. În anafaza II, fiecare cromosom bicromatidian se desparte în cele două

cromatide, care migrează în spre polii celulei - disjuncţie cromatidiană. În telofaza II se formează gameţii haploizi.

3. PARTICULARITĂŢILE MEIOZEI LA BĂRBAT ŞI FEMEIE

Meioza prezintă o serie de particularităţi la cele două sexe, legate de cronologia, desfăşurarea şi finalitatea ei. La bărbat se formează în final patru spermatozoizi, în timp ce la femeie, prin eliminarea globulilor polari, rezultă doar un ovul (figura 2.9.).

Meioza masculină are următoarele particularităţi: debutează la pubertate şi continuă întreaga viaţă; dintr-o spermatogonie, prin cele două diviziuni meiotice, rezultă patru spermatozoizi

funcţionali; jumătate dintre spermatozoizii formaţi au cromosom X, iar cealaltă jumătate are cromosom Y; meioza masculină este un proces rapid, durata sa fiind de circa 60 zile; meioza masculină este un proces intens, 1 ml de spermă conţinând în mod normal circa 70 de

milioane de spermatozoizi; meioza masculină este un proces autoreglabil, ce se autoîntreţine; meioza masculină este sensibilă la acţiunea factorilor de mediu (căldură etc.) în meioza masculină există un risc scăzut de apariţie al erorilor de distribuţie a materialului

genetic, deoarece durata procesului este scurtă, în schimb, odată cu creşterea vârstei,

Diviziunea celulei

31

bărbaţii au un risc crescut de a avea copii cu afecţiuni monogenice, deoarece o mutaţie apărută este copiată neîntrerupt.

Figura 2.9. Schema meiozei feminine (stânga) şi masculine (dreapta)

Meioza feminină are următoarele particularităţi: este un proces ce debutează prenatal (luna a III-a de viaţă intrauterină) după care se

blochează în luna a VII-a prenatal, în dichtioten, etapă intermediară între diploten şi diakineză; în acest moment toate ovogoniile (circa 300.000) sunt deja formate;

procesul este reluat la pubertate şi decurge ciclic, în fiecare lună eliberându-se câte unul sau maximum două ovocite de ordin II, care vor fi eliberate în trompa uterină; acest ovocit începe meioza II, dar procesul se încheie doar dacă se produce fecundarea;

meioza feminină se opreşte definitiv la menopauză; în cazul meiozei feminine dintr-o ovogonie, prin cele două diviziuni meiotice, rezultă o

singură celulă funcţională (ovulul) ce conţine aproape întreaga citoplasmă a celulei iniţiale şi doi globuli polari (celule nefuncţionale);

toate ovulele au doar cromosom X; meioza feminină este un proces lent, care durează între 10 şi 50 de ani;

Ovocit de ordinul II (n)

Celule germinale primordiale Testiculi Ovare

Mitoze repetate ale ovogoniilor şi

spermatogoniilor

Creştere şi diferenţiere

OvogonieSpermatogonie

Spermatocit de ordinul I (2n)

Meioza I

Meioza II

Ovocit de ordinul I (2n)

Spermatocit de ordinul II (n)

Ovul (n)

Al doilea globul polar

Primul globul polar

Spermatidă (n)

Spermatozoizi (n)

Diviziunea celulei

32

meioza feminină este un proces puţin intens, în ficare lună maturându-se maximum câţiva foliculi ovarieni;

meioza feminină este un proces reglat hormonal, fiind dependent de nivelul de FSH şi LH, secretaţi de hipofiză;

creşterea vârstei materne favorizează accidentele de distribuţie a materialului genetic în meioză (anomalii cromosomice numerice) deoarece ovogoniile rămân blocate o perioadă lungă în dichtioten; în schimb probabilitatea de apariţie a mutaţiilor genice este redusă, deoarece pe parcursul vieţii se maturează doar câteva sute de ovocite.

4. ACCIDENTE DE DISTRIBUŢIE A MATERIALULUI GENETIC ÎN MEIOZĂ ŞI CONSECINŢELE LOR

Desfăşurarea evenimentelor genetice poate fi tulburată în meioza I sau II prin aşa numitele "accidente anafazice" a căror consecinţă este fie blocarea meiozei, ce determină sterilitate, fie formarea unor gameţi neechilibraţi genetic, care după fecundare vor da zigoţi anormali. În funcţie de evoluţia acestor zigoţi se pot produce avorturi spontane, nou-născuţi morţi sau nou-născuţi vii plurimalformaţi. Mecanismele principale de apariţie a acestor erori sunt: nedisjuncţia cromosomică, nedisjuncţia cromatidiană, pierderea unor cromosomi ca urmare a migrării întârziate în anafază, nesepararea citelor de ordinul II.

a. NEDISJUNCŢIA

Nedisjuncţia poate surveni în decursul meiozei primare (nedisjuncţie cromosomică), secundare (nedisjuncţie cromatidiană) sau în ambele (nedisjuncţie dublă sau succesivă) şi poate afecta, atât autosomii, cât şi gonosomii (figura 2.10.).

Figura 2.10. Consecinţele nedisjuncţiei în meioza I şi II

(după Thompson, 2001)

Prin nedisjuncţie meiotică rezultă gameţi disomici şi nulisomici. Gameţii disomici, rezultaţi prin nedisjuncţie în meioza I, vor avea în cazul perechii afectate, un cromosom de origine maternă şi unul de origine paternă. Prin nedisjuncţie în meioza II, gametul disomic conţine doi cromosomi cu origine identică maternă sau paternă (disomie uniparentală).

Consecinţele nedisjuncţiei meiotice sunt diferite la bărbat şi la femeie, datorită particularităţilor gametogenezei la cele două sexe. Pentru înţelegerea acestor diferenţe vom considera nedisjuncţia gonosomilor la cele două sexe.

Diviziunea celulei

33

La bărbat, deoarece dintr-un spermatocit primar rezultă patru spermatozoizi, nedisjuncţia cromosomilor sexuali în prima meioză determină numai apariţia unor spermatozoizi anormali: disomici (XY) sau nulisomici (O). În schimb, nedisjuncţia gonosomilor în meioza II determină formarea de gameţi normali (X şi Y) şi gameţi disomici XX sau YY, respectiv nulisomici.

În schimb, diviziunea meiotică feminină este asimetrică prin formarea globulilor polari, care de obicei sunt eliminaţi. La femeie nedisjuncţia, fie că apare în prima, fie în a doua meioză, va produce ovule anormale: disomice (XX) sau nulisomice (O).

În unele situaţii apar trisomii duble, produse prin nedisjuncţie multiplă la acelaşi părinte, fiind afectaţi, de exemplu, gonosomii şi o pereche de autosomi (ovulul XX,+21 fecundat cu un spermatozoid normal va forma zigoţi 48,XXX,+21 sau 48,XXY,+21); acelaşi rezultat se produce şi când nedisjuncţia are loc la ambii părinţi, dar afectează cromosomi diferiţi (fecundarea unui ovul anormal XX de către un spermatozoid anormal X,+21 sau Y,+21).

b. ÎNTÂRZIEREA ANAFAZICĂ

Întârzierea anafazică constă în pierderea unui cromosom în cursul anafazei meiozei I sau II. În consecinţă, apar gameţi nulisomici (n-1) care prin fecundare, vor forma zigoţi monosomici (2n-1) unii incompatibili cu supravieţuirea, mai ales când sunt implicaţi autosomii.

c. NESEPARAREA "CITELOR" DE ORDIN II

Nesepararea citelor de ordinul II este un eveniment prin care se formează gameţi diploizi, care au întregul set de cromosomi (2n). Prin fecundare cu gameţi normali apar zigoţi triploizi, neviabili (3n = 69 cromosomi).

În meioză se pot produce erori de distribuţie a materialului genetic prin nedisjuncţie cromosomică, întârziere anafazică - în meioza I - sau nedisjuncţie cromatidiană, întârziere anafazică şi nesepararea citelor de ordinul II - în meioza II. În toate cazurile se formează gameţi neechilibraţi genetic (nulisomici, disomici, diploizi) care, prin fecundare cu gameţi normali vor forma zigoţi cu anomalii cromosomice omogene (monosomii, trisomii, triploidii).

II. APLICAŢII PRACTICE 1. a) Identificaţi pe diapozitive, la microscop şi pe fotografii fazele mitozei, pe preparate de celule vegetale şi animale. Descrieţi caracteristicile fiecărei faze observate şi comentaţi evenimentele genetice care pot avea loc în cursul acesteia. b) Precizaţi care sunt erorile de distribuţie ale materialului genetic în anafaza mitozei şi consecinţele lor asupra evoluţiei celulelor. 2. Exemplificaţi schematic formarea unui mozaic cromosomic prin nedisjuncţia mitotică a unei perechi de cromosomi, având ca model schema generală. 3. Întocmiţi diagrama nedisjuncţiei şi comentaţi formarea, la un bărbat, a unui mozaic cromosomic de tipul 45,X/46,XY/47,XYY. 4. Explicaţi formarea mozaicului cromosomic de tipul 46,XY/47,XXY. Cu acest prilej comentaţi rezultatele nedisjuncţiei gonosomilor în mitoză la bărbat. 5. Identificaţi şi analizaţi pe diapozitive, la microscop şi pe fotografii fazele meiozei. Caracterizaţi profaza I, metafaza I, anafaza I, metafaza II, anafaza II şi telofaza II. 6. Cum se poate face deosebirea între celulele aflate în următoarele stadii: a. o celulă aflată în metafaza mitozei şi una aflată în metafaza meiozei primare; b. o celulă în anafaza mitozei şi una în anafaza meiozei primare;

Diviziunea celulei

34

c. o celulă în profaza mitozei şi una în profaza meiozei primare. 7. La om, o gonie normală conţine 46 de cromosomi. Precizaţi numărul de cromosomi (autosomi şi gonosomi) în fiecare din următoarele tipuri de celule: a. o celulă rezultată printr-o diviziune mitotică a spermatogoniei; b. un ovocit primar; c. un spermatocit secundar; d. un globul polar rezultat în urma diviziunii unui ovocit II; e. o spermatidă; f. o celulă rezultată în urma spermatogenezei. 8. Într-un cromosom nereplicat este prezentă o singură moleculă de ADN. Dacă celulele umane au 2N = 46 cromosomi, precizaţi care este numărul moleculelor de ADN, al cromosomilor şi al bivalenţilor pentru o celulă aflată în fiecare din următoarele stadii:

Stadiul meiotic Număr molecule ADN Număr cromosomi Număr bivalenţi Pahiten Diploten Diakineză Telofaza I Profaza II Telofaza II

9. Întocmiţi separat diagrama nedisjuncţiei cromosomilor sexuali în spermatogeneză şi ovogeneză (anafaza I şi II) şi arătaţi care sunt consecinţele la un bărbat normal (XY) şi la o femeie normală (XX). Stabiliţi cu acest prilej stadiul în care se produc spermatozoizi YY, XY sau fără gonosom şi ovule XX sau fără cromosom sexual. Concomitent stabiliţi ce tipuri de zigoţi anormali rezultă prin participarea la fecundare a acestor gameţi neechilibraţi genetic, utilizând drept model figura 2.11.

Figura 2.11. Consecinţele nedisjuncţiei meiotice în gametogeneză: la bărbat şi la femeie şi rezultatul fecundării

10. Analizaţi pe diapozitive şi fotografii celule cu micronuclei; explicaţi semnificaţia lor şi importanţa practică a testului micronucleilor. 11. Calculaţi probabilitatea de asortare independentă a patru perechi de cromosomi (notaţi cu Aa, Bb, Cc, Dd) prin fenomenul de recombinare intercromosomică.

Diviziunea celulei

35

12. Câte tipuri de ovule cu genomuri diferite poate produce o femeie dacă este: a) heterozigotă pentru un singur locus; b) heterozigotă pentru patru loci independenţi; c) heterozigotă pentru n loci independenţi7. 13. Demonstraţi schematic distribuţia materialului genetic în meioză în cazul a) nedisjuncţiei perechii de cromosomi 21 în meioza I; b) nedisjuncţiei perechii de cromosomi 21 în meioza II; c) explicaţi consecinţele fecundării gameţilor rezultaţi. 14. Analizaţi figura 2.12 şi stabiliţi care sunt principalele asemănări şi deosebiri între mitoză şi meioză.

Figura 2.12. Diferenţele dintre mitoză şi meioză


A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - Mitoză - - Recombinare intracromosomică - Haploidie - Meioză - Recombinare intercromosomică - Diploidie - Anafază - Mozaic cromosomic - Trisomie

7 Heterozigot – individ care pe cromosomii omologi, într-un locus, prezintă variante genice diferite

Diviziunea celulei

36

- Diviziune reducţională - Nedisjuncţie cromosomică - Crossing-over - Monosomie - Nedisjuncţie cromatidiană

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Care sunt rolurile mitozei? 2. Care este cea mai importantă etapă a mitozei? De ce? 3. Care sunt erorile care pot avea loc pe parcursul mitozei? Ce fel de anomalii cromosomice rezultă

prin erori mitotice? 4. Care este semnificaţia genetică a meiozei? 5. Cancerul poate fi considerat consecinţa unor mitoze necontrolate (adevărat/fals?). 6. Crossing-over-ul este o modalitate de reasortare a genelor în noi combinaţii (adevărat/fals?). 7. Fiecare diviziune mitotică şi fiecare diviziune meiotică secundară sunt precedate de o replicare

semiconservativă a ADN-ului (adevărat/fals?). 8. Sinapsa cromosomilor omologi are loc numai în meioză, nu şi în mitoză (adevărat/fals?). 9. În care tip de diviziune celulele nou formate au cromosomi monocromatidieni? Dar bicromatidieni? 10. Ce fel de anomalii cromosomice pot fi observate la descendenţii unei persoane a cărei meioză s-a

desfăşurat anormal?


1. Care dintre următoarele fenomene este anormal în anafaza mitozei? A. Împărţirea totală şi egală a materialului genetic; B. Disjuncţia cromatidiană; C. Clivarea transversală a centromerului; D. Migrarea simultană şi cu aceeaşi viteză a cromatidelor; E. Clivarea longitudinală a centromerului.

2. Mozaicul cromosomic de tipul 47/46/45 se formează prin: A. Nedisjuncţie cromosomică în meioza I; B. Nedisjuncţie cromatidiană în meioza II; C. Nedisjuncţie cromatidiană în mitoza; D. Nedisjuncţie cromatidiană în mitoză sau meioza II; E. Nici unul din răspunsuri nu este corect.

3. Ce zigoţi vor rezulta prin fecundarea unui ovul normal cu gameţi produşi prin nedisjuncţia în meioza I a gonosomilor la tată?

A. 45,X; 47,XXY; B. 45,X; 46,XY; 47,XXX; C. 45,X; 47,XXY; 47,XYY; D. 45,X; 46,YY; 47,XYY; E. 46,XY; 47,XXX; 47,XYY.


4. Importanţa genetică a mitozei constă în faptul că: 1. Asigură dezvoltarea ontogenetică a organismului; 2. Este unica legătură materială între părinţi şi descendenţi; 3. Asigură transmiterea informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule;

Diviziunea celulei

37

4. Recombinarea mitotică asigură variabilitatea gameţilor şi unicitatea individului.

5. Clivarea transversală a centromerului unui cromosom în anafaza mitozei determină: 1. Pierderea cromosomului; 2. Formarea unui isocromosom p şi a unui isocromosom q; 3. Formarea unui mozaic 46/45; 4. Formarea de celule care prezintă duplicarea parţială a unui cromosom, concomitent cu deleţia

parţială a aceluiaşi cromosom.

6. Gameţii diploizi: 1. Se produc prin nesepararea celulelor fiice în cursul mitozei; 2. Se produc printr-o eroare de distribuţie a materialului genetic în anafază; 3. Duc la formarea de zigoţi cu mozaicuri cromosomice; 4. Duc la formarea de zigoţi triploizi.

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"): A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false.

7. În mitoză cromosomii omologi suferă o disjuncţie cromosomică, deoarece prin mitoză materialul genetic se împarte total şi egal la cele două celule fiice. 8. Meioza este o sursă de variabilitate genetică, deoarece în meioză au loc fenomene de recombinare intra- şi intercromosomică.

IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere:

În ce tip de diviziune celulară:

9. Se formează celule cu număr haploid de cromosomi; A. Mitoza; 10. Are loc în mod normal clivarea transversală a centromerului; B. Meioza I; 11. Se produce asortarea independentă a cromosomilor; C. Meioza I şi II; 12. Se formează celule cu cromosomi monocromatidieni; D. Mitoza şi meioza II 13. Se pot forma mozaicuri cromosomice. E. Nici una.

3. CROMATINA SEXUALA

I. DATE TEORETICE

A. GENERALITĂŢI Cromatina sexuală este un corpuscul de heterocromatină (cromocentru prezent în

nucleul celulelor interfazice) cu particularităţi morfologice bine definite, care permit stabilirea sexului genetic (în mod normal XX sau XY) şi identificarea unor anomalii de număr ale gonosomilor.

Cromatina sexuală reprezintă o formă de heterocromatină facultativă, care se prezintă diferit la cele două sexe, deoarece rezultă prin mecanisme diferite. La femeie, cromatina sexuală, denumită cromatină X, este un cromocentru intranuclear, rezultat prin inactivarea genică şi heterocromatinizarea unuia din cei doi cromosomi X. La bărbat, cromatina sexuală, denumită cromatină Y, se prezintă sub forma corpusculului F, care poate fi observat în nucleul interfazic, prin examinare la microscopul cu lumină ultravioletă, datorită afinităţii heterocromatinei braţului lung al cromosomului Y pentru diferite substanţe fluorescente.

Apariţia cromatinei X a fost explicată prin ipoteza Lyon (1961). Conform acesteia la persoanele normale de sex feminin unul din cei doi cromosomi X este inactivat genetic, deoarece între gonosomii X şi Y există diferenţe importante de mărime şi conţinut genic, care, în absenţa inactivării, ar genera o inegalitate genetică între sexe (figura 3.1.).

Cromosomul X este un cromosom mijlociu care conţine atât gene de sexualizare, cât şi gene care codifică diferite proteine/enzime neimplicate în procesul de sexualizare. Cromosomul Y este un cromosom mic care conţine genele implicate în formarea testiculilor şi spermatogeneză, precum şi câteva gene omologe unor gene de pe cromosomul X (localizate în regiunea “pseudoautosomală”). În rest, cromosomul Y prezintă o întinsă regiune de heterocromatină localizată în cele 2/3 distale ale braţului lung şi formată din secvenţe de ADN repetitiv. Astfel, comparativ cu persoanele XY, persoanele XX au o “doză” dublă de gene, care codifică diferite proteine8. “Egalizarea genetică” se produce prin inactivarea prin heterocromatinizare şi condensare a unuia din cei doi cromosomi X ai femeii, astfel încât, atât bărbaţii, cât şi femeile au un singur cromosom X activ. Postulatele ipotezei Lyon susţin următoarele: La femeile normale (XX) unul dintre cei doi cromosomi X se inactivează total; Inactivarea se produce precoce (în perioada embrionară) şi este definitivă (ireversibilă); Inactivarea este întâmplătoare (în unele celule se inactivează cromosomul X de origine

maternă, în timp ce în altele se inactivează cromosomul X patern) şi independentă în celule diferite9.

8 Mutaţiile acestor gene au efecte fenotipce mai severe la bărbaţi, deoarece la persoanele de sex feminin pentru apariţia unui fenotip anormal este necesară modificarea genelor de pe ambii cromosomi X 9 Mecanismul incativării şi unele particularităţi vor fi prezentate la curs

Cromatina sexuală

39

Figura 3.1. Morfologia şi conţinutul genic al cromosomilor X şi Y

Gene omologe – AMELX, AMELY (codifică o proteină similară amelogeninei); ZFY şi ZFX (codifică o proteină cu conformaţie în “degete de zinc”); SMCX şi SMCY (codifică antigenul H-Y); Gene specifice

cromosomului X – XIC (centrul de inactivare al cromosomului X) Gene specifice cromosomului Y – DAZ (deleted in azoospermia) AZF (azoospermia factor) (după Jameson et al., 1998)

Cromatina sexuală este un corpuscul de heterocromatină cu particularităţi morfologice distincte, care permite stabilirea sexului genetic (XX sau XY) şi a unor anomalii ale numărului cromosomilor sexuali.

Cromatina sexuală este o formă de heterocromatină facultativă, fiind specifică fiecărui sex: cromatina X se întâlneşte în mod normal numai în celulele provenite de la sexul feminin, în timp ce cromatina Y este caracteristică bărbaţilor.

Ipoteza Lyon susţine că la persoanele de sex feminin unul din cei doi cromosomi X se inactivează total, inactivarea fiind precoce, definitivă, întâmplătoare şi independentă în celule diferite

B. CROMATINA X Cromatina X poate fi observată în majoritatea ţesuturilor provenite de la o persoană

de sex feminin (46,XX). În mod obişnuit, ea este studiată în celulele din frotiuri de mucoasă bucală sau sânge periferic10, mai rar în celulele bulbului pilos, în celulele amniotice fetale sau alte tipuri de celule.

10 Celulele mucoasei bucale sau cele sanguine sunt mai uşor de obţinut

Cromatina sexuală

40

1. STUDIUL CROMATINEI X PE FROTIUL DE MUCOASĂ BUCALĂ

a. MORFOLOGIE

La nivelul mucoasei bucale, corpusculul de cromatină X este denumit corpuscul Barr11. Acesta are următoarele particularităţi morfologice (figura 3.2.): condensare şi colorare bazofilă intensă; poziţie, cel mai frecvent, periferică, lipit de faţa internă a membranei nucleare; uneori

corpusculul pare situat central (lângă nucleol) sau liber în nucleoplasmă; formă ovală sau plan convexă; în funcţie de incidenţa optică sub care este privit, poate apare

uneori triunghiular, sferic, bipartit (în halteră); mărime medie de 1 micron (± 0,3).

Uneori, corpusculul Barr poate fi confundat cu unii cromocentri nespecifici (fără semnificaţie sexuală) sau cu nucleolul. În aceste cazuri, diagnosticul diferenţial se face astfel: nucleolul are frecvent o poziţie centrală, este rotund şi mai mare decât corpusculul Barr, şi, prin reacţia cu verde de metil pironină se colorează roşu cărămiziu (ARN), diferit de restul nucleului (ADN) care este verde; cromocentrii nespecifici sunt mai mici sau mai mari, au o

formă neregulată şi pot fi localizaţi în diferite zone din nucleu. În practică, pentru a evita erorile de interpretare, se consideră drept cromatină X numai

corpusculii lipiţi de faţa internă a membranei nucleare, cu forma şi mărimea indicată mai sus.

b. FRECVENŢA

Teoretic, toţi nucleii celulelor provenite de la persoanele normale de sex feminin (XX), trebuie să aibă un corpuscul de cromatină X. În realitate, frecvenţa medie normală a celulelor "cromatin X pozitive" este de aproximativ 20 - 40%, datorită: selecţiei corpusculilor situaţi periferic şi excluderii celor dispuşi central; calităţilor improprii ale unor nuclei (cromatină condensată, numeroşi cromocentri, membrană

nucleară distorsionată) determinate, fie de poziţia lor în straturile superficiale ale mucoasei, fie de unele defecte de colorare;

existenţei reale a unor celule "cromatin X negative", în care, datorită unor condiţii metabolice celulare sau generale, cromosomul X, deşi inactiv, nu se condensează.

Pentru stabilirea corectă a frecvenţei se numără cel puţin 300 de nuclei. Au fost descrise şi alte cauze, mai puţin semnificative, care pot influenţa frecvenţa

cromatinei X: variaţii legate de vârstă, ciclul ovarian, unele boli sau tratamente etc.

c. INTERPRETARE

11 Termenul de corpuscul Barr a fost dat în onoarea unuia din cei doi descoperitori ai cromatinei X – Barr şi Bertram, 1949

Figura 3.2. Aspectul schematic al corpusculului Barr într-o celulă epitelială a mucoasei bucale

Cromatina sexuală

41

Deoarece, conform ipotezei Lyon, în fiecare celulă rămâne activ un singur cromosom X, iar restul se inactivează transformându-se în cromatină X, rezultă că:

Numărul de corpusculi Barr = Numărul de cromosomi X - 1

Aplicând relaţia de mai sus, devine evident faptul că, în mod normal, cromatina X se găseşte în nucleul celulelor interfazice numai la persoanele de sex feminin (un singur corpuscul Barr) şi lipseşte la persoanele de sex masculin. Datorită acestor particularităţi testul cromatinei X este folosit pentru stabilirea sexului genetic (XX sau XY)

În diferite stări patologice, datorate unor anomalii de număr sau structură ale cromosomilor X, posibile atât la femeie, cât şi la bărbat, pot apare modificări ale numărului şi mărimii corpusculului de cromatină X (figura 3.3.).

Figura 3.3. Modificările de număr (A) şi de mărime (B) ale cromatinei X, în funcţie de

mărimea şi structura cromosomilor X.

Astfel, absenţa din celule a unuia dintre cromosomii X (45,X - monosomie X), asociată unui fenotip feminin (sindrom Turner) se însoţeşte de un test Barr negativ, în timp ce prezenţa unor cromosomi X suplimentari (polisomii X), fie la femeie (47,XXX; 48,XXXX) fie la bărbat (sindrom Klinefelter – 47,XXY sau 48,XXXY) face ca în celule să fie identificaţi mai mulţi corpusculi Barr (figura 3.3. A).

Pornind de la acest fapt, pe baza numărului corpusculilor Barr se poate preciza numărul cromosomilor X existenţi în celulă: numărul cromosomilor X este mai mare cu 1 decât cel al corpusculilor Barr.

Atunci când pe o lamă cu frotiu de mucoasă bucală, provenind de la o anumită persoană, se întâlnesc celule cu număr diferit de corpusculi Barr, pentru a calcula numărul de cromosomi X, se ia întotdeauna în consideraţie numărul maxim de corpusculi Barr, deoarece unii dintre cromosomii X inactivaţi pot să nu fie vizibili în toate celulele analizate.

Mărimea cromatinei X poate depăşi valoarea obişnuită de 1 micron în cazul existenţei unor cromosomi X anormal de lungi (isocromosomi X de braţ lung) sau poate fi

Corpuscul Barr > 1,5 μm

Corpuscul Barr < 1 μm

A

B

Cromatina sexuală

42

mai mică, în cazul unor cromosomi X mai mici decât în mod normal (isocromosomi X de braţ scurt, deleţii Xq- sau cromosomi inelari X) (figura 3.3. B)12.

2. STUDIUL CROMATINEI X PE FROTIUL DE SÂNGE PERIFERIC ÎN POLIMORFONUCLEARE NEUTROFILE

a. MORFOLOGIE

Pe frotiul de sânge periferic, colorat cu soluţie May-Grünwald-Giemsa, cromatina X poate fi evidenţiat în leucocitele polimorfonucleare (PMN), unde este prezentă sub forma particulară a unor apendici nucleari. Aceştia sunt de două feluri (figurile 3.4. şi 3.5.): apendice tip A, în "băţ de tobă" (în limba engleză drumstick) format dintr-un "cap" oval sau

rotund, de aproximativ 1,5 microni, mai intens colorat decât nucleul şi ataşat de restul nucleului, printr-un filament subţire;

apendice tip B sau "nodul sesil", asemănător ca mărime, formă şi colorabilitate cu nodulul A, dar fixat direct la nucleu printr-o bază largă de implantare.

Figura 3.4. Apendici nucleari în polimorfonuclearele neutrofile

a b c

Figura 3.5. Aspectul la microscopul optic al cromatinei X în polimorfonuclearele neutrofile din frotiul de sânge periferic (coloraţie May-Grunwald-Giemsa)

a– apendice sexual de tip A; b – apendice sexual de tip B; c – doi apendici sexuali de tip A

b. FRECVENŢA

Frecvenţa medie a apendicilor sexuali la femeia normală este de 1 la 38 PMN, iar variaţiile sunt cuprinse între 1 la 6 şi 1 la 98 PMN; ele se datoresc gradului de lobulare al nucleului, tehnicii de executare a frotiului şi probabil unor factori metabolici celulari. În

12 Isocromosom –cromosom caracterizat prin existenţa unuia dintre braţe în dublu exemplar şi absenţa celuilalt braţ; Deleţie – anomalie cromosomică caracterizată prin absenţa unui fragment cromosomic; Cromosom inelar – cromosom cu configuraţie circulară (vezi capitolul Anomalii şi boli cromosomice)

Cromatina sexuală

43

practică, pe o lamă cu frotiu de sânge periferic se numără atâtea neutrofile până ce se totalizează 6 apendici A; pentru a afirma absenţa lor se numără cel puţin 500 neutrofile13.

Apendicii sexuali A şi B trebuie diferenţiaţi de alte formaţiuni asemănătoare fără semnificaţie sexuală (figura 3.4.): nodulii mici, au formă similară apendicilor A, dar sunt mai mici (sub 1 micron) şi mai slab

coloraţi; apendicii în "rachetă de tenis" sunt asemănători ca mărime cu apendicii A, dar au centrul

decolorat; lobii mici ai nucleului, seamănă cu apendicii B, dar sunt mai mari, conturul fiind neregulat, iar

culoarea este la fel cu cea a nucleului.

c. INTERPRETARE

Interpretarea corelaţiei dintre numărul sau mărimea apendicilor A şi B din PMN şi numărul sau mărimea cromosomilor X din care provin se face întocmai ca la corpusculii Barr din frotiul de mucoasă bucală.

În celulele epiteliale din frotiuri de mucoasă bucală cromatina X apare sub forma corpuscului Barr, un corpuscul de heterocromatină intens bazofil, lipit de faţa internă a membranei nucleare, cu formă ovală sau plan-convexă şi mărime de un micron. Frecvenţa medie normală a celulelor cromatin X pozitive în frotiul de mucoasă bucală este de 20 - 40%.

Deoarece cromatina X se produce prin inactivarea şi heterocromatinizarea unuia dintre cei doi cromosomi X la femeie numărul de corpusculi de cromatină X este egal cu suma cromosomilor X minus 1.

Pe frotiul de sânge periferic, cromatina X apare în polimorfonucleare neutrofile sub formă de apendici nucleari tip A (în băţ de tobă) sau tip B (nodul sesil). Ei sunt mai intens coloraţi decât restul nucleului, au 1,5 microni şi au o frecvenţă medie de 6 la 500 PMN.

C. CROMATINA Y

1. MORFOLOGIE

Cromatina Y poate fi evidenţiată pe frotiuri de mucoasă bucală sau pe secţiuni din ţesuturi prelevate de la persoane de sex masculin şi se evidenţiază, după colorare cu fluorocromi (quinacrină, atebrină, acridin-orange) şi examinare în lumina ultravioletă, la microscopul cu fluorescenţă, sub forma unui corpuscul de cromatină intens fluorescent. Aceste corpuscul a fost numit "corpuscul F".

Mărimea corpusculului F este de 0,25 microni, corespunzătoare mărimii celor 2/3 din braţul q al cromosomului Y. Mărimea poate fi diferită datorită variaţiilor lungimii braţului lung al cromosomului Y la persoane fenotipic normale (vezi capitolul "Cromosomii umani"). Corpusculul F se găseşte în nucleu, fixat la membrană sau liber în nucleoplasmă.

2. FRECVENŢA

Frecvenţa cu care este observată cromatina Y în celulele masculine depinde de ţesutul studiat, fiind de 70 - 80% în fibroblaşti, 75 - 85% în celulele amniotice, 40 - 45% în nucleul spermatozoizilor şi 25 - 50% în celulele mucoasei bucale. Existenţa de celule cromatin Y

13 Când numărul de apendici sexuali identificaţi în 500 PMN este între 1 şi 5 se repetă testul

Cromatina sexuală

44

negative se datorează probabil unor defecte tehnice de fixare a fluorocromilor sau dispariţiei rapide a fluorescenţei.

3. INTERPRETARE

Interpretarea rezultatelor obţinute se face folosind următoarea formulă:

Numărul de corpusculi F = Numărul cromosomilor Y

Aplicând relaţia de mai sus, este evident faptul că femeiile (indiferent de numărul de cromosomi X) nu prezintă niciodată corpuscul F, în timp ce bărbatul normal prezintă un singur corpuscul F. La bărbaţii cu un cromosom Y suplimentar (47, XYY) se evidenţiază doi corpusculi F.

Cromatina Y apare numai în nucleul celulelor provenite de la sexul masculin, şi reprezintă heterocromatina din cele 2/3 distale ale braţului lung al cromosomului Y. Ea se colorează cu fluorocromi (quinacrină), este studiată la microscopul cu fluorescenţă şi poartă denumirea de corpuscul F. Numărul de corpusculi F este egal cu suma cromosomilor Y.

D. VALOAREA PRACTICĂ A TESTULUI CROMATINEI SEXUALE (indicaţii şi limite)

Testul cromatinei sexuale asigură aprecierea numărului de gonosomi X sau Y, permiţând identificarea sexului genetic şi diagnosticul anomaliilor numerice ale cromosomilor sexuali, care produc sindroame cu disgenezie gonadică.

Testul se foloseşte în practica medicală în următoarele situaţii: 1. Diagnosticul prenatal al sexului fătului Testul cromatinei sexuale, efectuat în celulele fetale amniotice, este util în situaţiile în

care mama, aparent sănătoasă, este purtătoarea unei gene mutante recesive gonosomale (XNXa) pe care ar putea să o transmită la 50% din băieţi, aceştia urmând să manifeste fenotipic afecţiunea (de exemplu: hemofilie, miopatie Duchenne etc.). Cunoaşterea sexului fătului permite luarea unei decizii privind cursul ulterior al sarcinii, datorită riscului crescut de apariţie a bolii doar la băieţi (vezi capitolul “Sfatul genetic”). În prezent, testul cromatinei sexuale a fost înlocuit de tehnicile moderne de diagnostic molecular prenatal, care permit atât identificarea sexului fătului, cât şi evidenţierea prezenţei genei mutante în genotipul fătului, pentru multe dintre afecţiunile genetice legate de cromosomul X.

2. Stabilirea sexului genetic în stările intersexuale la nou-născut Prezenţa unor malformaţii ale organelor genitale externe la nou-născut, mai ales

atunci când testiculii nu se palpează în scrot, poate duce la erori de apreciere a sexului civil (sexul declarat în certificatul de naştere). Aceste erori au consecinţe importante pe termen lung. De aceea, în cazul unui nou-născut cu organe genitale externe ambigue (care nu permit stabilirea sexului civil) sau a unui băiat cu hipospadias şi/sau testiculi necoborâţi în scrot (criptorhidie), respectiv fată cu hipertrofie clitoridiană este obligatoriu testul cromatinei sexuale (şi, ulterior, analiza cromosomilor). Identificarea corectă şi rapidă a sexului genetic, prin testul cromatinei sexuale, permite în aceste situaţii declararea adecvată a sexului civil şi constituie un element de bază pentru stabilirea tipului de stare intersexuală (pseudohermafroditism feminin sau masculin), premisă obligatorie pentru tratamentul chirurgical corectiv precoce şi educarea corespunzătoare a copilului.

Cromatina sexuală

45

Diagnosticul etiologic al anomaliilor de sexualizare poate fi uneori necesar postnatal, la pacienţi de diferite vârste, fie ca urmare a unei evaluări incorecte sau incomplete la naştere, fie datorită manifestării tardive a afecţiunii. În aceste situaţii testul cromatinei sexuale, urmat de analiza cromosomică este decisiv pentru diagnostic.

3. Diagnosticul unor anomalii de număr sau structură ale cromosomilor sexuali care determină disgenezii gonadice, testiculare (la bărbat) sau ovariene (la femeie).

Disgeneziile gonadice sunt afecţiuni caracterizate prin dezvoltarea şi funcţionarea necorespunzătoare a gonadelor şi pot avea drept factor patogenic prezenţa unor anomalii de număr sau structură ale gonosomilor X sau Y (47,XXY; 48,XXXY; 47,XYY; 45,X; 47,XXX; 46,XXp-; 46,XXq-; 46,X,i(Xq) etc.).

În practica medicală, cele mai frecvente disgenezii gonadice sunt cele din sindroamele Klinefelter (47,XXY) – la bărbat - şi Turner (45,X) – la femeie. Ele pot fi evocate de următoarele semne clinice (detaliate în capitolul "Anomalii cromosomice"): la bărbat, testiculi mici, caractere sexuale secundare slab dezvoltate, ginecomastie,

azoospermie (sindrom Klinefelter); la femeie: talie mică, amenoree primară, caractere sexuale secundare insuficient dezvoltate

(sindrom Turner). 4. În medicina legală Testul cromatinei sexuale poate stabili provenienţa masculină sau feminină a unor

pete de sânge, fragmente de ţesuturi, fire de păr etc., uşurând anumite anchete criminalistice. În prezent, testul este înlocuit de metodele de realizare a “amprentei” ADN, care permit identificarea precisă a persoanei de la care provin probele biologice.

5. Limitele testului cromatinei sexuale Testul cromatinei sexuale este o metodă de investigare citogenetică utilă14, întrucât

permite un diagnostic orientativ rapid. Totuşi, acest test este un test subiectiv, a cărui interpretare ţine în mare măsură de priceperea şi experienţa examinatorului, nu poate da indicaţii exacte despre existenţa unor mozaicuri cromosomice gonosomale şi nici despre anomaliile cromosomice autosomale. De aceea, pentru obţinerea unui rezultat riguros exact, se recurge la studiul cromosomilor (efectuarea cariotipului) metodă mai laborioasă şi mai scumpă, dar în acelaşi timp, mult mai precisă.

Testul cromatinei sexuale se utilizează în practica medicală, pentru identificarea sexului genetic şi stabilirea numărului de cromosomi sexuali, în următoarele situaţii:

diagnosticul prenatal al sexului genetic al fătului în cazul bolilor recesive legate de X, pentru care mama purtătoare de genă mutantă va avea 50% dintre băieţi afectaţi şi toate fetele sănătoase;

diagnosticul anomaliilor de sexualizare la nou-născut şi copil (hipospadias ± testicul necoborât congenital, hipertrofie clitoridiană);

diagnosticul unor anomalii de număr (45,X; 47,XXX; 47,XXY) sau structură ale cromosomilor sexuali care produc disgenezii gonadice testiculare (manifestate prin: caractere sexuale secundare reduse, ginecomastie, testiculi mici, sterilitate, spermogramă anormală,) şi ovariene (caractere sexuale secundare reduse, amenoree primară, sterilitate);

în medicina legală, pentru a stabili dacă o pată de sânge, un fir de păr sau anumite fragmente de ţesut provin de la un bărbat sau de la o femeie.

14 Alte avantaje ale testului Barr sunt costul mic şi dotarea tehnică redusă

Cromatina sexuală

46


A. TEHNICA DE STUDIU A CROMATINEI X PE FROTIUL DE MUCOASĂ BUCALĂ

1. Materiale şi substanţe necesare: lame de recoltare rodate; lame de microscopie pentru frotiuri; comprese sterile; baie de fixare; amestec fixator (alcool metilic absolut şi acid acetic glacial în proporţie 9/1); băi cu alcool de 70 şi 50 băi cu apă distilată; soluţie de colorant (carbol-fuxină, orceină ş.a.); microscop, obiectiv cu imersie (x 90), ulei de cedru. 2. Prelevarea celulelor de mucoasă bucală Se marchează indicativul şi codul bolnavului pe lamele pentru frotiu. Cu o lamă rodată se raclează mucoasa bucală de pe faţa internă a obrajilor, iar la copii şi pacienţii dificili de pe faţa internă a buzei inferioare (în prealabil gura este clătită cu apă pentru îndepărtarea resturilor alimentare). Iniţial, se face o raclare uşoară pentru îndepărtarea salivei şi a stratului superficial de celule de descuamaţie; materialul obţinut se îndepărtează cu o compresă sterilă. Apoi, fără ca pacientul să închidă gura, se face o raclare fermă, trecând lama apăsat peste mucoasa bucală, de mai multe ori în aceeaşi direcţie şi în acelaşi loc. Lama cu materialul obţinut se aşează deasupra lamei de microscopie marcată cu indicativul bolnavului şi se întinde un frotiu relativ gros, pe o suprafaţă mică, în 1/3 medie a lamei. Apoi fără a se usca lama, aceasta este introdusă rapid în baia de fixare. La fiecare pacient se fac minimum două frotiuri, fiind recoltate celule din regiuni diferite ale mucoasei bucale. 3. Fixarea şi colorarea frotiurilor

Fixarea se face cu amestec de alcool metilic absolut şi acid acetic glacial (9/1) timp de o oră (minimum 30 de minute şi maximum 12 ore) la temperatura camerei. Este indicat ca lamele fiecărui pacient să fie fixate separat, pentru a împiedica trecerea celulelor dislocate pe lamele altei persoane.

Hidratarea are ca scop îndepărtarea fixatorului, precum şi recuperarea apei tisulare pierdute în timpul fixării; se face trecând succesiv lamele fixate, prin băile de alcool 70 şi 50, apă distilată I şi II, câte 5 minute în fiecare.

Colorarea frotiurilor este de preferat să se realizeze imediat, fără ca lamele să se usuce. Atunci când recoltarea este făcută la distanţă de laborator, iar lamele sunt ulterior examinate, ele vor fi uscate la aer, sub o placă Petri, pentru a evita depunerea prafului. Rezultatele nu sunt însă la fel de bune. Colorarea se face timp de 2 – 5 minute; timpul optim se tatonează de obicei cu prima lamă care se ţine 2 minute. Apoi lamele se spală cu apă de robinet şi, dacă este cazul, se îndepărtează excesul de colorant prin acoperirea lor cu alcool etilic absolut timp de 30 – 60 secunde (în funcţie de grosimea frotiului). Se usucă, se clarifică, trecându-le prin două băi cu xilol şi apoi se usucă din nou.

4. Examinarea preparatelor la microscop Examinarea se face la microscopul optic cu obiectiv de imersie, cu ocular 7 X şi filtru

verde. Cromatina apare colorată roz, iar cromocentrii roşu-carmin intens. Un frotiu corespunzător trebuie să aibă un număr suficient de celule, să fie bine fixat şi

colorat suficient de contrastant, dar nu excesiv. Dacă condiţiile nu sunt satisfăcute, este bine să se repete recoltarea şi examinarea.

Celulele optime trebuie să fie: bine etalate, fără superpoziţia altor celule, cu membrana nucleară intactă, regulată, cu cromatina fin dispersată, fără condensări excesive, cu corpusculii de cromatină X intens coloraţi şi net contrastanţi de restul cromatinei. Vor fi excluse de la analiză celulele provenite din straturile superficiale cu: nuclei picnotici, cromatină condensată; membrana nucleară ondulată, discontinuă; cromocentri numeroşi.

Pe celulele care îndeplinesc aceste condiţii de analiză se vor determina: - prezenţa corpusculului Barr, cu particularităţile morfologice descrise: intens bazofil,

situat pe faţa internă a membranei nucleare şi cu mărime de aproximativ 1 micron;

Cromatina sexuală

47

- numărul corpusculilor per nucleu; - mărimea corpusculului, normală sau anormală (mai mică sau mai mare de 1 micron); - frecvenţa celulelor cromatin X pozitive pe minimum 300 nuclei analizaţi.

Analiza frotiului trebuie să respecte următoarele condiţii: - să nu fie făcută în grabă, superficial; - să se aplice riguros criteriile de selecţie a nucleilor favorabili; - să se examineze mai multe câmpuri pe fiecare lamă, numărându-se cel puţin 300 nuclei; - să se repete examinarea dacă: frotiul este necorespunzător, frecvenţa celulelor cromatin-

X pozitive este mică (defect de tehnică, condiţii metabolice particulare, mozaic cromosomic) sau rezultatul obţinut diferă de normal (pentru certitudine). În acest ultim caz este utilă verificarea testului de un alt tehnician.

5. Formularea rezultatului Pe buletinul de analiză se va preciza: test Barr pozitiv sau negativ, evitându-se utilizarea termenului de cromatină sexuală (datorită ambiguităţii); nu se vor da procente decât în cazul unei frecvenţe mai mici de 10% (la 2 examene repetate). Medicul care a solicitat analiza va da explicaţiile necesare bolnavului, în contextul datelor clinice. La orice rezultat anormal se va indica efectuarea analizei cromosomice (cariotip).

B. TEHNICA DE STUDIU A CROMATINEI X ÎN POLIMORFONUCLEARELE NEUTROFILE

1. Pentru studiul cromatinei X se folosesc frotiuri obişnuite de sânge periferic, colorate cu soluţie May - Grűnwald - Giemsa. Analiza este efectuată cu obiectivul de imersie, la marginile frotiului, fiind analizate polimorfonuclearele neutrofile - PMN.

- În PMN se reperează prezenţa şi numărul apendicilor sexuali de tip A, pediculaţi (în "băţ de tobă") sau B (noduli sesili) care au dimensiuni de circa 1,5 microni şi sunt intens coloraţi. Se analizează atent morfologia apendicilor sexuali, pentru a-i deosebi - pe bază de mărime şi coloraţie - de nodulii mici (sub 1 micron) lobii mici ai nucleului (mai mari de 2 microni) apendicii în "rachetă de tenis" (au aceeaşi mărime ca apendicii A, dar prezintă un centru mai puţin colorat). Această analiză necesită "antrenament", datorită necesităţii comparării permanente a morfologiei unor apendici sexuali "standard" cu cea observată.

- Se analizează cel puţin 300-500 de PMN. În situaţia unui rezultat "anormal" se va cerceta un număr dublu de PMN, eventual pe lame diferite.

O variantă tehnică mai bună este studiul unor frotiuri realizate cu concentrat leucocitar. Pentru aceasta se recoltează circa 5 ml sânge care se trece imediat într-o eprubetă cu anticoagulant (1 ml soluţie EDTA 5%) care se plasează vertical într-un stativ. După o oră se recoltează supernatantul, se centrifughează, iar sedimentul rămas după decantare se resuspendă. Se ia o picătură din suspensia leucocitară şi se pune pe o lamă de microscop; se acoperă cu o lamelă şi atunci când picătura s-a etalat aproape complet între lamă şi lamelă se trage lamela lateral, rapid şi orizontal pentru a realiza un frotiu. După uscare se colorează obişnuit cu soluţie May - Grünwald - Giemsa.

C. ANALIZA UNOR PREPARATE MICROSCOPICE Analiza se face pe preparate microscopice şi fotografii din colecţia disciplinei, studiindu-se aspectul cromatinei sexuale şi observându-se corelaţia dintre numărul şi mărimea corpusculilor de cromatina X şi anomaliile numerice sau structurale ce interesează cromosomii X.

D. DISCUTAREA INDICAŢIILOR PRACTICE ALE TESTULUI CROMATINEI SEXUALE

1. Indicaţiile practice ale testului cromatinei X în determinarea sexului genetic în stările intersexuale şi diagnosticul anomaliilor de număr şi structură ale cromosomilor sexuali la pacienţi cu disgenezii gonadice vor fi discutate pe baza unor fotografii şi diapozitive.

Cromatina sexuală

48

2. Analizaţi figura 3.6. şi stabiliţi care ar putea fi, în fiecare caz, numărul de cromosomi sexuali ai persoanelor care prezintă nuclei cu aspectul prezentat în figură.

a b c d

Figura 3.6. Relaţia dintre numărul de cromosomi X şi numărul de corpusculi Barr (nuclei de celule epiteliale din mucoasa bucală)


A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - Cromatină X - Ipoteza Lyon - - Apendice sexual tip B - Corpuscul Barr - Corpuscul F - Apendice sexual tip A - Cromatină Y - Sex genetic - Heterocromatină sexuală

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Care sunt particularităţile cromatinei sexuale? 2. Ce reprezintă sexul genetic? 3. Formulaţi ipoteza Lyon. Care este rolul inactivării cromosomului X la femei? 4. Ce este corpusculul Barr? În care celule poate fi analizată cromatina X? 5. În care celule sanguine poate fi vizualizat un apendice sexual? Hematiile pot avea astfel de

formaţiuni? Justificaţi răspunsul. 6. Care este formula de calcul în cazul testului cromatinei X? Câţi corpusculi Barr are o femeie normală? Dar

un bărbat normal? 7. Există femei la care lipseşte corpusculul Barr? Dar bărbaţi la care acesta există? Justificaţi

răspunsurile. 8. Ce este cromatina Y? Ce fel de coloraţie este necesară pentru vizualizarea cromatinei Y? 9. Care este formula de calcul în cazul testului cromatinei Y? Câţi corpusculi Barr are o femeie normală?

Dar un bărbat normal? 10. Există bărbaţi la care lipseşte corpusculul F? 11. Care sunt indicaţiile studiului cromatinei sexuale? Care sunt limitele acestui test?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1. Care dintre următoarele cifre indică în mod corect numărul de corpusculi Barr observaţi la: un băiat cu trisomie 21, o femeie cu trisomie X, o femeie cu sindrom Turner şi un bărbat cu sindrom Klinefelter (în această ordine)? A. 0, 1, 2, 1; D. 2, 0, 1, 1; B. 1, 1, 0, 1; E. 1, 1, 0, 2. C. 0, 2, 0, 1;

Cromatina sexuală

49

2. Numărul corpusculilor F dintr-o celulă este egal cu: A. Suma cromosomilor Y-1; B. Suma cromosomilor Y; C. Suma cromosomilor X şi Y; D. Suma cromosomilor Y+1; E. Suma corpusculilor Barr.

II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B - dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4. 3. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la corpusculul Barr sunt adevărate? 1. Reprezintă un corpuscul de heterocromatină din nucleul PMN; 2. În celulele mucoasei bucale este lipit de faţa internă a membranei nucleare; 3. Se colorează intens cu quinacrină; 4. Este un corpuscul intens colorat bazofil. III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false.

4. Studiul corpusculului Barr permite stabilirea sexului genetic, deoarece numărul corpusculilor Barr este corelat cu cel al cromosomilor X. 5. Persoanele în ale căror celule se evidenţiază un corpuscul Barr au întotdeauna fenotip feminin, deoarece prezenţa unui corpuscul Barr semnifică existenţa în celule a doi cromosomi X. IV. Asociaţi următoarelor cariotipuri din coloana din stânga numărul corespunzător de corpusculi Barr din coloana din dreapta: 1. 46,XX; A. Unul; 2. 45,X; B. Doi; 3. 48,XXXY; C. Nici unul; 4. 48,XXXX; D. Trei; 5. 49,XXXXX; E. Patru.

4. CROMOSOMII UMANI

I. DATE TEORETICE

A. GENERALITĂŢI Celulele somatice umane normale conţin un set diploid (2n) format din 46

cromosomi.15 Cei 46 cromosomi sunt grupaţi în 23 perechi de cromosomi omologi: 22 de perechi identice la cele două sexe − autosomi − şi una diferită − gonosomii − XX la femeie şi XY la bărbat16. În celulele sexuale mature (gameţi) există numai 23 de cromosomi (22 autosomi + X sau 22 autosomi + Y) reprezentând un set haploid (n) de cromosomi.

B. METODE DE STUDIU A CROMOSOMILOR UMANI Studiul cromosomilor umani se bazează pe trei principii fundamentale:

obţinerea de celule în diviziune (mitoză sau meioză); blocarea diviziunii în metafază sau prometafază; obţinerea preparatelor cromosomice şi analiza lor la microscop.

1. OBŢINEREA DE CELULE ÎN DIVIZIUNE

Se realizează: direct analizând ţesuturilor cu diviziuni active: măduvă hematogenă, gonade, tumori; indirect prin culturi de ţesuturi:

de scurtă durată: sânge periferic (limfocite), măduvă osoasă hematogenă; de lungă durată: fibroblaşti din ţesutul conjunctiv (piele, fascii) celule din lichidul

amniotic, din vilozităţile coriale sau tumori solide. Pentru studiul de rutină al cromosomilor umani, cel mai frecvent se utilizează

culturile de limfocite T, deoarece sângele este uşor de prelevat, culturile durează numai 3 zile, pot fi stimulate pentru a obţine un indice mitotic crescut şi nu necesită dotări speciale. Stimularea diviziunilor celulare se face cu substanţe mitogene, precum fitohemaglutinina.

Celelalte metode au indicaţii particulare, aplicarea lor fiind limitată datorită dificultăţilor de prelevare sau cultură. Totuşi, studiul cromosomilor în măduvă osoasă este abordabil chiar în condiţiile unui laborator cu dotare modestă.

2. BLOCAREA DIVIZIUNILOR

Metafaza este stadiul mitotic optim pentru studiul cromosomilor, deoarece aceştia sunt bine individualizaţi şi dispuşi în acelaşi plan, la ecuatorul celulei. Diviziunea poate fi blocată într-un stadiu în care cromosomii sunt bicromatidieni (metafază, prometafază,

15 În 1956, Tijo şi Levan au stabilit că numărul de cromosomi ai speciei umane este de 46 16 La bărbat gonosomii nu sunt omologi

Cromosomii umani

51

profază) prin acţiunea unor substanţe statmokinetice, care inhibă formarea fusului de diviziune (polimerizarea tubulinei). Cele mai importante substanţe statmokinetice sunt colchicina şi derivaţii ei. Studiul cromosomilor în prometafază sau profază impune tehnici speciale, care asigură sincronizarea diviziunilor celulelor şi, prin obţinerea unor cromosomi mai puţin condensaţi, permite evidenţierea mai multor detalii de structură.

3. OBŢINEREA PREPARATELOR CROMOSOMICE

Obţinerea unor preparate în care cromosomii sunt dispuşi în acelaşi plan, la mică distanţă unul de altul, fără alterări morfologice, se realizează prin: hipotonizare - trecerea celulelor într-un mediu ce reprezintă 1/5-1/6 din tonicitatea

fiziologică duce la dilatarea celulelor şi dispersarea cromosomilor; se utilizează variate soluţii hipotone (KCl, ser bovin fetal diluat, citrat de sodiu);

fixarea celulelor - întrerupe brusc activitatea vitală, păstrând structura morfologică prealabilă fixării; se realizează cu un amestec 3:1 alcool etilic (metilic): acid acetic glacial; de regulă, se fac mai multe fixări (2-3) pentru a obţine cromosomi de calitate;

etalarea suspensiei celulare pe o lamă de microscopie asigură dispunerea cromosomilor în acelaşi plan şi accentuează dispersia produsă prin hipotonizare; astfel se obţin preparate definitive17;

pentru obţinerea de cromosomi uniform coloraţi se face colorarea preparatelor cu coloranţi bazici (soluţie Giemsa);

examinarea la microscop se face folosind un obiectiv cu imersie; se aleg metafazele cu cromosomi bine dispersaţi, contractaţi şi net conturaţi.

Metoda analizei directe la microscop este procedeul obişnuit pentru aprecierea cantitativă (numerică) şi calitativă (morfologică) a cromosomilor. Ea permite depistarea unor anomalii ale cromosomilor (în special de număr).

În cazurile în care nu există anomalii cromosomice, analiza a 16-20 de celule este suficientă. În cazul prezenţei unui mozaic, este necesară analiza a minimum 30 metafaze pentru a decela liniile celulare cu o incidenţă mai mică de 10%. Existenţa mai multor clone celulare impune analiza suplimentară a unui număr sporit de metafaze, pentru aprecierea cât mai corectă a procentajului fiecărei linii.

În procedurile clasice, analiza cromosomică se încheie prin fotografierea metafazelor optime, decuparea cromosomilor fotografiaţi şi realizarea cariotipului. În momentul de faţă a căpătat amploare metodele bazate pe preluarea imaginilor cu o cameră video şi analiza cromosomilor pe computer, folosind un soft specializat.

Pentru cazurile normale se cariotipează 2-3 metafaze. În cazul prezenţei unei anomalii cromosomice se analizează mai multe metafaze anormale. Dacă există mai multe clone, se recomandă cel puţin două cariotipuri pentru fiecare linie celulară.

Prin cariotip se înţelege dispunerea sistematizată, în perechi de omologi, a cromosomilor fotografiaţi şi decupaţi ai unei singure celule, pe baza lungimii, poziţiei centromerului sau altor criterii morfologice (constricţii secundare, sateliţi, benzi), precis codificate prin standarde internaţionale.

Studiul cromosomilor se bazează pe: obţinerea de celule în diviziune, blocarea diviziunii în metafază şi realizarea preparatelor cromosomice.

17 În cazul metodelor cu marcaj cromosomi după etalare sunt aplicate tratamente speciale care asigură apariţia benzilor.

Cromosomii umani

52

Celulele în diviziune se obţin, fie direct din ţesuturi care se divid activ, fie prin culturi celulare. Frecvent sunt folosite culturile de limfocite, stimulate cu fitohemaglutinină şi blocate în metafază, cu colchicină.

Preparatele cromosomice se obţin prin: hipotonizare, fixare, etalarea suspensiei pe lame de microscopie şi colorare. Cromosomii sunt examinaţi la microscopul optic cu un obiectiv cu imersie.

Cariotipul este obţinut prin decuparea cromosomilor fotografiaţi ai unei singure celule şi dispunerea sistematizată a acestora, în perechi de omologi, după criterii codificate prin standarde internaţionale.

C. IDENTIFICAREA CROMOSOMILOR UMANI Identificarea cromosomilor umani se face pe baza unor criterii morfologice

cantitative (lungimea cromosomului, poziţia centromerului) şi calitative (constricţii secundare, sateliţi). La acestea se adaugă marcajul în benzi şi hibridarea fluorescentă in situ (FISH). Toate aceste criterii au fost codificate cu ocazia conferinţelor de standardizare într-un sistem internaţional de identificare şi nomenclatură (ISCN18).

1. CRITERII MORFOLOGICE DE IDENTIFICARE

a. Criterii cantitative: 1. lungimea cromosomului - reprezentată de:

lungimea absolută, exprimată în microni, variază în funcţie de stadiul diviziunii; lungimea relativă (Lr) exprimată în procente din lungimea unui set haploid normal

(22 autosomi + X).

1000X autosomi 22

cromosom lungime

Lr

Cromosomii umani sunt: mari, mijlocii şi mici. 2. poziţia centromerului

se determină pe baza indicelui centromeric (Ic) - raportul procentual dintre lungimea braţului scurt şi lungimea totală a cromosomului: Ic = (p/p+q) x 100. Astfel, cromosomii se clasifică în: metacentrici (M) – Ic = 46-49; submetacentrici (SM) – Ic = 26-45; acrocentrici (A) – Ic = 17-25.

raportul braţelor, reprezentat de raportul dintre lungimea braţului scurt şi a celui lung (p/q); are următoarele valori: cromosomi metacentrici 1, cromosomi submetacentrici = 1/3 – 1/4, cromosomi acrocentrici < 1/5.

Folosind criteriile cantitative, se pot identifica perechile de cromosomi omologi, care se clasifică în 7 grupe notate cu majuscule de la A la G (tabelul 4.1.). Identificarea cromosomilor pe baza criteriilor cantitative este însă dificilă, cu excepţia cromosomilor din grupele A şi E. Determinarea parametrilor cantitativi prin măsurători este susceptibilă de erori, iar valorile obţinute sunt influenţate de gradul de condensare al cromosomilor omologi. b. Criterii calitative:

1. Sateliţii pot fi întâlniţi uneori pe braţele scurte ale cromosomilor acrocentrici din grupele D (13, 14, 15) şi G (21 şi 22) cu excepţia cromosomului Y. Numărul cromosomilor cu sateliţi şi mărimea sateliţilor variază de la o persoană la alta.

Tabel 4.1. Clasificarea cromosomilor umani după lungime şi poziţia centromerului

18 Ultima Conferinţă de standardizare s-a desfăşurat în 1995

Cromosomii umani

53

LUNGIMEA CROMOSOMULUI POZIŢIA CENTROMERULUI MARI MIJLOCII MICI METACENTRICI A 1-3 E 16 F 19-20 SUBMETACENTRICI B 4-5 C 6-12, X E 17-18 ACROCENTRICI - D 13-15 G 21-22, Y

2. Constricţiile secundare sunt segmente cromosomice despiralizate, slab colorate, formate din heterocromatină. Există două tipuri de constricţii secundare. Unele sunt prezente în regiunea juxtacentromerică a braţului lung al cromosomilor 1, 9 şi 1619. Un alt tip de constricţie secundară separă sateliţii de braţul scurt al cromosomilor acrocentrici. Constricţiile secundare nu sunt constante, iar atunci când sunt prezente pot avea lungimi diferite pe cromosomii omologi. 3. Situsurile fragile sunt regiuni cromosomice la nivelul cărora se produc mai frecvent rupturi cromosomice. Situsurile pot fi evidenţiate prin culturi celulare în mediu restrictiv sau prin adăugarea unor substanţe care cauzează rupturi cromosomice, precum aphidicilina sau agenţii antifolaţi. În majoritatea cazurilor situsul fragil nu este asociat cu manifestări clinice20. În practică, în cazul unei coloraţii uniforme, pentru identificarea cromosomilor pe

baza criteriilor morfologice (figura 4.1.) se ţine cont de următoarea recomandare: alegerea omologilor se va face pe baza lungimii şi a raportului dintre braţul scurt şi cel lung (p/q); toţi autosomii şi gonosomii XX de la femeie formează perechi de omologi, în timp ce gonosomii XY de la bărbat nu sunt omologi.

Caracteristicile morfologice ale fiecărei grupe de cromosomi sunt: Grupa A (1-3) - cromosomi mari, metacentrici; se identifică pe baza lungimii şi a poziţiei centromerului: cromosomul 1 este cel mai mare, prezintă centromerul median şi poate avea o constricţie

secundară pe braţul lung, lângă centromer; cromosomul 2 este mai mic şi uşor submetacentric (p/q=1/2); cromosomul 3 este mai mic decât primii doi şi este metacentric. Grupa B (4-5) - cromosomi mari, submetacentrici; cromosomul 4 este uşor mai lung şi are braţul scurt mai mare decât cromosomul 5; Grupa C (6-12,X) - cromosomi mijlocii, submetacentrici; la femeie sunt 16, iar la bărbat 15; fără marcaj cromosomic sunt dificil de identificat şi se

aranjează în ordinea mărimii; romosomii din perechile 6, 7, 11 şi X sunt mai puţin submetacentrici decât perechile 8, 9, 10,

12; cromosomul 9 poate avea o constricţie secundară juxtacenteromeric pe braţul lung; Grupa D (13-15) - cromosomi mijlocii, acrocentrici; toate cele trei perechi pot prezenta sateliţi; se aranjează în ordinea mărimii.

Grupa E (16-18) - cromosomi mijlocii, mici; cromosomul 16 este metacentric, iar cromosomii 17 şi 18 sunt submetacentrici; cromosomul 17 are braţele scurte mai mari decât cele ale cromosomului 18.

19 Aceste regiuni se caracterizează prin prezenţa unor benzi C largi şi conţin ADN înalt repetitiv. 20 Singura excepţie o reprezintă situsul fragil localizat Xq27.3, numit FRAXE, care se asociază cu retard mental

Cromosomii umani

54

Figura 4.1. Cariotip 46, XY - coloraţie uniformă (Giemsa), fără marcaj în benzi

Grupa F (19-20) - cromosomi mici, metacentrici; cromosomul 19 este puţin mai mic decât cromosomul 20. Grupa G (21-22,Y) - cromosomi mici, acrocentrici; la femeie sunt 4, iar la bărbat 5; cromosomul 21 este mai mic decât cromosomul 22 şi ambii sunt mai mici decât Y, care are

cromatidele mai puţin divergente şi mai puţin conturate în partea terminală; toţi cromosomii grupei G pot prezenta sateliţi, cu excepţia cromosomului Y.

Identificarea cromosomilor umani se face pe baza unor criterii morfologice: lungimea relativă sau absolută, împarte cromosomii în: mari, mijlocii, mici; poziţia centromerului determinată prin indicele centromeric, împarte

cromosomii în: metacentrici, submetacentrici, acrocentrici; sateliţii sunt prezenţi pe braţele scurte ale cromosomilor acrocentrici D şi G; constricţiile secundare sunt mai frecvente pe braţele lungi ale cromosomilor 1,

9, 16.

Cromosomii umani

55

Conform acestor criterii, cromosomii umani se clasifică în 7 grupe notate de la A-G. Fiecare grupă prezintă un anumit număr de perechi de cromosomi cu formă şi mărime caracteristică.

B. IDENTIFICAREA CROMOSOMILOR PRIN MARCAJ ÎN BENZI

Ultimele trei decenii au revoluţionat înţelegerea genomului uman prin introducerea unor tehnici speciale de analiză a cromosomilor. Acestea au facilitat identificarea precisă a fiecărui cromosom, prin evidenţierea unor benzi caracteristice, dispuse transversal pe cromatide, benzi care reflectă structura internă a cromosomilor (figura 4.2.).

Figura 4.2. Aspectul cromosomilor din grupele D (13 – 15) şi G (21 –22, Y) în coloraţia uniformă (sus) şi cu marcaj R (jos) [permite identificarea precisă a fiecărui cromosom]

Banda este un segment cromosomic distinct, ce se deosebeşte de benzile adiacente prin intensitatea coloraţiei. Denumirea benzilor se face în funcţie de metoda de marcaj

folosită sau de localizarea lor: marcaj Q - benzi ce devin vizibile prin coloraţie cu quinacrină (sau alt fluorocrom) şi examinare la microscopul cu iluminare în ultraviolet; benzile Q pozitive sunt fluorescente, iar cele Q negative sunt întunecate; marcaj G - benzi colorate cu soluţie Giemsa, după un tratament prealabil cu baze, enzime proteolitice (tripsină) sau soluţii saline concentrate; benzile Q şi G au aceeaşi dispoziţie şi corespund regiunilor de heterocromatină (bogate în perechi de baze AT) (figura 4.3); marcaj R - benzi obţinute prin denaturarea termică a ADN (tratarea lamelor într-o soluţie salină complexă, la pH 6,5, la 87oC) şi colorare cu soluţie Giemsa sau cu acridin orange; benzile R au dispoziţie inversă ("reverse") benzilor Q şi G; benzile R intens colorate (pozitive) corespund benzilor mai slab colorate obţinute prin tehnicile Q şi G; benzile R pozitive corespund regiunilor de eucromatină (bogate în perechi de baze GC) (figura 4.3.); marcaj C - benzi ce corespund heterocromatinei centromerice;

Figura 4.3. Comparaţie între marcajele G/Q şi R

Cromosomii umani

56

marcaj T - benzi localizate în regiunile telomerice; marcaj NOR – colorează sateliţii cromosomilor acrocentrici. Fiecare cromosom este alcătuit dintr-o alternanţă de benzi pozitive (colorate) şi negative (necolorate). Secvenţa acestor benzi constituie o caracteristică de specie, fiind aceeaşi în toate celulele unui organism şi la toţi indivizii normali ai speciei. Marcajul în benzi permite identificarea precisă a fiecărui cromosom (figurile 4.2., 4.5, 4.7 şi 4.8).

Unele benzi sunt net conturate şi reprezintă, alături de centromer şi telomere, elemente importante pentru identificarea unui cromosom. Acestea con-stituie repere cromosomice şi delimitează de-a lungul cromosomului mai multe regiuni. Regiunile şi benzile sunt numerotate de la centromer spre telomere, începând cu numărul 1, separat de-a lungul fiecărui braţ. În celelalte regiuni, numărătoarea începe cu reperul proximal situat spre centromer. Nomenclatura regiunilor şi benzilor se face notând, în ordine: numărul cromosomului, simbolul braţului, numărul regiunii, numărul benzii, după care urmează un punct, ce delimitează subdiviziunile. De exemplu: 1q21.2 = cromosomul 1, braţul lung (q) regiunea 2, banda 1, subbanda 2 (figura 4.4.). Conferinţa de standardizare şi nomenclatură a cromosomilor umani de la Paris (1971) a stabilit o reprezentare diagramatică a tuturor cromosomilor metafazici pe baza tipurilor de marcaj Q, R, G şi C, care cuprinde 320 benzi per set haploid (figura 4.5.). Unele tehnici permit identificarea tuturor cromosomilor (benzile Q, R, G) în timp ce altele evidenţiază segmente cromosomice (benzi C, T, marcaj BrdU). În funcţie de scop şi de cromosomii analizaţi este aleasă tehnica adecvată. Pentru obţinerea detaliilor de structură ale cromosomilor sunt

utilizate tehnici speciale de înaltă rezoluţie, bazate pe sincronizarea ciclurilor celulare (prin

Figura 4.4. Cromosomul 1: regiuni, benzi, subbenzi

Cromosomii umani

57

tratamente combinate cu metotrexat şi timidină sau BrdU) şi scurtarea perioadei de colchicinizare. Avantajul constă în obţinerea de preparate cu cromosomi mai puţin condensaţi, aflaţi în stadiile de prometafază sau profază, caracterizaţi printr-un număr sporit de benzi (figura 4.4.). În acest caz o bandă metafazică, obţinută prin metoda standard, este separată în mai multe subbenzi, a căror evidenţiere devine mai uşoară odată cu alungirea cromosomului.

În raport cu perioada în care se realizează blocarea diviziunii, rezoluţia marcajului este diferită, prin evidenţierea unui număr diferit de benzi (figura 4.4.). Dacă în metafază, când cromosomii sunt puternic condensaţi, se pot observa 300 - 450 benzi (tehnici clasice sau de generaţia a II-a), în prometafază numărul creşte până la 550 - 850, în timp ce analiza cromosomilor în profază poate evidenţia până la 1000 benzi (tehnici de înaltă rezoluţie sau de generaţia a III-a).

Metodele de înaltă rezoluţie au aplicabilitate pentru identificarea unor anomalii de structură de mici dimensiuni (translocaţii, deleţii, duplicaţii, situsuri fragile). Ele permit corelaţii între modificările cromosomice minore şi unele aspecte clinice.

Figura 4.5. Reprezentarea diagramatică a benzilor cromosomice (marcaj G)

[Conferinţa Paris, 1971]

În practică, examenul citogenetic de rutină trebuie să utilizeze o metodă de marcaj a tuturor cromosomilor (G sau R) iar dacă se depistează o anomalie cromosomică se recurge la alte metode specifice, mai laborioase.

Cromosomii pot fi identificaţi exact prin marcaj în benzi. Există mai multe tipuri de benzi (Q, G, R, C, T) obţinute prin diverse tehnici, care evidenţiază pe cromatide anumite repere (centromer, telomere, unele benzi), caracteristice fiecărui cromosom. Cu cât cromosomii sunt mai alungiţi, cu atât se observă mai multe benzi. Numerotarea benzilor se face pe fiecare braţ de la centromer spre telomere.

Cromosomii umani

58

C. TEHNICI DE CITOGENETICĂ MOLECULARĂ Definirea precisă a anomaliilor cromosomice structurale (deleţii, duplicaţii etc.)

depinde de rezoluţia metodelor de analiză citogenetică. Tehnicile de marcaj metafazic (300-450 benzi per genom haploid) permit obţinerea unei rezoluţii de 5-10 Mb/bandă. Analiza cromosomilor prometafazici (850 benzi per genom) are o rezoluţie de ordinul a 3-5 Mb/bandă şi permite diagnosticul unor microdeleţii sau microduplicaţii. Tehnicile de citogenetică moleculară depăşesc această limită, ajungând la o rezoluţie de 10 - 1000 de kilobaze, ce permite evidenţierea unor “deleţii submicroscopice”.

Cea mai folosită tehnică de citogenetică moleculară este hibridarea fluorescentă in situ (FISH – Fluorescence In Situ Hybridization) a două secvenţe nucleotidice complementare: ADN cromosomic monocatenar (“ţintă”) obţinut prin denaturare termică şi o sondă specifică. Detecţia hibridării poate fi directă sau indirectă. Detecţia directă (cea mai folosită) se bazează pe utilzarea de sonde marcate cu fluorocromi. În cazul detecţiei indirecte sunt utilizate nucleotide modificate chimic (biotină, digoxigenină) ce sunt recunoscute în urma fixării unui ligand fluorescent, precum avidina (figura 4.6.).

Figura 4.6. Principiul hibridării in situ fluorescente (FISH)

Sondele moleculare au specificităţi diferite (figura 4.7.): pentru un întreg cromosom sau un braţ cromosomic, care va apare colorat distinct de ceilalţi

cromosomi (tehnica de “pictare” cromosomică – engl. “chromosome painting”); pentru secvenţele de ADN satelit localizate în regiunea centromerică sau

pericentromerică a unui cromosom; ele pot semnala prezenţa cromosomului respectiv

Cromosomii umani

59

chiar în nuclei interfazici (de exemplu în trisomia 21, folosind sonde pentru centromerul cromosomului 21, vor fi evidenţiate trei semnale fluorescente);

sonde specifice unui locus din structura unui cromosom; va fi vizualizat un semnal de hibridare unic, specific locusului studiat; deleţia locusului determină absenţa semnalului;

sonde multi-locus care evidenţiază mai mulţi loci din structura unui cromosom.

A B C D E

Figura 4.7. Tipuri de sonde folosite în tehnica FISH A - Sondă specifică unui cromosom; B - Sondă specifică unui braţ; C - Sondă specifică

centromerului; D - Sondă specifică unui locus; E - Marcaj multilocus

Trebuie menţionat că alegerea sondelor moleculare, precum şi a “ţintei” (cromosom metafazic, nucleu interfazic, fibră de cromatină decondensată) şi a celulelor utilizate (fetale, somatice adulte, tumorale, gameţi) depinde de scopul analizei, determinat de o situaţie clinică dată (fenotipul bolnavului). Multitudinea sondelor, ţintelor şi celulelor studiate asigură tehnicilor de citogenetică moleculară o largă aplicaţie practică, în diagnostic şi cercetare.

În ultimii ani au fost introduse tehnici noi de citogenetică moleculară. Alte tehnici de citogenetică moleculară sunt SKY şi CGH.

Cariotiparea spectrală (SKY – Spectral Karyotyping) foloseşte cinci sonde diferite, o cameră video pentru preluarea imaginilor şi programe de prelucrare a imaginilor recepţionate, astfel că în final fiecare cromosom apare colorat specific, permiţând recunoaşterea rapidă a unor remanieri cromosomice complexe. Tehnica are aplicabilitate în citogenetica tumorală, deoarece în celulele canceroase sunt deseori prezente translocaţii complexe, ce implică mai mulţi cromosomi.

Hibridarea genomică comparată (CGH – Comparate Genomic Hybridization) foloseşte pentru marcarea ADN-ului cromosomilor pacientului o sondă colorată (de exemplu verde) iar pentru ADN-ul din celulele normale, folosite ca martor, o altă culoare (de exemplu roşu). Ambele tipuri de ADN se hibridează cu cromosomii unei metafaze normale. Dacă în ADN-ul pacientului există o duplicaţie (trisomie parţială) se va produce o hibridare în exces între ADN-ul pacientului şi ADN-ul normal, evidenţiată prin colorarea în verde. Dacă în ADN-ul pacientului există o deleţie (monosomie parţială) se va produce o hibridare preferenţială între ADN-ul martor şi ADN-ul normal, evidenţiată prin colorarea în roşu.

Tehnica FISH – hibridare in situ fluorescentă - permite identificarea precisă a tuturor cromosomilor, folosind sonde de ADN specifice; are avantajul că poate fi folosită pentru celule în diviziune şi pentru celule interfazice.

Alte tehnici, precum SKY (cariotipare spectrală) şi CHG (hibridare genomică comparată) permit identificarea rearanjamentelor cromosomice complexe sau a microdeleţiilor/microduplicaţiilor fără etalarea cromosomilor.

Cromosomii umani

60

D. NOMENCLATURA CROMOSOMILOR UMANI Nomenclatura cromosomilor umani este bazată pe Sistemul internaţional de

standardizare şi nomenclatură – ISCN, elaborat la Paris, în 1970 şi ameliorat la următoarele Conferinţe internaţionale. Acest sistem stabileşte detaliat simbolurile utilizate pentru descrierea cromosomilor normali şi a anomaliilor cromosomice, precum şi modul practic de reprezentare sau formulare al cariotipului.

Conţinutul informaţional al cariotipului se redă astfel: mai întâi se notează numărul total de cromosomi (autosomi + gonosomi) urmat, după o virgulă, de cromosomii sexuali. De exemplu: 46,XX - cariotip normal, sex genetic feminin (figura 4.8.);

Figura 4.8. Cariotip 46,XX cu marcaj R

46,XY - cariotip normal, sex genetic masculin (figura 4.9.); 45,X - cariotip anormal, caracterizat prin lipsa unuia dintre gonosomi, la o persoană de sex

feminin (în absenţa cromosomului Y orice persoană este de sex feminin);

Cromosomii umani

61

Figura 4.9. Cariotip 46,XY cu marcaj R

47,XXY - cariotip anormal cromosom X suplimentar, la o persoană de sex masculin. Autosomii sunt specificaţi numai în caz de anomalii. Astfel, absenţa unui autosom sau

existenţa unuia suplimentar, se notează cu semnele – sau +, plasate înaintea numărului ce desemnează cromosomul respectiv şi după cromosomii sexuali. De exemplu: 47,XY,+21 - cariotip anormal prin prezenţa unui cromosom 21 suplimentar, la o persoană de

sex masculin. În cazul unor mozaicuri cromosomice sunt notate toate liniile celulare, separate prin

linii oblice, în ordinea descrescătoare a frecvenţei fiecărei clone. 45,X/46,XX/47,XXX – cariotip anormal caracterizat prin existenţa unei linii celulare cu

monosomie X (45,X) a unei linii celulare normale (46,XX) şi a unei linii celulare trisomice (47,XXX) la o persoană de sex feminin, preponderentă fiind linia monosomică;

Cromosomii umani

62

46,XY/47,XY,+21 – cariotip anormal caracterizat prin coexistenţa unei linii celulare normale (46,XY) şi a uneia cu trisomie 21 (47,XY,+21) la o persoană de sex masculin, linia normală fiind mai frecventă.

Braţul scurt al unui cromosom se notează cu "p", iar cel lung cu "q". Dacă semnele + sau ─ sunt plasate după aceste litere, ele semnifică o micşorare sau o mărire a lungimii braţului respectiv. De exemplu: 46,XY,1q+, cariotip anormal al unei persoane de sex masculin cu 46 cromosomi şi cu o

creştere în lungime a braţului lung al cromosomului 1. 46,XX,5p-, cariotip anormal al unei persoane de sex feminin cu 46 cromosomi şi deleţie

(pierdere de material) pe braţul scurt al cromosomului 5. Constricţia secundară se notează cu litera "h", plasată după simbolul braţului pe care

se găseşte; creşterea ei în lungime se notează cu +. De exemplu: 46,XY,9qh+ - cariotip normal al unei persoane de sex masculin cu 46 cromosomi şi alungirea

constricţiei secundare de pe braţul lung al cromosomului 9. Anomaliile de structură ale cromosomilor se marchează cu simboluri specifice care

sunt descrise la capitolul “Anomalii cromosomice”.

Nomenclatura cromosomilor umani are la bază un sistem internaţional de standardizare, care permite descrierea cariotipului normal şi anormal cu ajutorul unor simboluri şi semne, prin care se redă numărul de cromosomi şi eventualele anomalii de structură cromosomice.

E. VARIAŢIILE CARIOTIPULUI LA PERSOANE CU FENOTIP NORMAL - POLIMORFISMUL CROMOSOMIC

Anumite persoane prezintă variante ale cariotipului, considerate modificări minore, a căror prezenţă nu poate fi asociată cu anomalii fenotipice şi care nu au semnificaţie clinică anormală, deoarece interesează regiuni cromosomice de heterocromatină, inactivă genetic. Aceste variante au fost denumite polimorfisme sau heteromorfisme.

La 2% dintre adulţi au fost detectate prin marcaj cromosomic diferenţe mici de lungime. Alte forme de variabilitate cromosomică neasociată cu anomalii clinice, implică sateliţii, constricţiile secundare şi polimorfismele benzilor Q, G, C. Lungimea cromosomilor omologi nu este întotdeauna aceeaşi, fiind modificată, în special,

lungimea braţelor lungi ale cromosomilor D şi G. Printre bărbaţii normali există variaţii marcate ale cromosomului Y pe seama părţii sale heterocromatiniene (Yq).

Sateliţii prezintă o mare variabilitate, fie de număr (foarte rar sunt prezenţi pe toţi cei 10 acrocentrici ai grupelor D şi G dintr-o celulă) fie de formă sau mărime. Pot fi întâlniţi sateliţi giganţi, alungiţi, multipli, divizaţi, dubli sau în tandem. În mod excepţional, ei pot apărea şi pe alţi cromosomi (17, Y).

Constricţiile secundare sunt depistate constant în regiunile proximale ale braţelor lungi ale cromosomilor 1, 9 şi 16. Uneori apare o alungire a constricţiei secundare21 sau apar constricţii neobişnuite pe cromosomii 6 sau 19.

Polimorfismele benzilor Q, G şi C se caracterizează prin diferenţe în ceea ce priveşte mărimea şi aspectul zonelor cromosomice colorate prin variate tehnici de marcaj. Aceste diferenţe variază de la o celulă la alta şi implică, în mod obişnuit, numai unul din cromosomii omologi. Cel mai frecvent, polimorfismele benzilor C implică regiunile

21 Prezenţa unei constricţii secundare mari determină o alungire totală a cromosomului, fără a avea însă efecte clinice.

Cromosomii umani

63

centromerice, braţele scurte şi regiunile satelit ale cromosomilor D şi G, precum şi zona de constricţie secundară de pe braţul lung al cromosomului Y.

Semnificaţia exactă a acestor variante nu este cunoscută. Se cunoaşte că ele se transmit dominant, conform legilor lui Mendel, şi că nu modifică expresia fenotipică, deoarece polimorfismul pare limitat numai la regiunile heterocromatice, inactive genetic. Importanţa practică a polimorfismelor cromosomice constă în utilizarea lor pentru determinarea originii cromosomilor suplimentari în trisomii, pentru identificarea cromosomilor ce conţin gene marker, în medicina legală etc.

II. APLICAŢII PRACTICE 1. Examinaţi pe planşă şi fotografii etapele de obţinere ale cromosomilor la om; corelaţi observaţiile

făcute cu ceea ce aţi observat în cadrul vizitei de prezentare a laboratorului de citogenetică (culturi celulare) al disciplinei de Genetică umană.

2. Examinaţi la microscop un preparat cu cromosomi; apreciaţi calitatea culturii prin numărul de metafaze, dispersia şi claritatea cromosomilor.

3. Reprezentaţi grafic (desen) după fotografii, cromosomii unei metafaze; recunoaşteţi pe desen tipurile de cromosomi după mărime (mari, mijlocii, mici) şi poziţia centromerului (metacentrici, submetacentrici, acrocentrici); observaţi dacă există sateliţi pe cromosomii acrocentrici şi constricţii secundare pe cromosomii 1, 9, 16.

4. Recunoaşteţi după lungime şi poziţia centromerului şi notaţi pe metafaza desenată cromosomii care aparţin fiecărei grupe; identificaţi cromosomii 1, 2, 3, 16, 17, 18 şi eventual, Y.

5. Pe idiograma cromosomilor umani cu marcaj G (figura 4.5.), recunoaşteţi reperele cromosomice = benzi, centromer, telomere. Observaţi particularităţile de marcaj ale fiecărui cromosom.

6. Pe o metafază cu marcaj în benzi (figura 4.10.) recunoaşteţi cu ajutorul ideogramei din figura 4.5. fiecare cromosom, identificaţi perechile de omologi şi stabiliţi sexul genetic şi dacă numărul total de cromosomi este 46.

7. Dacă pe o metafază cu marcaj există o anomalie de număr, identificaţi cromosomii suplimentari sau pe cei absenţi. Dacă la stabilirea perechilor de omologi constataţi o anomalie de structură, înregistraţi-o pentru a fi discutată.

8. Având ca model o idiogramă cu marcaj în benzi, realizaţi un cariotip prin aranjarea cromosomilor decupaţi de pe o fotografie, folosind criteriile caracteristice pentru separarea pe grupe, iar în cadrul grupelor, utilizaţi marcajul în benzi (ex. B 4-5, C 6-12, D 13-15, G 21-22).

9. Analizaţi pe diapozitive şi fotografii exemple de metafaze cu variaţii normale ale cromosomilor (numărul cromosomilor cu sateliţi, constricţie secundară 9qh+ sau Yq+).

10. Analizaţi diferite cariotipuri, identificaţi anomalia prezentă în fiecare caz şi stabiliţi formula cromosomică, conform nomenclaturii internaţionale.

III. ÎNTREBĂRI ŞI TESTE PENTRU VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

A. DEFINIŢI NOŢIUNILE Cariotip Criteriu cantitativ Criteriu calitativ Satelit Constricţie secundară Cromosom metacentric Cromosom submetacentric Cromosom acrocentric Bandă cromosomică Reper Marcaj Q Marcaj R Marcaj G FISH Polimorfism cromosomic

Cromosomii umani

64

Figura 4.10. Metafază cu marcaj G

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Ce etape sunt necesare pentru analiza cromosomilor ? 2. Care este cea mai folosită metodă de obţinere a unor celule în diviziune? 3. Care este substanţa care stimulează diviziunea limfocitelor cultivate? Care sunt substanţele care

asigură blocarea diviziunii într-o anumită etapă şi care este mecanismul lor de acţiune? 4. Care este rolul hipotonizării? Dar al fixării? 5. Ce reprezintă cariotipul? 6. Care sunt criteriile morfologice cantitative? Dar cele calitative? 7. În ce categorii sunt împărţiţi cromosomii pe baza lungimii? Dar pe baza poziţiei centromerului? 8. Enumeraţi care sunt caracteristicile cromosomilor din grupele: A, B, C, D, E, F şi G? 9. Care sunt cromosomii ce pot prezenta sateliţi? 10. Care sunt cromosomii ce pot prezenta frecvent constricţii secundare? 11. Care este singurul cromosom acrocentric care nu poate avea sateliţi? 12. Câţi cromosomi din grupa C au bărbaţii? Dar din grupa G? 13. Câţi cromosomi din grupa C au femeile? Dar din grupa G? 14. Ce sunt benzile cromosomice? 15. Cum se obţin benzile Q? Dar cele G, respectiv R?

Cromosomii umani

65

16. Care este relaţia între benzile Q, G şi R? 17. Care este principiul tehnicii FISH? 18. Care este limita de rezoluţie a tehnicii FISH comparativ cu cele ale marcajului cromosomic

metafazic şi profazic? 19. Care sunt tipurile de sonde folosite în FISH? 20. Scrieţi formula cromosomică pentru: o femeie normală, un bărbat normal, un bărbat cu constricţie

secundară pe braţul lung al cromosomului 16, o femeie cu trisomie 21, o femeie cu monosomie X, 21. Ce sunt polimorfismele cromosomice? 22. Care sunt principalele polimorfisme?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ La următoarele întrebări, răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1. Care dintre următoarele tipuri de coloraţii dau acelaşi aspect al benzilor?

A. Coloraţia T şi C; B. Coloraţia Q şi R; C. Coloraţia Q şi C; D. Coloraţia Q şi T; E. Nici unul din răspunsuri nu este corect.

2. Ce se înţelege prin cariotip? A. Informaţia genetică conţinută în nucleu; B. Informaţia genetică dintr-un set haploid de cromosomi; C. Tipurile de cromosomi din celule; D. Dispunerea sistematizată a cromosomilor unei celule; E. Nici unul din răspunsuri nu este corect.

La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4. 3. Cromosomul X:

1. Este un cromosom metacentric; 2. Este un cromosom mijlociu; 3. Se găseşte în triplu exemplar la copiii cu sindrom Down; 4. Este prezent în dublu exemplar la femei.

La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua este falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false. 5. Colchicina este frecvent folosită în studiile de citogenetică, deoarece blochează clivarea longitudinală a centromerului cromosomilor metafazici. 6. Variaţiile cariotipului la persoane normale includ prezenţa sateliţilor pe braţele scurte ale cromosomului Y, deoarece sateliţii sunt constituiţi din eucromatină, al cărei exces nu induce modificări ale fenotipului

Asociaţi următoarelor tipuri de cromosomi, din coloana din stânga, grupa corespunzătoare, din care fac parte, menţionată în coloana din dreapta. 1.Cromosomi mari, metacentrici; A. Grupa A; 2.Cromosomi mici, metacentrici; B. Grupa C, 3.Cromosomi mijlocii, acrocentrici; C. Grupa D 4.Cromosomi mijlocii, submetacentrici. E. Grupa G; 5.Cromosomi mici, acrocentrici; D. Grupa F;

5. ANOMALIILE {I BOLILE CROMOSOMICE

I. DATE TEORETICE

A. CLASIFICARE Anomaliile cromosomice sunt modificări ale numărului sau structurii cromosomilor.

Ele reprezintă o importantă componentă a patologiei genetice umane, atât datorită frecvenţei globale, cât mai ales datorită consecinţelor fenotipice şi reproductive. Până în prezent au fost identificate peste 100 de sindroame cromosomice. Anomaliile cromosomice afectează aproximativ: 0,7% din nou-născuţi, 2% din sarcinile femeilor cu vârsta peste 35 de ani în momentul concepţiei şi se regăsesc la peste 50% din produşii avorturilor spontane din primul trimestru.

Anomaliile cromosomice pot fi clasificate pe baza mai multor criterii (tabelul 5.1.).

Tabelul 5.1. Clasificarea anomaliilor cromosomice

Criteriu Tip de anomalie Momentul apariţiei constituţionale

dobândite Numărul de celule afectate omogene

în mozaic Tipul de ţesut afectat somatice

germinale Tipul de cromosom afectat autosomale

gonosomale mixte

Modul de afectare al materialului genetic

numerice - poliploidii - aneuploidii

structurale - echilibrate - neechilibrate

disomii uniparentale După momentul producerii lor, anomaliile cromosomice pot fi: anomalii

constituţionale şi anomalii dobândite. Anomaliile constituţionale sunt prezente la naştere şi au originea în cursul gametogenezei unuia dintre părinţi sau în primele etape ale embriogenezei. Anomaliile dobândite apar ulterior în cursul vieţii şi interesează o populaţie de celule (clone celulare anormale).

În raport cu numărul de celule afectate, anomaliile cromosomice pot fi împărţite în: omogene şi în mozaic. Anomaliile omogene se caracterizează prin prezenţa anomaliei în

Anomaliile şi bolile cromosomice

67

toate celulele individului afectat. Anomaliile în mozaic sunt caracterizate de prezenţa a două sau mai multe linii (clone) celulare, care diferă prin numărul de cromosomi. În raport cu tipul celulei afectate, anomaliile cromosomice în mozaic se clasifică în: anomalii somatice (pot modifica fenotipul individului afectat) şi anomalii germinale (anomalia nu modifică fenotipul pacientului, dar se poate transmite prin gameţi la descendenţi).

În funcţie de tipul de cromosom afectat, anomaliile cromosomice se clasifică în: anomalii autosomale (sunt interesaţi unul sau mai mulţi autosomi) anomalii gonosomale (anomalia implică cromosomii X sau Y) şi anomalii mixte (anomalia interesează cel puţin un autosom şi un gonosom).

În raport cu modul de afectare a materialului cromosomic, anomaliile pot fi împărţite în: numerice şi structurale. Prin anomalie cromosomică numerică se înţelege orice modificare a numărului de cromosomi în raport cu numărul normal de cromosomi (diploid – 2n = 46 cromosomi, în celule somatice, respectiv haploid – n = 23 cromosomi, în gameţi). Anomaliile numerice se clasifică în: poliploidii şi aneuploidii. Poliploidiile sunt caracterizate prin prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide complete de cromosomi. Aneuploidiile se caracterizează prin absenţa (monosomie) sau prezenţa în plus a unuia sau mai multor cromosomi (trisomie, tetrasomie, pentasomie) din aceeaşi pereche sau din perechi diferite.

Anomaliile cromosomice structurale se caracterizează prin modificarea structurii normale a cromosomilor. Ele se împart, în raport cu efectul fenotipic, în: anomalii echilibrate şi anomalii neechilibrate. Anomaliile cromosomice structurale echilibrate – translocaţii şi inversii – nu afectează cantitatea totală de material genetic celular şi nici fenotipul22. Anomaliile cromosomice structurale neechilibrate − deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici şi isocromosomi − sunt caracterizate prin prezenţa suplimentară, absenţa sau asocierea dintre surplusul şi lipsa unuia sau mai multor segmente cromosomice (trisomii sau monosomii parţiale), ceea ce determină o modificare a cantităţii totale de material genetic celular şi un fenotip anormal.

Un tip particular de anomalie cromosomică este disomia uniparentală, determinată de prezenţa în celulele unui individ a unei perechi de cromosomi ce provine de la acelaşi genitor. Ele se clasifică în: isodisomii (cei doi cromosomi sunt identici) şi heterodisomii (cei doi cromosomi sunt diferiţi). Aceste anomalii determină un fenotip anormal, doar când se realizează o stare homozigotă pentru gene recesive anormale (în isodisomii) sau când unele segmente cromosomice prezintă amprentare genetică (parentală) fenomen ce produce o neechivalenţă funcţională între cromosomii proveniţi de la cei doi genitori.

Anomaliile cromosomice se caracterizează prin modificarea numărului sau structurii cromosomilor

Principalul criteriu de clasificare este tipul anomaliei, care permite împărţirea anomaliilor cromosomice în: numerice, structurale şi disomii uniparentale.

B. ANOMALII NUMERICE Anomaliile numărului de cromosomi produc modificări importante ale cantităţii de

material genetic dintr-o celulă, determinând un fenotip anormal. Ele se împart în două categorii: poliploidii şi aneuploidii.

22 Uneori translocaţiile sau inversiile pot produce modificări fenotipice datorită producerii unei rupturi în interiorul unor gene de structură sau a formării unor gene himeră (gene fuzionate cu funcţii noi, diferite de cele normale).


68

1. POLIPLOIDIILE

Poliploidia se caracterizează prin prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide de cromosomi (n=23 cromosomi) faţă de numărul diploid normal (2n=46 cromosomi). La specia umană cele mai frecvente poliploidii sunt: triploidia (3n=69 cromosomi) şi tetraploidia (4n=92 cromosomi).

Poliploidiile se caracterizează prin modificări importante ale cantităţii de material genetic celular, determinând modificări majore ale fenotipului, cu efect letal, astfel că majoritatea embrionilor poliploizi sunt eliminaţi precoce prin avort spontan.

Poliploidiile pot rezulta prin erori: meiotice, mitotice sau de fecundare. Triploidiile pot rezulta prin erori meiotice sau erori de fecundare. Eroarea meiotică

constă în nesepararea citelor de ordin II şi poate afecta, atât meioza feminină, cât şi cea masculină. Neexpulzia celui de-al doilea globul polar, în timpul meiozei II feminine, conduce la formarea unui ovul diploid anormal, fenomen denumit diginie. Afectarea meiozei masculine duce la formarea unui spermatozoid diploid anormal, fenomen numit diandrie. Prin fecundarea unui gamet diploid cu un gamet normal rezultă un zigot triploid.

Eroarea de fecundare ce poate conduce la apariţia unui zigot triploid se numeşte dispermie şi constă în fecundarea concomitentă a unui ovul normal (n=23 cromosomi) de către doi spermatozoizi normali (n=23 cromosomi)23.

Tetraploidiile sunt, de obicei, consecinţa unei erori mitotice, numită endoreduplicare. Eroarea se caracterizează prin blocarea mitozei zigotului, după terminarea replicării ADN-ului nuclear. Celula trece direct în faza G1 a unui nou ciclu celular, perioadă în care cromosomii se despiralizează, producându-se separarea cromatidelor surori. Astfel, numărul de cromosomi din celulă se dublează de la 2n la 4n. O posibilitate, extrem de rară, este fecundarea unui ovul diploid de către un spermatozoid diploid.

2. ANEUPLOIDIILE

Aneuploidia se caracterizează prin modificarea numărului diploid de cromosomi (2n = 46 cromosomi) datorită pierderii unui cromosom (monosomie) sau prezenţei în exces a 1, 2 sau 3 cromosomi (trisomie, tetrasomie, pentasomie). Trisomiile se caracterizează prin prezenţa într-o celulă somatică a trei exemplare ale aceluiaşi cromosom, în locul perechii normale de cromosomi omologi (2n+1). La specia umană majoritatea trisomiilor complete sunt letale, ducând la avorturi spontane precoce. Singurele excepţii sunt trisomiile autosomale: 21, 18, 13, 8, şi cele gonosomale (XXX, XXY şi XYY). Monosomiile sunt anomalii caracterizate prin prezenţa într-o celulă somatică a unui singur cromosom, în locul unei perechi de cromosomi (2n-1). Efectele fenotipice ale monosomiilor sunt mult mai grave decât cele ale trisomiilor, astfel încât la om singura monosomie viabilă este monosomia X, celălalte monosomii conducând la avorturi spontane.

În cazul gonosomilor sunt posibile şi tetrasomii (48,XXXX, 48,XXYY, 48,XXXY) sau chiar pentasomii (49,XXXXX, 49,XXXXY).

a. ETIOLOGIA ANEUPLOIDIILOR

23 La om fecundarea este în mod normal monospermică, astfel ca prin fuziunea unui ovul haploid cu un spermatozoid haploid rezultă zigotul la care se reface numărul diploid de cromosomi, caracteristic speciei.


69

Cauzele aneuploidiilor sunt încă incomplet elucidate. În majoritatea cazurilor, aneuploidiile rezultă prin nedisjuncţie meiotică şi de aceea cele două fenomene au cauze identice.

Un fapt cunoscut de mult timp este concordanţa dintre creşterea vârstei materne în momentul concepţiei şi creşterea incidenţei trisomiilor la nou-născuţi. Cel mai clar efect al vârstei materne asupra incidenţei trisomiilor a fost dovedit în cazul sindromului Down (trisomia 21) dar efecte similare au fost identificate şi în cazul trisomiilor 13 şi 18. Se presupune că efectul vârstei materne asupra incidenţei trisomiilor are la bază două fenomene: o reducere a ratei recombinărilor intracromosomice (crossing-over) în meioza I şi formarea unui fus de diviziune anormal.

În schimb, factorii externi (nivel hormonal, alcool, fumat, diferite medicamente, radiaţii ionizante, boli autoimune etc.) nu cresc frecvenţa nedisjuncţiilor.

b. MECANISMELE DE APARIŢIE ALE ANEUPLOIDIILOR

Aneuploidiile omogene sunt consecinţa unor erori produse în cursul meiozei (nedisjuncţie cromosomică, nedisjuncţie cromatidiană, întârziere anafazică) dar şi a unor erori mitotice (nedisjuncţie cromatidiană) (vezi capitolul 2).

Nedisjuncţia meiotică se produce cel mai frecvent în meioza I (3/4 din cazurile de sindrom Down) originea fiind, de obicei, maternă (90-95% din cazurile de trisomie 21, 18 sau 13). Singurele excepţii sunt monosomia X (80% de origine paternă) şi trisomia XYY (exclusiv de origine paternă).

Nedisjuncţia cromosomică survine uneori în meioza I, fiind caracterizată prin migrarea celor doi cromosomi omologi la acelaşi pol al fusului de diviziune. Consecinţa acestei erori este formarea a doi gameţi anormali: unul disomic (n+1 = 24 cromosomi) iar celălalt nulisomic (n−1 = 22 cromosomi) (figura 2.10.). Fecundarea acestor gameţi de către gameţi normali (n=23 cromosomi) conduce la formarea de zigoţi aneuploizi trisomici, respectiv monosomici.

Nedisjuncţia cromatidiană poate apărea în meioza II şi se caracterizează prin migrarea celor două cromatide surori ale unui cromosom la acelaşi pol al fusului de diviziune. Consecinţa acestei erori este apariţia a doi gameţi anormali: unul disomic, iar celălalt nulisomic (figura 2.10.). Fecundarea acestor gameţi de către gameţi normali conduce, de asemenea, la formarea de zigoţi trisomici, respectiv monosomici.

Întârzierea anafazică este un accident care se poate produce în anafazele ambelor meioze (mai frecvent în anafaza II) şi constă în blocarea migrării sau reducerea vitezei de migrare a unor cromosomi/ cromatide normal segregate. Cromosomul sau cromatidele “întârziate” nu vor mai putea fi integrate într-unul din nucleii celulelor fiice şi vor rămâne în citoplasmă şi se vor pierde în cursul diferenţierii sau diviziunilor ulterioare. Efectul întârzierii anafazice este apariţia unor gameţi nulisomici, care prin fecundare cu gameţi normali vor conduce la zigoţi cu monosomie.

Aneuploidiile în mozaic sunt consecinţa unor erori de mitoză: nedisjuncţia cromatidiană şi întârzierea anafazică.

Efectul nedisjuncţiei cromatidiene este diferit în funcţie de celula afectată şi de cromosomul implicat. Afectarea diviziunii zigotului poate produce un mozaic de tip 47,XXX/45,X, doar dacă cromosomul implicat este cel X. Nedisjuncţia cromatidiană a altui cromosom va induce o trisomie omogenă, deoarece celulele monosomice vor fi eliminate. Afectarea diviziunii unei celule într-o etapă ulterioară de dezvoltare conduce la un mozaic de tip 47/46 (când este implicat un alt cromosom decât cromosomul X) sau la un mozaic de tip 47,XXX/46,XX/45,X sau 47,XXY/46,XY/45,X (când este implicat cromosomul X).

Întârzierea anafazică determină mozaicuri cromosomice de tip 46,XX/45,X sau 46,XY/45,X, deoarece implicarea unui autosom duce la celule monosomice neviabile.


70

Anomaliile numerice se împart în: poliploidii (prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide de cromosomi) şi aneuploidii (prezenţa în plus sau absenţa unuia sau mai multor cromosomi). Principalele aneuploidii sunt: trisomia (prezenţa unui cromosom suplimentar) şi monosomia (absenţa unuia dintre cromosomi).

Cauzele anomaliilor cromosomice numerice sunt puţin cunoscute, fiind semnalată însă asocierea cu vârsta maternă înaintată.

Mecanismul de producere al anomaliilor cromosomice numerice implică erori de meioză (poliploidii, aneuploidii) erori de fecundare (poliploidii) erori de mitoză (aneuploidii în mozaic).

C. ANOMALIILE DE STRUCTURĂ ALE CROMOSOMILOR

Anomaliile cromosomice structurale se caracterizează prin modificarea morfologiei şi a conţinutului genic normal al unuia sau mai multor cromosomi. Ele pot fi echilibrate (translocaţii, inversii) sau neechilibrate (deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici, isocromosomi).

Anomaliile cromosomice structurale sunt descrise folosind abrevierile din tabelul 5.2. Abrevierile se plasează înaintea cromosomului sau cromosomilor anormali, menţionaţi între paranteze. Dacă într-o anomalie de structură mai complexă (rearanjament cromosomic) sunt implicaţi mai mulţi cromosomi, ei vor fi înscrişi în paranteză în ordinea mărimii (exceptând cromosomii sexuali, care se vor scrie primii) şi se separă prin punct şi virgulă.

Tabelul 5.2. Simboluri utilizate pentru descrierea anomaliilor cromosomice (ISCN 1995)

SIMBOL DEFINIŢIE

de la ... până la ... : ruptură cromosomică :: ruptură urmată de reunirea segmentelor del deleţie dic cromosom dicentric dup duplicaţie i isocromosom ins inserţie inv inversie r cromosom inelar rob translocaţie Robertsoniană ("fuziune centrică") t translocaţie ter terminal, p ter = capătul braţului scurt; q ter = capătul braţului

lung. der Cromosom derivativ

Există două sisteme pentru descrierea anomaliilor structurale: prescurtat, în care natura rearanjamentului şi punctele de ruptură sunt identificate prin banda

sau regiunea în care se produc; detaliat, care, pe lângă identificarea tipului de rearanjament, defineşte fiecare cromosom

anormal după compoziţia sa în benzi.


71

1. CAUZELE ŞI MECANISMELE DE PRODUCERE ALE ANOMALIILOR CROMOSOMICE STRUCTURALE

Anomaliile cromosomice structurale sunt produse prin ruperea a unuia/doi cromosomi în unu/două puncte, urmată de reunirea captelor rupte (“adezive”) într-o nouă configuraţie, care generează un rearanjament cromosomic sau de pierderea unuia sau mai multor fragmente cromosomice. Ruperea se poate produce spontan (în anumite puncte “fragile” ale cromosomilor) sau poate rezulta sub acţiunea a diverşi agenţi mutageni din mediu (radiaţii ionizante, substanţe chimice, virusuri) numiţi şi clastogeni. Un alt mecanism este crossing-over-ul inegal determinat de împerecherea greşită a cromosomilor omologi în pahiten.

2. ANOMALII CROMOSOMICE STRUCTURALE ECHILIBRATE

Anomaliile cromosomice structurale echilibrate se caracterizează prin modificarea poziţiei unor segmente cromosomice, fără modificarea cantităţii totale de material genetic celular. Ele sunt de două tipuri: inversii şi translocaţii.

a. INVERSIILE

Inversiile, abreviate inv, sunt rearanjamente care afectează un singur cromosom şi se caracterizează prin modificarea (inversarea) poziţiei normale a unui segment cromosomic.

Inversiile rezultă prin ruperea cromosomului în două puncte, urmată de rotirea fragmentului intermediar cu 1800 şi reunirea fragmentelor. În funcţie de localizarea punctelor de ruptură, inversiile se clasifică în: paracentrice – dacă cele două puncte de ruptură sunt situate pe acelaşi braţ, iar fragmentul

rotit nu conţine centromerul (figura 5.2.a); pericentrice – dacă cele două puncte de ruptură sunt situate pe braţe diferite, iar fragmentul

rotit conţine centromerul (figura 5.2.b). Inversiile sunt greu de identificat în absenţa marcajului cromosomic, deoarece, în

general, nu modifică morfologia cromosomului implicat. Inversiile pericentrice de dimensiuni mai mari duc însă la schimbarea morfologiei şi la pierderea similitudinii între omologi.

a b Figura 5.2. Mecanismul inversiilor

a: inversie paracentrică; b: inversie pericentrică (după Emery, 1998)

În figura 5.3. este prezentat un exemplu de inversie (inversie paracentrică a cromosomului 7 – inv 7) vizualizată datorită marcajului în benzi.


72

Inversiile nu produc, de regulă, modificări fenotipice deoarece nu determină modificări ale cantităţii de material genetic, ci doar repoziţionarea unor gene în cromosom. Excepţiile apar când unul din punctele de ruptură este localizat în interiorul unei gene, ducând la modificarea distanţei dintre porţiunea centrală şi cea reglatoare a unei gene sau la disrupţia secvenţei codante. Inversiile pot produce grave probleme reproductive (sterilitate, avorturi spontane, naşterea unor copii plurimalformaţi) determinate de recombinarea intracromosomică în regiunea cu inversie. Datorită faptului că genele nu mai sunt poziţionate normal, sinapsa între cromosomii omologi nu se face corect (“genă la genă”) decât dacă cromosomul cu inversie formează o buclă la nivelul inversiei (figura 5.4.). Producerea unui crossing-over la acest nivel are consecinţe diferite în raport cu tipul de inversie. În cazul inversiilor paracentrice, prin crossing-over la nivelul zonei inversate rezultă doi cromosomi recombinanţi anormali: unul dicentric şi altul acentric (figura

5.4.a). Fragmentul acentric se pierde la următoare diviziune, deoarece este lipsit de centromer şi nu se poate ataşa la fusul de diviziune. Cromosomii dicentrici sunt instabili, iar supravieţuirea unui embrion cu un cromosom dicentric este improbabilă.

a b Figura 5.4. Mecanismul de formare a unor cromosomi recombinanţi neechilibraţi în

cazul inversiei paracentrice (a) şi al celei pericentrice (b) (după Emery, 1998)

Prin apariţia unui crossing-over la nivelul buclei de inversie, purtătorii de inversii pericentrice pot avea descendenţi anormali, cu anomalii cromosomice neechilibrate, ce

Figura 5.3. Inversie

paracentrică a cromosomului 7 (după Connor &

Ferguson Smith, 1998)


73

asociază duplicaţia unui segment (trisomie parţială) şi deleţia unui alt fragment cromosomic (monosomie parţială) (figura 5.4.b). Studiile efectuate au arătat că riscul unui purtător de inversie pericentrică de a avea un descendent afectat este de 1-10%, în funcţie de mărimea şi poziţia inversiei.

b. TRANSLOCAŢIILE

Prin translocaţie se înţelege transferul de segmente cromosomice între doi cromosomi. Există trei tipuri de translocaţii echilibrate: translocaţii reciproce, inserţii şi translocaţii prin fuziune centrică (Robertsoniene). TRANSLOCAŢII RECIPROCE Translocaţiile reciproce, abreviate t, implică schimbul reciproc de fragmente cromosomice între doi cromosomi neomologi, cu formarea a doi cromosomi derivativi. De exemplu, translocaţia reciprocă dintre cromosomii 3 şi 11 din figura 5.5. poate fi descrisă ca 46, XX, t(3q11qter;11p15pter). Mecanismul de formare al unei translocaţii reciproce implică ruperea (în cursul interfazei) a doi cromosomi neomologi, fiecare în câte un punct, urmată de schimbul reciproc

al fragmentelor acentrice şi realipirea fragmentelor rupte cu formarea cromosomilor derivativi (der). În cazul în care fragmentele schimbate au dimensiuni aproximativ egale, anomalia este imposibil de depistat prin colorarea uniformă a cromosomilor. Depistarea translocaţiilor reciproce se face însă cu mare acurateţe utilizând marcajul cromosomic de înaltă rezoluţie, cariotiparea spectrală sau tehnica FISH pentru translocaţii minime. Incidenţa translocaţiilor reciproce în populaţia generală este de aproximativ 1:200 - 1:500 de indivizi. De regulă, translocaţiile reciproce sunt specifice unei anumite familii. O translocaţie relativ frecventă este cea dintre braţele lungi ale cromosomilor 11 şi 22. Deoarece anomalia nu modifică cantitatea totală de material genetic, fenotipul purtătorilor de translocaţii reciproce nu este modificat24. În schimb, pot apărea tulburări de reproducere, determinate de segregarea cromosomilor derivativi în cursul meiozei I (figura 5.6. şi tabelul 5.3.) şi formarea de gameţi anormali.

Translocaţiile reciproce pot produce uneori blocarea spermatogenezei, astfel că bărbaţii purtători sunt sterili. Femeile purtătoare pot avea o fertilitate redusă, determinată de alterarea împerecherii cromosomilor omologi în

zigoten.

24 Cu excepţia cazurilor când produc disrupţia unei gene sau duc la formarea unor gene - himeră

3 der(3) der(11) 11 A B C D

Figura 5.5. Translocaţie reciprocă între cromosomii 3 şi 11 (după Thompson, 2001)


74

În cursul meiozei I, datorită translocaţiei, cromosomii omologi formează o sinapsă specială, numită cvadrivalent, cu aspect de cruce. În cadrul acestei structuri se produce alinierea regiunilor omologe ale cromosomilor implicaţi în translocaţie. În cursul anafazei I, când se produce segregarea cromosomilor omologi, cromosomii angajaţi în cvadrivalent pot urma trei căi de segregare: 2:2; 3:1; 4:0 (vezi tabelul 5.3.). Ultimele două căi, complet dezechilibrate, sunt foarte rare şi conduc la gameţi cu anomalii genetice majore. Segregarea 2:2 se poate face în trei moduri: alternativ, adiacent-1 şi adiacent-2. În cazul segregării alternative, cromosomii normali migrează la un pol al fusului de diviziune, la celălalt pol deplasându-se cromosomii cu translocaţie. Astfel, prin fecundarea acestor gameţi rezultă, fie zigoţi normali, fie zigoţi purtători ai translocaţiei echilibrate.

În segregarea adiacentă-1 centromerii neomologi segregă împreună, în timp ce în segregarea adiacentă-2 se produce segregarea împreună a centromerilor omologi. În ambele tipuri de segregare rezultă gameţi anormali, care prin fecundare vor conduce la zigoţi ce asociază trisomia parţială a unuia dintre cromosomi cu monosomia parţială a celuilalt cromosom.

În translocaţiile reciproce este foarte importantă calcularea riscului de apariţie a unor anomalii cromosomice la descendenţi. Deşi riscul teoretic este ridicat (50%) se consideră că riscul practic de apariţie a unor copii cu anomalii cromosomice neechilibrate este de 1-10%, dependent de tipul translocaţiei, deoarece majoritatea zigoţilor neechilibraţi sunt neviabili.

A C D B A D B C C D A B neechilibrat neechilibrat normal echilibrat neechilibrat neechilibrat ADIACENT-1 ALTERNATIV ADIACENT-2

Figura 5.6. Segregarea 2:2 a cromosomilor 3 şi 11 în cazul existenţei unei translocaţii t(3;11)(q12;p15.5) (după Thompson, 2001)

Tabelul 5.3. Tipuri de segregare a cromosomilor implicaţi în translocaţii reciproce

C A

B D


75

Tip de segregare Cromosomi segregaţi Embrion 2:2

Alternativ A + D normal B + C translocaţie echilibrată

Adiacent-1 A + C asociere de monosomie parţială şi trisomie parţială B + D

Adiacent-2 A + B asociere de monosomie parţială şi trisomie parţială

C + D 3:1

A + B + C A + B + D A + C + D B + C + D

Trisomie completă

D sau C sau B sau A Monosomie completă

INSERŢII

Inserţiile, abreviate ins, sunt translocaţii nereciproce, care implică transferul unui fragment cromosomic de pe un cromosom pe un cromosom neomolog. În figura 5.7. este prezentată inserţia ins(1;5)(q32;q11q22) în care un fragment din cromosomul 5 este translocat pe cromosomul 1.

1 ins(1) del(5) 5 1 ins(1) del(5) 5

Figura 5.7. Inserţie ins(1;5)(q32;q11q22)

Mecanismul de apariţie al anomaliei constă în ruperea a doi cromosomi neomologi, în trei puncte de ruptură, două situate pe un cromosom şi unul pe celălalt cromosom. Fragmentul liber al cromosomului cu două rupturi este transferat la nivelul punctului de ruptură al celui de-al doilea cromosom. Inserarea fragmentului translocat se poate realiza, fie în poziţie normală, fie inversat.

Anomalia nu modifică fenotipul purtătorului, dar poate conduce la tulburări de reproducere datorite segregării cromosomilor derivativi în cursul meiozei I. Astfel, un individ cu inserţie poate avea copii normali, copii purtători ai anomaliei echilibrate, copii cu monosomie parţială şi copii cu trisomie parţială.

TRANSLOCAŢII ROBERTSONIENE

Translocaţiile Robertsoniene, abreviate rob, reprezintă un tip special de anomalii echilibrate, deoarece afectează doar cromosomii acrocentrici. Ele sunt numite şi fuziuni centrice, deoarece se caracterizează prin “fuziunea” a doi cromosomi acrocentrici, omologi


76

sau neomologi, la nivelul centromerelor (figura 5.8.)25. La translocaţiile Robertsoniene pot participa toţi cromosomi acrocentrici, exceptând cromosomul Y.

Figura 5.8. Translocaţie Robertsoniană între un cromosom G şi un cromosom D

(după Emery, 1998)

Mecanismul de producere al anomaliei este reprezentat de ruperea a doi cromosomi acrocentrici la nivelul centromerelor sau foarte aproape de acestea pe braţele scurte, urmată de pierderea braţelor scurte şi unirea braţelor lungi într-un cromosom derivativ. Ca urmare se produce o modificare a numărului de cromosomi, care se reduce de la 46 la 45. În translocaţiile Robertsoniene echilibrate pierderea braţelor scurte ale cromosomilor implicaţi nu duce la modificarea fenotipului pacienţilor, deoarece braţele scurte ale tuturor acrocentricilor, cu excepţia cromosomului Y, conţin multiple copii ale genelor pentru ARN-ul ribosomal, gene care rămân într-un număr suficient de copii pe cromosomii acrocentrici normali.

Incidenţa globală a translocaţiilor Robertsoniene în populaţie este de aproximativ 1/1000 de indivizi. Cea mai frecventă translocaţie de acest tip este cea dintre cromosomii 13 şi 14 - rob(13q14q).

Translocaţiile Robertsoniene, deşi nu afectează fenotipul, pot produce grave probleme de reproducere, datorită segregării cromosomilor în cursul meiozei. Riscul de apariţie a unor descendenţi anormali este diferit în funcţie de tipul translocaţiei: între cromosomi omologi sau cromosomi neomologi.

În cazul unei translocaţii între cromosomi neomologi, de exemplu între cromosomii 14 şi 21 pot rezulta 6 tipuri de gameţi (figura 5.9.): trei viabili (normal, sănătos cu translocaţie Robertsoniană echilibrată sau disomie 21) şi trei neviabili (cu nulisomie 14, nulisomie 21 sau disomie 14). Fecundarea acestor gameţi cu un gamet normal va conduce la produşi de concepţie normali, cu translocaţie Robertsoniană echilibrată, cu sindrom Down, respectiv embrioni neviabili ce vor fi avortaţi (cu monosomie 14, monosomie 21 sau trisomie 14).

În cazul unei translocaţii Robertsoniene echilibrată (21q;21q) există un singur tip de segregare − 1:0 − care asigură formarea de gameţi cu disomie 21 sau nulisomie 21. Prin fecundare cu un gamet normal se pot forma doar două tipuri de zigoţi: cu trisomie 21 sau cu monosomie 21. Produşii de concepţie cu monosomie 21 nu sunt viabili şi sunt eliminaţi prin avort spontan, astfel încât un purtător de translocaţie Robertsoniană între cromosomii 21 poate avea doar copii anormali cu trisomie 21. Acest caz constituie una din puţinele situaţii în care riscul de recurenţă al unei afecţiuni genetice este de 100%.

25 În translocaţiile între cromosomi neomologi rezultă un cromosom dicentric cu centromere apropiate, iar în translocaţiile între cromosomi omologi apare un isocromosom de braţ lung.


77

Figura 5.9. Mecanismul de producere şi efectele reproductive ale unei translocaţii Robertsoniene, rob(14q21q)

(după Emery, 1998)

În funcţie de consecinţele fenotipice, anomaliile structurale sunt: echilibrate (fenotip normal) sau neechilibrate (fenotip anormal)

Mecanismul de producere implică rupturi cromosomice cu sau fără rearanjamente ale fragmentelor rupte.

Anomaliile structurale echilibrate se clasifică în: inversii şi translocaţii Inversiile, caracterizate prin modificarea poziţiei unui segment cromosomic, care

rămâne pe cromosomul de origine, se împart în inversii pericentrice şi paracentrice.

Translocaţiile, caracterizate prin modificarea poziţiei unor segmente cromosomice, ca urmare a transferului lor pe alţi cromosomi, se clasifică în: translocaţii reciproce, inserţii şi translocaţii Robertsoniene.

Anomaliile cromosomice echilibrate nu modifică fenotipul purtătorilor, dar produc tulburări de reproducere manifestate prin: sterilitate, infertilitate (avorturi spontane, nou-născuţi malformaţi morţi), naşterea de copii malformaţi vii.

Inversiile determină tulburări de reproducere datorită apariţiei unui crossing-over la nivelul buclei de inversie.

Translocaţiile se asociază cu tulburări de reproducere, datorită formării unor gameţi neechilibraţi prin segregarea cromosomilor cu translocaţie în cursul meiozei I.

3. ANOMALII CROMOSOMICE STRUCTURALE NEECHILIBRATE


78

Anomaliile cromosomice structurale neechilibrate se caracterizează printr-o modificare a cantităţii totale de material genetic, ceea ce induce o modificare a fenotipului persoanelor purtătoare ale anomaliei. Anomaliile structurale neechilibrate se împart în: deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici şi isocromosomi.

a. DELEŢIILE

Deleţiile, abreviate del, sunt anomalii cromosomice structurale neechilibrate caracterizate prin pierderea unui fragment cromosomic. Rezultatul acestei pierderi este apariţia unei monosomii parţiale. Deleţiile ce depăşesc 2% din cantitatea de material genetic al unui set haploid de cromosomi sunt letale.

Deoarece deleţiile care permit supravieţuirea sunt reduse ca dimensiuni, ele sunt greu de identificat prin analiza clasică, fără marcaj, a cromosomilor. Pentru evidenţierea deleţiilor este necesară, fie aplicarea marcajului cromosomic, de preferinţă de înaltă rezoluţie, fie folosirea unor sonde FISH pentru regiunea presupusă a fi absentă din cariotipul individului.

Din punct de vedere al localizării segmentului absent, deleţiile se clasifică în: deleţii terminale şi deleţii interstiţiale (figura 5.10.).

Deleţiile terminale rezultă prin ruperea unui cromosom într-un punct, urmată de pierderea fragmentului acentric.

Deleţiile interstiţiale sunt produse prin ruperea unui cromosom în două puncte situate pe acelaşi braţ, urmată de pierderea fragmentului interstiţial şi reunirea fragmentelor restante. O deleţie interstiţială localizată pe braţul scurt al cromosomului 3 este prezentată în figura 5.11. – del(3p22-p25).

Un alt mecanism de apariţie al deleţiilor îl constituie segregarea cromosomilor cu translocaţii echilibrate (figura 5.6.) sau inserţii în cursul meiozei I sau apariţia unei recombinări intracromosomice la nivelul unei inversii (crossing-over în bucla de inversie – figura 5.4.).

a b Figura 5.10. Tipuri de deleţii

a: deleţie terminală; b deleţie interstiţială (după Thompson 2001)

Figura 5.11. Deleţie interstiţială pe braţul scurt al cromosomului 3

Din punct de vedere al dimensiunilor, deleţiile se împart în deleţii microscopice şi

deleţii submicroscopice. Deleţiile microscopice pot fi observate prin tehnici de citogenetică cu marcaj

cromosomic. În practică cele mai frecvente deleţii sunt cele localizate pe braţele scurte ale cromosomilor 4 (sindromul Wolf Hirschhorn) şi 5 (sindromul cri du chat) şi cele de pe braţul lung al cromosomului 18.


79

Deleţiile submicroscopice sau microdeleţiile nu pot fi vizualizate decât prin tehnici de marcaj de înaltă rezoluţie sau prin tehnica FISH. Datorită perfecţionării tehnicilor de citogenetică a devenit posibilă stabilirea etiologiei cromosomice a numeroase sindroame malformative produse prin microdeleţii. Aceste sindroame au fost denumite şi sindroame ale genelor contigue, deoarece microdeleţia produce pierderea mai multor gene învecinate. Principalele sindroame cu microdeleţii sunt prezentate în tabelul 5.4.

Tabelul 5.4. Principalele sindroame produse prin microdeleţii

Sindrom Deleţie Manifestări clinice Sindrom Langer-Giedion (triho-rino-falangian)

del (8q24.1) multiple exostoze, aspect particular al nasului,păr subţire, anomalii falangiene

Sindrom “WAGR” del (11p13) tumoră Wilms, aniridie, displazie genito-urinară, retard mental

Sindrom Prader-Willi del(15q11-q13) hipotonie neonatală, retard mental, obezitate, dismorfie facială, acromicrie

Sindrom Angelman del (15q11-q13) retard mental, hipostatură, ataxie, crize de râs Sindrom Rubinstein-Taybi del (16p13.3) retard mental, hipostatură, police şi haluce late Sindrom Smith-Magenis del (17p11.2) retard mental, dismorfie, hiperactivitate,

automutilare Sindrom Miller-Dieker del (17p13.3) lisencefalie, retard mental, dismorfie facială Sindrom Alagille del (20p11-p12) colestază cronică, dismorfie facială,

anomalii vertebrale Sindrom DiGeorge şi Sindrom velo-cardio-facial

del (22q11.2) hipoplazia timusului şi paratiroidelor,malformaţii cardiace, dismorfie facială, retardmental, despicătură palatină

După Ch. Ledbetter, în Scriver’s “The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease”, 1996

b. DUPLICAŢIILE

Duplicaţiile, abreviate dup, sunt anomalii cromosomice structurale neechilibrate, caracterizate prin prezenţa pe unul dintre cromosomi a unui segment în dublu exemplar.

Consecinţa genotipică o reprezintă apariţia unei trisomii parţiale pentru segmentul cromosomic duplicat. Majoritatea duplicaţiilor sunt rezultatul unui crossing-over inegal între cromosomii omologi în cursul pahitenului, favorizat de prezenţa unor secvenţe similare de ADN repetitiv (figura 5.12.). Alte surse de trisomii parţiale sunt recombinarea intracromosomică la nivelul unei inversii şi segregarea cromosomilor în cazul unor translocaţii echilibrate. Cele mai frecvente duplicaţii sunt cele: dup12q, care produce sindromul Pallister şi 17q care determină boala Charcot – Marie - Tooth.

c. CROMOSOMII INELARI

Cromosomii inelari, notaţi cu r, sunt cromosomi caracterizaţi printr-o conformaţie circulară. Mecanismul de producere al acestei anomalii constă în ruperea unui cromosom în două puncte localizate pe braţe diferite, urmată de pierderea fragmentelor acentrice (terminale) şi

Figura 5.12. Mecanismul de

formare a unei duplicaţii prin crossing-over inegal



80

unirea capetelor fragmentului centric (figura 5.13.). Cromosomii inelari prezintă dificultăţi de segregare în cursul mitozei fiind astfel instabili. Datorită acestei particularităţi, frecvenţa cromosomilor inelari este redusă. Principalii cromosomi inelari întâlniţi în practica medicală sunt: r(X), r(21), r(18), r(22) şi r(15).

d. CROMOSOMII DICENTRICI

Cromosomii dicentrici, notaţi dic, sunt caracterizaţi prin prezenţa a două centromere. Mecanismul de formare implică o translocaţie neechilibrată, cu ruperea a doi cromosomi, fiecare în câte un punct, urmată de pierderea fragmentelor acentrice şi unirea fragmentelor centrice într-un cromosom derivativ. Consecinţa acestui proces este reducerea numărului de cromosomi din celulă de la 46 la 45.

Cromosomii dicentrici prezintă anomalii de ataşare la fibrele fusului de diviziune şi dificultăţi de segregare în cursul diviziunii, ceea ce induce pierderea lor. De regulă, unul din cei doi centromeri este inactivat, fiind posibilă transmiterea anomaliei în succesiunea generaţiilor celulare. Când ambele centromere rămân active, cromosomul este instabil şi dispare în timpul diviziunii datorită tracţiunii fibrelor fusului de diviziune.

e. ISOCROMOSOMII

Isocromosomii, notaţi cu i, sunt cromosomi anormali caracterizaţi prin prezenţa în dublu exemplar a unuia dintre braţe şi absenţa celuilalt braţ. Astfel, în cazul isocromosomilor există o asociere între duplicaţia unuia dintre braţe (trisomie parţială) şi deleţia celuilalt braţ (monosomie parţială) (figura 5.14.).

Isocromosomii rezultă prin clivarea transversală a centromerului, o eroare a mitozei. Astfel, rezultă un mozaic celular, o clonă având isocromosom de braţ scurt, iar cealaltă isocromosom de braţ lung. Deoarece monosomia unuia dintre braţe se caracterizează printr-un deficit major de material genetic, cei mai frecvenţi isocromosomi sunt i(Xq) şi i(Xp).

isocromosom de braţ lung

Figura 5.13. Mecanismul de formare al unui cromosom inelar (după Thompson, 2001)

Figura 5.14. Formarea unui isocromosom de braţ lung


Anomaliile structurale neechilibrate se caracterizează prin modificări cantitative ale materialului genetic, fiind clasificate în: deleţii (pierderea de fragmente cromosomice) duplicaţii (prezenţa în dublu exemplar a unui segment cromosomic) isocromosomi (cromosomi anormali formaţi din două braţe identice) cromosomi inelari (cromosomi anormali cu configuraţie circulară) şi cromosomi dicentrici (cromosomi anormali ce prezintă două centromere).


81

4. CONSECINŢELE ANOMALIILOR CROMOSOMICE NEECHILIBRATE

Anomaliile cromosomice, caracterizate prin modificări cantitative ale materialului genetic (anomalii numerice şi anomalii structurale neechilibrate) sunt anomalii de dozaj genic, deoarece efectele fenotipice ale acestora sunt consecinţa excesului sau absenţei uneia sau mai multor gene.

Indiferent de cromosomul afectat, toate anomaliile cromosomice neechilibrate viabile prezintă o serie de trăsături comune: tulburări de creştere şi dezvoltare pre- şi postnatală; retard psiho-motor; tulburări de reproducere, manifestate prin: sterilitate şi/sau infertilitate (avorturi repetate sau

naştere de copii plurimalformaţi morţi sau vii); sindrom plurimalformativ specific fiecărei anomalii în parte şi dermatoglife anormale;

Consecinţele anomaliilor cromosomice neechilibrate numerice şi structurale depind de mai mulţi factori: tipul anomaliei şi mărimea dezechilibrului genic; tipul cromosomului afectat (autosom sau gonosom) cantitatea de eucromatină şi heterocromatină a cromosomului; numărul de celule afectate.

Poliploidiile, producând o modificare majoră a cantităţii de material genetic, sunt incompatibile cu viaţa la specia umană, sarcinile cu făt poliploid încheindu-se prin avort spontan, de obicei în primul trimestru de sarcină26.

În cazul aneuploidiilor consecinţele fenotipice depind de tipul anomaliei. Pierderea de material genetic (monosomia) este mai gravă decât surplusul de material genetic (trisomia). Monosomiile, exceptând o mică parte din cazurile cu monosomie X, sunt letale la specia umană, conducând la avort spontan. În cazul trisomiilor, consecinţele fenotipice depind de tipul cromosomului implicat. Astfel, trisomiile cromosomilor mari sau a celor bogaţi în eucromatină sunt letale, în timp ce trisomiile cromosomilor mici sau a celor bogaţi în heterocromatină permit supravieţuirea produsului de concepţie, dar acesta va prezenta multiple malformaţii, ca urmare a alterării dozajului genic. Studiile produşilor de avort spontan au relevat prezenţa tuturor trisomiilor, exceptând trisomia 1. Singurele trisomii autosomale complete viabile sunt trisomiile: 21, 18, 13 şi 8 (în cazul ultimei de cele mai multe ori fiind prezentă o anomalie în mozaic).

Pe de altă parte, aneuploidiile autosomale sunt mai grave decât cele gonosomale. Acest fapt este determinat de două particularităţi ale gonosomilor: cromosomul Y conţine puţine gene şi multă heterocromatină, inactivă genetic, iar prezenţa a

doi cromosomi Y nu modifică major fenotipul persoanei afectate; cromosomii X suplimentari se inactivează aproape în întregime, astfel încât prezenţa lor

suplimentară nu modifică fenotipul în aceeaşi măsură ca şi trisomiile autosomale; această caracteristică a cromosomului X ar putea explica şi viabilitatea monosomiei X.

Un alt factor care influenţează fenotipul clinic al aneuploidiilor este numărul de celule afectate. Astfel, anomaliile omogene sunt mult mai grave decât anomaliile în mozaic, ultimele producând modificări cu atât mai mici, cu cât numărul de celule afectate este mai redus.

26 Rareori sarcinile triploide ajung la termen (de obicei când placenta este diploidă) şi se soldează cu naşterea de copii plurimalformaţi, care decedează în perioada neonatală.


82

Mozaicurile cromosomice produse în primele etape ale embriogenezei (prin erori mitotice sau prin “corecţia” unei trisomii iniţiale) au efecte fenotipice grave, deoarece numărul de celule anormale este mare, iar fenotipul nu este mult diferit de cel al anomaliei omogene. De exemplu, în sindromul Down fenotipul în trisomia 21 omogenă nu se deosebeşte semnificativ de cel identificat în trisomia 21 în mozaic. În schimb, mozaicurile cromosomice produse târziu în cursul ontogenezei sau cele postnatale au efecte fenotipice reduse sau chiar absente, de cele mai multe ori mozaicul fiind limitat la un singur ţesut.

Mozaicurile cromosomice somatice se asociază uneori cu diverse forme de cancer sau cu o degenerescenţă precoce a ţesutului afectat, în timp ce mozaicurile germinale pot cauza diverse tulburări de reproducere, datorită transmiterii anomaliei la descendenţi.

Mozaicurile cromosomice aneuploide sunt rare, deoarece atât monosomia cât şi polisomiile autosomale sunt letale. În schimb, mozaicurile ce implică anomalii structurale (monosomii parţiale sau trisomii parţiale) pot fi detectate în condiţiile în care dezechilibrul genic nu este foarte important.

Consecinţele fenotipice ale anomaliilor cromosomice, produse prin erori ale dozajului genic (anomalii numerice şi anomalii structurale neechilibrate) depind de tipul anomaliei, tipul cromosomului implicat, numărul de celule modificate şi localizarea lor tisulară.

Prezenţa unui dezechilibru genic important este incompatibilă cu supravieţuirea, determinând pierderea produsului de concepţie (avort spontan precoce sau naştere de copii morţi plurimalformaţi).

Aneuploidiile şi anomaliile structurale neechilibrate viabile prezintă aspecte comune: retard de creştere şi dezvoltare, sindrom malformativ caracteristic fiecărei anomalii în parte, debilitate mintală, tulburări de reproducere.

5. DISOMIILE UNIPARENTALE

Disomiile uniparentale sunt anomalii cromosomice caracterizate prin prezenţa unei perechi de cromosomi moştenite de la acelaşi genitor.

Mecanismul de producere al disomiilor uniparentale implică procese de corecţie (“salvare”) a unor aneuploidii omogene în primele etape ale embriogenezei. În cazul monosomiei, aceasta poate fi salvată prin duplicarea cromosomului implicat, rezultând obligatoriu o disomie uniparentală. În cazul trisomiei, corecţia constă în eliminarea unuia dintre cei trei cromosomi omologi, existând o probabilitate de 1/3 de apariţie a unei disomii uniparentale prin eliminarea cromosomului provenit de la unul din genitori.

Un exemplu de corecţie a unei trisomii 15 este prezentat în figura 5.15. În trisomia 15 de origine paternă pierderea cromosomului 15 de origine maternă determină sindrom Angelman. În trisomia 15 de origine maternă pierderea cromosomului 15 de origine paternă determină sindrom Prader-Willi.

Teoretic, pot exista disomii uniparentale pentru toţi cromosomii umani. Până la ora actuală au fost identificate 23 de disomii uniparentale, dintre care următoarele au implicaţii patologice: 15q paternă (sindrom Angelman) 15q maternă (sindrom Prader-Willi) 11p paternă (sindrom Beckwith-Wiedemann) 6 maternă (diabetul zaharat tranzitoriu al nou-născutului) şi 7 maternă (sindrom Silver – Russell).

Implicaţiile patologice ale disomiilor uniparentale sunt consecinţa unui fenomen recent identificat, numit amprentare genetică (gametică sau parentală). Meioza maternă


83

Figura 5.15. Mecanismul de producere al disomiei uniparentale 15

a – disomie uniparentală maternă 15 – sindrom Prader Willi; b – disomie uniparentală paternă 15 – sindrom Angelman

Genomurile parentale nu sunt echivalente funcţional. La nivelul anumitor loci se exprimă fenotipic, fie alela de origine maternă, fie cea de origine paternă (cea de a doua alelă fiind inactivă). Amprentarea gametică se produce în spermatogeneză sau ovogeneză şi constă


84

în marcarea specifică a anumitor gene localizate pe unii cromosomi. Procesul are două etape: ştergerea amprentării moştenite de la părinţi şi introducerea noii amprentări caracteristice sexului individului respectiv.

Zigotul rezultat în urma fecundării gameţilor va moşteni două genomuri parentale marcate specific şi diferite funcţional. Marcarea acestor gene (de regulă implicate în embriogeneză) constă fie în inactivarea prin metilare a uneia dintre alele, fie în modificarea regiunii reglatoare a uneia dintre alele.

Amprentarea genetică este responsabilă de imposibilitatea partenogenezei la mamifere (obţinerea de organisme diploide prin duplicarea informaţiei genetice a unui singur gamet).

Principalele regiuni cromosomice amprentate la om sunt: 15q11-13 şi 11p15.5. La nivelul regiunii 15q11-13 există un centru de control al amprentării, gene amprentate matern şi gene amprentate patern, anomaliile cromosomice ale acestei regiuni fiind implicate în sindroamele Angelman şi Prader-Willi (tabelul 5.5.).

La nivelul regiunii 11p15.5, implicată în sindromul Beckwith-Wiedemann, au fost identificate un centru de control al amprentării, gene amprentate matern (H19 şi p57KIP2) şi gene amprentate patern (IGF2).

Tabelul 5.5. Caracteristicile sindroamelor Prader-Willi şi Angelman

Sindrom Prader Willi Sindrom Angelman Anomalie cromosomică

deleţie paternă 15q11-13 (70%); disomie uniparentală maternă (25%); anomalie a centrului de amprentare

(5%)

deleţie maternă 15q11-13 (95%); disomie uniparentală paternă (2%); anomalie a centrului de amprentare

(3%) Gene implicate SNRPN Ligaza ubiquitinei Particularităţi clinice

hipotonie neonatală; hipogonadism; bulimie; obezitate; retard mental mediu; hipopigmentare; tulburări de comportament

retard mental sever; crize comiţiale; crize incontrolabile de râs; mişcări ataxice

Disomiile uniparentale sunt anomalii cromosomice determinate de prezenţa unei perechi de cromosomi moştenite de la acelaşi genitor, iar consecinţele lor fenotipice sunt rezultatul amprentării genomice.

D. SINDROAME CROMOSOMICE

1. SINDROMUL DOWN

Sindromul Down este consecinţa fenotipică a trisomiei 21. El a fost descris de John Langdon Down în 1866, iar substratul genetic al bolii a fost stabilit de Lejeune, care a asociat sindromul Down cu prezenţa în celule a trei cromosomi 21.

Incidenţa trisomiei 21 este estimată la 1:650 nou-născuţi vii (1,5‰). Boala este mai frecventă la copiii de sex masculin, raportul sexelor fiind de 3 băieţi : 2 fete.

Factorii etiologici care determină trisomia 21 nu sunt cunoscuţi, dar există numeroase date care incriminează: vârsta maternă avansată în momentul concepţiei pentru trisomiile libere şi prezenţa la unul dintre părinţi a unei translocaţiii Robertsoniene echilibrate ce implică un cromosom 21, pentru trisomia 21 prin translocaţie.


85

Simptomatologia clinică diferă în funcţie de vârsta la care este examinat pacientul. La nou-născut, trisomia 21 trebuie suspectată în prezenţa următoarelor semne clinice:

lungime şi greutate mică, hipotonie musculară, dismorfie facială - fante palpebrale oblice în sus şi în afară (mongoloide), nas mic cu narine anteversate, protruzie linguală (datorită gurii mici) gât scurt, cu exces de piele pe ceafă, mâini scurte şi late, cu brahidactilie, clinodactilie a degetului V pliu palmar transvers unic (pliu simian) şi malformaţii viscerale (atrezie duodenală, imperforaţie anală, defecte cardiace) (figura 5.16.).

La sugar şi copilul mic fenotipul de sindrom Down este caracterizat prin: talie şi greutate sub media vârstei, hipotonie musculară, hiporeflexie nervoasă, hiperlaxitate articulară, brahicefalie, dismorfie facială, anomalii ale membrelor şi malformaţii viscerale. Dismorfia facială se caracterizează prin fante palpebrale mongoloide, iris pestriţ (pete Brushfield) epicantus (pliu cutanat ce acoperă unghiul intern al ochiului) nas turtit, hipoplazia etajului mijlociu al feţei, limbă protruzionată.

Figura 5.16. Fenotip de sindrom Down la sugar

La nivelul membrelor se remarcă brahidactilie, clinodactilia auricularului, dermatoglife anormale (pliu simian, exces de bucle cubitale, triradius axial situat distal) spaţiul interdigital I larg la picior. Malformaţiile cardiace cu şunt dreapta stânga (defect septal ventricular sau atrial) produc cianoză (coloraţie violacee a tegumentelor şi mucoaselor indusă de deficitul de oxigenare a ţesuturilor) (tabelul 5.6., figura 5.17.).

Nici unul din aceste semne nu este relevant luat separat, ci doar în asociere cu celelalte semne. La sugar diagnosticul clinic de sindrom Down este certificat de prezenţa a cel puţin 6 din semnele din tabelul 5.6.

La adult semnele clinice relevante pentru diagnosticul sindromului Down sunt: retard mental sever, hipostatură, obezitate, fante palpebrale mongoloide, pete Brushfield (pete de culoare maronie localizate pe iris) buze groase şi eversate, limbă plicaturată, brahicefalie, microtie, gât scurt (figurile 5.18., 5.19.).

Tabelul 5.6. Semnele cardinale pentru diagnosticul de sindrom Down în perioada neonatală şi de sugar (după Hall, 1966)

Semne Frecvenţă (%) Reflex Moro redus 85 Hipotonie musculară 80


86

Profil facial plat 90 Fante palpebrale oblice în sus şi în afară 80 Urechi mici, rotunde, jos situate 60 Exces de piele pe ceafă 80 Pliu simian 45 Hiperlaxitate articulară 80 Modificări morfologice pelvine la examenul radiografic 70 Hipoplazia falangei mijlocii a auricularului 60

Figura 5.17. Aspectul dermatoglifelor în sindromul Down

(după Thompson 2001)

Figura 5.18. Aspectul regiunii oculare în

sindromul Down Figura 5.19. Fenotip de sindrom

Down la adult în vârstă

În sindromul Down ritmul de creştere este redus, ceea ce induce hipostatură, caracterizată prin prezenţa unei deviaţii de minimum –2 DS faţă de media normală a vârstei. Talia maximă a pacienţilor cu sindrom Down este de 140 – 160 cm.

Trisomia 21 determină un retard mental sever şi tulburări de limbaj. Coeficientul de inteligenţă (QI) al persoanelor afectate variază între 20 şi 85. Un bolnav cu sindrom Down poate acumula un nivel maxim de cunoştinţe comparabil cu cel al unui copil normal cu vârsta

Pliu simian

Bucle cubitale

Triradius axial în poziţie distală


87

între 6 şi 8 ani. După vârsta de 30-35 de ani există o descreştere marcată a funcţiilor cognitive, similară cu cea din boala Alzheimer.

Pacienţii cu sindrom Down prezintă tulburări senzoriale, în special auditive şi vizuale. Reducerea bilaterală a acuităţii auditive până la surditate afectează 50-75% din pacienţi. Anomaliile oculare sunt împărţite în două categorii: minore (epicantus, fante palpebrale mongoloide sau pete Brushfield) şi majore (cataractă congenitală sau strabism).

Analiza citogenetică este esenţială pentru diagnosticul etiologic şi poate releva unul din următoarele cariotipuri: trisomie 21 liberă omogenă (47,XX,+21 sau 47,XY,+21) prezentă la 92% dintre pacienţi,

cromosomul suplimentar fiind de origine maternă în 80% din cazuri; translocaţie Robertsoniană neechilibrată între cromosomi omologi, de exemplu între cromosomii

21 [46,XY,-21,rob(21q21q)] sau neomologi, de exemplu între cromosomii 14 şi 21 [46,XX,-14,rob(14q21q)]; acest tip de anomalie poate fi observat în 5% din cazuri;

mozaic cromosomic de tip 47/46 (47,XY,+21 /46,XY) prezent la 3% din pacienţi trisomie 21 parţială <0,1%. Sindromul Down poate fi depistat prenatal, folosind testul triplu (dozarea α-fetoproteinei [valoare scăzută], gonadotrofinei corionice umane [valoare crescută] şi a estriolului neconjugat [valoare scăzută] în sângele matern) şi/sau ecografia fetală (edem al cefei în primele luni de sarcină şi scurtarea femurului în a doua parte a sarcinii). Confirmarea diagnosticului necesită examen citogenetic pe amniocite sau vilozităţi coriale. În sindromul Down prognosticul vital este rezervat. Dintre pacienţii cu sindrom Down 25-30% mor în primul an, 50% în primii 5 şi numai 2-6% supravieţuiesc peste vârsta de 50 ani. Bărbaţii sunt sterili, în timp ce femeile pot fi uneori fertile, având copii normali. Cauzele de deces sunt: malformaţiile cardiace, infecţiile respiratorii şi leucemiile acute, mai ales cele limfoblastice.

Riscul de recurenţă al sindromului Down este dependent de tipul de trisomie 21, fiind nesemnificativ în trisomiile prin mozaic (<0,1%) redus în trisomia 21 liberă omogenă (aproximativ 1%) moderat în trisomia 21 prin translocaţie Robertsoniană între cromosomi neomologi (10%) şi total în trisomia 21 prin translocaţie Robertsoniană între cromosomi omologi (100%) (vezi capitolul Sfatul genetic).

Sindromul Down, determinat de trisomia 21, reprezintă cea mai frecventă boală genetică, afectând aproximativ 1/650 de nou-născuţi.

Pacienţii cu sindrom Down prezintă un fenotip anormal caracterizat prin: hipostatură, dismorfie craniofacială, anomalii digitale, dermatoglife anormale, malformaţii viscerale şi retard mental profund.

Sindromul Down poate fi determinat de: trisomia 21 liberă omogenă, trisomia 21 în mozaic, trisomia 21 prin translocaţie Robertsoniană neechilibrată şi trisomia 21 parţială.

2. SINDROMUL EDWARDS

Sindromul Edwards este consecinţa fenotipică a trisomiei 18. El are o incidenţă de aproximativ 1/5000-8000 de naşteri, cu afectare preponderentă a nou-născuţilor de sex feminin. Speranţa de viaţă este foarte mică, 71% din copii murind în primele 6 luni de viaţă, iar restul în primul an. Fenotipul se caracterizează prin: dolicocefalie cu occiput proeminent, dismorfie facială cu frunte teşită, microretrognatism, implantare joasă a urechilor, cu hipoplazia părţii anterioare ("urechi de faun") stern scurt, mâini cu degete flectate, încălecate, unghii


88

hipoplazice, dermatoglife anormale (exces de arcuri, pliu simian) picioare în piolet. Frecvent există malformaţii cardiace, cerebrale, hernii, sindrom de regresie caudală (figura 5.20.).

Cariotipul certifică diagnosticul, de obicei fiind depistat un mozaic 46,XX (XY)/ 47,XX (XY),+18. Rareori este identificată o trisomie omogenă (47,XX (XY), +18).

Figura 5.20. Fenotip de trisomie 18

3. SINDROMUL PATAU

Sindromul Patau este determinat de trisomia 13 şi are o incidenţă de 1/5000-10000 de naşteri, speranţa de viaţă variind de la câteva zile la câteva luni.

Sindromul malformativ se caracterizează prin: holoprozencefalie, defect de scalp, polidactilie, unghii înguste şi convexe (figura 5.23.). Holoprozencefalia este un defect al liniei mediene, afectând creierul (un singur emisfer cerebral, agenezie de corp calos, ventricul cerebral unic) structurile oculare (microftalmie/ anoftalmie) şi mugurele frontal (modificările pot fi severe cu ciclopie şi proboscis sau hipotelorism şi despicătură velo-palatină mediană sau minore cu hipotelorism şi incisiv superior central unic).

Cariotipul poate releva: o trisomie liberă omogenă - 47,XX,+13 sau 47,XY, +13 (75%). trisomie 13 prin translocaţie Robertsonienă neechilibrată – 46,XX(XY),-14,rob(13,14) sau

46,XX(XY),-13,rob(13,13).

4. TRISOMIA 8

Trisomia 8 are o incidenţă foarte mică, în jurul a 1/30.000 de nou-născuţi, de obicei fiind prezente mozaicuri cromosomice, aspect ce reflectă originea postzigotică a anomaliei. Speranţa de viaţă este cvasinormală.

Sindromul malformativ, determinat de trisomia 8, este caracterizat prin: dismorfie facială cu enoftalmie, buze groase, urechi proeminente, anomalii scheletice (scolioză, hemivertebre supranumerare, bazin îngust) anchiloze la nivelul articulaţiilor mâinilor şi picioarelor (camptodactilie). La sugar palmele şi plantele au un aspect caracteristic “capitonat”. Frecvene se asociază anomalii cardiace şi retard mental moderat, cu tulburări de vorbire (figura 5.22.).


89



5. SINDROMUL CRI DU CHAT

Sindromul “cri du chat” este determinat de monosomia parţială 5p. Denumirea sindromului derivă din particularitatea plânsului copiilor afectaţi, asemănător cu mieunatul unui pisoi (datorat hipoplaziei laringelui). La sugar semnele clinice sunt: plâns caracteristic, microcefalie, dismorfie cranio-facială cu facies rotund şi hipertelorism. La copilul mare şi adult dismorfia facială include facies îngust, micrognaţie şi ştergerea unghiului mandibular. Pacienţii prezintă un retard mental sever (QI =20) (figura 5.23.).

Analiza moleculară şi cea citogenetică de înaltă rezoluţie au relevat că majoritatea semnelor fenotipice sunt determinate de deleţia unei benzi cromosomice, localizate în regiunea 5p15.


90

a b

Figura 5.23. Fenotip caracteristic monosomiei 5p- a: sugar; b: copil

6. SINDROMUL WOLF-HIRSCHHORN

Sindromul Wolf-Hirschhorn, determinat de monosomia 4p-, este o anomalie rară, cu o incidenţă de circa 1/50.000 de naşteri. Fenotipul se caracterizează prin: hipotrofie staturo-ponderală marcată, dismorfie cranio-facială, anomalii cardiace şi retard mental sever. Dismorfia cranio-facială include: microcefalie, hipertelorism, rădăcină nazală lărgită ce conferă aspectul pătrat al nasului (aspect de “cască de luptător grec”) şi anomalii auriculare (urechi jos inserate, helix plat, sinus preauricular) (figura 5.24.).

a b

Figura 5.24. a: fenotip caracteristic monosomiei 4p-; b: cască de luptător grec

Malformaţiile cardiace sunt grave, fiind reprezentate, de obicei, de defecte de închidere a septurilor interatrial sau interventricular. Retardul mental este profund, coeficentul de inteligenţă fiind inferior valorii de 20.

Regiunea critică, a cărei deleţie produce fenotipul caracteristic este localizată în regiunea 4p16 şi poate fi analizată prin tehnici citogenetice de înaltă rezoluţie sau FISH.

7. SINDROMUL TURNER


91

Sindromul Turner este determinat de monosomia X, singura monosomie viabilă la specia umană. Boala afectează aproximativ 1/2500 din nou-născuţii de sex feminin.

Sindromul Turner poate fi diagnosticat clinic încă de la naştere, aspect foarte important pentru asigurarea unei terapii adecvate. Diagnosticul clinic este sugerat de următoarele semne: copil de sex feminin, lungime mai mică decât normal, limfedem (dur, nedureros, tranzitoriu) la nivelul mâinilor şi picioarelor, gât scurt, cu exces de piele pe ceafă şi/sau pterygium coli (pliu cutanat pe feţele laterale ale gâtului) şi distanţă intermamelonară mare (figura 5.25.).

a b

c

Figura 5.25. Aspect fenotipic caracteristic în sindromul Turner la nou-născut a – gât scurt; b – limfedem al picioarelor; c – exces de piele pe ceafă

Prepubertar, diagnosticul clinic se bazează pe existenţa unui retard major de creştere ( -3 DS) iar postpubertar pe asocierea hipostatură – amenoree primară, caractere sexuale secundare feminine deficitare.

Postpubertar la hipostatură se adaugă semnele determinate de disgenezia gonadică, caracterizată prin înlocuirea ovarelor cu bandelete fibroase. Ovarele disgenetice nu produc nici ovule şi nici hormoni sexuali, pacientele prezentând amenoree primară (absenţa ciclurilor menstruale) sterilitate primară şi dezvoltare insuficientă a caracterelor sexuale secundare feminine: glande mamare puţin dezvoltate, pilozitate axilară absentă, pilozitate pubiană redusă. Organele genitale externe au aspect infantil, iar uterul este hipoplazic.

În sindromul Turner există o dismorfie cranio-facială necaracteristică, manifestată prin: aspect matur al feţei, facies triunghiular, epicantus, fante palpebrale antimongoloide, palat înalt, anomalii dentare. Pacientele pot avea deficite auditive prin anomalii ale urechii interne.


92

Alte semne ce pot fi identificate la pacientele cu sindrom Turner sunt: linia joasă de inserţie a părului pe ceafă, terminată în trident, diametrul biacromial mai mare decât cel bitrohanterian, cubitus valgus (axul antebraţului face un unghi obtuz deschis în afară cu axul humerusului) scurtarea metacarpianului IV, unghii convexe hipoplazice, prezenţa unor numeroşi nevi pigmentari (figura 5.26.). În 30-40% din cazuri pot fi identificate malformaţii congenitale cardiace sau renale.

a b c

d e Figura 5.26. Caracteristici fenotipice în sindromul Turner

a: hipostatură, cubitus valgus, glande mamare slab dezvoltate; b: cifoscolioză; c: gât palmat (pterigyum coli) d: inserţie joasă a părului pe ceafă; e: unghii hipoplazice

Dermatoglifele sunt anormale: triradius axial în poziţie distală (t’ sau t”) şi suma crestelor digitale (SCD) mai mare decât media la sexul feminin.

Inteligenţa este normală sau la limita inferioară a normalului, cu o scădere în special a percepţiei spaţiale şi capacităţii de abstractizere.

Diagnosticul paraclinic se bazează pe investigaţiile citogenetice şi pe dozări hormonale care precizează existenţa unui hipogonadism hipergonadotrop.

Testul cromatinei X este negativ în monosomia omogenă şi pozitiv (cu valori reduse) în monosomia în mozaic sau în monosomiile parţiale prin anomalii structurale. În prezenţa de isocromosomi X de braţ scurt, a unor deleţii sau cromosomi inelari X corpusculul Barr este mai mic (aproximativ 0,7μm), în timp ce prezenţa unui isocromosom X de braţ lung se asociază cu un corpuscul Barr mai mare (aproximativ 1,2μm).


93

Examenul cromosomic este esenţial pentru stabilirea diagnosticului de certitudine. Cariotipul poate releva: monosomie omogenă, monosomie în mozaic sau anomalii de structură ale cromosomului X (deleţii, isocromosomi, cromosomi inelari) (tabelul 5.7.).

Tabelul 5.8. Anomalii cromosomice în sindromul Turner

Anomalie Cariotip Cromatină X Incidenţă (%) monosomie omogenă 45,X Negativă 65 monosomie în mozaic 46,XX/45,X

47,XXX/46,XX/45,X Pozitivă în procente scăzute

12

deleţie 46,X, delXp 46,X, delXq

Normală dar corpusculi Barr mai mici

6

isocromosom 46,X, i(Xp) 46,X, i(Xq)

Normală dar corpusculi Barr mai mici sau mai mari

11

cromosom inelar 46,X, r(X) Normală dar corpusculi Barr mai mici

6

Analizele moleculare au indicat că absenţa braţului scurt al cromosomului X determină hipostatura şi malformaţiile congenitale, în timp ce deleţia braţului lung al cromosomului X produce disfuncţia gonadică.

Nivelurile estrogenilor şi progesteronului sunt scăzute, în timp ce gonadotrofinele hipofizare (FSH şi LH) prezintă un nivel crescut.

Tratamentul sindromului Turner este diferenţiat în raport cu vârsta la care sunt diagnosticate pacientele. Prepubertar, tratamentul constă în administrarea cât mai precoce a hormonului de creştere pentru stimularea creşterii în înălţime. După vârsta normală de debut a pubertăţii se administrează hormoni sexuali feminini, cu scopul de inducere a ciclurilor artificiale şi de stimulare a sexualizării feminine.

Prognosticul vital este favorabil, speranţa de viaţă şi inteligenţa fiind normale, dar asociate cu sterilitate primară şi definitivă.

Monosomia X determină sindromul Turner, caracterizat prin: hipostatură, disgenezie ovariană cu tulburări de sexualizare feminină şi uşoară dismorfie cranio-facială.

Principalele aspecte citogenetice prezente în monosomia X sunt: cromatină X negativă şi monosomie X omogenă; cromatină X pozitivă în procente mici şi monosomie X în mozaic; cromatină X pozitivă în procente normale, dar cu corpuscul Barr anormal şi monosomie X parţială prin anomalii structurale neechilibrate ale cromosomului X

8. SINDROMUL KLINEFELTER

Sindromul Klinefelter este consecinţa fenotipică a trisomiei gonosomale XXY şi afectează aproximativ 1/1000 din nou-născuţii de sex masculin.

În copilărie sindromul Klinefelter poate fi suspectat în prezenţa unei staturi înalte, a aspectului gracil, a micropenisului şi a dificultăţilor de adaptare şcolară.


94

Principalele semne clinice evidente postpubertar sunt: statura înaltă, asocierea între microorhidie (testiculi mici) şi penis normal (disociaţie peno-orhitică), sterilitate masculină şi

inadaptabilitate socială. Majoritatea pacienţilor cu trisomie XXY prezintă o sexualizare masculină deficitară, determinată de disgenezia gonadică. Înlocuirea celulelor Sertoli şi Leydig cu ţesut fibros, determină absenţa secreţiei de testosteron, azoospermie şi hipoplazie testiculară. În absenţa testosteronului, caracterele sexuale secundare sunt slab dezvoltate: pilozitatea facială, axilară şi tronculară sunt absente, pilozitatea pubiană este redusă şi are aspect ginoid (triunghi cu vârful în jos), corpul are conformaţie de tip feminin, vocea este înaltă, iar adipozitatea are o dispoziţie de tip ginoid (figura 5.27.). O altă particularitate fenotipică este prezenţa ginecomastiei (dezvoltarea glandelor mamare la un individ de sex masculin)27. Dermatoglifele sunt caracterizate prin: triradius axial în poziţie distală (t’ sau t”) şi suma crestelor digitale (SCD) mai mică decât media sexului masculin. Dezvoltarea intelectuală este aproape normală, dar pacienţii cu sindrom Klinefelter prezintă tulburări de învăţare, determinate de dislexie. În schimb, prezenţa unui număr crescut de cromosomi X se asociază cu retard intelectual. Diagnosticul de certitudine este asigurat de analizele citogenetice. Testul cromatinei sexuale X şi testul cromatinei sexuale Y sunt pozitive. Cariotipul relevă în 85% din cazuri o trisomie liberă omogenă (47,XXY). În circa 15% din cazuri este prezent un mozaic cromosomic: 46,XY/47,XXY. Mai rar pot fi prezente şi alte formule cromosomice (46,XY/48,XXXY;

45,X/46,XY/47,XXY; 47,XXY/48,XXXY). Nivelul testosteronului este scăzut, în timp ce hormonii gonadotropi (FSH şi LH) au valori crescute. Tratamentul se aplică numai postpubertar şi constă în administrare de hormoni sexuali masculini, cu scopul de inducere a dezvoltării caracterelor sexuale secundare masculine. În general, ginecomastia nu răspunde la tratament hormonal, ci necesită tratament chirurgical, întrucât se însoţeste de creşterea riscului de cancer mamar.

27 Ginecomastia este secundară. Absenţa testosteronului şi nivelurile crescute ale gonadotropilor hipofizari stimulează corticosuprarenala care produce androgeni slabi aromatizabili. Metabolizarea acestora în ficat generează estrogeni care stimulează dezvoltarea glandelor mamare.

Figura 5.27. Fenotip de sindrom

Klinefelter


95

Prognosticul vital şi intelectual sunt favorabile, dar pacienţii cu sindrom Klinefelter prezintă sterilitate primară şi definitivă.

Trisomia XXY determină sindromul Klinefelter, caracterizat prin: statură înaltă, disgenezie testiculară, sterilitate, tulburări de sexualizare masculină.

Explorările citogenetice aplicate în sindromul Klinefelter relevă: cromatină X şi Y pozitive, respectiv cariotip anormal (trisomie XXY omogenă sau în mozaic).

9. SINDROMUL TRIPLO X

Trisomia X determină un fenotip polimorf, fără modificări majore caracteristice. Diagnosticul clinic, în general dificil, este sugerat de următoarele semne: talie şi

coeficient de inteligenţă la limita inferioară a normalului, dismorfie facială necaracteristică (facies rotund cu fante mongoloide) tulburări menstruale şi de reproducere, inadaptabilitate socială.

Cel mai frecvent pacientele adulte sunt diagnosticate datorită unor tulburări menstruale (menarhă precoce, cicluri neregulate, menopauză precoce) sau a unor tulburări de reproducere (sterilitate sau avorturi spontane repetate). Femeile cu trisomie X au de obicei copii normali, dar uneori pot avea copii cu trisomie X sau trisomie XXY.

Explorările citogenetice care precizează diagnosticul sunt: testul cromatinei sexuale şi cariotipul. Cromatina X este pozitivă, fiind evidenţiaţi doi corpusculi Barr. Cariotipul poate releva o trisomie X omogenă (47,XXX) sau o trisomie în mozaic (46,XX/47,XXX sau 45,X/46,XX/47,XXX).

10. SINDROMUL DUBLU Y

Trisomia XYY este relativ frecventă, dar diagnosticul citogenetic este rareori stabilit datorită modificărilor fenotipice minore pe care le determină. Fenotipul se caracterizează prin talie înaltă, dezvoltare intelectuală normală, dar cu labilitate psihică şi comportament agresiv. Uneori sunt prezente tulburări de spermatogeneză, care induc hipofertilitate.

Examenele citogenetice relevă: testul cromatinei X negativ, testul cromatinei Y pozitiv, cu doi corpusculi F, cariotipul fiind 47,XYY.

11. SINDROMUL X FRAGIL

Sindromul X-fragil, numit şi Martin-Bell, este cea mai frecventă formă de retard mental legat de cromosomul X (1/2 – 1/3 din cazuri) fiind totodată şi una dintre cele mai frecvente boli genetice, afectând 1:4000 bărbaţi. Fenotipul caracteristic sindromului X-fragil este evident la bărbaţii adulţi şi constă în dismorfie facială (faţă alungită, cu prognatism şi urechi mari, proeminete) macroorhidie şi retard mental moderat cu tulburări de comportament (figura 5.28.).

La copil afecţiunea este sugerată de întârzierea apariţiei limbajului, hiperactivitate cu deficit de atenţie sau comportament de tip autist.

Afecţiunea este determinată de mutaţia unei gene localizate în regiunea Xq27.3. - fra(X)(q27.3). Mutaţia constă în amplificarea unei secvenţe repetitive trinucleotidice CCG, ce induce o alterare cromosomică localizată, situs fragil. Studiile de genetică moleculară au arătat că bărbaţii cu sindrom X-fragil au peste 200 repetiţii ale trinucleotidului CCG (la persoanele normale există mai puţin de 50 repetiţii). Persoanele care au între 50 şi 200 repetiţii


96

se consideră că au premutaţie, fenotipul lor fiind normal. Amplificarea numărului de repetiţii şi transformarea premutaţiei în mutaţie este produsă exclusiv în cursul meiozei feminine.

a b Figura 5.28. Fenotip caracteristic sindromului X fragil

A – facies: faţă prelungă, urechi mari, decolate; B- macroorhidism (după Connor, 1997)

Evidenţierea citogenetică a situsului X fragil se face prin utilizarea unui mediu de cultură sărac în acid folic şi timidină (evidenţiere în 4-10% din celule) sau prin folosirea unor agenţi inductori, parţial citotoxici, precum metotrexatul. Diagnosticul de certitudine impune analiza moleculară a mutaţiei.

12. MODIFICĂRI CROMOSOMICE ÎN CANCER

Cancerul este o boală caracterizată prin proliferarea anarhică a unor celule dintr-un anumit ţesut (clone celulare maligne) cu capacitate de invazie locală şi metastazare la distanţă. În timpul dezvoltării clonei, celulele pot suferi mutaţii ce generează anomalii cromosomice numerice (trisomii, monosomii) sau structurale neechilibrate (deleţii, duplicaţii sau translocaţii).

De regulă, anomaliile cromosomice din celulele canceroase prezintă un înalt polimorfism. Depistarea unei asocieri caracteristice între o anomalie cromosomică şi apariţia cancerului a fost posibilă în unele tipuri de cancer: translocaţia 9:22 (cromosomul Philadelphia) în leucemia mieloidă cronică (figura 5.29.); translocaţia 15:17 în leucemia promielocitară acută deleţia 11p- în nefroblastom (tumora Wilms); deleţia benzii 13q14- în retinoblastom.

Anomaliile cromosomice induc sau favorizează tumorigeneza prin mai multe mecanisme: activarea unor oncogene prin apariţia unor puncte de ruptură în interiorul genei sau în genele

adiacente acestora; formarea unei gene himeră cu funcţie anormală ca urmare a unei translocaţii (de exemplu

gena bcl-abl activată prin translocaţia 9;22); separarea unei gene de regiunea reglatoarea a ei, ca urmare a unei translocaţii; deleţia unei regiuni cromosomice ce conţine o genă supresoare de tumori – de exemplu în

retinoblastom deleţia regiunii 13q14 care conţine gena supresoare de tumori Rb.


97

În unele cazuri anomaliile cromosomice constituie factori predispozanţi pentru cancere. În această categorie intră sindroamele cu “fragilitate cromosomică” (anemia Fanconi, sindromul Bloom, ataxia-telangiectazia), precum şi unele anomalii ale cromosomilor somatici (trisomia 21, trisomia 18).

13. STĂRILE INTERSEXUALE

Stările intersexuale se caracterizează prin ambiguitatea organelor genitale externe sau prin neconcordanţă între sexul genetic şi aspectul organelor genitale. De cele mai multe ori stările intersexuale nu sunt determinate de anomalii cromosomice, fiind implicate defecte monogenice. Realizarea testului cromatinei X şi a cariotipului sunt necesare în stările intersexuale pentru stabilirea sexului civil pe baza celui genetic.

Totuşi, în unele situaţii, cariotipul relevă existenţa unor anomalii cromosomice. De exemplu, în hermafroditismul adevărat pot exista două linii celulare una 46,XX şi una 46,XY. În alte cazuri, existenţa unor translocaţii între cromosomii X şi Y, ce implică segmente cromosomice localizate în regiunea pseudoautosomală, poate induce o sexualizare anormală (bărbaţi XX, mai rar femei XY).

E. INDICAŢIILE PRACTICE ALE STUDIULUI CROMOSOMILOR UMANI

Analiza cromosomilor umani reprezintă un test indispensabil pentru diagnostic în următoarele circumstanţe: 1. La indivizii cu stări intersexuale, analiza cromosomilor permite stabilirea concordanţei

între sexul genetic şi cel civil, precum şi decelarea unor eventuale anomalii cromosomice.

2. La indivizii cu sindroame plurimalformative (trei sau mai multe malformaţii) cu sau fără retard mental, este utilă efectuarea analizei cromosomice, folosind marcajul de înaltă rezoluţie şi FISH, deoarece poate fi identificată prezenţa unei anomalii numerice sau structurale neechilibrate mici; analiza cromosomică este importantă chiar şi când diagnosticul clinic este cert, ca în sindromul Down, deoarece permite depistarea tipului de dezechilibru cromosomic, aspect important pentru acordarea sfatului genetic.

3. În debilităţile mentale de cauză necunoscută, cu sau fără tulburări de comportament, efectuarea cariotipului poate indica prezenţa unei anomalii cromosomice structurale neechilibrată de tipul unei microdeleţii telomerice sau prezenţa unui situs fragil (de exemplu sindromul X fragil).

4. La persoane cu dezvoltare anormală a caracterelor sexuale secundare (de exemplu băieţi cu pilozitate sexuală redusă şi voce înaltă) sau întârzierea apariţiei pubertăţii (în special la fete cu talie mică sau la băieţi longilini) efectuarea cariotipului permite identificarea unei anomalii gonosomice (monosomie X sau trisomie XXY).

5. La cuplurile cu sterilitate primară de origine nedeterminată, în special la bărbaţii cu spermogramă anormală sau la femei cu amenoree primară, efectuarea cariotipului poate releva o anomalie gonosomică sau o anomalie structurală echilibrată.

6. La cuplurile cu avorturi spontane repetate sau copii născuţi morţi, efectuarea cariotipului poate indica prezenţa unei anomalii cromosomice echilibrate, răspunzătoare de accidentele reproductive. Efectuarea cariotipului la produşii de avort poate indica existenţa unei anomalii numerice (poliploidie, aneuploidie) sau a unei anomalii cromosomice structurale neechilibrată letale (deleţie, duplicaţie, isocromosom, cromosom inelar).


98

7. La părinţii copiilor cu anomalii structurale neechilibrate, efectuarea cariotipului este necesară, deoarece poate releva prezenţa unei anomalii cromosomice structurale echilibrate, de tipul inversiei sau translocaţiilor. La rudele apropiate ale indivizilor cu anomalii cromosomice echilibrate (inversii, translocaţii) efectuarea cariotipului poate releva aceeaşi anomalie, aspect important pentru stabilirea riscului de recurenţă al anomaliei.

8. La persoanele expuse la acţiunea unor agenţi mutageni (radiaţii ionizante, agenţi alchilanţi) efectuarea analizei cromosomice permite, uneori, identificarea unor anomalii cromosomice structurale neechilibrate dobândite, de tipul cromosomilor inelari sau cromosomilor dicentrici.

9. În unele forme de cancer, efectuarea cariotipului poate releva o anomalie cromosomică structurală dobândită. Astfel, în leucemia mieloidă cronică poate fi identificat cromosomul Philadelphia 1 (translocaţie între cromosomii 9 şi 22) în retinoblastom există o deleţie 13q−, iar în tumora Wilms (nefroblastom) poate fi identificată o deleţie 11p−. Detecţia anomaliei cromosomice specifice este utilă pentru identificarea recidivelor şi, în unele cazuri, pentru stabilirea prognosticului pacienţilor.

10. Diagnosticul prenatal este indicat pentru cuplurile cu risc crescut (un părinte purtător al unei anomalii cromosomice echilibrate, cupluri care au avut copii cu anomalii cromosomice neechilibrate, vârstă maternă avansată – peste 35 de ani - în momentul concepţiei). Realizarea analizei cromosomilor din celulele fetale (din lichidul amniotic sau vilozităţile coriale) permite evidenţierea unor anomalii cromosomice numerice sau structurale neechilibrate. În cazul identificării unor anomalii cromosomice cuplul parental poate opta pentru întreruperea sarcinei (vezi capitolul Diagnosticul prenatal).

Efectuarea studiului cromosomilor umani este importantă în: sindroame malformative, retard mental, tulburări de reproducere, tulburări de sexualizare, la rudele persoanelor afectate de o anomalie cromosomică, la persoanele expuse la factori mutageni, în cancer, în diagnosticul prenatal.

II. APLICAŢII PRACTICE 1. Analizaţi pe fotografii şi diapozitive fenotipurile ce corespund diferitelor sindroame cromosomice, identificând elementele de diagnostic ale bolilor cromosomice:

- sindrom Down la nou-născut şi copilul mic; - sindrom Turner la nou-născut; - sindrom Turner la adult; - sindrom Klinefelter.

2. Observaţi la microscop diferite anomalii cromosomice. 3. Analizaţi fotografiile din figura 5.30. şi identificaţi elementele dismorfice prezente, încercând

să stabiliţi diagnosticul clinic pe baza datelor identificate. 4. Analizaţi cariotipurile din figurile 5.31. şi 5.32., identificaţi anomaliile cromsomice prezente şi

scrieţi formula cromosomică corespunzătoare. 5. Stabiliţi modalităţile de segregare meiotică a următoarelor anomalii cromosomice echilibrate:

- translocaţie reciprocă 46,XY, t(2;5)(q21;q31); - translocaţie Robertsoniană 45,XX, -14,rob (21q;14q); - translocaţie Robertsoniană 45,XX, -21,rob (21q;21q).


99

a.

b c

Figura 5.30. Identificaţi particularităţile fenotipice ale pacienţilor din fotografiile de mai sus şi numiţi sindroamele corespunzătoare

a. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………....

b. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

c. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….


100

a. b.

c. d.

Figura 5.31. Identificaţi formulele cromosomice ale cariotipurilor de mai sus

a……………………..b……………………c…………..…….d…………………


101

a. b.

c. d.

Figura 5.32. Identificaţi formulele cromosomice ale cariotipurilor de mai sus

a……………………..b……………………c…………..…….d………………… 6. Un pacient în vârstă de 1 an este trimis de medicul de familie la consult genetic, deoarece prezintă următoarele semne clinice: hipotonie musculară, retard de creştere, dismorfie cranio-facială cu brahicefalie, nas turtit, fante mongoloide, canal atrio-ventricular. Pe baza acestor date răspundeţi la următoarele întrebări:

- ce sindrom vă sugerează fenotipul pacientului? - ce analiză citogenetică este necesară pentru confirmarea diagnosticului? - care ar fi rezultatele posibile ale analizei de la punctul precedent? - este utilă efectuarea testului cromatinei X în aceste condiţii? Explicaţi opţiunea Dv.


102

- este utilă efectuarea cariotipului la părinţi, dacă copilul prezintă 46 de cromosomi? - în condiţiile în care mama ar avea 45 de cromosomi şi doar 2 cromosomi acrocentrici mici

care este riscul acestui cuplu de a avea un alt copil cu aceeaşi afecţiune? - care este evoluţia probabilă a acestui copil?

7. O pacientă în vârstă de o lună este adusă la consult genetic de către părinţi deoarece, prezintă: lungime mai mică decât normalul vârstei, mameloane îndepărtate şi a prezentat la naştere limfedem pe faţa dorsală a mâinilor şi picioarelor. Pe baza acestor date răspundeţi la următoarele întrebări:

- ce sindrom cromosomic credeţi că are pacienta? - ce alte semne clinice vor putea fi evidenţiate la pacientă, la maturitate? - ce examen citogenetic simplu poate confirma diagnosticul clinic? care sunt rezultatele

acestuia? - este necesară analiza cromosomică în acest caz? Explicaţi opţiunea Dv.

- care este riscul pacientei de a avea un copil cu aceeaşi boală? - care este prognosticul pacientei?

8. Un pacient în vârstă de 18 ani este trimis la consult genetic de către medicul de familie, deoarece prezintă: talie înaltă, musculatură slab dezvoltată şi absenţa caracterelor sexuale secundare masculine. Pe baza acestor date răspundeţi la următoarele întrebări:

- ce sindrom cromosomic credeţi că prezintă pacientul? - ce alte semne clinice vor putea fi evidenţiate la pacient? - ce examen citogenetic simplu poate confirma diagnosticul clinic? care sunt rezultatele

acestuia? - este necesară efectuarea cariotipului în cazul acestui pacient? dacă răspunsul este da care

sunt rezultatele posibile ale acestei analize? - care este riscul pacientului de a avea un copil cu aceeaşi boală?

9. Un cuplu tânăr este trimis la consult genetic deoarece anamneza reproductivă relevă două avorturi spontane şi un copil sănătos. A fost efectuată analiza cromosomică la ambii soţi şi a fost identificată prezenţa la femeie a unei translocaţii reciproce echilibrate t(1q;15p). Răspundeţi la următoarele întrebări.

- cum este fenotipul pacientei? - credeţi că ar fi fost utilă examinarea cromosomilor la produşii de avort? dacă răspunsul

este afirmativ ce anomalii cromosomice credeţi că ar fi putut fi identificate la aceştia? - este utilă efectuarea cariotipului şi la copilul sănătos? Explicaţi opţiunea Dv. - care este riscul cuplului de mai sus de avea un alt avort spontan? - în cazul în care cuplul se hotărăşte pentru a avea o nouă sarcină ce ar trebui să facă?


A. DEFINIŢI URMĂTORII TERMENI Aneuploidie Poliploidie Anomalie echilibrată Anomalie neechilibrată Trisomie Monosomie Disomie uniparentală Amprentare genomică Inversie Translocaţie Translocaţie reciprocă Inserţie Translocaţie Robertsoniană Deleţie Duplicaţie Isocromosomi Cromosomi inelari Cromosomi dicentrici Anomalie în mozaic Fuziune centrică Cromosom acentric

B. RĂSPUNDEŢI LA URMĂTOARELE ÎNTREBĂRI 1. Ce sunt anomaliile cromosomice? 2. Cum se clasifică anomaliile cromosomice? 3. Care sunt diferenţele dintre poliploidii şi aneuploidii? 4. Care sunt diferenţele dintre trisomie şi monosomie?


103

5. Care din următoarele anomalii produc modificări fenotipice: anomaliile structurale echilibrate sau cele neechilibrate? De ce?

6. Care sunt principalele cauze ale apariţiei anomaliilor cromosomice? 7. Care sunt consecinţele fenotipice ale anomaliilor cromosomice numerice? 8. Care sunt particularităţile fenotipice comune anomaliilor cromosomice neechilibrate? 9. Câte tipuri de inversii există ? Care sunt particularităţile lor? 10. Care sunt consecinţele reproductive ale inversiilor? 11. Care este modul de segregare al cromosomilor cu translocaţii reciproce în cursul meiozei I? Dar

cel al cromosomilor cu inserţie? 12. Care este modul de segregare al cromosomilor în cazul unei translocaţii Robertsoniene între

cromosomi neomologi? Care este riscul purtătorilor acestui tip de translocaţie de a avea un descendent cu fenotip anormal? Dar cu cariotip anormal?

13. Care este modul de segregare al cromosomilor în cazul unei translocaţii Robertsoniene între cromosomi omologi? Care este riscul purtătorilor acestui tip de translocaţie de a avea un descendent cu fenotip anormal? Dar cu cariotip anormal?

14. Cum se clasifică deleţiile? Care sunt particularităţile fiecărui tip? 15. Care sunt principalele sindroame cu microdeleţie? Prin ce tehnici de analiză citogenetică pot fi

evidenţiate ele? 16. Care sunt mecanismele posibile de apariţie ale duplicaţiilor? 17. Ce sunt cromosomii inelari? Care sunt consecinţele fenotipice ale acestora? 18. Prin ce mecanism rezultă cromosomii dicentrici? 19. Ce sunt isocromosomii şi care este mecanismul de formare ale acestora? 20. Care sunt particularităţile fenotipice ale sindromului Down la sugar? Cum se modifică fenotipul

pacienţilor în cursul vieţii? 21. Ce analiză citogenetică este necesară pentru certificarea diagnosticului de sindrom Down? Care

sunt variantele posibile de cariotip în sindromul Down? 22. Care sunt particularităţile fenotipice în trisomia 18? Dar în trisomiile 13 şi 8? 23. Care sunt malformaţiile caracteristice în deleţiile 4p- şi 5p- ? 24. Prin ce se caracterizează sindromul Turner? Care sunt anomaliile cromosomice posibile? 25. Care sunt aspectele fenotipice ale monosomiei X în copilărie? Ce alte semne clinice pot fi decelate

la adult? 26. Care sunt principalele semne clinice în sindromul Klinefelter? Poate fi acest sindrom diagnosticat

în copilărie? 27. Ce analize citogenetice sunt necesare pentru diagnosticul de sindrom Klinefelter? Care sunt

rezultatele posibile? 28. Ce alte anomalii gonosomale cunoaşteţi şi care sunt rezultatele testului Barr şi ale analizei

cromosomice în aceste afecţiuni? 29. Ce este sindromul X fragil şi care sunt particularităţile lui fenotipice? Este o boală cromosomică

sau o boală monogenică? 30. Care sunt particularităţile anomaliilor cromosomice din cancer? Care sunt tipurile de cancer în

care există anomalii cromosomice caracteristice? 31. Ce stări intersexuale pot fi diagnosticate prin analiză citogenetică? De ce este importantă

efectuarea cariotipului în orice stare intersexuală? 32. Care sunt principalele indicaţii ale efectuării cariotipului? Exemplificaţi fiecare indicaţie.

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând UN SINGUR RĂSPUNS, cel mai bun din cele enunţate. 1. La un subiect fenotipic normal, al cărui cariotip cuprinde 46 de cromosomi, care este anomalia cromosomică ce se poate observa ?

A. Trisomie liberă; B. Inversie pericentrică; C. Deleţie. D. Trisomie prin translocaţie Robertsoniană; E. Translocaţie Robertsoniană.

2. Care dintre afirmaţiile următoare referitoare la translocaţia Robertsoniană este falsă? A. Poate fi observată la subiecţi clinic normali;


104

B. Poate afecta oricare cromosom; C. Poate fi responsabilă de malformaţii la descendenţi; D. Reprezintă una din anomaliile cromosomice de structură; E. Este totdeauna rezultatul unei translocaţii parentale.

La următoarele întrebări răspundeţi ASTFEL ("complement grupat"): A, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B, dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3 C, dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4 D, dacă este corect răspunsul 4 E, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4

3. Indicaţi care dintre formulele cromosomice următoare reprezintă anomalii de structură: 1. 45,X; 2. 46,XX,del(1)(q21qter); 3. 47,XY,+13; 4. 46,X,i(Yq).

4. Care din următorii zigoţi se pot forma prin fecundarea unui gamet normal cu un gamet provenit de la un părinte cu translocaţie Robertsoniană a cromosomilor 13 şi 14? 1. 13, 13, 14, 14; 2. 13, 13/14, 14; 3. 13, 14, 14; 4. 13, 14, 14, 14.

III. La următoarele întrebări răspundeţi ASTFEL: A: dacă cele două propoziţii sunt adevărate şi între ele există o relaţie tip cauză-efect B: dacă cele două propoziţii sunt adevărate dar nu există o relaţie tip cauză-efect C: dacă prima propoziţie este adevărată şi a doua este falsă D: dacă prima propoziţie este falsă şi a doua este adevărată E: dacă ambele propoziţii sunt false

5. Cuplurile în care unul din părinţi este purtătorul unei translocaţii reciproce sunt totdeauna sterile, deoarece acesta produce numai gameţi anormali. 6. Clivarea transversală a centromerului duce la formarea de anomalii cromosomice echilibrate, deoarece anomalia cromosomică rezultată nu se caracterizează prin modificări ale numărului de cromosomi ai celulei.

IV. La următoarea întrebare asociaţi fiecărui enunţ din coloana din stânga, notat cu cifre, cel mai bun din răspunsurile din coloana din dreapta, notate cu litere.

7. Asociaţi elementele din coloana stângă cu formula cromosomică corespunzătoare prezentată în coloana dreaptă:

1. Bărbat cu un corpuscul Barr A. 46,XY, inv (9)(q12q22) 2. Femeie cu amenoree primară şi fără corpuscul Barr B. 45,XX, rob(21q;21q) 3. Băiat cu retard mental sever şi dismorfie facială caracterizată prin fante palpebrale mongoloide şi brahicefalie cu profil facial turtit

C. 47,XXY

4. Bărbat cu fenotip normal, formulă cromosomică cu 46 de cromosomi dar cu descendenţi anormali ce asociază o trisomie şi o monosomie parţială

D. 47,XY, +21

5. Femeie cu 45 de cromosomi şi un copil cu sindrom Down E. 45,X

6. CARACTERE EREDITARE NORMALE CU DETERMINISM MONOGENIC

I. DATE TEORETICE

A. DEFINIŢII. PARTICULARITĂŢI Caracterele fenotipice ale unui individ – morfologice, biochimice, fiziologice -

definesc individul din punct de vedere biologic. Aceste caractere sunt rezultatul final al acţiunii combinate (în diferite proporţii) a factorilor ereditari (gene) şi a celor de mediu.

Caracterele ereditare sunt caracterele fenotipice în determinismul cărora rolul major aparţine factorilor ereditari (genotipului nuclear şi mitocondrial). Determinismul genetic al caracterelor ereditare poate fi monogenic sau poligenic.

Caracterele monogenice pot fi normale sau anormale (boli monogenice). Până în prezent au fost identificate şi studiate peste 9000 de caractere fenotipice cu determinism monogenic. Caracterele monogenice normale prezintă o serie de particularităţi care le deosebesc de caracterele fenotipice cu determinism multifactorial: sunt “pur ereditare”, expresia lor nefiind influenţată de factorii de mediu; genele sunt

recunoscute şi deseori denumite după caracterele fenotipice pe care le determină; transmiterea lor ereditară se face conform legilor eredităţii descrise de Mendel, motiv pentru

care aceste caractere sunt denumite şi caractere „mendeliene”; prezintă o mare variabilitate în populaţie – polimorfism ─ care se bazează pe existenţa în

populaţie a unor multiple variante; distribuţia în populaţie este bimodală (un anumit caracter fenotipic este prezent la unele

persoane şi lipseşte la altele) sau multimodală (există variante multiple ale caracterului fenotipic).

Deşi genetica clasică a fost îmbogăţită cu noile cunoştinţe ale geneticii moleculare, termenii cei mai importanţi au rămas neschimbaţi şi sunt în continuare utilizaţi în limbajul de specialitate. Astfel:

Gena este un segment de cromosom (moleculă de ADN) ce conţine informaţia codificată necesară pentru realizarea expresiei unui anumit caracter (de obicei un polipeptid); gena se notează cu una, două sau trei litere simbolice pentru caracterul pe care gena îl codifică (ex. gena A pentru grupul sanguin A, gena Se pentru caracterul secretor).

Locusul (plural loci) reprezintă poziţia specifică aunei gene pe un cromosom. Modificarea structurii unei gene iniţiale (“sălbatică” sau ancestrală) se numeşte

mutaţie şi produce o variantă a genei normale –alelă – care influenţează acelaşi carcater. Uneori, o genă poate suferi mutaţii diferite, rezultând mai multe variante alelice (polialelie).

Deoarece în celulele somatice cromosomii există în perechi de omologi, orice caracter este determinat de o pereche de gene alele. Perechea de gene alele (variante identice sau diferite) ce ocupă loci omologi constituie genotipul, care este simbolizat

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

106

folosind prescurtările celor 2 alele (de sexemplu SeSe). În cazul caracterelor monogenice, genotipul determină un anumit fenotip (caracter morfologic, biochimic etc.) (de exemplu, genotipul SeSe determină fenotipul secretor). Noţiunile de genotip şi fenotip sunt interpretate aici în sens restrâns.

Conform primei legi a lui Mendel, care se bazează pe fenomenul de segregare a cromosomilor omologi în cursul primei diviziuni meiotice, gameţii (haploizi) conţin câte o singură genă pentru fiecare locus, urmând ca în urma fecundării a doi gameţi (spermatozoid şi ovul) să se formeze zigotul diploid şi să se reconstituie perechile de alele la nivelul fiecărui locus (în locii omologi).

Termenul de homozigot defineşte genotipul format din două gene alele identice; homozigoţii sunt şi homogametici - gameţii lor conţin aceeaşi alelă pentru locusul respectiv.

Heterozigot este denumit genotipul format din două gene alele diferite; heterozigoţii sunt heterogametici.

Hemizigot este denumit genotipul constituit dintr-o singură genă în loc de o pereche de alele; situaţia se referă la locii situaţi pe cromosomii X şi Y, în cazul persoanelor de sex masculin (care posedă câte un singur cromosom X şi unul Y) sau pentru orice locus, când una dintre cele două gene alele s-a pierdut în urma unei deleţii cromosomice.

Un caracter este denumit dominant dacă se manifestă fenotipic atât la homozigoţi cât şi la heterozigoţi şi recesiv dacă nu este manifest fenotipic decât la homozigoţii pentru o anumită alelă. Dominanţa şi recesivitatea sunt proprietăţi ale caracterelor şi nu ale genelor (de cele mai multe ori la nivel molecular se exprimă ambele alele). Cu toate acestea, termenii de dominant şi recesiv se aplică în continuare pentru gene.

O genă este denumită dominantă dacă se manifestă fenotipic atât în stare homozigotă cât şi în stare heterozigotă. Gena dominantă se notează cu litere mari şi determină manifestarea unui caracter dominant (de exemplu, genotipurile GG şi Gg determină acelaşi fenotip: gustător).

Gena recesivă se manifestă numai la indivizii homozigoţi; la heterozigoţi gena recesivă fiind nemanifestă fenotipic. Genele recesive se notează cu litere mici şi corespund unui caracter recesiv (de exemplu, genotipul gg determină caracterul negustător).

În unele situaţii, fenotipul heterozigotului este intermediar între cel al homozigotului dominant, situaţie în care se consideră că între genele alele există o relaţie de semidominanţă sau dominanţă incompletă

În cazul anumitor alele, cele două gene au activitate la fel de puternică, fiind amândouă manifeste la heterozigoţi. Cele două gene sunt considerate codominante. În acest caz, fenotipul heterozigoţilor va fi rezultatul acţiunii ambelor alele, fiind diferit de cel al ambilor homozigoţi. De exemplu, în cazul sistemului de grup sanguin ABO, genele A1 şi B sunt codominante, iar heterozigoţii A1B prezintă atât antigen A1, cât şi B, spre deosebire de indivizii A1A1 care au doar antigen A1, respectiv BB, care au doar antigen B.

Expresia perechii de gene dintr-un anumit locus lor poate fi influenţată de alte gene, precum şi de factori negenetici. Fenomenul de condiţionare a expresiei fenotipice a unei perechi de gene alele de către produsul unei alte perechi de gene alele este denumit epistazie.

Caracterele ereditare monogenice normale: sunt pur ereditare, determinate de o pereche de gene alele şi se transmit conform legilor lui Mendel, având frecvent o distribuţie populaţională bimodală;

Locusul este poziţia specifică ocupată de o genă pe un cromosom;


107

Mutaţia unei gene normale produce o variantă genică numită alelă; uneori prin mutaţii diferite rezultă variante multiple (polialelie) care influenţează diferit acelaşi caracter fenotipic;

Între genele alele, care ocupă loci omologi, există relaţii de forţă: dominanţă/recesivitate sau codominanţă;

În condiţiile în care una dintre genele alele se manifestă mai puternic, această genă este considerată dominantă, în timp ce gena slabă este considerată recesivă;

În condiţiile în care cele două gene alele se manifestă la fel de puternic ele sunt considerate codominante;

Între diferite perechi de gene alele pot exista interacţii, precum epistazia, caracterizată prin influenţarea acţiunii unei perechi de gene alele de către o altă pereche de gene alele care ocupă un locus diferit;

B. TIPURI DE CARACTERE NORMALE MONOGENICE Caracterele biochimice şi imunologice (grupele sanguine, grupele serice, grupele

enzimatice, grupele tisulare, caracterul secretor), dar şi unele caractere fiziologice (sensibilitatea gustativă şi olfactivă la anumiţi stimuli) sau morfologice (forma dinţilor, a bărbiei, a limbii) au un determinism monogenic. Ansamblul acestor caractere specifice contribuie la individualitatea biologică a fiecărei persoane.

1. GRUPELE SANGUINE

Termenul de grupe sanguine se referă, la antigenele prezente pe suprafaţa hematiilor. Ele sunt caractere biochimice determinate 100% genetic. Termenul de sistem de grup sanguin se referă atât la antigenele corespunzătoare cât şi la genele care le determină şi la relaţia genotip-fenotip.

Au fost descrise mai multe sisteme de grup sanguin (tabelul 6.1.) dar numai sistemele AB0 şi Rh au o largă aplicaţie practică în transfuzii de sânge, transplante de organe şi ţesuturi, precum şi în profilaxia bolii hemolitice a nou-născutului.

Tabelul 6.1. Principalele sisteme de grup sanguine şi determinismul lor genetic

Grupul sanguin (Abreviere)

Antigene Locus Localizare cromosomică

Determinantul antigenic sau produsul genic

ABO A1, A2, B ABO 9q34.1-34.2 glicoziltransferaze ABO Rhesus (Rh) D,d; C/c, E/e RH 1p34.3-36.1 acilproteine Rh Secretor (Se) A, B FT2 19q13.3 (1,2) fucoziltransferaze MN Ss M, N S GYPA şi B 4q28-31 glicoforina A şi B Xg Xga, Xg XG Xp22.32 proteina PBDX Duffy Fy FY 1p22-23 receptorul pentru chemokine Lewis (Le) Lea, Leb FT3 19p13.3 (1,3) fucoziltransferaze Kell K, k, Kp, Js KEL 7q33 metaloproteinază Diego (Di), Wright (Wr)

Di, Wr AE1

17q12-q21 schimbătorul de anioni AE1

Lutheran Lu LU/BCAM 19q13.2-13.3 proteină înrudită cu molecula de adeziune BCAM

P1 P P 22q11.2-qter glicoziltransferază Kidd Jk JK 18q12-21 transportorul pentru uree


108

Alte aproximativ 12 sisteme de grup snaguin (între care sistemele Duffy, Lewis, Xg, MN şi Ss) au relevanţă clinică numai la persoanele care fac transfuzii repetate, deoarece este posibilă apariţia de anticorpi împotriva antigenelor caracteristice acestor sisteme de grup sanguin. Până în momentul introducerii amprentei genetice (ADN) determinarea acestor sisteme de grup sanguin era utilizată în testele de paternitate şi studiile de înlănţuire genică.

a. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN ABO

Grupele sanguine ABO au fost descoperite în anul 1900, de către Karl Landsteiner (premiul Nobel pentru medicină 1938). În raport cu prezenţa pe hematii a două antigene (aglutinogene) A şi B, respectiv în ser a anticorpilor (aglutinine) corespunzători: anti-A (α) şi anti B (β), el a evidenţiat a patru grupe majore AB0: A, B, AB şi 0 (tabelul 6.2.).

O caracteristică a grupelor sanguine AB0, absentă la celălalte sisteme de grup sanguin, este relaţia reciprocă dintre antigenele de pe hematii şi anticorpii din ser, prin care prezenţa unui anumit antigene exclude automat prezenţa în ser a anticorpului corespunzător antigenului respectiv. De exemplu o persoană cu grupa snaguină A, va avea pe hematii antigen A, iar în ser va lipsi anticorpul α. Explicaţia acestei relaţii este încă neclară, dar se crede că apariţia anticorpilor este corelată cu contactul cu anumite antigene din mediul ambiant28, individul producând toţi anticorpii AB0, exceptând cel corespunzător antigenului de pe hematii.

Tabelul 6.2. Relaţiile dintre antigene şi anticorpi la fenotipurile AB0

Grupa sanguină

Antigene pe hematii (Ag)

Aglutinine în ser (Ac)

Reacţii cu antiser Frecvenţa grupelor ABO

Anti A Anti B în România

01 - anti-A (α) anti-B (β) - - 32,68% A2 A anti-B(β) + - 43,15% B B anti-A (α) - + 16,50%

AB2 A, B, - + + 7,65%

1 persoanele cu grup sanguin 0 nu au pe hematii antigenele A şi B, dar prezintă antigenul H, astfel sistemul ar trebui denumit ABH, dar din raţiuni de ordin istoric se menţine denumirea de sistem AB0 2 prin folosirea unor antiseruri adecvate, la persoanele cu grup sanguin A, respectiv AB, pot fi identificate două subgrupe A1 şi A2, respectiv A1B şi A2B

Determinismul genetic al sistemului AB0 este asigurat de genele care ocupă un locus localizat 9q34. La nivelul acestui locus pot exista patru alele: A1, A2, B şi 0, între care există relaţii de dominanţă/recesivitate sau codominanţă: Gena A1 este dominantă faţă de gena A2; Genele A1 şi A2 sunt codominante în raport cu gena B Toate cele trei gene sunt dominante faţă de gena 0

Relaţia genotip – fenotip pentru sistemul AB0 este prezentată în tabelul 6.3.

Tabelul 6.3. Relaţia genotip-fenotip în sistemul sanguin ABO

28 Antigenele A şi B au fost depistate şi la o serie de bacterii

(A1 > A2) = B> 0

H > h


109

FENOTIP GENOTIP homozigot heterozigot

A1 A1A1 A1A2, A10 A2 A2A2 A20 B BB B0

A1B - A1B A2B - A2B

O 00 -

Antigenele din sistemul AB0 sunt complexe glicosfingolipidice fixate pe membrana eritrocitelor, antigenicitatea fiind dependentă de restul glucidic. Sinteza acestor antigene este catalizată de două sisteme enzimatice ce intervin succesiv asupra unui precursor sfingolipidic. Genele care codifică cele două sisteme enzimatice – H (localizată 19q13) şi AB0 (loclaizată 9q34) – se află în relaţie de epistazie.

Gena H codifică o fucozil transferază care asigură ataşarea unei molecule de fucoză la precursorul sfingolipidic, determinând formarea antigenului H. Asupra antigenului H acţionează genele A, B şi 0. Gena A codifică o transferază ce asigură ataşarea la antigenul H a unui rest de N-acetilglucozamină, în timp ce gena B codifică o altă transferază care asigură fixarea unei molecule de D-galactoză. Gena 0 nu produce nici o enzimă ectivă, astfel că antigenul H rămâne nemodificat.

Un număr foarte mic de persoane, purtători homozigoţi ai unei mutaţii inactivatoare a genei H (genotip hh) nu au pe hematii nici un fel de antigene, deoarece în absenţa genei H precursorul sfingolipidic rămâne nemodificat, iar enzimele codificate de genele A şi B nu pot acţiona pentru că lipseşte restul de fucoză. Aceşti indivizi sunt consideraţi a avea fenotip Bombay. Ei prezintă similitudini serologice cu persoanele cu grup sanguin 0, dar pe hematii nu există nici un antigen.

b. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN Rh

Grupul sanguin Rh se caracterizează prin prezenţa pe suprafaţa eritrocitelor a trei tipuri de antigene (aglutinogene) denumite C, D şi E. Antigenele Rh sunt de tip polipeptidic, reprezentând porţiuni dintr-o proteină transmembranară cu rol de canal ionic. Antigenul D este cel mai imunogenic şi defineşte în practică fenotipurile Rh29: persoane Rh pozitive care au antigen D pe hematii (85% dintre indivizi); persoane Rh negative care nu au antigen D pe hematii (15% dintre indivizi).

Determinismul genetic al antigenelor Rh este complex, fiind implicaţi 2 loci genetici, D şi C/E, situaţi foarte apropiat pe acelaşi cromosom, astfel că genele se transmit înlănţuit. Fiecare locus poate fi ocupat alternativ de mai multe alele, astfel că se pot constitui haplotipuri distincte, ce determină antigene specifice (tabelul 6.4.) 30. Locusul D poate fi ocupat fie de alela D dominantă, care codifică antigenul D, fie de alela d recesivă, care este amorfă. Determinanţii antigenici C/c şi E/e constituie domenii distincte ale aceluiaşi polipeptid, codificat de genele din locusul C/E31.

Tabelul 6.4. Frecvenţa haplotipurilor Rh comune în populaţia caucaziană

Haplotip Frecvenţă Antigene produse

29 Fenotipurile Rh sunt definite în raport cu reacţia hematiilor la acţiunea anticorpilor anti D 30 Locusul Rh este localizat 1p34 31 Antigenele C şi c, respectiv E şi e diferă prin 1-4 aminoacizi


110

CDe 0,40 C, D, e cde 0,38 c, e cDE 0,14 c, D, E cDe 0,025 c, D, e cdE 0,013 c, E Cde 0,009 C, e CDE Rar C, D, E CdE Foarte rar C, E

Fiecare individ posedă 2 haplotipuri (cele mai frecvente fiind CDe/cde şi CDe/CDe), pe autosomii omologi. Prin urmare antigenele prezente pe hematii şi fenotipul individului sunt determinate de ambele haplotipuri, pe baza interrelaţiei alelice la nivelul fiecărui locus (dominanţă-recesivitate pentru locusul D, codominanţă pentru locusul C/E).

Ţinând cont de antigenicitatea redusă a antigenelor C/E, pentru simplificare se poate considera că doar locusul D este implicat în determinismul Rh. În acest caz, persoanele Rh pozitive sunt fie homozigoţi DD, fie heterozigoţi Dd, în timp ce persoanele Rh negative sunt obligatoriu homozigoţi dd.

Deşi în mod natural persoanele Rh negative nu au în ser anticorpi împotriva antigenelor D, ele pot forma aceşti anticorpi în urma imunizării cu hematii D. Această imunizare se poate produce într-una din următoarele situaţii: transfuzie de sânge sau transplant de organ de la un individ Rh+, respectiv la prima sarcină Rh+ la o femeie Rh.

Incompatibilitatea feto-maternă în sistemul Rh poate cauza la copil boala hemolitică a nou-născutului32. Aceasta este consecinţa trecerii transplacentare a anticorpilor anti-D de la mamă la făt pe parcursul sarcinii.

Mecanismul patogenic este prezentat în figura 6.1. La prima sarcină Rh+, în circulaţia maternă trec un număr mic de hematii fetale, purtătoare de antigen D. Cantitatea de antigen D, conţinută de aceste eritrocite, este însă insuficientă pentru declanşarea unei reacţii imune din partea organismului matern, astfel încât, în absenţa imunizării prealabile, la prima sarcină Rh+ copilul nu va fi afectat de boala hemolitică a nou-născutului.

În cursul naşterii (avortului) în circulaţia maternă pătrunde o cantitate însemnată de antigen D, suficientă pentru declanşarea sintezei de anticorpi anti-D. Aceştia se vor fixa pe hematiile fetale şi le vor distruge. În schimb, nu vor afecta fătul deoarece acesta a fost deja expulzat.

Tata Rh+ Dd

Mam

a R

h-

dd

Gam

eţi

Gameţi D d

d Dd dd d Dd dd

32 Boala hemolitică a nou-născutului poate apare mai rar şi datorită unei incompatibilităţi materno-fetale în sistemul AB0 (femei cu grup sanguin 0 şi feţi cu grup sanguin A, B sau AB). Hematiile fetale ce trec în circulaţia maternă produc anticorpi anti-A sau anti-B, dar aceştia sunt de tip IgM, care au dimensiuni mari şi de obicei nu pot trece prin bariera feto-placentară. De aceea, în majoritatea cazurilor acets tip de incompatibilitate determină la făt doar forme uşoare de anemie


111

Mama Rh- Mama Rh- Anticorpi anti-D Antigen D Antigen D Primul făt Anticorpi anti-D

Placentă Următorii feţi

Rh+ Rh+

Copil normal Copii cu boală hemolitică

Figura 6.2. Mecanismul imunizării unei femei Rh- în cursul sarcinilor Rh+

Informaţia despre existenţa antigenelor D va fi stocată în memoria limfocitelor B şi la următoarea sarcină Rh+, numărul redus de eritrocite fetale pătrunse în circulaţia maternă va fi suficient pentru declanşarea răspunsului imun.

Anticorpii anti-D sunt de tip IgG, au dimensiuni reduse şi pot trece de la mamă la făt prin bariera placentară. Ajunşi în circulaţia fetală ei se fixează pe antigenul D de pe hematii şi determină o reacţie antigen-anticorp finalizată prin hemoliză.

Distrugerea hematiilor fetale are trei efecte: apariţia unei stări de anemie; stimularea eritropoiezei fetale, ceea ce va produce o hiperplazie a organelor eritropoietice,

concretizată prin apariţia hepato-splenomegaliei; eliberarea unei cantităţi crescute de bilirubină.

Bilirubina este toxică pentru făt şi nou-născut, deoarece sistemele enzimatice hepatice de conjugare cu glicocolul şi taurina sunt nedezvoltate. Până la naştere, bilirubina nu produce efecte toxice, deoarece este metabolizată de ficatul matern. În schimb, postnatal bilirubina restantă, nefiind conjugată, nu poate fi eliminată din organism şi se depune la nivelul pielii şi mucoaselor, determinând icter (coloraţia galben-brun-verzuie a pielii şi mucoaselor) respectiv la nivelul nucleilor bazali ai encefalului, producând fenomene neurologice. Asocierea de icter şi fenomene neurologice constituie icterul nuclear.

În concluzie, existenţa bolii hemolitice a nou-născutului poate fi suspicionată în prezenţa următoarelor semne clinice: icter nuclear (icter intens, persistent mai mult de 3-4 zile postnatal asociat cu fenomene neurologice) anemie şi hepato-splenomegalie.

Boala hemolitică a nou-născutului constituie o urgenţă neonatologică, deoarece fenomenele neurologice se pot croniciza şi determină sechele pentru toată viaţa.

Tratamentul vizează pe de o parte eliminarea bilirubinei şi a anticorpilor anti-D din sângele fetal, iar pe de altă parte stimularea maturării sistemelor enzimatice hepatice. Pentru aceasta se face pe de o parte o exsanguinotransfuzie completă cu sânge izogrup ABO şi Rh, iar pe de altă parte se administreaza timp de 10-14 zile fenobarbital care acţionează ca inductor enzimatic.


112

Profilaxia bolii hemolitice a nou-născutului poate fi primară sau secundară. Profilaxia primară se face la femeile Rh- neimunizate33 şi constă în administrarea de anticorpi anti-D cu 2-3 zile înaintea naşterii. Astfel, în momentul naşterii antigenele fetale pătrunse în circulaţia maternă vor fi distruse de anticorpii administraţi, fiind blocată reacţia imună maternă. În acest mod, la următoarea sarcină Rh+, femeia Rh- va fi practic neimunizată.

Profilaxia secundară se adresează femeilor Rh- imunizate cu antigen D şi constă în administrarea periodică, de–a lungul perioadei gestaţionale, de antigene D, care vor fixa anticorpii anti-D produşi de mamă, reducând astfel titrul anticoprilor ce ajung în circulaţia fetală.

Totuşi, accidentele de incompatibilitate materno-fetală în sistemul Rh se produc rar datorită reducerii imunizării materne în situaţia în care mama şi fătul sunt incompatibili şi în sistemul ABO (hematiile fetale trecute în circulaţia maternă sunt distruse în acest caz imediat de aglutininele AB0).

c. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN MNSs

Grupul sanguin MNSs este caracterizat prin prezenţa pe hematii a antigenelor M şi/sau N, S sau s. Aceşti determinanţi antigenici polipeptidici sunt reprezentaţi de porţiuni din două sialoglicoproteine transmembranare eritrocitare numite glicoforine. Antigenele M şi N fac parte din glicoforina A, în timp ce antigenele S şi s fac parte din glicoforina B. Cele două glicoforine sunt codificate de două gene situate adiacent pe acelaşi autosom34 şi care se transmit înlănţuit, constituind un haplotip. În populaţia europeană cele mai frecvente haplotipuri sunt: Ns (38%) Ms (30%) MS (24%) şi NS (7%). Relaţiile între genele celor doi loci sunt de codominanţă pentru alelele M şi N, respectiv dominanţă/recesivitate pentru alelele S şi s (tabelul 6.5.).

Tabel 6.5. Relaţiile genotip-fenotip pentru haplotipurile MNSs

GENOTIP FENOTIP MM/SS, MM/Ss MM/ss NN/SS, NN/Ss NN/ss MN/SS, MN/Ss MN/ss

MS Ms NS Ns MNS MNs

Semnificaţia clinică a sistemului MNSs este minoră. Anticorpii anti-M sau anti-N pot apare “natural” şi reprezintă de obicei un amestec de molecule de tip IgM şi IgG. Anticorpii anti-S sau anti-s sunt de tip IgG şi se produc numai prin reacţii de imunizare la persoane negative ca urmare a unei transfuzii sau sarcini. Totuşi, datorită actvităţii imunologice reduse, aceşti anticorpi sunt rareori implicaţi în reacţii transfuzionale sau producerea unei anemii hemolitice la noul născut.

d. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN Xg

Fenotipurile posibile sunt Xg(a+) şi Xg(a-) determinate de prezenţa, respectiv absenţa de pe hematii a antigenului Xga. Variaţia fenotipică este determinată de existenţa a două gene alele: Xga şi Xg, care pot ocupa alternativ locusul Xg situat pe cromosomul X.

33 Este important ca la o persoană de sex feminin, în cazul administrării de transfuzii de sânge, să se determine şi grupul sanguin Rh, nu numai cel AB0 34 Locii sistemului MNSs sunt localizaţi 4q28


113

Acest locus nu este supus inactivării la femei, el fiind situat în porţiunea pseudoautosomală a cromosomului X (Xp22). Gena Xga este dominantă faţă de Xg şi produce antigenul Xga, în timp ce gena Xg este recesivă (tabelul 6.6.).

Tabelul 6.6. Relaţiile genotip-fenotip în sistemul Xg

GENOTIP FENOTIP

BĂRBAŢI XgaY Xg Y

Xg (a+) Xg (a-)

FEMEI XgaXga, XgaXg Xg Xg

Xg (a+) Xg (a-)

Datorită situării locusului Xg pe cromosomul X, bărbaţii şi femeile sunt diferiţi genotipic. Bărbaţii sunt hemizigoţi, deoarece nu au decât un singur cromosom X, în timp ce femeile pot fi homozigote sau heterozigote. Transmiterea grupului Xg la descendenţi se face respectând legile transmiterii dominante gonosomale.

2. GRUPE DIN SECREŢII

Genotipurile care determină fenotipurile secretor şi nesecretor sunt formate prin împerecherea alelelor Se (dominantă) şi se (recesivă, amorfă). Indivizii SeSe sau Sese sunt secretori şi au capacitatea de a sintetiza antigenele AB0 într-o formă hidrosolubilă, în timp ce persoanele nesecretoare sunt numai homozigoţii sese, la care antigenele AB0 rămân în formă liposolubilă, fiind absente din secreţii. Genele secretoare acţionează independent de genele sistemului sanguin AB0, dar condiţionează exprimarea acestor gene în secreţii, deoarece se găsesc în relaţie de epistazie cu acestea (tabelul 6.7.).

Tabelul 6.7. Relaţia genotip-fenotip în sistemul secretor.

Fenotip sistemulsecretor

Genotip sistemul secretor

Antigene AB0 sanguine

Antigene AB0 în secreţii

Secretor (Se) SeSe sau Sese

SeSe sau Sese A A SeSe sau Sese B B SeSe sau Sese A, B A, B Nesecretor (se) sese oricare

Fenotipurile sunt caracterizate de prezenţa sau absenţa în diversele secreţii ale organismului ale antigenelor grupului sanguin AB0. Persoanele care prezintă antigenele ABO în umori sunt consideraţi secretori [Se] (78%) iar cei care nu le prezintă sunt consideraţi nesecretori [se] (22%). Gena Se modifică solubilitatea antigenelor ABO, transformându-le din liposolubile în hidrosolubile. Astfel, antigenele ABO trec în secreţiile organismului (salivă, lapte, urină, spermă, sudoare etc.)35. La indivizii nesecretori, în absenţa genei Se (genotip sese) antigenele sunt liposolubile şi vor lipsi din secreţiile apoase.

3. GRUPELE SERICE

35 Statusul secretor este asociat cu o predispoziţie la ulcer duodenal


114

Polimorfismul structural al diferitelor proteine serice (structurale sau enzimatice) este determinat genetic monogenic, numărul de variante depinzând de numărul de alele diferite pentru locusul genetic ce codifică o anumită proteină. Polimorfismul proteic, baza individualităţii biologice, poate fi demonstrat prin electroforeză în gel (variantele haptoglobinelor, transferinelor, alfa-2 globulinelor şi fosfatazelor) sau prin imunelecroforeză (sistemul gamma globulinelor şi beta lipoproteinelor), separarea lor făcându-se în funcţie de încărcătura electrică, mărimea şi forma moleculelor.

a. HAPTOGLOBINELE

Haptoglobinele sunt α2-globuline care au rolul de a fixa hemoglobina din eritrocitele distruse prin hemoliză intravasculară. Există trei tipuri de haptoglobine: Hp 1-1, Hp 1-2 şi Hp

2-2, diferenţiate pe baza vitezei de migrare electroforetică în gel. Cele 3 variante polipeptidice sunt determinate de prezenţa în genotipul individului, în stare homozigotă sau în stare heterozigotă, a două gene alele codominante Hp1 şi Hp2 (tabelul 6.8.).

Tabelul 6.8. Relaţia genotip-fenotip pentru haptoglobine

Fenotip Genotip

Hp 1-1 Hp 2-2

Hp 1-2

Hp1 Hp1 Hp2 Hp2 Hp1 Hp2

b. TRANSFERINELE

Transferinele sunt β1-globuline care au capacitatea de a fixa şi transporta fierul şi alţi ioni metalicic. Se cunosc 14 tipuri, determinate probabil de o serie de alele codominante. Cele mai importante sunt Tf C, Tf B, Tf D.

c. GRUPUL COMPONENT SPECIFIC

Proteinele grupului component specific sunt α2-globuline. Ele se notează cu GC, existând trei fenotipuri Gc1-1, Gc1-2, Gc2-2. Fenotipul Gc2-2 este asociat frecvent cu psoriazisul.

4. GRUPELE ENZIMATICE

Grupele enzimatice pot fi serice sau eritrocitare. Enzimele serice polimorfe sunt reprezentate de pseudocolinesterază, acetil-transferază, lacticdehidrogenază, creatinfosfokinază, etc în timp ce enzimele eritrocitare polimorfe sunt reprezentate de fosfataza acidă, fosfoglucomutază, adenilatkinază, glucozo-6-fosfat dehidrogenază etc. Grupele enzimatice prezintă importanţă practică, fiind folosite în studii populaţionale.

Un exemplu de polimorfism enzimatic este reprezentat alfa1-antitripsină. α1-antitripsina este o proteină serică care inhibă activitatea unor enzime proteolitice (tripsina, chemotripsina etc.). Totuşi principala enzimă inhibată de α1-antitripsină este elastaza leucocitară, enzimă care distruge elastina din ţesutul alveolelor pulmonare, determinând o formă severă de emfizem pulmonar (cu debut precoce). Gena pentru α1-antitripsină este situată în locusul PI (proteaz-inhibitor) de pe cromosomul 14. La nivelul acestui locus cel mai frecvent pot fi detectate alelele M1, M2 şi M3, iar mai rar pot fi idnetificate alelele S şi Z. Aceste alele codifică proteine cu activitate antiproteazică diferită. Unele dintre aceste proteine au activitate foarte redusă, în timp ce alte enzime nu pot fi eliberate din hepatocite (se produce o acumulare intrahepatică de α1-antitripsină). Din punct de vedere patologic cele mai importante alele sunt alelele Z şi S. Persoanele cu genotipuri ZZ, MZ, MS şi ZS au o activitate antiproteazică redusă şi un risc crescut de boli pulmonare obstructive, artrită


115

reumatoidă sau hepatită cronică. Bolile pulmonare sunt mai frecvente la fumători, deoarece substanţele chimice din fumul de ţigară alterează situsul activ al enzimei.

5. GRUPELE TISULARE

Grupele tisulare sunt reprezentate de proteine cu rol structural, incluse în membrana celulară, dar care prezintă şi antigenitate specifică. Cel mai important sistem tisular este cel denumit HLA ("Human Leucocyte Antigen"). Este un sistem multigenic şi multifuncţional cu rol major în supravegherea şi apărarea imună a organismului, alcătuind complexul major de histocompatibilitate.

Genele care determină proteinele sistemului HLA sunt localizate pe cromosmul 6p21.3 şi sunt foarte strâns înlănţuite determinând haplotipuri. Există mai mulţi loci, corespunzători unor gene care codifică proteine cu roluri diferite, genele fiind grupate în 3 clase distincte (datele referitoare la aceste gene sunt discutate pe larg la curs).

Genele de clasă I ocupă locii HLA-A, HLA-B şi HLA-C şi prezintă fiecare un polialelism marcat (59 variante alelice pentru locusul A; 118 pentru locusul B şi 36 pentru locusul C). Ele determină glicoproteine antigenice exprimate pe suprafaţa tuturor celulelor nucleate (cu excepţia celulelor SNC, trofoblastice şi embrionare) şi sunt implicate în diferenţierea antigenelor self de cele nonself de către limfocitele T citotoxice. Au rol major în stabilirea compatibilităţii donor - acceptor în transplantele tisulare şi grefele de organe.

Genele de clasă II ocupă locii D (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) existând 12 variante alelice. Aceste gene produc proteine existente pe membrana celulelor cu rol în prezentarea antigenelor către limfocitele T helper, având rol în recunoaşterea antigenelor străine şi declanşarea răspunsului imun umoral. Genele de clasă III codifică unele componente ale ale sistemului complement.

Alelele genelor HLA sunt codominante şi formează un haplotip, care se transmite “în bloc” de la părinţi la descendenţi. Fiecare individ are are două haplotipuri HLA moştenite de la cei doi genitori, fiind semiidentic cu fiecare dintre aceştia. În cazul unei fratrii, un individ are o probabilitate de 25% de a fi idnetic cu unul dintre fraţi, de 50% de a fi semiidentic cu aceştia şi de 25% de a fi diferit de fraţii săi (figura 6.2.).

Sistemul HLA este cel mai polimorfic sistem genetic datorită numărului foarte mare de alele existente în populaţie pentru fiecare locus al sistemului. Fiecare persoană are câte o singură alelă pentru fiecare locus, rezultând un număr de aproximativ 300 milioane de haplotipuri şi 40 miliarde de genotipuri posibile în populaţie. Majoritatea antigenelor HLA pot fi determinate prin metode serologice sau imunologice, contribuind la realizarea profilului biologic al individului. Acesta este util atât pentru identificarea persoanei (haplotipurile HLA pot fi considerate ca devărate “buletine de identitate moleculară”) şi filiaţiei, cât şi în stabilirea predispoziţiei pentru anumite afecţiuni.

1 2 3 4

A1

C11

B12

DR4

I

II

1 2

A3

C8

B9

DR3

A6

C5

B3

DR1

A22

C19

B47

DR8

A3

C8

A22

C19

A1

C11

A6

C5

A1

C11

A22

C19

A3

C8

A6

C5


116

a b c d

Figura 6.2. Modul de transmitere al haplotipurilor HLA Persoana a (II.1.) este semiidentică cu părinţii săi (I.1. şi I.2) sora b (II.2.)

şi fratele c (II.3.) şi diferită complet de sora d (II.4)

6. SENSIBILITATEA GUSTATIVĂ

Sensibilitatea gustativă este un caracter fiziologic determinat monogenic, caracterizat prin existenţa unor praguri gustative diferite pentru cele 4 gusturi fundamentale. Testele efectuate cu zaharină, chinină, sare de bucătărie etc. au arătat că gustul acestor substanţe este perceput în mod diferit de persoane diferite. Unele dintre acestea simţeau gustul substanţelor la concentraţii mici, în timp ce altele percepeau aceste substanţe ca insipide.

Sensibilitatea gustativă prezintă variaţii în funcţie de sex, vârstă, rasă şi chiar în cazul aceluiaşi individ, la testări succesive. Similar sensibilităţii gustative şi în cazul sensibilităţii olfactive, indivizi diferiţi prezintă praguri olfactive distincte. Practic, variabilitatea sensibilităţii gustative este testată folosind fenil tiocarbamidă (PTC) substanţă care este percepută ca amară de către o parte din populaţie şi insipidă de ceillalţi indivizi.

Genotipurile sunt determinate de asocierea a 2 alele: G dominantă şi g recesivă. În tabelul 6.9. sunt prezentate genotipurile posibile şi relaţia lor cu fenotipul, la părinţi şi la descendenţi.

Tabelul 6.9. Relaţia genotip – fenotip pentru caracterul gustător

Fenotip Genotip

Gustător Negustător

GG, Gg gg

Fenotipurile prezente în populaţie sunt gustător (2/3 din populaţie) – percep gustul amar al PTC- şi negustător (1/3 din persoane) - cei care o percep substanţa ca insipidă.

Principalele caractere monogenice sunt: sistemele de grup sanguin AB0, Rh, MN, Xg, caracterele secretor şi gustător, grupele din secreţii, grupele enzimatice şi grupele tisulare HLA;

Sistemul de grup sanguin AB0 se caracterizează prin prezenţa pe hematii a unui antigen specific (A, B sau H) şi prezenţa în ser a tuturor anticorpilor (α, β şi anti-H) cu excepţia celuia (celor) împotriva antigenului de pe eritrocite; antigenele AB0 sunt determinate de genele AB0 (A1, A2, B şi 0);

Datorită antigenicităţii crescute a antigenelor AB0, sistemul AB0 este principalul sistem de grup sanguin cercetat pentru stabilirea compatibilităţii transfuzionale;

Sistemul de grup sanguin Rh este determinat în principal de asocierea a două gene D şi d, existând două fenotipuri caracteristice Rh+ (antigen D prezent) şi Rh- (antigen D absent);


117

În mod natural anticorpii anti-D lipsesc atât la indivizii Rh+, cât şi la cei Rh-, ultimii începând producerea de astfel de anticorpi în urma contactului cu hematii Rh+; o situaţie cu implicaţii patologice este aceea prezentă la femeile Rh-, care au sarcini Rh+, când fătul poate fi afectat datorită trecerii transplacentare a anticorpilor anti-D produşi de mamă; în această situaţie după naştere poate apărea boala hemolitică a nou-născutului, caracterizată prin anemie, hepatosplenomegalie şi icter nuclear

Sistemul MN este determinat în principal de două gene codominante M şi N, fiind caracterizat prin trei fneotipuri: M, N sau MN

Sistemul Xg este caracterizat prin prezenţa sau absenţa de pe hematii a antigenului Xga, determinat de o pereche de gene alele Xga (dominantă) şi Xg (recesivă) care ocupă un locus situat pe cromosomul X; datorită acestei particularităţi femeile pot fi homo- sau heterozigote, în timp ce bărbaţii vor fi obligatoriu hemizigoţi;

Caracterul secretor este determinat de o pereche de gene alele (Se şi se) aflate în relaţie de epistazie cu genele sistemului AB0; în prezenţa genei Se, antigenele AB0 de pe hematii devin hidrosolubile, trecând în secreţiile apoase ale organismului (fenotip secretor); persoanele cu genotip sese sunt considerate nesecretoare, antigenele AB0 fiind absente în secreţiile apoase;

Caracterul gustător este determinat de o pereche de gene alele G şi g, implicate în existenţa unor praguri gustative diferite la persoane diferite;

C. VALOAREA TEORETICĂ ŞI PRACTICĂ A STUDIULUI CARACTERELOR EREDITARE NORMALE

Studiul caracterelor ereditare normale are numeroase aplicaţii teoretice şi practice. Principalele puncte de interes teoretic, legate de studiul caracterelor ereditare

normale, sunt: demonstrarea la om a valabilităţii legilor lui Mendel: “legea purităţii gameţilor” şi “legea

segregării independente a genelor”; studiul funcţiei genice - analiza produşilor genei (proteine sau enzime) permite identificare

pe de o parte a funcţiei genei analizate, iar pe de altă parte poate decela efectele existenţei unei mutaţii genice noi;

evidenţierea la om a unor fenomene genetice, descoperite la alte specii, precum himerele, dubla fecundare, recombinarea genică, nedisjuncţia meiotică, ceea ce atestă universalitatea proceselor genetice, valabile atât cele mai simple organisme, cât şi la mamiferul cel mai evoluat – omul;

studiile de înlănţuire genică între locusul unui caracter fenotipic normal (utilizat ca marker) şi locusul unui caracter morbid permit identificarea unor mutaţii noi şi sunt folosite pentru determinarea indirectă a poziţiei genelor necunoscute pe cromosomi şi implicit pentru realizarea hărţilor cromosomice

Aplicaţiile practice ale studiului caracterelor ereditare normale sunt: Identificarea persoanelor – datorită existenţei a numeroase caractere monogenice normale

şi a polimorfismului fenotipic al acestora probabilitatea ca doi indivizi (cu excepţia gemenilor monozigoţi, care provenind din aceeaşi celulă au aceleaşi gene) să fie identici din punct de vedere genetic minimă. Astfel, se poate spune că fiecare individ este un unicat biologic. Cu cât numărul de caractere monogenice investigate este mai mare, cu atât identificarea unei persoane este mai certă. Totuşi, datorită testării unui număr limitat


118

de sisteme monogenice, stabilirea cu certitudine a identităţii unei persoane este de obicei imposibilă. În condiţiile determinării şi a polimorfismului HLA, probabilitatea de eroare se reduce foarte mult;

Expertiza filiaţiei şi paternităţii – testele de filiaţie şi paternitate nu pot atesta că un copil aparţine unui anumit cuplu sau că un bărbat este tatăl unui anumit copil, datorită folosirii unui număr limitat ssiteme monogenice, aceste teste fiind doar teste de excludere;

- astfel dacă un copil are grupa sanguină 0, iar unul dintre membrii cuplului parental are grupa sanguină A1B se poate declara că acel copil nu aparţine cuplului analizat;

- de asemenea, dacă un bărbat are grupa sanguină A1B, iar copilul a cărui paternitate este contestată are grupul sanguin A2 se poate concluziona că acel bărbat nu poate fi tataăl copilului

diagnosticul tipului de gemelaritate – utilizarea analizei mai multor sisteme monogenice permite să stabilim dacă doi gemeni sunt monozigoţi sau dizigoţi

- în condiţiile în care un anumit caracter monogenic nu concordă la doi gemeni de acelaşi sex, în mod cert cuplul gemelar este dizigot;

- în schimb, dacă toate determinările sunt concordante nu se poate stabili cu exactitate tipul de gemelaritate, dar cu cât numărul de sisteme analizate este mai mare, cu atât probabilitatea gemenilor de a fi monozigoţi este mai mare;

stabilirea compatibilităţii între donator şi primitor în cazul transfuziilor sanguine şi a transplantelor de organe:

- determinarea tipului d egrup sanguin AB0 şi Rh este obligatorie înaintea oricărei transfuzii de sânge, atât la donator, cât şi la primitor, pentru a preveni apariţia unor accidente posttransfuzionale, care pot determina chiar şi decesul persoanei transfuzate;

- în cazul transplantelor de organe, pentru a preveni rejetul grefei, este obligatorie existenţa unei compatibilităţi în sistemul HLA între donator şi primitor (în special pentru genele A, B şi C);

asocierea dintre anumite caracetre monogenice şi unele boli: - incompatibilitatea feto-maternă în sistemul Rh este implicată în patogenia bolii

hemolitice a nou-născutului –determinarea fenotipului Rh, atât la femeia însărcinată cât şi la presupusul tată permite aplicarea unor măsuri de profilaxie primară; cunaşterea existenţei unei imunizări prealabile cu antigen D a femeii Rh- permite în schimb aplicarea unor măsuri de profilaxie secundară, cu scopul împiedicării apariţiei bolii hemolitice a nou-născutului;

- în condiţiile în care este cunoscută existenţa unei înlănţuiri genice între locusul genei unui caracter monogenic normal şi cel al genei implicate într-o boală monogenică, se poate stabili, în mod indirect, prin studii de înlănţuire genică, prezenţa sau absenţa genei mutante la descendenţii unui cuplu cu risc; exemple de astfel de înlănţuiri sunt: - locusul pentru sistemul de grup sanguin Rh şi locusul genei elipsocitozei36; - locusul genelor HLA de clasă III şi locusul 21 hidroxilazei37;

36 Eliptocitoza este o formă de anemie hemolitică intravasculară, determinată de prezenţa unor hematii de formă ovalară, ceea ce favorizează distrugerea prematură a hematiilor şi formarea trombilor capilari; afecţiunea are o transmitere dominant autosomală şi este determinată de mutaţia genei α sau β spectrinei, gene localizate 1p36.2-p34, la fel ca şi genele sistemului de grup snaguin Rh


119

- persoanele negustătoare au un risc crescut de a face hipotiroidie – unii compuşi naturali, similari feniltiocarbamidei, au acţiune antitiroidiană – persoanele negustătoare deoarece nu percep gustul amar al acestor compuşi pot dezvolta un mixedem ca urmare a consumului exagerat de produse vegetale ce conţin aceşti produşi38;

- persoanele cu genotip ZZ, MZ, SZ sau MS pentru α1-antitripsină au un risc crescut de a face emfizem pulmonar, poliartrită reumatoidă sau hepatică cronică;

- unele haplotipuri HLA sunt asociate cu anumite afecţiuni – explicaţia acestei asocieri nu este încă posibilă, dar depistarea unui anumit haplotip HLA la o persoană creşte riscul individului respectiv de a face boala; exemple de astfel de asocieri sunt: - diabet zaharat tip I - haplotipul HLA DR3 sau DR4; - spondilita ankilopoetică - haplotipul HLA B27; - hemocromatoză- haplotipul HLA A3.


A. STABILIREA PATERNITĂŢII ŞI FILIAŢIEI Stabilirea paternităţii şi filiaţiei prin folosirea grupelor ABO se face ţinând cont de următoarele 4 reguli: Antigenele A1, A2 sau B nu pot fi prezente în sângele unui copil, dacă nu se găsesc în sângele unuia sau

ambilor părinţi; un părinte AB trebuie să transmită copiilor gena A sau B şi nu poate avea copii cu grupa 0; persoană cu grupa 0 nu poate fi părintele unui copil cu grupa AB; dacă ambii părinţi sunt cu grupa 0, atunci toţi copii vor avea grupa 0. De la aceste reguli fac excepţie

persoanele homozigote hh (fenotip Bombay) Ţinând cont de relaţiile genotip - fenotip şi de relaţiile dintre genele existente în sistemele de grup sanguin, precum şi de legile lui Mendel, se pot stabili raţionamentele necesare pentru rezolvarea următoarelor tipuri de probleme:

1. DETERMINAREA GRUPELOR SANGUINE POSIBILE LA COPII

Exemplu: determinaţi care sunt grupele posibile şi imposibile la copiii unor părinţi cu grupele A1, respectiv B. Rezolvare: ştiind că grupul sanguin A1 al unui părinte poate fi determinat de unul din următoarele genotipuri: A1A1, A1A2 sau A10, iar grupul sanguin B al celuilalt părinte poate fi determinat de genotipurile BB sau B0, prin încrucişarea gameţilor posibili (purtători ai unei singure gene) la copil pot rezulta genotipurile sau fenotipurile prezentate în tabelul 6.10.:

Tabelul 6.10. Genotipurile şi fenotipurile copiilor unor părinţi cu grupe sanguin A1 şi B

37 21-hidroxilaza este o enzimă cheie în metabolizarea colesterolului la nivelul cortico-suprarenalei şi transformarea acestuia în gluco- sau mineralocorticoizi; deficitul enzimatic produce o afecţiune gravă caracterizată prin: nivel scăzut al glucocorticoizilor (hipoglicemie şi răspuns inadecvat la stres şi infecţii) nivel scăzut al mineralocorticoizilor (pierdere crescută de apă şi Na prin urină şi hipotensiune arterială) nivel crescut al androgenilor (masculinizarea prenatală atât a feţilor de sex masculin, cât şi a celor de sex feminin) şi nivel crescut al ACTH-ului prin feed-back negativ (hiperplazie congenitală a corticosuprarenalelor) 38 tiocarbamida este folosită în tratamentul hipertiroidiilor datorită limitării sintezei de hormoni tiroidieni


120

Încrucişări parentale

Gameţi Genotip copii Fenotip copii

A1A1 x BB A1 + B A1B A1BA1A1 x B0 A1 + B sau 0 A10 sau B0 A1 sau B A1A2 x BB A1 sau A2+ B A1B sau A2B A1B sau A2B A1A2 x B0 A1 sau A2+ B sau 0 A10, A20, A1B sau A2B A1, A2, A1B sau A2B A10 x BB A1 sau 0+ B A1B sau B0 A1B sau B A10 x B0 A1 sau 0+ B sau 0 A10, A1B, B0 sau 00 A1, A1B, B sau 0

Teoretic, se poate remarca faptul că din încrucişarea acestor părinţi se pot obţine copii având oricare din cele 6 grupe – A1, A2, B, 0, A1B, A2B, deşi unele genotipuri sunt imposibile: A1A1, A1A2, A2A2, BB. Este evident că problema de mai sus este o problemă teoretică, în care au fost luate în considerare toate variantele genotipice parentale posibile. În realitate, un individ nu poate avea în acelaşi timp mai multe genotipuri.

2 DETERMINAREA GRUPELOR SANGUINE POSIBILE LA PĂRINŢI

Exemplu: determinaţi grupele posibile ale părinţilor unui copil cu grupa A2. Rezolvare: un copil cu grupa A2 poate avea teoretic genotipuril A2A2 sau A2O. Ţinând cont de legelile lui Mendel, este clar că una dintre gene vine de la mamă, iar cealaltă de la tată, asocierile parentale posibile fiind prezentate în tabelul 6.11.

Tabelul 6.11. Genotipuri şi fenotipuri posibile la părinţii unui copil cu grup sanguin A2

Genotip copil A2A2 A20

Gameţi parentali Gameţi parentali A2 A2 A2 0

Genotipuri părinţi Genotipuri părinţi A2A2, A20, A1A2, A2B A2A2, A20, A1A2, A2B A2A2, A20, A1A2,

A2B 00, A10, A20, B0

Fenotipuri părinţi Fenotipuri părinţiA2, A1, A2B A2, A1, A2B A2, A1, A2B 0, A1, A2, B

Din tabelul 6.11. se observă că pot exista două tipuri de asocieri parentale: fiecare dintre părinţi poate avea grupele sanguine A2, A1, sau A2B; unul dintre părinţi poate avea grupele sanguine A2, A1, sau A2B, în timp ce celălalt părinte poate avea

grupele sanguine 0, A1, A2, sau B.

3. DETERMINAREA FILIAŢIEI ŞI PATERNITĂŢII

Stabilirea fenotipurilor posibile ale tatălui, când sunt cunoscute fenotipurile mamei şi copilului. Exemplu: o mamă A1 are un copil cu grupa B; stabiliţi grupele posibile ale tatălui. Rezolvare:

- în condiţiile în care mama are grupa sanguină A1, genotipurile posibile materne sunt A1A1, A1A2, A10;

- deoarece copilul are grupa sanguină B, genotipurile posibile ale acestuia sunt BB sau B0;

- ştiind că orice copil moşteneşte o genă de la mamă şi una de la tată, este clar că de la mamă acest copil a primit gena 0, genotipul său fiind B0, iar cel al mamei A10;

- în aceste condiţii, copilul moşteneşte obligatoriu de la tată gena B, genotipurile posibile ale tatălui fiind BB, B0, A1B sau A2B, fenotipurile corespunzătoare fiind: B A1B şi A2B (figura 6.3.).

B, A1B,A2B

A1 A1A1 A1A2 A10

BB, B0 A1B A2B


121

Figura 6.3. Identificarea genotipurilor şi fenotipurilor paterne în sistemul de grup sanguin AB0, când sunt cunoscute fenotipurile mamei şi copilului

Stabilirea legitimităţii unui copil când se cunoaşte fenotipul acestuia, al părinţilor săi şi al unui frate mai mare considerat legitim. Noţiunea de “legitim” se referă întotdeauna la tatăl copilului, deoarece mama copilului este în general cunoscută, una dintre genele ei regăsindu-se obligatoriu în genotipul copilului; în rarele cazuri în care mama poate fi nelegitimă (genotipul copilului nu are gene materne), este vorba întotdeauna despre un copil adoptat voluntar sau involuntar (schimbat la maternitate).

Exemplu: tatăl este A1, mama este B, ei au 6 copii în ordinea următoare: A1, A2, B, O, A1B, A2B. Considerând primul copil sigur legitim, care dintre ceilalţi copii sunt legitimi. Rezolvare: teoretic tatăl poate avea genotipurile: A1A1, A1A2, A10, iar mama poae avea genotipurile BB sau

B0 dacă primul copil este sigur legitim şi are grupul sanguin A1, ţinând cont de fenotipul mamei

înseamnă că genotipul său este A1O, iar cel al mamei sale BO tatăl poate avea oricare din genotipurile grupei A1; dacă al doilea copil, grup sanguin A2, este legitim, tatăl are obligatoriu genotipul A1A2; în aceste condiţii, copiii cu grupa sanguină B şi O nu pot fi legitimi, deoarece ar trebui să moştenească

de la tată gena 0, în timp ce copiii cu grupe sanguine A1B şi A2B sunt legitimi (figura 6.4.). În cazul familiei de mai sus dacă se consideră ca sigur legitim copilul 4, grup sanguin O, părinţii săi vor fi A1O şi BO, nelegitimi fiind copiii 2 (A2 ) şi 6 (A2B).

B. DETERMINAREA COMPATIBILITĂŢII TRANSFUZIONALE

Determinarea compatibilităţii transfuzionale se realizează în funcţie de proporţia de antigene pe care donatorul şi primitorul le au în comun. Acelaşi principiu este valabil şi pentru antigenele sistemului HLA în cazul transplantelor de ţesuturi sau organe. Pentru stabilirea compatibilităţii transfuzionale esenţiale sunt determinarea antigenelor AB0 şi Rh, celălalte sisteme nefiind importante, datorită antigenicităţii reduse. Determinarea grupelor sanguine în sistemele AB0 şi Rh: principiul metodei – determinarea prezenţei unor antigene specifice pe hematiile indivizilor investigaţi

se face pe baza reacţiei antigen-anticorp, produse la contactul dintre eritrocitele testate şi diverse tipuri de ser

A1 B

A1

BB B0

A1A1 A1A2 A10

A A A A

A2 B 0 A1B A2B


122

Figura 6.4. Stabilirea legitimităţii copiilor unui cuplu

metodologie se recoltează câteva picături de sânge prin puncţie capilară, respectându-se principiile asepsiei; sângele recoltat este pus în contact cu ser ce conţine anticorpi α, β şi anti-D

interpretarea rezultatelor dacă se produce aglutinare numai la contact cu ser α, înseamnă că persoana are grupa A1 sau

A2, având pe hematii antigen A39; dacă se produce aglutinare numai la contact cu ser β, înseamnă că persoana are grupa B, având

pe hematii antigen B; dacă se produce aglutinare la contact cu ser α şi β, înseamnă că persoana are grupa A1B sau

A2B, având pe hematii atât antigen A, cât şi antigen B; dacă nu se produce aglutinare la contact cu ser α şi β, înseamnă că persoana are grupa 0,

neavând pe hematii nici antigen A, nici antigen B; dacă se produce aglutinare la contact cu ser anti-D, înseamnă că persoana are grupa Rh+, având

pe hematii antigen D. O problemă esenţială în cazul transfuziilor de sânge este legată de obligativitatea determinării grupei sanguine, atât a donatorului, cât şi a primitorului, înainte de efectuarea transfuziei. În cazul efectuării transfuziei de sânge este preferabilă administrarea de sânge izogrup AB0 şi Rh. În condiţii de urgenţă şi când volumul de sânge transfuzat nu depăşeşte 500 mL, este acceptabilă administrarea de sânge 0, fără a se ţine cont de grupa Rh. Totuşi, dacă persoana este Rh- şi a fost imunizată în prealabil cu antigen D, atunci obligatoriu trebuie să primească sânge Rh-.

C. DETERMINAREA STATUSULUI SECRETOR Principiul metodei constă în evidenţierea aglutinării antigenelor A, B, H de către aglutininele corespunzătoare, prezente în serul test. Evidenţierea se realizează prin adăugarea de hematii corespunzătoare grupului sanguin al probantului. Materialul necesar este reprezentat de rondele de hârtie de filtru (Ø = 5 mm) sterile, pense, lame de microscopie curate, ser test A, B, 0; concentrat de hematii de grup A, B, AB şi 0 în diluţie 3-5% ; micropipete. Modul de lucru este următorul se stabileşte grupul sanguin al probantului; se îmbibă bine cu salivă o rondelă de hârtie, manevrându-se cu pensa, după care se pune pe o lamă de

microscopie; peste rondelă se adaugă 1 ml de ser test ce conţine aglutinine care reacţionează cu antigenele specifice

grupului sanguin al probantului: pentru o persoană cu grup sanguin A se foloseşte ser B, care conţine aglutinine α; pentru o persoană cu grup sanguin B se foloseşte ser A, care conţine aglutinine β; pentru o persoană cu grup sanguin AB se foloseşte ser 0, care conţine aglutinine α şi β; pentru o persoană cu grup sanguin 0 se foloseşte ser anti-H, recoltat de la un individ cu grup

sanguin AB; lama de microscopie se ţine 10 minute la temperatura camerei, pentru a permite desfăşurarea eventualei

reacţii de aglutinare; reacţia de aglutinarea se evidenţiază indirect:

peste rondele se pune 1 ml de suspensie de hematii izogrup cu probantul;

39 Determinarea prezenţei antigenului A1 sau A2 este posibilă doar în condiţii speciale de dotare


123

se aşteaptă 10 minute, pentru realizarea posibilei reacţii Ag-Ac; interpretarea rezultatelor se face în modul următor:

prezenţa aglutinării indică statusul nesecretor - în salivă nu există antigene AB0, astfel încât anticorpii din serul test rămân activi şi reacţionează cu antigenele din suspensia eritrocitară;

absenţa aglutinării indică statusul secretor – în salivă există antigene AB0, care aglutinează în prezenţa anticorpilor din serul test, iar la adăugarea suspensiei eritrocitare antigenele nu sunt aglutinate, deoarece nu mai există anticorpi liberi.

D. DETERMINAREA SENSIBILITĂŢII GUSTATIVE LA FENILTIOCARBAMIDĂ

Principiul metodei constă în aplicarea pe limbă, în mod seriat, a unor soluţii cu concentraţie crescândă de feniltiocarbamidă - PTC (phenylthiocarbamide) pentru a evidenţia pragul percepţiei gustative amare. Materialul necesar: 7 soluţii de PTC (soluţia 1 - 1300 mg%; soluţia 2 - 325 mg%; soluţia 3 - 81,25 mg%; soluţia 4 - 20,32 mg%; soluţia 5 - 5,08 mg%; soluţia 6 - 1,27 mg%; soluţia 7 - 0,32 mg%) obţinute prin diluări succesive de ¼ ale unei soluţii de bază cu o concentraţie de 1,3 g%, şapte pipete, două pahare cu apă distilată. Modul de lucru: se aplică cu pipeta, pe limba persoanei testate, 1-2 picături din soluţia cea mai diluată de PTC (soluţia

7); dacă persoana nu percepe un gust amar distinct, se trece la soluţiile următoare din ce în ce mai

concentrate, până ce individul identifică gustul specific al feniltiocarbamidei; soluţia cea mai diluată, percepută amar în comparaţie cu apa, este soluţia prag probabilă.

Pentru stabilirea riguroasă a pragului real subiectul trebuie să guste din cele două soluţii cu concentraţii adiacente soluţiei la care a perceput gustul amar, fiecare probă fiind urmată de clătirea gurii cu apă.


A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: Genă alelă Haplotip Dominanţă Recesivitate Codominanţă Epistazie Aglutinogen Aglutinină Sistem hla Negustător Gustător Secretor Nesecretor Grup seric Fenotip Bombay Boala hemolitică a nou-născutului

B. INTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. De ce caracterele ereditare monogenice se transmit conform legilor lui Mendel? 2. Ce reprezintă termenul de locus? Dar cel de gene alele? 3. Care sunt diferenţele dintre termenii: polialelie şi poligenie? 4. Ce antigene AB0 prezintă un individ cu grup sanguin A1? Dar unul cu grup sanguin B? 5. În cazul sistemului de grup sanguin AB0, un anumit antigen şi anticorpul corespunzător se exclud

reciproc. Este valabil acest lucru şi în cazul sistemului de grup sanguin Rh? 6. De ce o persoană cu grup sanguin 0 este considerată donator universal? 7. De ce o persoană cu grup sanguin AB este considerată primitor universal? 8. Care sunt particularităţile fenotipului Bombay? 9. Care sunt semnele şi simptomele bolii hemolitice a nou-născutului? 10. Poate fi prevenită boala heolitică a nou-născutului? Explicaţi opţiunea Dv.


124

11. De ce genele sistemului HLA se transmit în bloc de la părinţi la copii? 12. Care este cel mai polimorf sistem monogenic prezent la specia umană? 13. Este adevărată afirmaţia: “genele pentru caracterul gustător se află în relaţie de epistazie cu genele

sistemului de grup sanguin ABO”? Cu care gene se află în relaţie de epistazie genele AB0? 14. Ce relaţie există între genele haptoglobinelor?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPL| I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"):

1. O femeie are un copil care a avut boala hemolitică a nou-născutului, iar soţul său a prezentat şi el boala în copilărie. Ce risc are cuplul de a avea un alt copil afectat? A. 100%; B. 75%; C. 50%; D. 25%; E. 0%

2. O femeie cu grupele sanguine A1, MN a născut doi copii gemeni: unul cu grupele A1, M, iar celălalt cu grupele AB, MN. Care dintre următorii bărbaţi poate fi tatăl copiilor? A. A1, N; B. O,MN C. A1B, M; D. A1,N; E. A2B, N.

3. Ce grupe sanguine în sistemul Xg vor avea copiii următorului cuplu: mama: Xg(a+); tata: Xg(a-) ? A.Toţi copiii Xg(a+); B.Fetele Xg(a-) şi băieţii Xg(a+); C.Fetele Xg(a+) şi băieţii Xg(a-); D. Copii Xg(a+) sau Xg(a-) în funcţie de genotipul mamei; E. Fetele Xg(a+) sau Xg(a-) în funcţie de genotipul mamei şi băieţii numai Xg(a-).

4. Un copil gustător homozigot are ambele bunici negustătoare. Care sunt genotipurile parinţilor? A. GG şi GG; B. gg şi gg; C. Gg şi GG D. Gg şi gg; E. Gg şi Gg.

5. O pacientă are cariotipul 47,XXX; ea are grupa sanguină Xg(a-). Tatăl ei are grupa sanguină Xg(a-), iar mama ei este Xg(a+); bunica maternă a pacientei a avut grupa sanguină Xg(a-). Stabiliţi când a avut loc nedisjuncţia meiotică ce a determinat anomalia cromosomică existentă în cariotipul pacientei,

A. În cursul primei diviziuni în meioza paternă; B. În cursul primei diviziuni în meioza maternă; C. În cursul diviziunii ecvaţionale a meiozei paterne; D. În cursul celei de-a doua diviziuni meiotice materne; E. În cursul primei sau al celei de-a doua diviziuni meiotice materne.


6. În cadrul unei familii, tatăl are grupa A2 şi este Rh+, mama este O, Rh-, iar cei patru copii au, în ordine, următoarele fenotipuri: - primul - O, Rh+; al doilea - O, Rh-; al treilea - A2, Rh+ - ; al patrulea -A2, Rh- . Care dintre propoziţiile următoare sunt corecte?

1. genotipul tatălui este A2O, Dd; 2. genotipul tatălui este A2A2, Dd; 3. proporţia teoretică pentru fiecare fenotip dintre cele ale descendenţilor este de 25%; 4. la cea de a doua sarcină este posibilă apariţia unui accident de incompatibilitate feto-maternă.

7. Analizaţi familia de mai jos şi stabiliţi care copii sunt nelegitimi; mama este A2, M, se, iar tatăl este B, MN, Se (mama sa a fost se). Copiii au următoarele fenotipuri:

1. A2B, MN, Se; 3. A2, M, se; 2. B, N, Se; 4. A1B, MN, se.

8. In situaţia de mai jos care dintre copiii cuplului sunt nelegitimi ştiind ca bunica lor materna a avut grupa O şi a fost nesecretoare?


125

Mama: A1, Rh+, N, Se, Hp 2-2; Tata: B, Rh-, MN, se, Hp 1-2 (părinţii au fost A1B şi A2B); Copii: 1. A1B, Rh-, MN, se, Hp 1-2; 2. O, Rh-, MN, se, Hp 2-2; 3. B, Rh+, N, Se, Hp 2-2; 4. B, Rh+, M, Se, Hp 1-1. 9. Care dintre următoarele propoziţii referitoare la transmiterea grupelor sanguine sunt corecte? 1. transmiterea în sistemul sanguin ABO se face după legile monohibridării; 2. dacă o femeie cu grupa A1B naşte un copil cu cu grupa A1, nu se poate face excluderea de la paternitate folosind numai sistemul ABO; 3. doi părinţi Rh+ pot avea copii Rh-; 4. doi părinţi având grupele A1, respectiv B nu pot avea copii cu grupa sanguină A2B.

10. În următoarea situaţie precizaţi care femeie poate fi mama copilului: tata: B, M , Rh+, Xg(a+) copilul (băiat): A1B, MN, Rh-, Xg(a-) femei: 1. B, MN, Rh-, Xg(a+) 2. A2B, N, Rh-, Xg(a+) 3. A1B, M, Rh-, Xg(a+) 4. A1 , MN, Rh+, Xg(a+) .


10. O persoană cu fenotip Bombay nu prezintă în salivă antigenele sistemului ABO deoarece în absenţa genei H, antigenele sistemului ABO nu pot fi transformate din stare liposolubilă în stare hidrosolubilă.

11. Antigenele sistemului ABO se găsesc la unele persoane şi în salivă deoarece antigenele ABO de pe suprafaţa hematiilor sunt liposolubile.

IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere:

12. Într-o maternitate s-au încurcat brasardele care identificau nou-născuţii. Identificaţi cărui cuplu aparţin fiecare dintre următorii copii? COPII: PĂRINŢI 1. O, MN, Hp1-1, Se. A. A1, M, Hp1-1, Se / B, MN, Hp1-2, Se. 2 A1B, N, Hp1-2, Se. B. B, N, Hp1-2, Se / A1B, N, Hp2-2, se. 3. A2, MN, Hp1-1, Se. C. O, M, Hp1-2, se /A2, N, Hp2-2, Se. 4. O, N, Hp1-2, se. D. A2, M, Hp2-2, se / B, MN, Hp2-2, se. 5. A2B, M, Hp2-2, se. E. B, N, Hp1-2, se / B, MN, Hp1-2, se.

13. La o maternitate s-au încurcat brasardele care identificau nou-născuţii. Determinaţi cărei familii aparţine fiecare dintre următorii copii: COPII: PARINŢI: 1. 0, M, Rh+, G; A. 0, MN, Rh-, g / A1, MN, Rh-, g; 2. A1, MN, Rh-, g; B. A1, M, Rh-, G / A2B, M, Rh-, G; 3. 0, N, Rh-, G; C. A2, MN, Rh+, G / B, N, Rh-, g; 4. A1B, M, Rh-, G; D. A1B, M, Rh+, g / A1, M, Rh+, g; 5. A1B, M, Rh+, g; E. B, MN, Rh+, g / A2, M, Rh-, G.

7. TRANSMITEREA EREDITARÃ A CARACTERELOR MONOGENICE ANORMALE.

BOLI MONOGENICE.

I. DATE TEORETICE

A. GENERALITĂŢI Factorii mutageni externi fizici, chimici, biologici, pot modifica accidental structura

materialului genetic (secvenţa deoxiribonucleotidelor dintr-o moleculă de ADN). Modificările permanente ale genelor, care se pot propaga (transmite) de la o generaţie de organisme la alta, sunt denumite mutaţii.

Mutaţiile determină modificarea caracterului produs de o anumită genă. De multe ori, mutaţia unei gene poate modifica atât de mult expresia unui caracter (absenţa unei enzime, producerea unei proteine toxice, etc.) încât se ajunge la un fenotip anormal - boală genetică.

Bolile monogenice sunt produse prin mutaţii care afectează o singură pereche de gene alele. Bolile monogenice sunt caracterizate prin fenotipuri anormale, determinate exclusiv de factorii ereditari. Ele reprezintă o parte importantă a patologiei genetice, deoarece sunt numeroase - peste 4.500 de entităţi clinice distincte, per ansamblu sunt relativ frecvente – afectând 1-2% dintre nou-născuţii vii - şi au un impact deosebit asupra individului şi familiei sale, fiind boli cronice, cu risc ridicat de recurenţă la descendenţi.

Transmiterea ereditară a caracterelor determinate de perechi de factori ereditari a fost studiată şi descrisă de Gregor Mendel. Bolile monogenice prezintă toate particularităţile caracterelor ereditare descrise de Mendel.

Identificarea unuia dintre tipurile mendeliene de transmitere genealogică pentru o anumită boală ereditară permite, de obicei, evaluarea corectă a riscului de recurenţă (de reapariţie) al afecţiunii la alţi membri ai familiei. De aceea, dacă o boală ereditară este prezentă într-o anumită familie, investigaţia genetică presupune în primul rând efectuarea anamnezei familiale şi a arborelui genealogic (vezi capitolul „Consultul genetic”). Pe baza arborelui genealogic, folosind criterii specifice fiecărui tip, se poate stabili modul de transmitere monogenic al afecţiunii: dominant sau recesiv, autosomal sau legat de cromosomul X. Cel mai frecvent însă, transmiterea mendeliană este stabilită pe baza asocierii unui anumit diagnostic clinic cu un tip de transmitere compatibil (care corespunde datelor din literatur de specialitate).

Evaluarea tipului de transmitere ereditară a unei boli genetice poate fi extrem de dificilă, datorită manifestărilor variabile ale mutaţiilor şi fenomenului de heterogenitate genetică40. Bolile care se transmit genealogic după criterii mendeliene sunt prezentate într-un

40 Heterogenitatea genetică – fenomenul genetic prin care genotipuri diferite determină fenotipuri identice sau asemănătoare

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

134

vast catalog – „Mendelian Inheritance in Man” (ed. 12, 1998), realizat de un colectiv de cercetători condus de Victor McKusick, de la Johns Hopkins University, fapt care uşurează mult efortul geneticianului de a stabili un diagnostic corect (tabelul 7.1.).

Tabelul 7.1. Exemple de boli monogenice.

TIP DE TRANSMITERE EXEMPLE DE BOLI MONOGENICE Dominant Autosomal

Boli cu afectare neurologică sau musculară Coreea Huntington Boala Steinert (distrofia miotonică)

Boli cu afectare scheletică Acondroplazia Osteogenesis imperfecta Brahidactilia

Boli cu afectare cardiovasculară Hipercolesterolemia familială Sindromul Marfan

Boli cu afectare oculară Hemeralopia Aniridia

Boli cu afectare renală Boala polichistică renală cu transmitere dominant

autosomală (ADPKD) Sindromul Alport

Boli cu afectare cutanată Epidermoliza buloasă Ihtioza vulgară Hipercheratoza palmo-plantară

Boli hematologice Boala von Willebrand Microsferocitoza ereditară Minkowski-Chauffard

Cancere ereditare Cancerul de sân Cancerul de colon nonpolipozic Polipoza colică familială Retinoblastomul

Dominant legat de cromosomul X (rare)

Boli cu afectare neurologică Sindromul Rett

Boli cu afectare scheletică Rahitismul hipofosfatemic (rezistent la vitamina D)

Boli cu afectare cutanată Incontinentia pigmenti Sindromul Goltz

Recesiv Autosomal Boli metabolice Glicogenozele, Galactozemia Sindromul Morquio, Sindromul Hurler Boala Niemann-Pick, Boala Gaucher Aminoacidopatii: Fenilcetonuria, Homocistinuria

Boli hematologice Hemoglobinopatii: Drepanocitoza, Beta-talasemia

Boli cu afectare cutanată Albinismul oculo-cutanat Xeroderma pigmentosum

Boli cu afectare pulmonară


135

TIP DE TRANSMITERE EXEMPLE DE BOLI MONOGENICE Mucoviscidoza

Boli cu afectarea organelor de simţ Retinopatia pigmentară Surditatea congenitală

Recesiv legat de cromosomul X

Boli cu afectare musculară Distrofia musculară Duchenne / Becker

Boli cu afectare hematologică Hemofilia A şi B Deficitul de G6PD

Boli cu afectare oculară Albinismul ocular Discromatopsiile (daltonismul)

Boli metabolice Boala Lesch-Nyhan Boala Hunter Diabetul insipid nefrogen

În acest capitol genele mutante anormale vor fi notate simbolic cu „A”, dacă sunt dominante, respectiv cu „a” dacă sunt recesive. În raport cu gena mutantă A, respectiv a, variantele alelice normale corespunzătoare vor fi notate cu „n” (genă normală recesivă) respectiv „N” (genă normală dominantă).

B. TRANSMITEREA DOMINANTĂ O boală genetică este considerată dominantă în situaţia în care se manifestă atât la

homozigoţi, cât şi la heterozigoţi. Alterarea unei singure alele duce la apariţia fenotipului anormal la heterozigoţi prin diferite mecanisme: haploinsuficienţă – când singura genă normală nu produce o cantitate de proteină suficientă

pentru realizarea funcţiilor celulare; câştig de funcţie – când proteina mutantă este produsă în cantităţi prea mari, uneori ectopic

sau are o activitate funcţională crescută; sinteză de proteine toxice sau cu alte funcţii fiziologice decât cea normală; efecte dominante negative – când proteina anormală face parte din complexe multimerice şi

interferă chiar cu funcţia proteinei normale. Bolile dominante sunt boli rare (cele mai frecvente au o incidenţă de 1:1.000 indivizi),

iar căsătoriile între bolnavi sunt foarte rare, exceptând căsătoriile asortative, precum cele dintre doi bolnavi de acondroplazie sau doi surzi. Astfel, homozigoţii afectaţi sunt extrem de rari. În plus, deseori homozigoţii pentru alela mutantă sunt mai grav afectaţi decât heterozigoţii - dominanţă incompletă (ex. hipercolesterolemia familială) sau sunt neviabili (ex. acondroplazia). În consecinţă, în majoritatea cazurilor, bolnavii cu afecţiuni dominante sunt heterozigoţi (cu o singură alelă mutantă) sau hemizigoţi (tabelul 7.2.).

Tabel 7.2. Corelaţia între genotip şi fenotip în cazul bolilor dominante

Transmiterea dominantă autosomală

Transmiterea dominant legată de cromosomul X

Genotipuri

AA An

nn XAXA XAXn

XAY

XnXn

XnY

Fenotipuri Bolnavi Sănătoşi Bolnavi Sănătoşi


136

Au fost identificate boli dominante determinate de mutaţii la nivelul unor loci genetici de pe autosomi (boli dominante autosomale) sau de mutaţii la nivelul unor loci de pe cromosomul X (boli dominante legate de cromosomul X, gonosomale).

Bolile dominante pot fi recunoscute cu uşurinţă prin examinarea arborelui genealogic al unei familii întrucât prezintă următoarele caracteristici: a. Număr mare de bolnavi în familie. Frecvenţa bolii se apreciază comparând numărul

bolnavilor cu numărul indivizilor sănătoşi. În familiile cu boli dominante, frecvenţa bolnavilor este mare deoarece toţi indivizii care au gena anormală (AA, An sau XAXA, XAXn, XAY) sunt bolnavi.

b. Continuitatea transmiterii bolii din generaţie în generaţie - transmitere genealogică verticală. Continuitatea transmiterii se apreciază urmărind pe verticală, în arborele genealogic, apariţia indivizilor bolnavi. De obicei, bolile dominante au o transmitere continuă deoarece toţi indivizii bolnavi pot transmite gena anormală unora dintre descendenţi, iar orice bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi.

c. Doi părinţi sănătoşi nu pot avea copii bolnavi. În bolile dominante cu penetranţă completă, doi părinţi sănătoşi (nn sau XnXn, XnY) nu pot avea copii bolnavi deoarece, neavând genele anormale, nu le pot transmite copiilor lor. Interacţiunile între gene nealele şi factorii de mediu determină uneori o expresivitate variabilă a mutaţiilor sau o penetranţă incompletă (vezi subcapitolul D) şi pot duce aparent la „salturi” peste o generaţie şi naşterea unui copil bolnav (cu o boală dominantă) din părinţi sănătoşi.

d. Doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi. În familiile cu boli dominante, dacă ambii părinţi bolnavi sunt heterozigoţi (An boli autosomale) sau mama este heterozigotă (XAXn boli legate de cromosomul X), ei pot transmite genele normale unora dintre descendenţi şi pot avea copii sănătoşi (vezi tabelele 7.3. şi 7.4.). Această situaţie este rară, fiind întâlnită doar în asocierile preferenţiale în care partenerii au acelaşi handicap.

e. Consanguinitate absentă sau redusă. Consanguinitatea (căsătoria între persoane cu fond genetic comun – înrudite) nu are importanţă în bolile dominante deoarece un individ bolnav poate avea copii bolnavi, indiferent dacă se căsătoreşte cu o persoană sănătoasă neînrudită sau cu o persoană din aceeaşi familie.

1. TRANSMITEREA DOMINANTĂ AUTOSOMALĂ

Bolile dominante autosomale sunt consecinţa mutaţiilor dominante produse la nivelul unor loci de pe autosomi (perechile de cromosomi 1-22). Există numeroase afecţiuni de acest tip, iar unele boli dominante autosomale sunt frecvente (de exemplu, hipercolesterolemia familială afectează 1:500 indivizi, iar boala polichistică renală transmisă dominant autosomal afectează 1:1.000 indivizi în populaţia caucaziană). Ambele sexe sunt afectate în proporţii relativ egale, bolnavii fiind în mare majoritate heterozigoţi.

Analiza transmiterii bolilor dominante autosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.1.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.3.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni.


137

Figura 7.1. Arbore genealogic sugestiv pentru o boală ereditară dominantă autosomală

Tabelul 7.3. Bolile dominante autosomale: cupluri parentale şi descendenţii lor

Încrucişări parentale Genotipuri parentale

Gameţi Genotipuri copii (proporţii)

Fenotipuri copii (proporţii)

Ambii părinţi sunt sănătoşi

nn + nn n x n nn (toţi)

sănătoşi (toţi)

Un părinte bolnav (heterozigot) şi un părinte sănătos

An + nn (A + n) x n

An (1/2) nn (1/2)

bolnavi (1/2) sănătoşi (1/2)

Un părinte bolnav (homozigot) şi un părinte sănătos

AA + nn A x n An (toţi) bolnavi (toţi)

Ambii părinţi sunt bolnavi (heterozigoţi)

An + An (A + n) x

(A + n)

AA (1/4) An (1/2) nn (1/4)

bolnavi (3/4)

sănătoşi (1/4) Ambii părinţi sunt bolnavi (homozigot + heterozigot)

AA + An A x (A + n)

AA (1/2) An (1/2)

bolnavi (toţi)

Ambii părinţi sunt bolnavi (homozigoţi)

AA + AA A x A AA (toţi)

bolnavi (toţi)

Bolile dominant autosomale se particularizează prin: a. Orice bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi. Transmiterea genealogică

a afecţiunii este verticală, continuă. Doi părinţi sănătoşi nu pot avea copii bolnavi deoarece nu posedă gena anormală. Excepţii de la această regulă apar în afecţiunile dominante autosomale caracterizate prin penetranţă incompletă sau când mutaţia s-a produs în celulele liniei germinale ale unuia dintre părinţi.

b. Bărbaţii şi femeile sunt afectaţi în proporţii egale. c. Atât bărbaţii, cât şi femeile pot transmite afecţiunea la descendenţii lor. d. Doi părinţi cu aceeaşi boală dominantă pot avea copii sănătoşi şi băieţi şi fete. e. Bărbaţii bolnavi pot transmite boala fiilor lor (transmitere tată – fiu posibilă) dovadă că

gena mutantă nu se găseşte pe cromosomul X, pe care băieţii îl moştenesc de la mame. f. Bărbaţii bolnavi (heterozigoţi) pot avea fiice sănătoase (indiferent dacă mama este

sănătoasă sau bolnavă – heterozigotă). Naşterea unei fete perfect sănătoase, când tatăl este afectat, este o dovadă a faptului că gena mutantă se găseşte pe alt cromosom decât cromosomul X.

g. Riscul de recurenţă a bolii la descendenţii unui pacient (indiferent de sex) cu o boală dominantă autosomală este în general de 50%. Deoarece pacienţii cu boli dominante


138

autosomale sunt în majoritate heterozigoţi (cu o alelă normală şi una mutantă) probabilitatea ca un gamet să conţină la nivelul locusului respectiv gena mutantă este de 1/2 (50%). Dacă partenerul de cuplu este sănătos, el are gameţi doar cu alela normală, existând o probabilitate (risc) de 1/2 (50%) ca orice sarcină să ducă la naşterea unui copil afectat (heterozigot) (tabelul 7.4.), indiferent de sexul acestuia.

Tabelul 7.4. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă pentru boli dominante autosomale (un părinte afectat)

Mama n n

Tată A An An

n nn nn

2. TRANSMITEREA DOMINANTĂ LEGATĂ DE CROMOSOMUL X

Bolile numite gonosomale sunt consecinţa mutaţiilor genelor situate pe cromosomul X (genele situate pe cromosomul Y sunt în majoritate implicate în procesul de sexualizare şi până în prezent nu au fost identificate mutaţii care să determine boli ereditare). Sunt cunoscute puţine boli legate de cromosomul X care să fie consecinţa unor mutaţii dominante (un exemplu fiind rahitismul hipofosfatemic, rezistent la vitamina D).

În cazul bolilor dominante gonosomale, atât femeile, cât şi bărbaţii pot fi afectaţi, dar, în timp ce femeile bolnave sunt de obicei heterozigote (au o alelă normală şi una mutantă) bărbaţii bolnavi sunt hemizigoţi (au numai alela mutantă, deoarece au un singur cromosom X).

Datorită procesului de inactivare întâmplătoare a unuia dintre cromosomii X, femeile heterozigote pentru o anumită mutaţie dominantă a unei gene de pe cromosomul X vor avea un tablou clinic extrem de variat. Unele boli dominante gonosomale se manifestă doar la femei (de exemplu incontinentia pigmenti), fiind letale pentru embrionii de sex masculin - fapt evidenţiat de excesul de avorturi spontane (figurile 7.2. şi 7.3., tabelul 7.5.).

Analiza transmiterii bolilor dominante gonosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.2.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.5.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni. Particularităţile bolilor cu transmitere dominantă legată de cromosomul X sunt : a. Orice bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi. Transmiterea genealogică

a afecţiunii este verticală, continuă, specifică bolilor dominante. Doi părinţi sănătoşi nu pot avea copii bolnavi deoarece nu posedă gena anormală.

b. Atât femeile, cât şi bărbaţii pot fi afectaţi, dar există o predominanţă a femeilor bolnave (aproximativ 2:1 faţă de bărbaţii bolnavi).

c. Atât femeile, cât şi bărbaţii pot transmite afecţiunea la descendenţi, dar riscul de recurenţă depinde de sexul acestora.

d. Doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi exclusiv băieţi. e. Bărbaţii bolnavi nu pot transmite boala fiilor lor, dovadă că gena mutantă se găseşte pe

cromosomul X, pe care băieţii îl moştenesc de la mamele lor.


139

Figura 7.2. Arbore genealogic sugestiv pentru o boală ereditară dominantă legată de

cromosomul X

Figura 7.3. Arbore genealogic al unei familii cu o boală ereditară dominantă legată de

cromosomul X, letală la bărbaţi

Tabelul 7.5. Cuplurile parentale şi descendenţii lor în bolile dominante legate de cromosomul X


Gameţi Genotipuri copii

(proporţii)


Ambii părinţi sunt sănătoşi XnXn + XnY (Xn) x

(Xn + Y)

XnXn (1/2) XnY (1/2)

toţi sănătoşi (ambele sexe)

Mama bolnavă (heterozigotă) şi tatăl sănătos

XAXn + XnY (XA + Xn)x

(Xn + Y)

XAXn (1/4) XAY (1/4) XnXn (1/4) XnY (1/4)

-bolnavi (1/2) (ambele sexe) -sănătoşi (1/2) (ambele sexe)

Mama bolnavă (homozigotă) şi tatăl sănătos

XAXA + XnY (XA) x

(Xn + Y)

XAXn (1/2) XAY (1/2)

toţi bolnavi (ambele sexe)

Mama sănătoasă şi tatăl bolnav

XnXn + XAY (Xn) x (XA + Y)

XAXn (1/2) XnY (1/2)

- fete bolnave (1/2) - băieţi sănătoşi (1/2)

Mama bolnavă (heterozigotă) şi tatăl bolnav

XAXn + XAY (XA + Xn)x

(XA + Y)

XAXA (1/4) XAXn (1/4) XAY (1/4) XnY (1/4)

- fete bolnave (1/2) - băieţi bolnavi (1/4) - băieţi sănătoşi (1/4)

Mama bolnavă (homozigotă) şi tatăl bolnav

XAXA + XAY (XA) x

(XA + Y)

XAXA (1/2) XAY (1/2)



140

f. Bărbaţii bolnavi nu pot avea fiice sănătoase (indiferent dacă mama este sănătoasă sau bolnavă). Fetele moştenesc un cromosom X de la tatăl lor şi dacă mutaţia dominantă se găseşte pe cromosomul X respectiv, ele vor manifesta aceeaşi boală ca şi tatăl lor.

g. Riscul de recurenţă a bolii la descendenţii unui pacient cu o boală dominantă legată de cromosomul X este de 50%. Un bărbat bolnav (căsătorit cu o femeie sănătoasă) va avea toate fiicele bolnave şi toţi fiii sănătoşi, în timp ce riscul de recurenţă a bolii la descendenţii unui femei cu o boală dominantă gonosomală va fi de 50%, indiferent de sexul copiilor. Deoarece pacientele cu boli dominante legate de cromosomul X sunt în majoritate heterozigote, probabilitatea ca un gamet să conţină un cromosom X purtând gena mutantă este de 1/2 (50%). Dacă partenerul de cuplu este sănătos (XnY) există o probabilitate (risc) de 1/2 (50%) ca sarcina să ducă la naşterea unei fete afectate (heterozigote) (figura 7.2.) şi o probabilitate (risc) de 1/2 (50%) ca sarcina să ducă la naşterea unei băiat afectat (hemizigot) (tabelul 7.6.).

Tabelul 7.6. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă pentru boli dominante legate de cromosomul X (tată afectat şi mamă sănătoasă)

Mama Xn Xn

Tatăl

XA XAXn XAXn

Y XnY XnY

Transmiterea dominantă poate fi recunoscută pe baza următoarelor criterii: frecvenţă mare a bolii în familie, transmiterea continuă a bolii în succesiunea generaţiilor, absenţa consanguinităţii, doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi sau bolnavi, doi părinţi sănătoşi au întotdeauna copii sănătoşi;

Transmiterea dominant autosomală poate fi identificată ţinând cont de următoarele reguli: doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi de ambele sexe, un cuplu în care tatăl este bolnav, iar mama este sănătoasă poate avea băieţi bolnavi, tatăl bolnav poate avea fete bolnave sau sănătoase, mama sănătoasă poate avea băieţi bolnavi sau sănătoşi;

Transmiterea dominantă legată de cromosomul X poate fi identificată ţinând cont de următoarele reguli: doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi exclusiv băieţi, un cuplu în care tatăl este bolnav, iar mama este sănătoasă nu poate avea băieţi bolnavi, tatăl bolnav are toate fetele bolnave, mama sănătoasă are toţi băieţii sănătoşi;

C. TRANSMITEREA RECESIVĂ O boală genetică este considerată recesivă în situaţia în care se manifestă doar la

indivizii homozigoţi (care prezintă aceeaşi mutaţie la nivelul locilor omologi) sau la heterozigoţii compuşi (care au în locii omologi, gene mutante anormale diferite). Mutaţiile genice pot duce la apariţia fenotipului anormal recesiv prin diferite mecanisme: producerea unei proteine anormale instabile care nu îşi poate îndeplini funcţia celulară; absenţa unei enzime şi devierea căii metabolice corespunzătoare cu producerea de metaboliţi

toxici. Bolile recesive sunt boli rare (cele mai frecvente pot afecta 1:2.500 indivizi), iar

căsătoriile între bolnavi sunt excepţionale, survenind mai frecvent în comunităţi de persoane


141

cu un handicap comun (de exemplu surditate). Cel mai adesea, numărul de persoane bolnave dintr-o familie este redus (uneori există un singur caz), iar părinţii indivizilor afectaţi sunt sănătoşi (purtători heterozigoţi ai mutaţiei). Este de subliniat faptul că orice persoană sănătoasă poate fi purtătoarea unei mutaţii recesive nemanifeste, pe care însă o poate transmite descendenţilor săi (tabelul 7.7.).

Tabelul 7.7. Corelaţii între genotip şi fenotip pentru bolile recesive

TRANSMITEREA RECESIVĂ AUTOSOMALĂ

TRANSMITEREA RECESIVĂ GONOSOMALĂ

GENOTIPURI

aa NN Na

XaXa

XaY XNXN

XNXa

XNY FENOTIPURI Bolnavi Sănătoşi Bolnavi Sănătoşi

Au fost identificate, atât boli recesive determinate de mutaţii la nivelul unor loci de pe autosomi (boli recesive autosomale) cât şi afecţiuni determinate de mutaţii la nivelul unor loci de pe cromosomul X (boli recesive legate de cromosomul X, gonosomale).

Bolile recesive pot fi recunoscute cu uşurinţă prin examinarea arborelui genealogic al unei familii, întrucât prezintă următoarele caracteristici: a. Număr redus de bolnavi în familie. Aceasta se datorează faptului că boala recesivă se

manifestă numai la indivizi homozigoţi (aa sau XaXa) sau hemizigoţi (XaY) numărul acestora fiind mai mic decât cel al persoanelor sănătoase homozigote sau heterozigote. Cel mai frecvent bolnavii se găsesc în cadrul aceleiaşi generaţii sau chiar în aceeaşi fratrie, de obicei părinţii fiind sănătoşi – transmitere orizontală. În familie există în schimb numeroşi purtători sănătoşi ai genelor anormale (heterozigoţi Na, XNXa).

b. Boala se transmite discontinuu, cu salturi peste una sau mai multe generaţii. În familiile cu boli recesive, un individ afectat (aa sau XaXa, XaY) poate avea numai copii sănătoşi dacă se căsătoreşte cu o persoană sănătoasă, nepurtătoare a genei anormale (NN sau XNXN, XNY). Copiii vor fi sănătoşi, dar purtători ai genei anormale (Na sau XNXa). Dacă aceştia la rândul lor se căsătoresc cu persoane care nu posedă mutaţia, boala poate fi absentă pe parcursul mai multor generaţii, deşi gena anormală se transmite prin indivizii purtători (heterozigoţi) din generaţie în generaţie. Apariţia unor alţi indivizi bolnavi în familie este condiţionată de căsătoria întâmplătoare, dar mai ales de căsătoria consanguină, a doi heterozigoţi.

c. Numărul bolnavilor cu afecţiuni recesive este mai ridicat în familiile în care există căsătorii consanguine (între persoane înrudite, care au un fond comun de gene). Mutaţiile recesive sunt numeroase, astfel încât mulţi dintre indivizii sănătoşi din populaţie sunt, de fapt, purtători ai mai multor gene recesive anormale. În familiile lor apar însă rareori copii bolnavi, deoarece există o probabilitate mică de a se căsători cu un heterozigot cu o mutaţie la nivelul aceluiaşi locus genetic. Consanguinitatea creşte riscul asocierii într-un cuplu a doi heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie, pe care au moştenit-o de la ascendentul (strămoşul) comun şi pe care o pot transmite concomitent la unii dintre descendenţii lor (aceştia fiind homozigoţi). Consecinţele negative ale consanguinităţii au fost observate din cele mai vechi timpuri şi de aceea majoritatea religiilor sau legislaţiilor interzic formal căsătoriile consanguine. În România nu este permisă căsătoria între persoane înrudite până la gradul IV.

d. Doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi. În cazul bolilor recesive, dacă părinţii sunt sănătoşi, dar heterozigoţi (Na, XNXa) ei pot transmite concomitent genele anormale


142

unora dintre descendenţii lor, care vor fi astfel homozigoţi şi vor manifesta fenotipul anormal (vezi tabelele 7.8. şi 7.10.).

e. Doi părinţi bolnavi nu pot avea copii sănătoşi (au numai copii bolnavi). Dacă ambii părinţi au aceeaşi boală recesivă, fiind homozigoţi pentru gena mutantă (aa) sau unul este homozigot, iar celălalt hemizigot (XaXa, respectiv XaY) ei nu pot avea copii sănătoşi, deoarece nici unul dintre ei nu posedă gene normale pe care să le transmită descendenţilor.

1. TRANSMITEREA RECESIVĂ AUTOSOMALĂ

Bolile recesive autosomale sunt determinate de mutaţii ale unor gene situate pe autosomi (afectând în proporţii egale femeile şi bărbaţii) dar manifeste doar la homozigoţi sau la heterozigoţii compuşi, genele mutante fiind recesive faţă de alelele normale dominante (figura 7.4., tabelul 7.8.).

Figura 7.4. Arbore genealogic sugestiv pentru o afecţiune cu transmitere recesivă autosomală

Tabelul 7.8. Cuplurile parentale şi descendenţii lor în boli recesive autosomale:


Gameţi Genotipuri copii

(proporţii)


Ambii părinţi sunt bolnavi aa + aa a x a aa (toţi) bolnavi (toţi) Un părinte bolnav şi un părinte sănătos (homozigot)

aa + NN a x N Na (toţi) sănătoşi (toţi) purtători

Un părinte bolnav şi un părinte sănătos (heterozigot)

aa + Na a x (a + N)

aa (1/2) Na (1/2)


Ambii părinţi sănătoşi (heterozigoţi)

Na + Na (a + N) x

(a + N)

aa (1/4) Na (1/2) NN (1/4)


Ambii părinţi sunt sănătoşi (homozigot + heterozigot)

NN + Na N x

(a + N)

Na (1/2) NN (1/2)

sănătoşi (toţi) purtători (1/2)

Ambii părinţi sunt sănătoşi -homozigoţi

NN + NN N x N NN (toţi) sănătoşi (toţi)

Bolile recesive autosomale sunt numeroase şi, deseori, au consecinţe grave asupra calităţii vieţii şi prognosticului vital al pacientului (ex. mucoviscidoza, erorile înnăscute de metabolism - mucopolizaharidoze, aminoacidopatii, albinismul oculocutanat, etc).


143

Analiza transmiterii bolilor recesive autosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.4.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.8.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni: a. Bolnavii sunt în general descendenţii unor indivizi sănătoşi şi sunt frecvent membrii

aceleiaşi fratrii. Transmiterea genealogică a afecţiunii este aparent orizontală. Cei doi părinţi sănătoşi sunt heterozigoţi pentru mutaţii produse la nivelul aceluiaşi locus genetic şi pot fi înrudiţi.

b. Cu cât o boală recesivă autosomală este mai rară în populaţie, cu atât este mai frecventă consanguinitatea în familiile bolnavilor.

c. Bărbaţii şi femeile sunt afectaţi în proporţii egale. d. Doi părinţi sănătoşi (heterozigoţi) pot avea copii bolnavi şi băieţi şi fete. e. Bărbaţii sănătoşi (Na) pot avea fiice bolnave, indiferent dacă mama este sănătoasă (Na)

sau bolnavă (aa), dovadă că locusul genetic implicat nu se găseşte pe cromosomul X. Dacă gena respectivă s-ar găsi pe cromosomul X, fiicele oricărui bărbat sănătos ar fi sănătoase, întrucât ar moşteni o alelă normală dominantă de la tatăl lor.

f. Femeile bolnave (homozigote) pot avea fii sănătoşi, dacă soţul lor este sănătos (Na sau NN). Naşterea unui băiat sănătos, când mama este afectată, este o dovadă a faptului că gena mutantă se găseşte pe alt cromosom decât cromosomul X.

g. Riscul de recurenţă a bolii în fratria unui bolnav (indiferent de sex) cu o maladie recesivă autosomală este de 25% (presupunând că părinţii sunt sănătoşi). Deoarece pacienţii cu boli recesive autosomale sunt homozigoţi şi au moştenit câte o alelă mutantă de la fiecare dintre părinţi, rezultă că părinţii bolnavilor sunt heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie. Probabilitatea ca un gamet provenit de la oricare dintre părinţi să conţină la nivelul locusului respectiv gena mutantă este de 1/2 (50%). Probabilitatea fecundării, a doi gameţi conţinând aceeaşi alelă mutantă, este produsul probabilităţilor fiecărui gamet de a conţine mutaţia respectivă (1/2 x 1/2 = 1/4) adică 25%. Membrii sănătoşi ai fratriei unui bolnav cu o boală recesivă autosomală au o probabilitate de 2/3 de a fi purtători asimptomatici ai mutaţiei (Na) (tabelul 7.9.).

Tabelul 7.9. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă în fratria unui bolnav cu o boală recesivă autosomală

Mama N a

Tat

a N NN Na

a Na aa

Naşterea unui copil bolnav când un părinte este afectat (aa) iar celălalt este sănătos (Na) mimează o transmitere dominantă şi este denumită pseudodominanţă. În această situaţie riscul de recurenţă a afecţiunii la ceilalţi descendenţi ai cuplului este de 50%.

2. TRANSMITEREA RECESIVĂ LEGATĂ DE CROMOSOMUL X

Bolile recesive gonosomale sunt consecinţa unor mutaţii produse la nivelul locilor situaţi pe cromosomul X, alelele mutante având un comportament de tip recesiv în prezenţa genei normale. În absenţa genei normale, la bărbaţii hemizigoţi care posedă gena mutantă, mutaţia se exprimă fenotipic, determinând un fenotip anormal. Prin urmare, numărul bărbaţilor afectaţi este mai mare decât cel al femeilor, care vor avea un fenotip anormal doar în prezenţa unei duble mutaţii (pe cei doi cromosomi X) (figura 7.5., tabelul 7.10.).


144

Figura 7.5. Arbore genealogic sugestiv pentru o boală transmisă recesiv legat de cromosomul X

Tabelul 7.10. Cuplurile parentale şi descendenţii lor în boli recesive legate de X:


Gameţi Genotipuri copii (proporţii)


Ambii părinţi sunt bolnavi XaXa + XaY (Xa) x (Xa + Y)

XaXa (1/2) XaY (1/2)


Mama bolnavă şi tatăl sănătos

XaXa + XNY (Xa) x (XN + Y)

XNXa (1/2) XaY (1/2)

fete sănătoase (1/2) băieţi bolnavi (1/2)

Mama sănătoasă (purtătoare) şi tatăl sănătos

XNXa + XNY (Xa+XN)x

(XN + Y)

XNXa (1/4) XNXN (1/4) XaY (1/4) XNY (1/4)

fete sănătoase (1/2 purtătoare)

băieţi bolnavi (1/2) băieţi sănatoşi (1/2)

Mama sănătoasă (purtătoare) şi tatăl bolnav

XNXa + XaY (Xa+XN)x

(Xa + Y)

XaXa (1/4) XNXa (1/4) XaY (1/4) XNY (1/4)

fete bolnave (1/2) fete sănătoase (1/2) băieţi bolnavi (1/2) băieţi sănătoşi (1/2)

Mama sanătoasă (homozigotă) şi tatăl bolnav

XNXN+ XaY (XN) x

(Xa + Y)

XNXa (1/2)

XNY (1/2)

fete sănatoase (purtătoare)

băieţi sănătoşi Ambii părinţi sănătoşi XNXN+ XNY (XN) x

(XN+ Y)XNXN 1/2) XNY (1/2)

fete sănătoase băieţi sănătoşi

Apariţia la o femeie a unei boli recesive legate de cromosomul X poate fi consecinţa: procesului de inactivare în proporţie mai mare (sau exclusivă, aşa cum se întâmplă în

cazul translocaţiilor X-autosom) a cromosomului X, care conţine alela normală (femeia fiind în acest caz heterozigotă);

a unor anomalii ale cromosomului X (monosomie X, deleţii ale cromosomului X) prin care se pierde alela normală - femeia este hemizigotă, având doar gena mutantă;

prezenţei mutaţiei în stare homozigotă, mai ales când aceasta are o frecvenţă mare în populaţia respectivă (ex. discromatopsiile – incapacitatea de a distinge culoarea roşie sau verde – se întâlnesc la 8% dintre bărbaţi, dar şi la 1:150 dintre femei).

Femeile heterozigote sunt de obicei asimptomatice (sănătoase) dar pot fi uneori depistate prin identificarea de semne minore de boală (pigmentarea „în mozaic” a retinei la femeile heterozigote pentru mutaţia ce produce albinismul ocular, creşterea activităţii creatin-kinazei serice la purtătoarele mutaţiei pentru distrofia musculară Duchenne etc.).


145

Analiza transmiterii bolilor recesive autosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.5.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.10.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni: a. Bolnavii sunt în general descendenţii unor indivizi sănătoşi. b. Boala este prezentă aproape în exclusivitate la bărbaţi. c. Transmiterea se face de obicei prin femei sănătoase, dar purtătoare de mutaţie, la fiii lor

– transmitere genealogică oblică. d. Doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi, exclusiv băieţi. e. Bărbaţii sănătoşi (XNY) au toate fiicele sănătoase, indiferent dacă mama este sănătoasă

(XNXa sau XNXN) sau bolnavă (XaXa) dovadă că locusul genetic implicat se găseşte pe cromosomul X. Fiicele oricărui bărbat sănătos sunt sănătoase, întrucât moştenesc (odată cu cromosomul X patern) o alelă normală dominantă de la tatăl lor.

f. Femeile bolnave (homozigote XaXa) nu pot avea fii sănătoşi, chiar dacă soţul lor este sănătos. Băieţii moştenesc unicul cromosom X de la mama lor şi de aceea, ei vor manifesta aceeaşi boală ca şi mama lor. Naşterea unui băiat sănătos când mama este afectată, exclude o mutaţie recesivă legată de cromosomul X.

g. Riscul de recurenţă a bolii în fratria unui băiat bolnav cu o boală recesivă legată de X este de 25% (când părinţii sunt sănătoşi). Dacă mama este heterozigotă (XNXa), probabilitatea ca un gamet provenit de la mamă să conţină un cromosom X cu gena mutantă este de 1/2 (50%). Dacă tatăl bolnavului este hemizigot sănătos (XNY), el va genera atât gameţi care conţin cromosomul X cu alela normală (1/2 = 50%), cât şi gameţi care conţin cromosomul Y. Prin urmare toate fiicele cuplului vor fi sănătoase (1/2 homozigote, 1/2 heterozigote) iar fiii vor fi fie sănătoşi (1/2), fie bolnavi (1/2) (tabelul 7.11.).

Tabelul 7.11. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă în fratria unui bolnav cu o boală recesivă legată de cromosomul X

Mama XN Xa

Tatăl

XN XNXN XNXa

Y XNY XaY

Particularităţile diferitelor tipuri de transmitere mendeliană sunt prezentate comparativ în tabelul 7.12.

Transmiterea recesivă poate fi recunoscută pe baza următoarelor criterii: frecvenţă mică a bolii în familie, transmiterea discontinuă a bolii în succesiunea generaţiilor, consanguinitate prezentă, doi părinţi bolnavi au toţi copiii bolnavi, doi părinţi sănătoşi au copii sănătoşi sau bolnavi

Transmiterea recesiv autosomală are următoarele criterii: doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi de ambele sexe, un cuplu în care tatăl este sănătos iar mama este bolnavă poate avea fete bolnave, tatăl sănătos poate avea fete bolnave sau sănătoase, mama bolnavă poate avea băieţi bolnavi sau sănătoşi

Transmiterea recesivă legată de cromosomul X poate fi identificată ţinând cont de următoarele reguli: doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi exclusiv băieţi, un cuplu în care tatăl este sănătos iar mama este bolnavă nu poate avea fete bolnave, tatăl sănătos are toate fetele sănătoase, mama bolnavă are toţi băieţii bolnavi


146

Tabelul 7.12. Caracteristicile transmiterii mendeliene.

Caracteristici Transmiterea dominantă autosomală

Transmiterea dominantă legată

de X

Transmiterea recesivă

autosomală

Transmiterea recesivă legată de X

Tip de transmitere

Verticală Verticală (oblică pentru bolile letale

la bărbaţi)

Orizontală Oblică

Persoane afectate

Femei şi bărbaţi în

proporţii egale

Femei şi bărbaţi (raport 2:1) sau

numai femei (boli letale la bărbaţi)

Femei şi bărbaţi în proporţii

egale

Aproape exclusiv bărbaţi

Transmitere prin

Persoane afectate (femei

sau bărbaţi)

Persoane afectate (femei sau bărbaţi)

Purtători sănătoşi

(femei sau bărbaţi)

Femei purtătoare sau bărbaţi afectaţi

Risc de recurenţă

50% pentru bolnavi (orice

sex) 0% pentru sănătoşi

50% pentru descendenţii

femeilor bolnave 0% pentru fii şi

100% pentru fiicele bărbaţilor afectaţi

25% dacă părinţii sunt

purtători (indiferent de sexul

copilului)

0% pentru fiice şi 50% pentru fiii

femeilor purtătoare 0% pentru

descendenţii bărbaţilor afectaţi

Fenomene asociate

Transmitere tată-fiu posibilă

Mutaţii noi Penetranţă incompletă

Expresivitate variabilă

Transmitere tată-fiu imposibilă

Afectare mai puţin severă la femeile

heterozigote decât la bărbaţi

Consanguinitate prezentă, mai ales în

cazul bolilor rare

Mutaţii noi Femei heterozigote afectate (inactivare neîntâmplătoare a cromosomului X)

D. MANIFESTĂRI VARIABILE ALE MUTAŢIILOR GENICE Deşi teoretic transmiterea monogenică (mendeliană) este cel mai simplu mod de

transmitere şi poate fi recunoscută cu uşurinţă într-un arbore genealogic, în realitate bolile de acest tip ridică probleme care fac dificile diagnosticul şi evaluarea riscului de recurenţă. Problemele derivă din variabilitatea care caracterizează expresia fenotipică a mutaţiilor, fenomen incomplet cunoscut şi înţeles până în prezent. Variaţiile în expresia genelor pot fi explicate prin faptul că genele acţionează corelat, sub influenţa unor factori din mediul intern şi extern. Manifestările variabile ale mutaţiilor genice pot avea diferite aspecte, concretizate în termeni ca penetranţă, expresivitate şi specificitate.

1. PENETRANŢA

Penetranţa este o noţiune cantitativă aplicabilă bolilor dominante, noţiune care defineşte frecvenţa manifestării genei mutante (numărul bolnavilor), în raport cu numărul total de purtători ai genei anormale (AA, An).

În cazul unor familii prezentând boli dominante cunoscute, s-a observat că unii heterozigoţi (An) sunt aparent sănătoşi, gena „A” fiind în acest caz „mută” din punct de


147

vedere al expresiei fenotipice (se comportă asemănător unei gene recesive - este lipsită de penetranţă). Totuşi, în multe situaţii, aceşti indivizi heterozigoţi sănătoşi, pot avea descendenţi (An) la care boala se manifestă complet (figura 7.6.).

Figura 7.6. Arbore genealogic al unei familii cu retinoblastom ereditar (transmis autosomal dominant, cu penetranţă incompletă)

Se realizează în acest mod o transmitere dominantă neregulată, în care, spre deosebire de transmiterea dominantă clasică: Doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi. Transmiterea genealogică a afecţiunii este discontinuă, cu salturi peste o generaţie.

Riscurile de recurenţă pentru afecţiunile cu penetranţă incompletă sunt dificil de evaluat, deoarece, pe de o parte, un individ aparent sănătos poate fi heterozigot şi se va confrunta cu un risc de 50 % de a transmite mutaţia la descendenţi, iar pe de altă parte, un individ heterozigot nu manifestă semne de boală în 100% din cazuri, ci se confruntă cu un risc care depinde de penetranţa mutaţiei (vezi capitolul „Sfatul genetic”). De remarcat că penetranţa este un fenomen dependent de vârsta individului, fapt care trebuie luat în consideraţie în special pentru bolile genetice cu debut tardiv (ex. coreea Huntington, pentru care penetranţa este de 50% la vârsta de 40 de ani, dar atinge 100% la vârsta de 70 de ani).

2. EXPRESIVITATEA

Expresivitatea este o noţiune cantitativă, care defineşte manifestarea clinică a anomaliei genetice cu diferite grade de intensitate, în aceeaşi familie sau în familii diferite. Deşi există şi boli dominante care au o expresie clinică aproape constantă (ex. acondroplazia) expresivitatea variabilă este aproape o regulă, îmbrăcând o diversitate de aspecte: a. Afecţiunile dominante, caracterizate prin anomalii unice, pot prezenta grade diferite de

severitate la membrii aceleiaşi familii sau în familii diferite (de exemplu polidactilia poate fi prezentă la indivizi afectaţi unilateral, bilateral, numai la mâini, numai la picioare sau la toate membrele).

b. În unele boli dominante, persoanele afectate pot avea fie forme tipice ale bolii, fie forme incomplete, variabile, care pot fi chiar fruste, cu manifestări reduse, subclinice. Acest aspect este întâlnit în bolile dominante determinate de gene anormale cu efect multiplu (pleiotrope) (de exemplu în familiile cu sindrom Marfan, există indivizi care prezintă afectare oculară, scheletică şi cardiovasculară caracteristică, dar şi indivizi cu forme fruste de boală, care prezintă doar talie înaltă, aspect astenic şi arahnodactilie sau miopie) (figura 7.7.). Recunoaşterea cazurilor cu manifestări reduse, monosimptomatice, nu este întotdeauna uşor de realizat, dar este esenţială pentru managementul afecţiunii şi acordarea sfatului genetic.

c. Expresivitatea variabilă poate fi corelată şi cu vârsta la care boala devine manifestă clinic. Un fenomen particular legat de manifestarea bolii la vârste diferite, la membrii aceleiaşi familii, este fenomenul de anticipaţie. Anticipaţia se referă la manifestarea


148

bolii (cu severitate crescută) la vârste din ce în ce mai tinere în generaţii succesive (ex. coreea Huntington). În cazul coreei Huntington, substratul anticipaţiei este reprezentat de o mutaţie „dinamică”, care constă în amplificarea, în cursul meiozei, a unei secvenţe trinucleotidice repetitive, localizată în interiorul genei. Amplificarea produce o proteină cu efecte toxice celulare prin alterarea transcripţiei. Creşterea numărului de repetiţii, în succesiunea generaţiilor, duce la efecte celulare din ce în ce mai grave, care se manifestă clinic precoce.

d. Predominanţa sau limitarea la unul dintre sexe este un fenomen remarcat în unele boli determinate de mutaţii autosomale. Un exemplu este hemocromatoza, transmisă dominant autosomal, care are o frecvenţă de zece ori mai mare la bărbaţi decât la femei. O explicaţie a acestui fenomen ar putea fi aportul alimentar mai redus în fier şi pierderile menstruale prezente la femei. Alte exemple de boli predominante la bărbaţi sunt: guta, calviţia frontală (boli în care este incriminat rolul hormonilor androgeni) în timp ce aplazia emailului dentar sau căderea precoce a dinţilor sunt întâlnite mai frecvent la femei. Limitarea la un sex survine atunci când organul ţintă este prezent doar la unul dintre cele două sexe (de exemplu, sindromul Morris se manifestă clinic doar la subiecţii de sex masculin).

Cardiac Ocular Scheletic Anevrism arterial Ectopie de cristalin Talie înaltă, aspect astenic

Scolioză Prolaps de valvă mitrală Miopie Hiperlaxitate articulară

Arahnodactilie Figura 7.7. Arbore genealogic al unei familii cu sindrom Marfan (boală autosomal

dominantă cu expresivitate variabilă)

Absent Mediu Sever

Cardiac Moarte prin disecţie aortică

Scheletic Ocular


149

3. SPECIFICITATEA DE ORGAN

Specificitatea de organ este o noţiune calitativă introdusă pentru a caracteriza tipul şi localizarea efectelor fenotipice ale genei mutante.

Specificitatea de organ se întâlneşte în unele familii cu boli dominante, care afectează de obicei multiple organe sau ţesuturi. De exemplu, boala Rendu-Osler (angiomatoza hemoragică ereditară) se caracterizează prin hemoragii determinate de dezvoltarea unor hemangioame în diferite ţesuturi sau organe, cu toate că mutaţia este prezentă în toate celulele organismului. În unele familii, indivizii afectaţi au numai epistaxis sau numai hematurie.

E. PLEIOTROPIA ŞI HETEROGENITATEA GENETICĂ Analiza familiilor cu boli genetice arată că mutaţia unei gene poate avea un efect limitat

la nivelul unui singur ţesut sau organ. Mai frecvent, însă, o singură mutaţie poate avea consecinţe asupra mai multor ţesuturi sau organe, fenomen denumit pleiotropie. Un exemplu în acest sens este sindromul Marfan, în care o mutaţie dominantă la nivelul genei fibrilinei (componentă a ţesutului conjunctiv) produce anomalii scheletice (talie înaltă, aspect astenic, arahnodactilie, hiperlaxitate articulară) oculare (subluxaţie de cristalin, miopie) şi cardiovasculare (prolaps de valvă mitrală, anevrism aortic). Dezvoltarea geneticii moleculare a permis explicarea efectelor pleiotrope ale mutaţiilor genice, pe baza localizării expresiei proteinei codificate de gena respectivă.

La nivel molecular a fost demonstrat faptul că mutaţii diferite, la nivelul aceluiaşi locus sau la nivelul unor loci distincţi, pot avea consecinţe fenotipice identice sau similare, determinând aceeaşi boală genetică - heterogenitate genetică.

Situaţia în care mutaţii distincte, survenite în aceeaşi genă, determină acelaşi tablou clinic – heterogenitate alelică - este amplu ilustrată de mucoviscidoză, boală recesivă autosomală pentru care au fost identificate până în prezent peste 700 de mutaţii, care alterează o proteină membranară, cu rol de canal ionic pentru ionul de clor (CFTR).

Există afecţiuni, care au ca substrat mutaţii la nivelul unor loci genetici distincţi – heterogenitate de locus - şi care pot avea chiar moduri diferite de transmitere genealogică. Un exemplu clasic este retinopatia pigmentară, care se poate transmite autosomal dominant sau recesiv, sau chiar legat de cromosomul X.

Datorită fenomenului de heterogenitate genetică, diagnostic clinic al unei afecţiuni ereditare nu este suficient pentru evaluarea riscului de recurenţă la alţi membri ai familiei, aceasta realizându-se pe baza identificării unui anumit tip mendelian de transmitere în arborele genealogic al familiei. De asemenea, trebuie menţionată existenţa unor fenotipuri anormale care pot fi determinate, atât monogenic, cât şi de factori de mediu (fenocopii). Un exemplu clasic este microcefalia, care poate fi consecinţa unei mutaţii genice autosomale recesive sau poate face parte din tabloul clinic al unui sindrom teratogenic – sindromul alcool fetal. Riscul de recurenţă este mult diferit în cele două situaţii, fiind de 25% în primul caz şi practic nul în cel de-al doilea, dacă se evită factorul teratogen.

F. CONSANGUINITATEA ŞI ROLUL EI ÎN BOLILE RECESIVE AUTOSOMALE

Căsătoriile consanguine (între persoane înrudite, care au un fond comun de gene, moştenite de la strămoşul comun) au drept rezultat creşterea probabilităţii ca descendenţii să moştenească de la ambii părinţi aceeaşi mutaţie genică, cu efecte recesive şi să fie homozigoţi afectaţi. Acest risc este prezent, chiar şi atunci când nu există o anamneză


150

familială pozitivă pentru membrii cuplului consanguin, deoarece fiecare individ sănătos posedă 3-4 gene mutante recesive. Dintre acestea 2-3 sunt letale şi vor duce la moartea embrionilor homozigoţi, iar una este o genă recesivă care în stare homozigotă determină o boală gravă. Astfel, probabilitatea ca primul copil al unui cuplu consanguin să aibă o boală recesivă gravă se calculează pornind de la premisa că fiecare dintre genitorii comuni posedă o genă autosomală recesivă cu efecte morbide majore.

De exemplu, probabilitatea ca primul născut al unui cuplu de veri primari se calculează, pornind de la ipoteza că fiecare dintre bunicii comuni ai consultanţilor (I1 şi I2) este purtătorul unei mutaţii recesive (figura 7.8.). În acest caz, probabilitatea ca ambii părinţi ai copilului să fie heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie recesivă moştenită de la bunicul comun este de 1/4 x 1/4, iar probabilitatea ca primul lor copil să fie homozigot pentru această mutaţie este de 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/64. Aceleaşi probabilităţi (riscuri) se aplică şi pentru situaţia în care mutaţia recesivă se moşteneşte de la bunica comună. Astfel, probabilitatea totală ca primul copil (IV1) să fie homozigot pentru o mutaţie recesivă cu efecte severe este de 1/64 + 1/64 = 1/32.

Figura 7.8. Riscul genetic pentru o căsătorie consanguină între veri primari

Probabilitatea copilului provenit dintr-un cuplu consanguin de a fi homozigot (afectat) pentru o genă la nivelul unui locus specific, moştenită de la genitorul comun al cuplului parental, este denumită coeficient de consanguinitate (F). Coeficientul de consanguinitate este diferit de coeficientul de înrudire (R) care se referă la membrii cuplului consanguin, indicând proporţia medie de gene pe care aceştia le au în comun, ca urmare a faptului că au un strămoş comun (tabelul 7.13.).

Coeficientul de înrudire se calculează folosind formula: 121

2

1

nn

R

unde: R – coeficient de înrudire; n1 – numărul de generaţii existente între unul din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun; n2 – numărul de generaţii existente între celălalt din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun.

Coeficientul de consanguinitate se calculează cu formula:

4

12 RF

unde: F – coeficient de consanguinitate, iar R – coeficient de înrudire. Pentru exemplul de mai sus coeficientul de consanguinitate este de 1/16 pentru copilul

cuplului de veri primari, pornind de la calcularea probabilităţii copilului de a fi homozigot pentru alela 1 sau pentru alela 2 de la bunicul comun al părinţilor săi şi respectiv a probabilităţii copilului de a fi homozigot pentru alela 1 sau pentru alela 2 de la bunica comună a părinţilor

432

I II III IV

*

1 2

1

21

½ ½

¼ ¼

1


151

săi. Fiecare dintre aceste probabilităţi este de 1/64, deci suma lor va fi 1/16. Alternativ, valoarea de 1/16 pentru coeficientul de consanguinitate poate fi dedusă, pornind de la faptul că, dacă unul dintre părinţi transmite copilului o anumită alelă, probabilitatea partenerului (văr primar) de a transmite aceeaşi genă este R x 1/2 = 1/8 x 1/2 = 1/16.

Tabelul 7.13. Coeficienţii de înrudire, consanguinitate şi riscul descendenţilor de a avea o boală recesivă autosomală pentru unele uniuni consanguine

Cuplul consanguin Coeficientul de înrudire

(R)

Coeficientul de consanguinitate

(F)

Riscul de apariţie a unei boli recesiv autosomale la

descendenţi Fraţi 1/2 1/4 1/8 Fraţi vitregi 1/4 1/8 1/16 Unchi – nepoată de frateMătuşă – nepot de frate

1/4 1/8 1/16

Veri primari 1/8 1/16 1/32 Unchi – nepoată de văr Mătuşă – nepot de văr

1/16 1/32 1/64

Veri de gradul II 1/32 1/64 1/128 Veri primari dubli 1/4 1/8 1/16 Veri de gradul II dubli 1/16 1/16 1/64

În perspectiva sfatului genetic, conceptul de coeficient de consanguinitate poate duce

la confuzii, întrucât se referă la probabilitatea copilului cuplului consanguin de a fi homozigot, atât pentru alela mutantă cât şi pentru cele normale. Probabilitatea de interes pentru cuplul consultant este cea care reflectă riscul genetic – probabilitatea copilului de a fi homozigot pentru o mutaţie care determină o boală genetică, în situaţia de mai sus aceasta fiind de 1/32.

La modul general, probabilitatea ca un copil născut din părinţi consanguini să aibă o boală recesivă autosomală este (F/2) x n, unde n reprezintă numărul de alele recesive ale fiecărui genitor (strămoş) comun.

Manifestările variabile ale genelor dominante sunt reprezentate de penetranţa incompletă (absenţa manifestărilor de boală la unii dintre heterozigoţii An) expresivitatea variabilă (simptomatologie diferită la indivizii afectaţi din aceeaşi familie sau din familii diferite) şi specificitate de organ (prezenţa aceleiaşi modificări dar în ţesuturi diferite la indivizi din familii diferite sau chiar din aceeaşi familie);

Pleiotropia reprezintă asocierea de efecte fenotipice diferite induse de aceeaşi mutaţie;

Heterogenitatea genetică reprezintă fenomenul prin care mutaţii diferite, ale aceleiaşi gene sau a unor gene diferite, induc un fenotip anormal, identic sau similar;

Căsătoriile consanguine cresc riscul de apariţie a unor copii afectaţi de o boală recesivă, deoarece descendenţii unui astfel de cuplu au o probabilitate crescută de a moşteni de la ambii părinţi aceeaşi mutaţie, moştenită de aceştia de la un strămoş comun.


152


A. IDENTIFICAREA MODULUI DE TRANSMITERE ÎN BOLI EREDITARE ŞI EVALUAREA RISCULUI DE RECURENŢĂ

1. CAZUL CLINIC 1

Un copil, în vârstă de 5 ani, este adus pentru consult genetic de către părinţi. Copilul prezintă o constituţie gracilă, stern înfundat, suflu cardiac, iar un examen oftalmologic, efectuat anterior a depistat o subluxaţie a cristalinului. Pe baza semnelor clinice, medicul genetician stabileşte diagnosticul de sindrom Marfan. Anamneza familială relevă că, probantul are două surori: o soră în vârstă de 8 ani (IV-1) fără manifestări clinice şi alta în vârstă de 3 ani (IV-3) care are o constituţie gracilă, hiperlaxitate articulară şi prolaps de valvă mitrală. Mama probandului este sănătoasă şi are o anamneză familială negativă pentru sindromul Marfan, în timp ce tatăl probandului are numeroase rude cu boli cardiace, talie înaltă şi aspect gracil. Tatăl probandului (III-2) nu este deosebit de înalt (talie 175 cm) şi nu prezintă afectare oculară sau cardiacă. În schimb, fratele său (III-1) în vârstă de 39 de ani, are o talie de 190 cm, constituţie astenică, platfus şi hernii inghinale bilaterale, fiind diagnosticat cu anevrism şi insuficienţă aortică. Atât bunicul patern al probandului, cât şi străbunicul au avut talie peste medie şi au decedat în decada a 4-a de viaţă în urma unor „atacuri de cord”. Bunicul patern al probandului a avut un frate mai mic sănătos (încă în viaţă, dar necăsătorit) şi o soră cu talie înaltă şi miopie; aceasta e căsătorită şi a avut 3 copii: un băiat sănătos, o fată cu talie înaltă care a decedat în urma unui anevrism disecant de aortă şi un alt băiat cu talie înaltă, arahnodactilie, hernii inghinale şi suflu cardiac. Vara primară a tatălui probandului are la rândul ei trei copii: o fată cu talie înaltă, arahnodactilie şi miopie, precum şi un băiat şi o fată fără manifestări clinice sugestive de sindrom Marfan (figura 7.9.).

Figura 7.9. Arborele genealogic al familiei (cazul clinic 1)

Sindromul Marfan (MIM 154700) este o boală monogenică, dominant autosomală, după cum se poate observa şi în arborele genealogic al acestei familii: există numeroase persoane afectate în familie; fiecare bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi – transmitere verticală;

excepţie face probandul al cărui tată nu are semne clinice evidente, reprezentând un caz de lipsă de penetranţă;


153

bărbaţii şi femeile sunt afectaţi în egală măsură şi pot transmite boala descendenţilor lor; boala se poate transmite de la tată la fiu, dovadă certă a transmiterii autosomale.

După cum se remarcă din anamneza familială, sindromul Marfan se caracterizează printr-o expresivitate clinică extrem de variabilă. Deşi toate persoanele afectate prezintă aceeaşi mutaţie genică (sunt heterozigoţi An) semnele clinice sunt diverse, de la talie înaltă şi miopie (formă frustă, II-4) la talie înaltă, constituţie gracilă, platfus, hernii inghinale bilaterale, anevrism şi insuficienţă aortică (formă completă, III-1). Persoanele sănătoase din familie, cu excepţia tatălui probandului (purtător sănătos, An) sunt toate homozigote pentru alela normală, nn, şi ca urmare nu transmit alele mutante descendenţilor lor.

Riscul de recurenţă a bolii în fratria probandului (în cazul unor sarcini ulterioare) este teoretic de 50% (tabelul 7.14.) deoarece tatăl probandului este cert heterozigot, An, iar mama este sănătoasă şi nu posedă mutaţia. Practic, datorită faptului că un individ purtător de mutaţie poate fi lipsit de manifestări clinice (penetranţă incompletă) riscul de recurenţă este sub 50%, în funcţie de gradul de penetranţă a mutaţiei (pentru o evaluare mai precisă vezi capitolul „Sfatul genetic”).

Tabelul 7.14. Tabelul Punett ilustrând riscul de recurenţă a afecţiunii în fratria probantului

Mama n n

Tatăl

A An An

n nn nn

2. CAZUL CLINIC 2

Un bărbat are doi fraţi cu microcefalie (craniu de dimensiuni reduse) şi retard mintal. El este căsătorit cu vara sa primară şi este preocupat de riscul de recurenţă a microcefaliei la descendenţii săi. Anamneza familială (figura 7.10.) relevă următoarele: bărbatul este al patrulea născut, după un băiat afectat, o fată sănătoasă şi o altă fată cu

microcefalie; părinţii săi sunt sănătoşi, dar mama sa şi mama soţiei sale sunt surori; mama soţiei sale mai are o soră geamănă, sănătoasă dar necăsătorită; soţia consultantului mai are un frate şi o soră, ambii sănătoşi; bunicii comuni ai consultanţilor sunt sănătoşi.



154

Microcefalia este o afecţiune caracterizată prin heterogenitate genetică. În plus, ea poate fi şi consecinţa unor expuneri teratogene. În situaţia de faţă, în prezenţa a doi copii grav afectaţi în aceeaşi fratrie, provenind din părinţi sănătoşi, există date care pledează pentru o boală recesivă autosomală (MIM 251200), fapt relevat şi de arborele genealogic al familiei: numărul de bolnavi în familie este redus; bolnavii sunt membri ai aceleiaşi fratrii, iar părinţii lor sunt sănătoşi – transmitere

orizontală; bolnavii sunt de ambele sexe; un cuplu de părinţi sănătoşi au o fată bolnavă.

În cazul bolilor recesive autosomale, bolnavii sunt homozigoţi pentru gena mutantă, iar părinţii lor, sănătoşi, sunt heterozigoţi. Riscul de recurenţă a microcefaliei în descendenţa cuplului consultant depinde de probabilitatea membrilor cuplului de a transmite gena mutantă, deci de a fi heterozigoţi. Consultantul este sănătos şi provine dintr-un cuplu de părinţi sănătoşi dar heterozigoţi, ceea ce face ca probabilitatea sa de a fi heterozigot să fie 2/3 (tabelul 7.15.).

Tabelul 7.15. Tabelul Punett ilustrând probabilitatea unui copil sănătos provenind dintr-un cuplu de heterozigoţi de a fi la rândul său heterozigot

Mama N a

Tatăl

N NN Na

a Na aa41

În ceea ce priveşte consultanta, ea poate moşteni gena mutantă de la oricare dintre părinţii săi; întrucât tatăl ei este sănătos şi neînrudit cu familia mamei, riscul major provine de la mamă. Mama consultantei are o soră (mama consultantului) care este cert heterozigotă şi deci va avea o probabilitate de 1/2 de a fi moştenit şi ea mutaţia de la unul dintre părinţi (de a fi heterozigotă). Ca urmare, probabilitatea consultantei de a fi heterozigotă este de 1/4 (jumătate din probabilitatea mamei sale). Naşterea unui copil afectat (aa) în familia consultanţilor presupune deci 2 evenimente independente: consultantul trebuie să transmită o genă mutantă (1/2 din probabilitatea sa de a fi heterozigot) şi, concomitent, consultanta trebuie să transmită cea de a doua mutaţie (1/2 din probabilitatea sa de a fi heterozigot). Riscul de recurenţă a microcefaliei în descendenţa probanţilor va fi deci:

(1/2 x 2/3) x (1/2 x 1/4) = 1/24.

3. CAZUL CLINIC 3

Un bărbat în vârstă de 20 de ani se prezintă la medicul neurolog pentru scăderea forţei musculare la membrele inferioare (în principal la muşchii gambei). Anamneza familială (figura 7.11.) relevă următoarele: părinţii probandului sunt sănătoşi, ca şi fratele său mai tânăr, dar bunicul matern a suferit de

„slăbiciune musculară” şi a decedat la vârsta de 40 de ani în urma unei boli cardiace; mama probandului are două surori şi un frate, toţi sănătoşi; fiecare soră are câte 3 copii; sora mijlocie are doi băieţi (veri primari cu probandul) care au fost diagnosticaţi cu „distrofie

musculară” în decada a doua de viaţă, şi o fată sănătoasă;

41 Din arborele genealogic se observă că persoana este sănătoasă, genotipul aa fiind exclus


155

sora mai mică are o fată şi doi băieţi, toţi sub vârsta de 20 de ani şi aparent sănătoşi. Atât probandul cât şi cei doi veri ai săi ar dori să afle riscul de recurenţă a afecţiunii la

viitorii lor descendenţi.


Forma de distrofie musculară prezentă în această familie, cu debut în a doua decadă de viaţă şi deces în cea de a 4-a, sugerează diagnosticul de distrofie musculară Becker (forma clinică mai puţin severă, determinată de o mutaţie în gena pentru distrofină – MIM 310200).

În acelaşi sens pledează şi transmiterea recesivă legată de X, sugerată de arborele genealogic: număr redus de bolnavi în familie; toţi bolnavii sunt de sex masculin; bolnavii sunt descendenţii unor părinţi sănătoşi; transmiterea se face discontinuu, de la un bărbat afectat, prin fiicele sale purtătoare, la băieţii

acestora – transmitere oblică. Atât mama probandului (II-2) cât şi surorile ei (II-3, II-5) sunt heterozigote, deoarece

au moştenit mutaţia odată cu cromosomul X patern. Fiicele lor sănătoase au fiecare o probabilitate de 1/2 de a fi moştenit mutaţia de la mamele lor şi deci un risc de 1/8 de a avea la rândul lor fii cu distrofie Becker (probabilitatea unei heterozigote de a avea un copil cu distrofie Becker este de 1/4, vezi tabelul 7.16.). Bărbaţii afectaţi nu transmit boala la descendenţi dacă se căsătoresc cu femei sănătoase neînrudite (care nu au această mutaţie) dar fiicele lor vor fi obligatoriu heterozigote şi vor avea un risc de 1/4 de a avea copii afectaţi (1/2 dintre băieţi). Întrucât gena care determină această boală este cunoscută, diagnosticul molecular poate fi aplicat prenatal pentru a preveni naşterea copiilor afectaţi.

Tabelul 7.16. Tabelul Punett ilustrând riscul de recurenţă a afecţiunii în descendenţa purtătoarelor de mutaţie (sănătoase)

Mama XN Xa

Tatăl

XN XNXN XNXa

Y XNY XaY

B. EVALUAREA UNUI CAZ SPORADIC Naşterea unui copil bolnav într-o familie de oameni sănătoşi reprezintă de cele mai

multe ori o adevărată dramă familială. În practica medicală, situaţia este destul de frecventă, constituind o bună parte din cazurile pentru care se solicită sfat genetic cu scopul de a se


156

calcula riscul de reapariţie a afecţiunii la viitorii copii ai familiei respective. Calcularea riscului de recurenţă nu este întotdeauna simplă, deoarece naşterea unui copil afectat din părinţi sănătoşi poate avea cauze diverse, care trebuie analizate cu atenţie. a. Naşterea unui copil bolnav din părinţi sănătoşi este cel mai adesea datorată bolilor

recesive, fie autosomale, când ambii părinţi sunt purtători sănătoşi (heterozigoţi Na) ai unor mutaţii care afectează acelaşi locus genetic, fie gonosomale, dacă este vorba de un băiat bolnav (în acestă situaţie doar mama este purtătoare, XNXa).

b. Naşterea unui copil bolnav din părinţi sănătoşi poate fi rezultatul unei boli dominante cu penetranţă incompletă, unul dintre părinţi fiind în acest caz purtător asimptomatic de mutaţie.

c. Părinţii sănătoşi pot da naştere unui copil cu o boală monogenică, în situaţia apariţiei unei mutaţii noi (dominantă autosomală sau recesivă legată de X) care survine în celulele sexuale ale unuia dintre părinţi. Vârsta paternă avansată ca şi expunerea la agenţi mutageni favorizează producerea mutaţiilor genice. Agentul mutagen nu este totdeauna decelabil, dar cazurile spontane, nou apărute, pot constitui cazuri primare, care vor transmite afecţiunea generaţiei următoare.

d. Copii bolnavi proveniţi din părinţi sănătoşi pot avea boli genetice cu determinism poligenic (multifactorial), atunci când copilul moşteneşte de la ambii părinţi un număr de gene anormale ce depăşeşte pragul de risc (vezi capitolul „Ereditatea multifactorială”). Evenimentul se produce cu atât mai frecvent, cu cât există şi alţi membri afectaţi în familie sau condiţii favorizante ale mediului extern.

e. Copilul bolnav poate avea o boală cromosomică, produsă de agenţi mutageni de mediu sau apărută în urma existenţei unei anomalii cromosomice echilibrate la unul dintre părinţi.

f. O ultimă posibilitate este reprezentată de existenţa unei fenocopii, anomalii datorite factorilor de mediu, dar care se manifestă congenital, mimând o afecţiune ereditară.

Există trei posibilităţi de estimare a riscului în prezenţa unei anamneze familiale negative.

Prima este legată de dobândirea de informaţii noi, care ar putea orienta către un anumit tip de transmitere, de exemplu prezenţa consanguinităţii în familie (boală monogenică recesivă autosomală) vârsta maternă avansată (boală cromosomică) sau vârsta paternă avansată (boală dominantă autosomală determinată de o mutaţie genică nouă).

Dacă nu există date sugestive, atunci boala însăşi poate fi relevantă asupra modului de transmitere; catalogul bolilor monogenice „Mendelian Inheritance in Man” furnizează informaţii asupra bolilor genetice cunoscute. Astfel, identificarea unui copil cu acondroplazie (MIM 100800) semnifică un risc mic de recurenţă în fratrie, boala fiind consecinţa unei mutaţii noi care se transmite dominant autosomal, în timp ce diagnosticul de mucoviscidoză (MIM 219700, boală recesivă autosomală) sau de distrofie musculară Duchenne (MIM 310200, boală recesivă legată de X) este asociat unui risc de recurenţă de 25%.

Dacă nu există nici factori familiali şi nici un mecanism cunoscut, riscul maxim va fi apreciat la 25%, luându-se astfel în consideraţie posibilitatea unei boli recesive (autosomale sau legate de X). În această situaţie se trece cu vederea posibilitatea extrem de rară a unei boli dominante cu penetranţă incompletă.

Estimarea riscului de recurenţă la 25% este foarte importantă pentru familiile care au o percepţie greşită asupra bolilor genetice: „nu există alţi bolnavi în familie, deci boala nu poate fi transmisă ereditar”.

Un exemplu în acest sens îl constituie cazul clinic 4 (figura 7.12.). Un băiat de 14 ani este trimis pentru consult genetic deoarece a fost diagnosticat cu retinopatie pigmentară


157

(retinitis pigmentosa). El a remarcat scăderea treptată a acuităţii vizuale, începând de la vârsta de 10 ani şi este în prezent practic orb. Probandul are un frate mai mic, în vârstă de 7 ani, care a remarcat şi el o scădere a acuităţii vizuale pe parcursul ultimului an. Două surori mai mici, în vârstă de 8 şi respectiv 3 ani, sunt sănătoase, ca şi părinţii şi rudele lor. Părinţii copiilor sunt preocupaţi de posibilitatea copiilor aparent sănătoşi de a manifesta boala în viitor, precum şi de riscul recurenţei afecţiunii la descendenţii băiatului orb.


Catalogul McKusick relevă faptul că retinopatia pigmentară este o boală heterogenă din punct de vedere genetic, putând prezenta orice mod de transmitere mendeliană: autosomal recesivă – MIM 268000, autosomal dominantă – MIM 180100 sau recesivă legată de X – MIM 312650. În situaţia de faţă băiatul afectat ar putea avea o formă recesivă legată de X sau o formă dominantă autosomală, consecinţa unei mutaţii noi.

Simptomele prezente la fratele său sugerează că ambii băieţi pot fi afectaţi, fapt care a fost confirmat de examenul oftalmologic. Acest lucru indică o transmitere recesivă (pe orizontală). Transmiterea autosomală recesivă este sugerată de gravitatea şi manifestarea precoce a afecţiunii.

Riscul de recurenţă a bolii în fratria bolnavilor este de 25% (părinţii sunt cert heterozigoţi, Na) în timp ce riscul de recurenţă la descendenţii bolnavilor este redus dacă ei evită căsătoriile consanguine cu femei care ar putea fi purtătoare sănătoase de mutaţie. Modalitatea concretă de calcul a riscului de recurenţă este prezentată în capitolele „Genetica populaţiilor” şi „Sfatul genetic”.


A. DEFINIŢI TERMENII URMĂTORI: - homozigot - heterozigot compus - genă dominantă - heterozigot - genă recesivă - fenotip - hemizigot - arbore genealogic - mutaţie

B. RĂSPUNDEŢI LA URMĂTOARELE ÎNTREBĂRI: 1. Care sunt criteriile de recunoaştere a transmiterii dominante? 2. Care sunt criteriile de recunoaştere a transmiterii recesive? 3. Cum recunoaşteţi că un caracter anormal este determinat de mutaţia unei gene autosomale? 4. Cum recunoaşteţi că un caracter anormal este determinat de mutaţia unei gene situate pe

cromosomul X? 5. Ce caracter normal studiat anterior se transmite dominant legat de cromosomul X?


158

6. Un cuplu de părinti, afectaţi de o boală genetică cu transmitere verticală în arborele genealogic, are următorii copii: o fată (2 ani) cu o formă gravă de boală (homozigotă); un băiat (4 ani) bolnav, heterozigot şi o fată (6 ani) sănătoasă. Ce probabilitate are cuplul de a avea un alt copil afectat?

7. Determinaţi tipul transmiterii caracterelor anormale prezente în familiile reprezentate în arborii genealogici din figurile 7.13.7.15. Estimaţi riscul de recurenţă a afecţiunii la descendenţii probandului (II.1 - figura 7.13.; III.1 – figura 7.14.; III.4 – figura 7.15.).

Figura 7.13. Arbore genealogic




I

II

III

1 2 3 4

1 2 3 4 5

5 4 3 2 1

6

6

7

I

II

III

2

1 2 3 4 5

5 4 3 2 1

6

IV 1 2 3

1

I

II

III

1 2 3 4

1 2 3 4 5

5 4 3 2 1

6

6

7

7

IV 1 2 3 4

8


159

1. Prin căsătoria a doi indivizi afectaţi de aceeaşi boală dominantă autosomală vor rezulta copii homozigoţi în proporţie de: A. 0%, B. 25% C. 50%, D. 75%, E. 100%

2. Care este probabilitatea unui cuplu heterozigot pentru o aceeaşi genă mutantă recesivă de a avea copii sănătoşi? A. 0%, B. 25% C. 50%, D. 75%, E. 100% II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4.

3. În cazul unei femei cu albinism oculo-cutanat: 1. afecţiunea se regăseşte obligatoriu la unul dintre părinţii săi; 2. dintre copii săi, băieţii vor moşteni afecţiunea, iar fetele vor fi sănătoase; 3. genotipul său este heterozigot; 4. nici unul dintre copii săi nu va fi afectat, dacă se căsătoreşte cu o persoană homozigotă normală.

4. Un cuplu format dintr-un bărbat sănătos şi o femeie purtătoare a unei gene mutante pentru hemofilia A, are o fată ce prezintă semnele clinice ale acestei afecţiuni. Care dintre următoarele mecanisme pot explica apariţia bolii la fetiţă?

1. fetiţa are şi sindrom Turner; 2. existenţa unui mozaic germinal patern (o mutaţie a genei corespunzătoare de pe cromosomul X în unele celule sexuale paterne); 3. s-a produs inactivarea preferenţială a cromosomului X provenit de la tată, în condiţiile în care fata a moştenit cromosomul cu genă mutantă al mamei; 4. fetiţa prezintă simultan sindromul Down.



5. O femeie care are tatăl afectat de hemofilie va avea toţi băieţii afectaţi, deoarece ea a moştenit obligatoriu gena mutantă de la tatăl său 6. Un individ afectat de hipercolesterolemie familială are un risc de 50% de a avea descendenţi anormali, deoarece el prezintă obligatoriu un genotip An. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: 1. Două fete bolnave născute din părinţi sănătoşi; A. Dominantă autosomală; 2. Tată şi fiu cu aceeaşi afecţiune; B. Dominantă legată de X; 3. Veri primari (băieţi) cu aceeaşi boală; C. Recesivă autosomală; 4. Tatăl şi 3 fete cu aceeaşi boală, 2 băieţi sănătoşi; D. Recesivă legată de X; 5. Gemeni monozigoţi cu aceeaşi boală; E. Date neconcludente.

8. EREDITATEA MULTIFACTORIAL\

I. DATE TEORETICE Numeroase caractere normale şi anormale sunt determinate de interacţiunea, în

proporţii variate, între factorii ereditari şi cei de mediu (tabelul 8.1.), fiind considerate a avea o ereditate multifactorială. Ele prezintă o agregare familială evidentă, dar transmiterea lor în succesiunea generaţiilor nu respectă legile lui Mendel. Riscul de recurenţă se calculează, în consecinţă, empiric şi este mai redus decât în cazul caracterelor cu determinism monogenic.

Tabelul 8.1. Caractere ereditare normale şi anormale determinate multifactorial

Caractere normale Caractere anormaleAnomalii congenitale (unice, izolate) Boli comune ale adultului

Tensiunea arterială Despicătura labio-palatină Diabetul zaharat Dermatoglifele Stenoza hipertrofică de pilor Epilepsia Talia Spina bifida Glaucomul Greutatea Piciorul strâmb congenital Hipertensiunea arterială Inteligenţa Luxaţia congenitală de şold Boala coronariană Culoarea pielii Malformaţii congenitale cardiace Schizofrenia

Componenta genetică a caracterelor multifactoriale este reprezentată de mai multe gene, fiecare cu o pondere mică în determinismul caracterului respectiv, dar al căror efecte sunt cumulate (teoria poligenică a caracterelor multifactoriale) respectiv de un număr redus de gene, unele având o pondere mai importantă în etiologia caracterului (teoria oligogenică).

Pentru evaluarea factorilor genetici în determinismul unui caracter multifactorial este utilizat un indice, numit heritabilitate (h2), egal cu raportul dintre variaţia factorilor genetici implicaţi în formarea acelui caracter şi variaţia fenotipurilor pe care le determină:

h2 = VG/VF

unde VG este variaţia factorilor genetici, iar VF variaţia fenotipurilor. În tabelul 8.2. este prezentată heritabilitatea pentru unele boli multifactoriale.

A. TIPURI DE EREDITATE MULTIFACTORIALĂ

1. EREDITATEA MULTIFACTORIALĂ A CARACTERELOR CANTITATIVE (MODELUL DISTRIBUŢIEI CONTINUE)

Modelul distribuţiei continue explică modul de transmitere a numeroase caractere cantitative, precum: tensiunea arterială, talia, greutatea, inteligenţa etc. Aceste caractere sunt rezultatul intervenţiei mai multor gene şi a factorilor de mediu. Efectele acestor gene, care ocupă loci diferiţi, sunt mici şi aditive, fără a exista relaţii de dominanţă – recesivitate sau codominanţă.

Ereditatea multifactorială

162

Tabelul 8.2. Estimări ale heritabilităţii pentru diverse boli multifactoriale

Boala Incidenţa în populaţie (%) Heritabilitatea Schizofrenia 1 85 Astmul 4 80 Despicătura labială / palatină 0,1 76 Stenoza pilorică 0,3 75 Spondilita anchilopoietică 0,2 70 Piciorul strâmb congenital 0,1 68 Boala coronariană 3 65 Hipertensiunea arterială esenţială 5 62 Subluxaţia congenitală de şold 0,1 60 Anencefalia şi spina bifida 0,3 60 Ulcerul peptic 4 37 Malformaţii congenitale cardiace 0,5 35

Caracterele cantitative prezintă următoarele particularităţi: distribuţia continuă în populaţie (sunt prezente la toate persoanele, dar se manifestă cu grade diferite de intensitate) - reprezentarea grafică a distribuţiei este o curbă Gauss. Cu cât numărul genelor implicate este mai mare, cu atât reprezentarea grafică este mai apropiată de o curbă Gauss. De exemplu, prin acţiunea unei perechi de gene alele codominante rezultă 3 fenotipuri distincte, două perechi determină 5 variante fenotipice, trei perechi 7 variante fenotipice etc. (figura 8.1.). ca urmare a distribuţiei de tip gaussian, majoritatea indivizilor manifestă caracterul respectiv cu o intensitate medie, în timp ce valorile extreme ale acelui caracter, foarte mici sau foarte mari, se regăsesc în populaţie la un număr minim de persoane. Astfel, nu există o distincţie clară între normal şi patologic. Diferenţierea se realizează prin calculul deviaţiei standard (DS) şi/sau al percentililor (P). Deviaţia standard este egală cu radicalul variaţiei fenotipice. Percentilii arată procentul indivizilor din populaţie ce manifestă caracterul cu o anumită intensitate.

Se consideră că 68% din indivizii populaţiei au intensitatea manifestării fenotipice corespunzătoare unei valori ce se înscrie intervalul ± 1 DS, iar 95% în intervalul ± 2 DS (figura 8.2.). Pentru majoritatea caracterelor multifactoriale cantitative se consideră patologice manifestările fenotipice care nu se încadrează în intervalul – 2DS → + 2DS.

tendinţa de “regresie spre medie” a caracterului în succesiunea generaţiilor. În cazul în care un cuplu parental prezintă un caracter cantitativ, precum talia sau inteligenţa, a cărui

Figura 8.1. Distribuţia fenotipurilor în

cazul înălţimii, dacă se consideră existenţa a 1, 2 sau 3 loci, fiecare cu câte

două alele cu frecvenţă egală


163

valoare este situată spre unul din capatele scalei de valori, la descendenţi valoarea caracterului respectiv va fi apropiată de media manifestării.

Figura 8.2. Distribuţia gaussiană a caracterelor multifactoriale cantitative

2. EREDITATEA MULTIFACTORIALĂ CU PRAG (CARACTERE CU DISTRIBUŢIE DISCONTINUĂ)

Un număr important de caractere multifactoriale anormale nu au o distribuţie de tip continuu în populaţia generală, ci o distribuţie bimodală, unele persoane prezentând acel caracter anormal, altele nu. În această categorie de afecţiuni intră anomaliile congenitale izolate şi unele boli comune ale adultului (tabelul 8.1.). Totuşi, aceste boli nu pot fi încadrate în categoria bolilor monogenice, întrucât transmiterea lor nu respectă legile lui Mendel.

Pentru acest gen de caractere anormale Falconer (1981) a propus aşa-numitul model al eredităţii multifactoriale cu prag. Conform acestui model: predispoziţia genetică la boală (determinată de factorii genetici) prezintă o distribuţie

continuă în populaţie (după un model gaussian). Orice persoană dintr-o anumită populaţie prezintă o predispoziţie la boală, mai mare sau mai mică.

există însă un aşa-numit prag al acestei predispoziţii, care odată depăşit determină apariţia bolii. Aşa se explică distribuţia bimodală a acestor boli, o persoană putând fi sau sănătoasă, sau bolnavă.

Modelul eredităţii multifactoriale cu prag explică tendinţa de agregare a acestor boli

în familie. În cazul rudelor unei persoane bolnave, acestea au un număr mai mare de gene de susceptibilitate şi, de aceea, curba de distribuţie a predispoziţiei este deplasată către dreapta, în timp ce pragul rămâne acelaşi (figura 8.3.).


164

Figura 8.3. Curbele de distribuţie ale predispoziţiei în populaţia generală şi la rude în cazul unei afecţiuni transmise după modelul eredităţii multifactoriale cu prag

B. RISCUL DE RECURENŢĂ ÎN AFECŢIUNILE MULTIFACTORIALE

În timp ce riscul de recurenţă poate fi calculat cu exactitate în cazul bolilor monogenice, în bolile multifactoriale riscul se calculează empiric. Aceasta deoarece nu sunt cunoscute cu exactitate numărul genelor ce contribuie la determinismul acelei boli, constituţia alelică a părinţilor şi gradul de implicare al factorilor de mediu.

Pentru aprecierea riscului de recurenţă în bolile multifactoriale, sunt necesare studii populaţionale ample, urmărindu-se recurenţa unei anumite boli în familiile în care există deja un individ cu acea boală. Însă, riscul de recurenţă în bolile multifactoriale variază de la o populaţie la alta, deoarece frecvenţa alelelor mutante şi factorii de mediu prezintă variaţii importante de la o regiune la alta.

În condiţiile absenţei cazurilor de boală multifactorială într-o familie, riscul apariţiei unei astfel de afecţiuni este de aproximativ 3%. În cazul existenţei unor persoane afectate riscul de recurenţă este influenţat de mai mulţi factori: Riscul de recurenţă este mai mare atunci când în familie sunt mai mulţi indivizi

afectaţi. De exemplu, riscul de recurenţă pentru un defect de sept ventricular (DSV) este de 3% atunci când există un singur descendent afectat, dar creşte la aproximativ 10% dacă malformaţia este prezentă la doi descendenţi. Existenţa mai multor descendenţi bolnavi într-o familie înseamnă o plasare mai spre dreapta pe curba de distribuţie a predispoziţiei, deci, implicit, un risc mai mare de apariţie a unor noi descendenţi bolnavi.

Riscul de recurenţă este mai mare dacă probandul are o formă mai severă de boală. Existenţa unei forme mai severe de boală presupune existenţa în familie a unui număr mai mare de factori de risc genetici sau ambientali, deci o plasare spre dreapta a curbei predispoziţiei. De exemplu, în cazul despicăturii labio-palatine, riscul de recurenţă creşte de la 2% (pentru formele unilaterale) la peste 6% (pentru formele bilaterale).


165

În cazul bolilor ce prezintă o frecvenţă mai mare la un anumit sex, riscul de recurenţă este crescut dacă probandul aparţine sexului mai rar afectat. De exemplu în stenoza hipertrofică de pilor, afecţiune mai frecventă la sexul masculin (1/200 băieţi faţă de 1/1.000 fete), riscul de recurenţă este mult mai mare când probandul este de sex feminin. Apariţia bolii la sexul feminin presupune acumularea mai multor factori de risc în familie, deci o amplasare spre dreapta a curbei de distribuţie a predispoziţiei.

Riscul de recurenţă scade rapid odată cu creşterea gradului de rudenie cu persoana afectată. În timp ce riscul de recurenţă pentru bolile monogenice scade cu 50% pentru fiecare generaţie, reducerea se face mult mai rapid în cazul bolilor multifactoriale (tabelul 8.3.). Aceasta se datorează faptului că pentru apariţia bolii este nevoie de combinarea mai multor factori genetici şi de mediu, condiţii care pot fi greu îndeplinite pentru rudele mai îndepărtate.

Tabelul 8.3. Riscul de recurenţă corelat cu gradul de rudenie în boli multifactoriale

BOALA RISCUL (%)

Rude de gradul 1

Rude de gradul 2

Rude de gradul 3

Populaţia generală

Despicătura labio/palatină 4,0 0,7 0,3 0,1

Piciorul strâmb congenital 2,5 0,5 0,2 0,1 Luxaţie congenitală de şold 5,0 0,6 0,4 0,2

Autismul infantil 4,5 0,1 0,05 0,04

Conceptul eredităţii multifactoriale a fost propus pentru a explica agregarea familială a unor malformaţii congenitale unice şi a bolilor comune ale adultului care nu respectă modelul de transmitere mendelian.

Aceste afecţiuni sunt considerate a fi rezultatul interacţiunii mai mulor factori genetici şi de mediu.

Multe caractere normale precum talia, inteligenţa etc. prezintă în populaţia generală o distribuţie de tip continuu, gaussian.

În cazul malformaţiilor congenitale şi a bolilor comune ale adultului distribuţia în populaţie este discontinuă, afecţiunea fiind prezentă doar la unii indivizi. În aceste boli, susceptibilitatea la boală are o distribuţie gaussiană, dar apariţia afecţiunii este condiţionată de depăşirea unui prag de susceptibilitate (modelul eredităţii multifactoriale cu prag).

Riscul de recurenţă în cazul afecţiunilor multifactoriale este influenţat de severitatea bolii, gradul de rudenie cu probandul, numărul rudelor afectate şi de sexul persoanei afectate, în bolile cu incidenţă mai mare la un anumit sex.

C. EREDITATEA OLIGOGENICĂ În unele afecţiuni multifactoriale a fost identificată influenţa crescută a câtorva gene

cu efect major şi în asociere cu alte gene şi factori de mediu care au efecte mici suplimentare. Astfel, a fost elaborat modelul oligogenic care permite identificarea mai uşoară a genelor de risc şi un calcul mai exact al riscului de recurenţă. Genele care au rolul cel mai important în determinismul unor asemenea caractere se numesc gene majore, iar restul factorilor alcătuiesc componenta multifactorială.


166

Un model oligogenic a fost propus pentru determinismul taliei. Modelul presupune existenţa a două gene majore notate cu A şi a. Indivizii cu genotip AA tind să fie mai înalţi, în timp ce indivizii cu genotip aa tind să fie mai scunzi, iar cei cu genotip Aa vor avea o talie intermediară. La componenta genetică se asociază componenta multifactorială care generează variaţii suplimentare. Ca urmare, cei cu genotip aa vor avea înălţimi cuprinse între 130 şi 170 cm, cei cu genotip Aa vor avea talii de 150 până la 190 cm, iar cei cu genotip AA între 170 şi 210 cm (figura 8.4.). Suprapunerile dintre cele trei genotipuri sunt generate de “fondul” multifactorial. Pe ansamblu, distribuţia după înălţime a populaţiei urmează o curbă de tip gaussian prin suprapunerea celor trei distribuţii ale fiecărui genotip.

Figura 8.4. Distribuţia gaussiană a unui caracter precum talia în determinismul căruia intervin două gene majore (A şi a) şi un “fond” multifactorial

(după Jorde et al, 1999)

Multe din aşa-numitele “boli comune ale adultului” par a fi rezultatul unui determinism oligogenic, ca urmare a intervenţiei unor gene majore. Astfel, sunt cazuri de cancer de colon, cancer de sân sau boală coronariană în care afecţiunea este moştenită similar bolilor monogenice (cu variaţii suplimentare în susceptibilitatea la boală induse de intervenţia altor factori genetici sau de mediu). Identificarea acestor cazuri este importantă deoarece: studiul lor permite identificarea genelor majore care ar putea reprezenta chei importante în

înţelegerea fiziopatologiei şi în descoperirea unor noi metode terapeutice; riscul de recurenţă în aceste cazuri este semnificativ mai crescut faţă de situaţia bolilor

multifactoriale în general, datorită distribuţiei de tip mendelian a genelor majore; determinismul oligogenic uşurează identificarea persoanelor cu risc crescut într-o familie,

premisă importantă în profilaxia acestor boli.

Unele caractere au un determinism oligogenic: sunt determinate de câteva gene majore ce interacţionează cu un “fond” multifactorial, reprezentat de o serie de gene cu acţiune minoră şi de factorii ambientali. Riscul de recurenţă al acestor afecţiuni este semnificativ crescut comparativ cu alte boli multifactoriale.

D. METODE DE APRECIERE A DETERMINISMULUI GENETIC AL UNUI CARACTER MULTIFACTORIAL

Există două strategii importante pentru estimarea influenţei relative a eredităţii şi mediului în determinismul caracterelor multifactoriale: studiul gemenilor şi studiile de adopţie.


167

1. STUDIUL GEMENILOR

În populaţia caucaziană sarcinile gemelare au o incidenţă de 1%. Există două tipuri de gemeni: monozigoţi (MZ) – 1/3 din cazuri şi dizigoţi (DZ) – 2/3 din cazuri.

Gemenii monozigoţi rezultă dintr-un singur zigot, ca urmare a separării embrionului în două mase distincte în cursul primelor 14 zile post-fecundare. Ei reprezintă clone naturale şi au un aspect fizic asemănător.

Gemenii dizigoţi sunt rezultatul unei ovulaţii duble urmate de fertilizarea fiecărui ovul de câte un spermatozoid. Ei au acelaşi grad de asemănare genetică precum doi fraţi.

Deoarece gemenii MZ sunt identici genetic, orice diferenţă între ei este determinată de intervenţia factorilor de mediu.

Studiul gemenilor constă în compararea a diferite caractere între gemenii MZ şi DZ. Dacă ambii membri ai unei perechi de gemeni prezintă un anumit caracter (de exemplu, despicătură palatină), ei sunt consideraţi a fi concordanţi. Dacă nu prezintă acelaşi caracter, ei sunt consideraţi discordanţi. Pentru caracterele determinate exclusiv genetic, concordanţa la gemenii MZ este întotdeauna completă, în timp ce gemenii dizigoţi au o concordanţă mai redusă, deoarece ei au în comun doar 50% din gene.

În cazul caracterelor cantitative, precum talia sau tensiunea arterială, testul gemenilor nu este potrivit pentru estimarea concordanţei. În aceste cazuri este utilizat coeficientul de corelaţie intraclasă, care are valori în intervalul –1,0 şi +1,0 şi măsoară gradul de asemănare al acelor cantităţi într-o populaţie. Un caracter determinat în întregime genetic va avea un coeficient de corelaţie de 1,0 la gemenii MZ şi 0,5 la gemenii DZ.

Compararea ratelor de concordanţă sau a coeficienţilor de corelaţie între gemenii MZ şi DZ permite aprecierea ponderii factorilor genetici în determinismul caracterelor multifactoriale.

Studiul gemenilor prezintă însă unele dezavantaje: dificultatea realizării de studii pe loturi mari care ar da rezultate semnificative statistic; existenţa unor diferenţe genetice între gemenii MZ în ceea ce priveşte:

tipul anticorpilor şi cel al receptorilor limfocitelor T prin rearanjamente epigenetice; mutaţiile somatice; numărul moleculelor de ADN mitocondrial (deoarece împărţirea lor are loc prin

fenomene epigenetice); modelul inactivării unuia din cei doi cromosomi X la gemenii MZ de sex feminin.

posibilitatea ca gemenii DZ să aibă taţi diferiţi; în situaţia caracterelor ce prezintă frecvenţe diferite la cele două sexe, ratele de concordanţă

pot diferi în cazul perechilor de gemeni DZ de acelaşi sex şi cele de sex opus. În aceste situaţii, pentru compararea ratelor de concordanţă faţă de gemenii MZ trebuie utilizate numai perechi de gemeni DZ de acelaşi sex;

gemenii MZ care cresc împreună sunt supuşi acţiunii aceloraşi factori de mediu, fapt care poate influenţa rata de concordanţă pentru unele caractere. Pentru a evita acest factor de eroare, o metodă utilă este studiul gemenilor MZ crescuţi în medii diferite.

2. STUDIILE DE ADOPŢIE

Studiile de adopţie reprezintă metodele cele mai bune pentru discriminarea între factorii genetici şi cei de mediu în determinismul unui caracter. În situaţia în care copiii proveniţi dintr-o familie în care apare o anumită boală cu caracter familial dezvoltă acea boală mai frecvent decât copiii adoptaţi din familii sănătoase, rezultă că există un factor genetic care intervine în determinismul acelei boli. De exemplu, circa 8 - 10% din copiii unor


168

părinţi schizofrenici adoptaţi de familii sănătoase dezvoltă această boală, faţă de doar 1% în cazul copiilor adoptaţi care au părinţi sănătoşi.

Ca şi în cazul studiului gemenilor, există câţiva factori ce pot influenţa rezultatele, exagerând aparent importanţa factorilor genetici: factorii de mediu ce acţionează prenatal pot avea consecinţe de lungă durată; copiii sunt adoptaţi deseori după ce au fost crescuţi un număr de ani în cadrul familiei; de multe ori agenţiile de adopţie caută părinţi adoptivi din medii asemănătoare socio-

economic cu cele de origine.

Aprecierea componentei ereditare în determinismul unui caracter multifactorial se realizează prin studii comparative pe perechi de gemeni MZ şi DZ sau prin studii de adopţie.

E. IDENTIFICAREA GENELOR IMPLICATE ÎN DETERMINISMUL CARACTERELOR MULTIFACTORIALE

Metode precum studiul gemenilor sau studiile de adopţie nu sunt capabile să identifice genele specifice implicate în determinismul caracterelor multifactoriale. Acest lucru este însă important pentru înţelegerea corectă a patogeniei şi pentru tratamentul corect al acestor boli. Există mai mulţi factori ce fac dificilă identificarea genelor implicate în determinismul caracterelor multifactoriale: heterogenitatea de locus, intervenţia a numeroase gene cu penetranţă scăzută, debutul tardiv al multor boli multifactoriale sau existenţa fenocopiilor (indivizi afectaţi fără a fi purtători ai unei mutaţii genice).

În prezent sunt utilizate mai multe strategii pentru identificarea locilor genetici implicaţi în determinismul caracterelor multifactoriale: Analizele de înlănţuire sunt utile în special pentru bolile cu transmitere monogenică, dar şi

pentru unele afecţiuni în care intervin gene majore de susceptibilitate (determinism oligogenic).

Metoda perechilor de descendenţi afectaţi se bazează pe identificarea familiilor în care există doi sau mai mulţi fraţi afectaţi. La aceştia se realizează o scanare a întregului genom cu markeri polimorfici. Se identifică markerii cu concordanţă de peste 50% la fraţii afectaţi, aceştia putând fi înlănţuiţi cu loci de susceptibilitate la boală. Această metodă a fost utilizată de exemplu pentru evidenţierea regiunilor HLA ce contribuie la susceptibilitatea pentru diabetul zaharat tip I. Dezavantajele metodei sunt reprezentate de necesitatea unor loturi mari şi rezoluţia redusă (regiunea genomică incriminată este adeseori mare, de peste 10 cM).

Studiile de dezechilibru al înlănţuirii utilizează scanarea întregului genom cu ajutorul unor seturi de markeri polimorfici, precum microsateliţi şi, mai recent, polimorfisme mononucleotidice (single nucleotide polymorphisms – SNPs).

Studii de înlănţuire pe modele animale. Această metodă a fost utilizată pentru studiul unor boli precum hipertensiunea arterială sau diabetul zaharat tip I. Metoda permite identificarea unor gene individuale ce intervin în determinismul unor boli multifactoriale.

Identificarea locilor care contribuie la susceptibilitatea pentru afecţiunile multifactoriale se realizează prin: analize de înlănţuire clasice, analize de înlănţuire pe perechi de descendenţi afectaţi, studii de dezechilibru al înlănţuirii sau analize de înlănţuire pe modele animale.


169

F. DERMATOGLIFELE – EXEMPLU DE CARACTER NORMAL CU DETERMINISM MULTIFACTORIAL Dermatoglifele (gr.: derma = piele şi glyphein = a grava) reprezintă dispoziţia

crestelor papilare (dermice) şi a pliurilor de flexie pe suprafaţa degetelor, palmelor şi plantelor. Pielea din celelalte regiuni ale corpului nu prezintă creste dermice.

Caractere generale: Formarea în viaţa intrauterină: dermatoglifele încep să apară din săptămâna a 17-a de

viaţă intrauterină prin cudarea ectodermului, ca urmare a creşterii sale mai rapide faţă de mezenchimul subiacent; pliurile de flexie se dezvoltă din luna a III-a, ca urmare a aderenţei epidermului la structurile subiacente şi a mişcării de flexie a degetelor pe palmă.

Fixitatea: odată formate, crestele papilare îşi păstrează forma şi particularităţile în tot cursul vieţii, ulterior producându-se numai modificări ale dimensiunilor, prin creştere.

Unicitatea: dispoziţia crestelor dermice precum şi modelele realizate de ansamblul lor sunt specifice fiecărei persoane, au un caracter individual, unic şi irepetabil. Există totuşi diferenţe chiar şi între cele două palme ale aceleiaşi persoane sau între gemenii monozigoţi, datorită factorilor de mediu diferiţi.

Încadrarea în tipuri de model: deşi variate, dermatoglifele se pot încadra în anumite tipuri de model, ceea ce facilitează clasificarea şi studiul lor.

Determinismul genetic: ponderea factorilor genetici (poligenie) în realizarea dermatoglifelor este de peste 95%. Pentru aceasta pledează: distribuţia continuă (gaussiană) în populaţie a numărului total de creste papilare de pe

degete (suma crestelor digitale); aspectul concordant la gemenii monozigoţi în proporţie de 95% (teoretic, în lipsa unei

varianţe a mediului, concordanţa poate fi de 100%); transmiterea modelelor de la părinţi la descendenţi; modificarea relativ specifică a configuraţiei dermatoglifelor în diferite boli genetice.

1. DERMATOGLIFELE DIGITALE

Falanga distală. Modelele determinate de crestele dermice pe falanga terminală a degetelor pot fi clasificate în funcţie de numărul triradiilor. Triradiusul (figură deltică) este figura formată prin intersectarea a trei creste papilare, cu direcţii divergente. Se disting trei tipuri principale de modele (figura 8.5.): arcuri (engl.: arch) – notate cu A, sunt simple, fără triradius (figuri adeltice) şi

piniforme, care prezintă un triradius situat în centrul figurii (monodeltice); bucle (engl.: loop) – notate cu L, prezintă un triradius (figuri monodeltice) ce se

prelungeşte cu o buclă deschisă spre cubitus (bucle cubitale - UL) sau spre radius (bucle radiale - RL);

vârtejuri (engl.: whorl) – notate cu W, au două sau trei triradii (bi- sau trideltice), şi pot fi de trei subtipuri: concentrice, spiralate şi bucle duble.

Falanga medie şi proximală. Crestele papilare de pe aceste falange sunt paralele şi nu formează figuri, dar orientarea lor poate fi oblică, arcuată sau ondulată.

La nivelul fiecărui deget pot fi identificate o serie de pliuri de flexie, corespunzătoare articulaţiilor interfalangiene şi metacarpo-falangiană. Fiecare deget, exceptând policele, are câte trei pliuri de flexie digitale. Policele, având doar două falange, are implicit numai două pliuri.


170

Modelele dermatoglifelor digitale diferă şi prin dimensiuni şi amplasare, putându-se calcula doi parametri principali: Suma crestelor digitale (SCD) reprezintă numărul crestelor digitale ce participă la realizarea figurilor de pe cele 10 degete. Se calculează prin numărarea crestelor intersectate de o linie trasată între centrul şi triradiusul figurii respective. Pentru figurile adeltice SCD este 0. În cazul figurilor bi- şi trideltice se ia în considerare numărul cel mai mare de creste ce corespunde numai unuia dintre triradii. Valorile medii ale SCD sunt de 135 ± 47 la sexul masculin_şi 127 ± 45 la sexul feminin. Distribuţia figurilor digitale. Frecvenţa figurilor digitale diferă în funcţie de apartenenţa etnică, sex, lateralitate şi pentru fiecare deget în parte. În ansamblu, la ambele mâini predomină buclele (63,4%), urmate de vârtejuri (29,6%) şi arcuri (7%). Arcurile şi buclele radiale predomină pe index (II), buclele cubitale sunt mai frecvente pe degetul mic (V), iar vârtejurile predomină pe police (I). Variaţiile legate de sex sunt nete pentru arcuri care predomină la femei şi vârtejuri care sunt mai frecvente la bărbaţi. Aceasta explică valorile SCD mai mari la bărbaţi. Variaţiile de lateralitate sunt evidente pentru arcuri şi bucle, care predomină la mâna dreaptă.

2. DERMATOGLIFELE PALMARE

Palma prezintă în mod normal trei şanţuri mai adânci decât cele determinate de crestele papilare, numite pliuri de flexie: Pliul longitudinal (pliul de flexie al policelui), determinat de mişcările de opoziţie ale

policelui, porneşte din primul spaţiu interdigital, înconjură eminenţa tenară şi ajunge în pliul de flexie al articulaţiei pumnului (baza palmei).

Pliul tranvers proximal (pliul de flexie al degetelor II-IV), porneşte din primul spaţiu interdigital, putând avea aceeaşi origine cu pliul de flexie al policelui şi ajunge în proximitatea marginii cubitale a palmei. Atunci când se prelungeşte până la marginea cubitală, este numit pliu Sydney, situaţie întâlnită la aproximativ 11% din populaţie, dar poate avea şi semnificaţie diagnostică în unele sindroame cromosomice.

Pliul transvers distal (pliul de flexie al degetelor III-V), porneşte din dreptul celui de-al II-lea spaţiu interdigital şi se termină la marginea ulnară a mâinii.

Uneori cele două pliuri transverse sunt fuzionate într-un pliu palmar transvers unic (engl.: single transversal crease, STC) numit şi pliu simian. Acesta se întâlneşte şi în populaţia generală, la o singură mână (aproximativ 4%) sau bilateral (aproximativ 1%), dar frecvenţa este mult mai mare în unele anomalii cromosomice (95% în trisomia 21 - sindromul Down). Fuziunea celor două pliuri transverse poate fi incompletă, unirea lor făcându-se printr-un pliu intermediar, ce realizează un echivalent de STC.

Cele trei pliuri de flexie palmare delimitează trei regiuni:

Figura 8.5. Modele ale

dermatoglifelor de la nivelul falangei terminale a degetelor


171

Eminenţa tenară delimitată de pliul de flexie al policelui prezintă creste papilare paralele şi uşor arcuate şi mult mai rar alte modele (bucle).

Eminenţa hipotenară poate prezenta o varietate de modele ce se pot înscrie în tipurile de bază (arcuri, bucle vârtejuri).

Regiunea subdigitală (superioară) cuprinde ariile interdigitale 2, 3, 4, delimitate de triradiile subdigitale (aflate la baza fiecărui deget) care se notează cu: a - pentru index (II); b - pentru medius (III); c - pentru inelar (IV); d - pentru auricular (V) (figura 8.6.).

Uneori pot fi prezente bucle cu deschidere distală, vârtejuri sau se constată absenţa unui triradius. Două din crestele care formează triradiusul subdigital delimitează baza degetului, iar cea de-a treia: linia principală (notată cu A, B, C, D, după numele triradiusului subdigital corespunzător) - se prelungeşte spre unul dintre cele 13 sectoare ale palmei fără să se întretaie niciodată între ele. Linia principala A merge spre marginea ulnară a palmei, proiectându-se în câmpul 4 sau 5. Orientarea celorlalte linii principale depinde de orientarea liniei D care se orientează cel mai frecvent către spaţiul interdigital 2 sau 3. Suma numerelor corespunzătoare câmpurilor unde se termină liniile principale constituie indicele de transversalitate (IT). Valorile normale ale IT sunt cuprinse între 24 şi 29 (de exempu: IT = A4 + B5 + C7 + D9 =

25). Acest indice apreciază gradul de tranversalitate al crestelor palmare (IT > 27 indică o tendinţă la orizontalizare a crestelor, iar IT < 24 indică verticalizarea acestora).

La baza policelui, între eminenţa tenară şi hipotenară, se află triradiusul axial - t (figura 8.6.) care se prelungeşte cu linia principală T, ce se termină de obicei în câmpul 13. Poziţia t se apreciază pe baza unghiului atd (unghiul format de liniile imaginare care unesc triradiusurile a, t şi d). În funcţie de valoarea unghiului atd, poziţia triradiusului se notează cu: t - pentru atd < 45; t' - pentru 45 < atd < 56; t" - pentru atd >56.

3. ASPECTUL DERMATOGLIFELOR ÎN UNELE SINDROAME CROMOSOMICE

Sindromul Down se caracterizează prin următoarele modificări ale dermatoglifelor: pliu palmar transvers unic (uni sau bilateral), preponderenţa buclelor cubitale sau radiale pe degetele IV-V, triradius axial situat distal (t' sau t") (figura 8.7.) şi buclă halucală.

Figura 8.6. Aspectul dermatoglifelor digitale şi palmare la un individ normal


172

Figura 8.7. Modificări ale dermatoglifelor care pot fi întâlnite la pacienţi cu sindrom Down

Sindromul Edwards determinat de trisomia 18 se caracterizează prin: exces de arcuri (6-10), triradius axial situat distal şi, uneori, un singur pliu de flexie pe degetul V.

Sindromul Patau determinat de trisomia 13 se caracterizează prin: pliu simian, triradius axial situat distal şi buclă, arc sau arc în formă de “S” pe haluce.

Sindromul Turner determinat de monosomia X se caracterizează prin: triradius axial situat distal şi SCD peste medie.

Dermatoglifele reprezintă totalitatea modelelor determinate de aşezarea crestelor papilare şi a pliurilor de flexie pe suprafaţa degetelor, palmelor şi plantelor.

Dermatoglifele se formează în viaţa intrauterină, au un caracter fix, unic şi un determinism multifactorial în cadrul căruia factorii genetici reprezintă 95%.


A. CALCULUL COEFICIENTULUI EREDITAR PENTRU UNELE CARACTERE MULTIFACTORIALE

În tabelul 8.4. sunt specificate ratele de concordanţă la gemenii monozigoţi şi dizigoţi pentru unele caractere multifactoriale normale şi anormale. Aceste date pot fi utilizate pentru aprecierea ponderii factorilor ereditari în determinismul lor. Pentru aceasta se poate calcula un parametru numit coeficient ereditar (CE), după următoarea formulă:

concordanţa la MZ – concordanţa DZ CE = ---------------------------------------------

100 – concordanţa DZ

În cazul unui CE = 1, caracterul este determinat exclusiv de factori genetici.


173

Tabelul 8.4. Ratele de concordanţă la gemenii monozigoţi şi dizigoţi pentru anumite caractere multifactoriale

Caracterul normal sau afecţiunea multifactorială

Rata concordanţei la gemenii monozigoţi

Rata concordanţei la gemenii dizigoţi

Talia 0,94 0,44 Coeficientul de inteligenţă 0,76 0,51 Dermatoglifele 0,95 0,49 Indexul de masă corporală 0,95 0,53 Tensiunea arterială sistolică 0,55 0,25 Tensiunea arterială diastolică 0,58 0,27 Alcoolismul 0,60 0,30 Autismul 0,92 0,0 Despicătura labio-palatină 0,38 0,08 Diabetul zaharat tip I 0,35 – 0,50 0,05 – 0,10 Diabetul zaharat tip II 0,70 – 0,90 0,25 – 0,40 Epilepsia 0,69 0,14 Scleroza multiplă 0,28 0,03 Schizofrenia 0,47 0,12 Spina bifida 0,72 0,33

Calculaţi coeficientul ereditar pentru caracterele normale şi anormale multifactoriale din tabelul 8.4. aplicând formula de mai sus. Care din acestea au coeficientul ereditar cel mai crescut? Interpretaţi aceste rezultate şi specificaţi importanţa lor în practica medicală.

B. METODE DE STUDIU AL DERMATOGLIFELOR Dermatoglifele pot fi observate direct cu ajutorul unei lupe, având grijă ca lumina să cadă oblic pe suprafaţa de examinare, sau cu ajutorul unui otoscop cu sursă de lumină încorporată. 1. Înregistrarea dermatoglifelor se poate realiza în mai multe moduri: Aplicarea unui rulou cu tuş pe suprafaţa palmei şi apoi aplicarea palmei pe o foaie de hârtie; se

procedează similar pentru înregistrarea dermatoglifelor plantare. umezirea palmelor şi plantelor cu o soluţie de sulfit de sodiu, hidroxid de sodiu şi amidon şi aplicarea

lor pe o hârtie fotografică, urmată apoi de fixarea hârtiei; colorarea palmelor şi plantelor cu un creion de grafit moale şi recoltarea dermatoglifelor cu ajutorul

unor benzi adezive transparente (tip Scotch) care se lipesc apoi pe o foaie de hârtie pentru contrast.

În laboratorul nostru se foloseşte următoarea tehnică: Pe o placă metalică sau o sticlă groasă se pune o mică cantitate de tuş tipografic; se întinde într-un strat

subţire cu un rulou de cauciuc; scopul acestei manevre este de a depune uniform pe suprafaţa ruloului o peliculă de tuş (dacă ruloul este prea "încărcat" se îndepărtează surplusul de tuş deplasând ruloul pe suprafaţa unei hârtii);

Se trece ruloul pe suprafaţa palmei, începând de la bază spre degete, având grijă să se "înnegrească" uniform toată suprafaţa digito-palmară; mâinile vor fi în prealabil spălate cu săpun sau şterse de transpiraţie cu un tifon curat (folosirea oricărui solvent, în special eter, este contraindicată);

Palma înnegrită se aplică pe o coală de hârtie albă cu baza pumnului şi apoi, progresiv, cu restul compartimentelor. Se va urmări cu atenţie ca mâna să nu se mişte în cursul acestei acţiuni, pentru a nu şterge desenele digito-palmare recoltate. Pentru o imprimare mai bună se apasă uşor pe dosul mâinii, apoi degetelor li se dă o uşoară mişcare spre dreapta şi spre stânga, pentru a surprinde eventualele triradii situate pe marginea falangelor.

Palma se ridică de pe coala de hârtie începând cu marginea radială şi se răstoarnă spre marginea cubitală, care va fi ultima regiune ce va păstra contact cu hârtia; în felul acesta se imprimă desenul marginii cubitale, putându-se evidenţia un eventual triradius în partea externă a regiunii hipotenare.


174

La sfârşit se înregistrează din nou figurile digitale, prin rularea fiecărui deget în parte.

2. Analiza dermatoglifelor se realizează în modul următor: la nivelul degetelor:

cu ajutorul unui creion bine ascuţit localizaţi poziţia şi numărul triradiilor digitale şi trasaţi conturul figurilor digitale;

trasaţi o linie între mijlocul figurii digitale şi triradiusul acesteia; stabiliţi numărul de creste papilare intersectate şi calculaţi suma pentru cele 10 degete.

la nivelul palmei: localizaţi triradiile subdigitale şi cel axial; măsuraţi unghiul atd; trasaţi liniile principale A, B, C, D şi T, stabilind în ce câmp al palmei îşi termină parcursul; calculaţi indicele de transversalitate însumând valorile câmpurilor respective; examinaţi cu atenţie regiunile tenară, hipotenară şi interdigitale, pentru a stabili eventuala

prezenţă a unei figuri în aceste regiuni; stabiliţi dispoziţia pliurilor de flexie de la nivelul degetelor şi palmelor şi recunoaşteţi

eventualele tipuri particulare; comparaţi valorile obţinute pentru SCD şi IT cu valorile medii corespunzătoare pentru ţara

noastră; corelaţi frecvenţele modelelor digitale cu frecvenţele menţionate în lucrarea practică; stabiliţi variaţiile de lateralitate şi diferenţele ce ţin de sex (calculaţi raportul A/V).

3. Calculaţi parametrii dermatoglifelor digito-palmare pentru lotul reprezentat de grupele ce fac lucrarea practică; comparaţi rezultatele obţinute cu valorile medii obţinute pentru ţara noastră.


A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI: poligenie multifactorial heritabilitate gemeni monozigoţi gemeni dizigoţi coeficient ereditar dermatoglife bucle vârtejuri triradius arcuri radiant

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. În cazul bolilor multifactoriale riscul de recurenţă este mai crescut decât pentru bolile cu

determinism monogenic? (adevărat / fals) 2. Hipertensiunea arterială este o afecţiune cu determinism multifactorial? (adevărat / fals) 3. Doi părinţi cu valori mici ale taliei au copii a căror talie este egală cu media taliilor lor? (adevărat

/fals)

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate ("complement simplu"): 1. Numărul de creste digitale are o distribuţie: A. discontinuă; B. gaussiană; C. logaritmică; D. liniară; E. nici un răspuns nu este corect.

2. Figurile adeltice sunt: A. arcul; B. arcul piniform; C. vârtejul. D. bucla cubitală; E. bucla radială;

3. Care este riscul de recurenţă aproximativ la descendenţii unei persoane afectate pentru o afecţiune multifactorială cu incidenţa în populaţia generală de 1/1.000? 5%; B. 1% C. 10% D. nu poate fi calculat E. 3%.


175

4. Se consideră o afecţiune multifactorială care este de două ori mai frecventă la femei faţă de bărbaţi. Indicaţi care este situaţia cu risc maxim de recurenţă la descendenţii unei persoane afectate:

A. la descendenţii de sex feminin ai bărbaţilor afectaţi; B. la descendenţii de sex masculin ai bărbaţilor afectaţi; C. la descendenţii de sex feminin ai femeilor afectate; D. la descendenţii de sex masculin ai femeilor afectate; E. la descendenţii bărbaţilor afectaţi, indiferent de sexul acestora.


5. Modelele teoretice privind ereditatea poligenică presupun că: 1. toate genele au efecte aditive; 3. genele acţionează independent una de alta; 2. există relaţii de epistazie; 4. expresia fenotipică prezintă o variaţie liniară.

6. Care sunt caracterele generale ale dermatoglifelor ?: 1. formare în viaţa intrauterină; 2. modificare postnatală; 3. diversitate; 4. determinate de mediu.

7. Între doi gemeni MZ pot exista diferenţe genetice în ceea ce priveşte: 1. tipul anticorpilor şi cel al receptorilor limfocitelor T; 2. mutaţiile somatice; 3. numărul moleculelor de ADN mitocondrial; 4. modelul inactivării unuia din cei doi cromosomi X la gemenii MZ de sex feminin.


8. Concordanţa dermatoglifelor la gemenii monozigoţi este de 100%, deoarece dermatoglifele au determinism genetic.

9. În cazul afecţiunilor multifactoriale ce prezintă incidenţă mai mare la un anumit sex, riscul de recurenţă este mai crescut dacă probandul aparţine sexului mai rar afectat deoarece aceasta presupune acumularea mai multor factori de risc în acea familie.

IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere:

10. Asociaţi tipul de figură digitală cu numărul de triradii corespunzător: 1. arc A. 0 2. arc piniform B. 1 3. buclă cubitală C. 2 4. vârtej D. 3 5. buclă radială E. 4

9. GENETICA POPULA]IILOR

I. DATE TEORETICE În Genetică, mai mult ca în orice altă specialitate medicală, pacientul este reflectarea

familiei şi a populaţiei căreia îi aparţine. Genetica Medicală nu se ocupă numai cu stabilirea unui diagnostic corect la un anumit pacient, ci şi cu determinarea genotipurilor altor membri ai familiei şi estimarea riscului de recurenţă atât pentru părinţii unui copil afectat, cât şi pentru rudele lor mai apropiate sau mai îndepărtate. Cunoaşterea frecvenţei diferitelor boli genetice în diferite populaţii este foarte utilă pentru diagnosticul clinic şi sfatul genetic.

Genetica populaţiilor este studiul distribuţiei genelor în populaţie şi a modului în care frecvenţele genelor şi genotipurilor sunt menţinute sau modificate. Genetica populaţiilor se referă atât la factori genetici, cu sunt mutaţiile, cât şi la factori de mediu şi sociali (selecţia şi migraţia), factori care împreună determină frecvenţa şi distribuţia bolilor genetice în familii şi comunităţi.

Studiile antropologice actuale sugerează că strămoşii oamenilor au apărut în urmă cu aproximativ 1,5 milioane de ani în Africa şi s-au răspândit în restul lumii în valuri succesive de migraţie. Au rezultat astfel comunităţi umane izolate geografic şi genetic unele de altele, comunităţi care au format grupuri etnice cu frecvenţe genice specifice. Selecţia mutaţiilor favorabile ca răspuns la factorii de mediu sau supravieţuirea mutaţiilor neutre sau nefavorabile, împreună cu un anumit grad de izolare reproductivă între grupuri au dus la stabilirea de diferenţe genetice între grupurile populaţionale. Frecvent există diferenţe mari între grupurile populaţionale în ceea ce priveşte frecvenţa diferitelor gene (normale şi anormale).

A. OBIECTIVELE GENETICII POPULAŢIILOR Populaţia reprezintă un grup (comunitate) de indivizi care au un fond comun de gene,

trăiesc în acelaşi habitat şi se împerechează la întâmplare (panmictic), fără selecţia partenerilor de sex opus.

Fiecare organism primeşte de la părinţii săi, prin genele gameţilor, informaţiile necesare pentru formarea şi dezvoltarea sa. În acest mod, membrii unei populaţii umane moştenesc şi transmit gene asemănătoare. Totalitatea genelor existente la un moment dat în populaţie alcătuiesc fondul comun de gene. Astfel, se poate considera că indivizii reprezintă "asocieri temporare unice" ale unor gene din fondul de gene caracteristic populaţiei, iar populaţia biologică reprezintă "o populaţie de gene".

Populaţiile pot fi deci descrise în termeni de frecvenţă a diferitelor fenotipuri/genotipuri sau a diferitelor alele ale unui locus dat. În populaţie, genele formează combinaţii care interacţionează şi se influenţează reciproc, stabilindu-se relaţii alelice şi nonalelice care fac ca ansamblul lor să fie integrat. Acest fapt conferă fondului genic al populaţiei o puternică coeziune.

Genetica populaţiilor

179

Împerecherea întâmplătoare a indivizilor din populaţie produce un schimb permanent de gene, care printr-o continuă recombinare şi segregare meiotică generează la descendenţi o heterozigoţie perpetuă, iar în populaţie o intensă variabilitate genetică. Astfel, se poate explica unicitatea genetică a fiecărei persoane şi adaptabilitatea populaţiei. Exceptând parţial omul, la celelalte specii individul are un rol neînsemnat în evoluţie, rolul decisiv revenind populaţiei.

Populaţia biologică constituie o unitate de reproducere panmictică şi o unitate de evoluţie.

Specia umană poate fi divizată în trei grupe populaţionale, denumite rase: albi (caucazieni), negri şi asiatici. Fiecare grup se subdivide în numeroase subpopulaţii distincte, numite grupuri etnice. Grupele şi subgrupele populaţionale se deosebesc unele de altele prin fondul specific de gene, determinat de frecvenţele diferite ale alelelor multor loci. De exemplu: în sistemul polialelic al grupului sanguin AB0, alela B predomină în populaţia asiatică, frecvenţa ei scăzând de la est spre vest, alela A predomină în vestul Europei, iar alela O în populaţia africană.

Genetica populaţiilor umane studiază frecvenţa genelor şi proporţiile relative ale diferitelor genotipuri în populaţie, dar şi factorii care menţin sau modifică frecvenţa acestora de la o generaţie la alta. Evaluarea acestor parametri este utilă pentru: definirea structurii genetice a populaţiei respective pe baza frecvenţelor specifice a unor gene

mutante şi boli genetice; sfatul genetic, deoarece prin cunoaşterea frecvenţei diferitelor genotipuri în populaţie se

poate stabili incidenţa heterozigoţilor (Na) sănătoşi şi calcularea riscului de apariţie în descendenţă a unor copii afectaţi (aa);

aprecierea rentabilităţii programelor de screening genetic într-o anumită populaţie.

B. LEGEA HARDY - WEINBERG Frecvenţele genotipice şi alelice depind de factori cum ar fi tipul de căsătorie

(consanguină sau nu), mărimea şi distribuţia populaţiei, mutaţii, migraţii şi selecţie. Calcularea frecvenţelor genotipice pe baza frecvenţelor alelice, într-o populaţie în echilibru, în care încrucişările sunt întâmplătoare, se poate face folosind legea Hardy – Weinberg, elaborată în 1908 independent de matematicianul englez Goeffrey Hardy şi medicul german Wilhelm Weinberg.

Enunţul legii Hardy – Weinberg este următorul: într-o populaţie panmictică în echilibru (în care căsătoriile se fac la întâmplare), neinfluenţată de migraţii, selecţie sau mutaţii, în cazul unui locus ce poate fi ocupat de două alele A1 şi A2, frecvenţele alelelor (p şi q) şi frecvenţele genotipurilor A1A1, A1A2 şi A2A2, (p2, 2pq respectiv q2) se menţin constante în succesiunea generaţiilor.

Demonstrarea legii Hardy – Weinberg se face în modul următor: În cazul unui locus ce poate fi ocupat doar de două alele A1 şi A2, genotipurile posibile sunt:

A1A1, A1A2 şi A2A2. În condiţiile în care frecvenţa în populaţie a genei A1 = p, iar a genei A2 = q, atunci p + q = 1

(100%), deoarece locusul A poate fi ocupat fie de A1, fie de A2, eventualităţi care se exclud reciproc; în cazul în care una dintre gene este dominantă, iar cealaltă recesivă, pentru gena dominantă se foloseşte litera p, iar pentru cea recesivă litera q.

Ţinând cont de cele de mai sus frecvenţa genotipurilor A1A1, A1A2 şi A2A2, în funcţie de frecvenţele p şi q ale genelor A1 şi A2, este: A1A1 = p2; A1A2 = 2pq; A2A2= q2. (vezi tabelul 9.1).

Frecvenţa de apariţie a tuturor încrucişărilor posibile în populaţia respectivă este prezentată în tabelul 9.2.


180

Tabelul 9.1 Frecvenţa genotipurilor realizate de prin asocierea alelelor A1 şi A2

Gameţi masculini A1 (p) A2 (q)

Gameţi feminini A1 (p) A1A1 (p2) A1A2 (pq) A2 (q) A1A2 (pq) A2A2 (q2)

Tabelul 9.2 Frecvenţa diferitelor tipuri de încrucişări parentale

Frecvenţa genotipurilor la tată A1A1 (p2) A1A2 (2 pq) A2A2 (q2)

Frecvenţa genotipurilor la mamă

A1A1 (p2) p4 2p3q p2q2 A1A2 (2 pq) 2p3q 4 p2q2 2 pq3

A2A2 (q2) p2q2 2 pq3 q4

Analiza detaliată a fiecărui tip de încrucişare, cu frecvenţele diferitelor genotipuri rezultate la descendenţi este prezentată în tabelul 9.3

Tabelul 9.3 Frecvenţa genotipurilor la descendenţi în diferite încrucişări parentale

Incrucişări parentale Frecvenţa genotipurilor la urmaşi Tipuri Frecvenţă A1A1 A1A2 A2A2 A1A1 x A1A1 p4 p4 - - A1A1 x A1A2 4p3q 2p3q 2p3q - A1A2 x A1A2 4 p2q2 p2q2 2 p2q2 p2q2 A1A1 x A2A2 2 p2q2 - 2 p2q2 - A1A2 x A2A2 4 pq3 - 2 pq3 2 pq3

A2A2 x A2A2 q4 - - q4 Total genotipuri la urmaşi

= (p4+2p3q+p2q2) + (2p3q+2p2q2+2p2q2+2 pq3) + ( p2q2+2 pq3+ q4) = = p2 (p2 + 2pq + q2) + 2pq (p2 + 2pq + q2) + q2 (p2 + 2pq + q2) = = p2 (p+q)2 + 2pq (p+q)2 + q2 (p+q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1

Genotipurile care apar la copii prin combinarea gameţilor parentali vor fi: A1A1, A1A2 şi A2A2 cu frecvenţele: A1A1: p4 + 2p3q + p2q2 = p2 (p2 + 2pq + q2) = p2; A1A2: 2p3q + 2 p2q2 + 2 p2q2 + 2pq3 = 2pq (p2 + 2pq + q2) = 2pq; A2A2: p2q2 + 2pq3 + q4 = q2 (p2 + 2pq + q2) = q2.

Rezultă că frecvenţele celor trei genotipuri în generaţia descendenţilor sunt identice cu cele ale părinţilor: A1A1 = p2; A1A2 = 2pq; A2A2= q2.

Frecvenţele genelor A1 şi A2 în generaţia a doua sunt identice cu cele din prima generaţie: frecvenţa genei A1 = p2 + 1/2 x 2pq = p ( p + q ) = p; frecvenţa genei A2= q2 + 1/2 x 2pq = q ( p + q ) = q;

Acelaşi lucru va fi valabil pentru toate generaţiile următoare şi astfel se poate formula o concluzie cu caracter general.

Pentru genele situate într-un locus de pe cromosomul X aplicarea legii Hardy - Weinberg este diferită deoarece echilibrul nu se realizează după prima generaţie de încrucişări întâmplătoare, ci este obţinut, într-o manieră oscilatorie, după un număr de


181

generaţii, întrucât transmiterea ereditară diferă la bărbaţi şi femei. Bărbaţii au un singur cromosom X pe care îl moştenesc obligatoriu de la mamele lor şi îl transmit obligatoriu la toate fiicele, în timp ce femeile moştenesc câte un cromosom X de la ambii părinţi. Când se realizează echilibrul genic el este menţinut în generaţiile următoare (Tabel 9.4.).

Tabel 9.4. Tipuri de încrucişări în cazul a două alele (A şi a) situate pe cromosomul X

Genotip patern

Genotip matern

Frecvenţa încrucişării

Frecvenţa genotipurilor la descendenţi

Genotipuri la băieţi Genotipuri la fete

A a AA Aa aa A (p) AA (p2) p3 p3 - p3 - - A (p) Aa (2pq) 2p2q p2q p2q p2q p2q - A (p) aa (q2) pq2 - pq2 - pq2 - a (q) AA (p2) p2q p2q - - p2q - a (q) Aa (2pq) 2pq2 pq2 pq2 - pq2 pq2 a (q) aa (q2) q3 - q3 - - q3 Total p(p2 + 2pq

+ q2) = p q(p2 + 2pq + q2) = q

p2(p + q) = p2

2pq(p + q) = 2pq

q2(p + q) = q2

În aceste condiţii, frecvenţa genică este aceeaşi la ambele sexe, dar frecvenţa bărbaţilor afectaţi (hemizigoţi XaY) este egală cu aceea a genei alele mutante (Xa) în timp ce frecvenţele genotipice la femei (XX) sunt la fel ca şi în cazul unui locus autosomal.

În cazul unor alele multiple frecvenţele genice şi genotipice pot fi calculate prin adăugarea unui/unor noi termen(i) la ecuaţia binomială (p + q)2. De exemplu, frecvenţele genice şi genotipice în cazul existenţei a trei alele pentru un anumit locus se vor calcula pe baza formulei (p + q + r)2, unde p, q şi r reprezintă frecvenţele celor trei alele.

Presupunerile pe care se bazează legea Hardy - Weinberg sunt următoarele: legea se aplică populaţiilor mari; rata mutaţiilor este constantă; nu există selecţie în favoarea sau defavoarea unui genotip (indivizii cu diverse genotipuri au

aceeaşi capacitate de a transmite genele la descendenţi); căsătoriile se fac complet la întâmplare, fără căsătorii preferenţiale sau consangvine; nu există migraţie spre sau dinspre populaţia respectivă; genele alele nu diferă în efectul lor asupra fertilităţii.

Legea Hardy - Weinberg: într-o populaţie panmictică (în care încrucişările se fac la întâmplare), fără migraţii, selecţie şi mutaţii, frecvenţele la origine p şi q ale alelelor A1 şi A2 se menţin constante din generaţie în generaţie; la fel se păstrează constante şi frecvenţele genotipurilor A1A1, A1A2 şi A2A2, ele fiind

p2, 2pq şi q2. O astfel de populaţie cu frecvenţe genice stabile este în echilibru.

Presupunerile pe care se bazează legea Hardy - Weinberg sunt următoarele: legea se aplică populaţiilor mari, rata mutaţiilor este constantă, nu există selecţie în favoarea sau defavoarea unui genotip, căsătoriile se fac complet la întâmplare, nu există migraţie spre sau dinspre populaţia respectivă, iar genele alele nu diferă în efectul lor asupra fertilităţii.


182

C. FACTORII CARE MODIFICĂ ECHILIBRUL HARDY - WEINBERG

Echilibrul genic postulat de legea Hardy - Weinberg se realizează în anumite condiţii speciale (vezi paragraful anterior). Legea nu este valabilă decât în populaţiile panmictice (mari) în care încrucişările sunt aleatorii şi nu există selecţie, mutaţii sau migraţii. Aceste condiţii sunt rar îndeplinite în populaţiile umane, totuşi evoluţia spre un echilibru genetic stabil este posibilă şi principiile ce decurg din legea Hardy - Weinberg rămân valabile în genetica clinică, permiţând aprecierea frecvenţei genelor alele.

Factorii care modifică echilibrul Hardy - Weinberg sunt următorii: căsătoriile neîntâmplătoare (stratificare, căsătorii asortative şi consangvinitate), mutaţiile, selecţia şi migraţiile.

1. CĂSĂTORIILE NEÎNTÂMPLĂTOARE

Termenul de căsătorii neîntâmplătoare se referă la fenomenul de stratificare, căsătoriile asortative şi căsătoriile consangvine.

În majoritatea populaţiilor umane, căsătoriile sunt rareori aleatorii. Ele sunt de obicei orientate, în sensul că membrii unei subpopulaţii, definită pe criterii rasiale, etnice, religioase, se unesc mai frecvent cu alţi membri ai aceleiaşi populaţii. Acest lucru este firesc deoarece multe populaţii sunt stratificate, fiind alcătuite din mai multe subgrupe cu un "profil genic" caracteristic. Uneori ele formează adevărate "izolate", populaţii mici în care membrii lor nu se vor încrucişa înafara grupului (de exemplu populaţia Statelor Unite formată din caucazieni, afro-americani, indieni, asiatici şi hispanici). Datorită stratificării, în fiecare subgrup unele afecţiuni sunt mai frecvente, iar altele mai rare. Exemple de afecţiuni frecvente în anumite subgrupuri populaţionale sunt: boala Tay- Sachs la evreii Ashkenazi, talasemia în jurul bazinului Mediteraneean, siclemia la negrii americani, fibroza chistică şi fenilcetonuria la caucazieni. Informaţiile legate de stratificare au importanţă deosebită pentru sfatul genetic şi diagnosticul prenatal.

La acest fenomen de stratificare a populaţiei se adaugă încrucişarea asortativă sau preferenţială, care constă în alegerea partenerului pe baza anumitor criterii (limbaj, inteligenţă, statură, culoarea pielii, talent muzical, abilităţi sportive etc). Ea este de obicei pozitivă, adică indivizii tind să-şi aleagă un partener care să le semene. O astfel de încrucişare influenţează echilibrul Hardy- Weinberg deoarece creşte frecvenţa homozigoţilor în defavoarea heterozigoţilor. Încrucişarea asortativă negativă se referă la alegerea unui partener cu caracteristici opuse, este mai rar întâlnită şi nu influenţează semnificativ echilibrul Hardy- Weinberg. Un aspect important din punct de vedere clinic se referă la tendinţa indivizilor de a se căsători cu parteneri cu probleme medicale similare (de exemplu surditate, cecitate, nanism). Atunci când partenerii sunt purtători ai aceloraşi gene anormale (ceea ce se întâmplă rar), frecvenţa genică se modifică prin creşterea frecvenţei copiilor anormali. De obicei, deşi partenerii au aceeaşi problemă medicală, substratul este reprezentat de mutaţii diferite (heterogenitate genetică); astfel de cupluri au un risc mai mic de copii anormali, dar mai mare faţă de populaţia generală.

Un aspect particular al uniunilor nonaleatorii îl reprezintă încrucişările consangvine. Frecvenţa lor a scăzut în ultimele decenii, căsătoriile consanguine rămânând frecvente doar în anumite subgrupe populaţionale.

O căsătorie este considerată consanguină când cei doi membri au cel puţin un strămoş comun până la a treia generaţie de ascendenţi (stră-străbunic). Ei vor avea mai multe gene în comun decât indivizii neînrudiţi, ceea ce duce la o creştere a posibilităţilor de întâlnire a doi


183

heterozigoţi pentru aceiaşi genă şi la o amplificare la descendenţi a proporţiei homozigoţilor bolnavi cu afecţiuni recesive severe, a bolilor poligenice/multifactoriale sau a malformaţiilor congenitale. Riscul naşterii unui copil homozigot pentru o alelă recesivă rară este proporţional cu gradul de înrudire.

De exemplu, pentru verii primari riscul unui urmaş anormal fizic sau mintal este aproape dublu faţă de riscul unui cuplu neînrudit din populaţia generală: 1/30 faţă de 1/50. La verii de gradul II riscul se reduce, pentru ca la grade de înrudire mai îndepărtate acesta să devină neglijabil, cu excepţia situaţiilor când în fiecare din familiile înrudite există cel puţin un bolnav cu o afecţiune identică. În cazul căsătoriilor consanguine este importantă stabilirea coeficientului de înrudire (R) şi a coeficientului de consangvinitate (F).

Coeficientul de înrudire se calculează folosind formula: 121

2

1

nnR

unde: R este coeficientul de înrudire, n1 numărul de generaţii existente între unul din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun, iar n2 – numărul de generaţii existente între celălalt din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun.

Coeficientul de consanguinitate se calculează cu formula:

4

12 RF

unde: F este coeficientul de consangvinitate iar R coeficientul de înrudire. Coeficientul de consanguinitate al unui copil rezultat dintr-o căsătorie consanguină

reprezintă probabilitatea acestuia de a moşteni aceeaşi alelă de la ambii genitori, genă pe care aceştia au moştenit-o de la un strămoş comun. În tabelul 9.5 sunt prezentaţi coeficienţii de consangvinitate pentru diferite tipuri de căsătorii consangvine.

Aprecierea înrudirii dintr-o populaţie poate fi realizată prin măsurarea scăderii heterozigozităţii fată de populaţiile unde încrucişările se fac la întâmplare.

Spre deosebire de afecţiunile din populaţiile stratificate, în care fiecare subgrup are o frecvenţă crescută a câtorva alele, tipurile de boli recesive care apar la descendenţii căsătoriilor consangvine sunt reprezentate de boli foarte rare, care de obicei apar numai în acea familie, nu şi la alţi membri ai comunităţii.

Tabelul 9.5 Coeficienţii de înrudire şi de consanguinitate în diferite tipuri de căsătorii

Tip de căsătorie Proporţia de alele în comun (coeficient de înrudire)

F (coeficient de consangvinitate)

Părinte - copil 1/2 1/4 Frate - soră 1/2 1/4 Fraţi vitregi 1/4 1/8 Unchi – nepoată Mătuşă - nepot

1/4 1/8

Veri gradul I 1/8 1/16 Veri gradul II 1/32 1/64 Veri gradul III 1/128 1/256

Stratificarea se referă la formarea de izolate în cadrul unei populaţii, fiecare grup având anumite afecţiuni mai frecvente;


184

Căsătoriile asortative sunt căsătorii între indivizi cu caracteristici similare (tip pozitiv) sau total opuse (tip negativ); cele de tip pozitiv modifică frecvenţa genelor în populaţie;

Căsătoriile consangvine sunt căsătorii între persoane înrudite şi duc la apariţia de afecţiuni recesive rare (neîntâlnite la alţi indivizi din acea populaţie);

Înrudirea între 2 indivizi se măsoară prin coeficientul de consangvinitate şi coeficientul de înrudire.

2. POPULAŢIILE REDUSE

Pentru motive diferite (geografice, religioase, politice) un subgrup restrâns dintr-o populaţie se poate izola fizic şi/sau social de restul populaţiei formând un izolat genetic. În populaţiile mici se poate produce un fenomen care modifică echilibrul Hardy - Weinberg, numit deriva genetică întâmplătoare.

Spre deosebire de populaţiile mari, în care variaţiile numărului copiilor indivizilor cu genotipuri diferite nu influenţează semnificativ frecvenţa genelor, în populaţiile mici asemenea variaţii pot modifica, uneori considerabil, această frecvenţă. Dacă într-o astfel de populaţie, gena "A" este mai frecventă decât alela "a" şi indivizii cu gena "a" nu au copii sau nu o transmit la descendenţi, atunci după câteva generaţii, gena "a" va dispare iar gena "A" se va fixa mai puternic. Astfel se poate explica frecvenţa crescută a unor grupe sanguine sau boli genetice în anumite populaţii mici, dar este greu de acceptat că deriva genetică este unica cauză a fenomenului.

O altă explicaţie a incidenţei mari a unor afecţiuni genetice în anumite populaţii este efectul de fondator. Dacă membrii fondatori ai unui subgrup au o genă mutantă recesivă rară, prin încrucişările ulterioare în cadrul subgrupei populaţionale respective se produce o homozigotare frecventă şi o creştere a incidenţei bolii produsă de gena mutantă. Se cunosc mai multe exemple: frecvenţa crescută a bolii Huntington în regiunea lacului Maracaibo din Venezuela, a tirozinemiei în regiunea franceză a Canadei sau a porfiriei variegata în Africa de Sud. Ultimul exemplu este sugestiv pentru efectul de fondator. În Africa de Sud există la ora actuală circa un milion de persoane de origine afrikaans. Aceştia reprezintă urmaşii unui mic grup de origine olandeză care au emigrat în colonia Cape Town în secolul XVII. Unul dintre membrii fondatori a prezentat porfiria variegata, o boală dominant autosomală, caracterizată prin fotosensibilitate şi fenomene neuroviscerale. Prin încrucişare preferenţială, frecvenţa bolnavilor este astăzi de 3/1.000, mult mai mare decât cea din Olanda sau alte ţări ale lumii.

O acţiune combinată a derivei genetice şi efectului de fondator s-a înregistrat în Finlanda, unde populaţia a fost mult timp izolată genetic, geografic, lingvistic şi cultural. La acest fenomen s-a adăugat explozia demografică din ultimele secole. Aceşti factori au determinat o frecvenţă crescută în Finlanda a circa 20 de boli genetice, rare în alte zone ale lumii (sindromul nefrotic congenital, aspartilglicosaminuria, coroideremia etc.).

Deriva genetică se referă la populaţiile mici, în care creşterea sau scăderea numărului de descendenţi ai unei persoane afectate duce la modificarea semnificativă a frecvenţelor genice şi genotipice.

Efectul de fondator apare atunci când unul dintre indivizii care iniţiază o comunitate prezintă o afecţiune ce va fi transmisă la descendenţii săi; boala devine mai frecventă decât în alte comunităţi.

3. MUTAŢIILE


185

Mutaţiile sunt modificări accidentale, permanente şi ereditare, care determină o modificare a functiei unei gene, ducând la apariţia unor caracteristici noi utile, neutre sau defavorabile. Mutaţiile favorabile au jucat un rol important în evoluţia biologică, culminând cu apariţia omului şi evoluţia acestuia. Majoritatea mutaţiilor noi sunt însă defavorabile şi tind să rupă echilibrul genic din populaţie.

Amploarea efectului defavorabil al unei mutaţii poate fi apreciat prin consecinţele acesteia asupra capacităţii biologice de supravieţuire şi reproducere a individului (fitness). Ea reprezintă principalul factor care determină dacă o genă mutantă dispare imediat, supravieţuieste câteva generaţii sau devine o alelă predominantă.

O mutaţie poate fi letală atunci când nu se transmite la generaţia următoare deoarece afectează supravieţuirea sau reproducerea (produce moarte sau sterilitate). De exemplu, osteogenesis imperfecta tip 2, sindromul Apert sau displazia tanatoforică sunt determinate de mutaţii care nu se pot transmite la descendenţi, iar aceste boli au caracter sporadic. Mutaţiile pot fi subletale când reduc rata de reproducere, cum este cazul în acondroplazie, unde indicele de fertilitate al bolnavilor este 0,20.

Mutaţiile se produc continuu, iar efectele lor defavorabile realizează în ansamblu povara genetică a populaţiei, reprezentată de reducerea capacităţii reproductive indusă global de toate mutaţiile existente la indivizii unei populaţii. Mutaţiile dominante autosomale sau situate pe cromosomul X şi cele recesive localizate pe cromosomul X se exprimă la heterozigoţi, respectiv hemizigoţi. În schimb, mutaţiile recesive, destul de frecvente, nu se manifestă la heterozigoţi. Analiza statistică a populaţiilor panmictice a arătat că fiecare persoană normală are în stare heterozigotă 3-5 gene recesive, letale la homozigoţi, dar acestea diferă de la o persoană la alta.

Efectul negativ al unor mutaţii este influenţat şi contrabalansat de selecţie, păstrându-se astfel un echilibru genic. Menţinerea constantă a unei frecvenţe genice se realizează prin înlocuirea genelor anormale pierdute prin deces sau sterilitate prin mutaţii noi în generaţia următoare.

Pentru majoritatea genelor umane rata de mutaţie este relativ mică, de ordinul a 10-6-5 per locus/gamet/generaţie. Dintre excepţiile de la această regulă pot fi citate neurofibromatoza tip 1 şi miopatia Duchenne în care rata mutaţiilor este de ordinul 10-4. Fenomenul poate fi explicat în distrofia Duchenne prin dimensiunea foarte mare a genei (>2.000Kb) care o face mai vulnerabilă la acţiunea agenţilor mutageni.

Factorii de mediu care produc mutaţii la om sunt reprezentaţi de radiaţiile ionizante şi diferiţi agenţi chimici. La aceşti factori se adaugă efectul vârstei paterne, caracterizat prin creşterea frecvenţei mutaţiilor dominante noi odată cu creşterea vârstei bărbatului, riscul pentru astfel de mutaţii fiind de 0.5 - 1% la copiii bărbaţilor peste 40 de ani.

Mutaţiile letale apar în majoritatea cazurilor sub formă de cazuri sporadice; rareori apar în fratrii (mozaicism gonadic);

Mutaţiile subletale reduc rata de reproducere, frecvenţa fiind menţinută prin apariţia de mutaţii noi.

4. SELECŢIA

Selecţia reprezintă acţiunea factorilor de mediu asupra unui anumit genotip. Genotipurile dezavantajoase sunt selectate negativ (eliminate) şi contribuie cu puţine gene la fondul generaţiei următoare. În schimb, genotipurile avantajoase sunt selectate pozitiv (menţinute) şi contribuie cu un număr mare de gene la generaţia următoare. Astfel, selecţia


186

stabileşte cota de gene prin care indivizii cu genotipuri diferite contribuie la fondul comun de gene al populaţiei în funcţie de viabilitatea şi fertilitatea lor.

Teoria darwinistă consideră că selecţia naturală a constituit un factor crucial al evoluţiei. Indivizii cei mai apţi într-un anumit mediu supravieţuiesc şi se reproduc. În concepţia actuală selecţia este consecinţa unui indice de fertilitate diferit al anumitor fenotipuri produse de genotipuri ce rezultă prin mutaţii. Selecţia acţionează prin diminuarea sau creşterea aptitudinii biologice de supravieţuire şi reproducere a indivizilor. Selecţia favorizează indivizii cu cea mai ridicată capacitate de reproducere şi elimină variaţiile care slăbesc potenţialul reproductiv.

Indicele de fertilitate măsoară aptitudinea reproductivă a unui individ şi contribuţia acestuia la fondul genetic al generaţiei următoare. Valoarea acestui indice variază între 0 (alelă letală sau care produce sterilitate) şi 1 (alelă normală ). Indicele de fertilitate este parametrul cel mai util în compararea diferitelor genotipuri într-o populaţie, dar el este valabil în contextul unui mediu particular în care există o diferenţă de adaptare la mediu.

Mutaţiile produse în regiunile necodante ale genelor sau în segmentele intergenice sunt neutre din punct de vedere al efectului lor fenotipic. În aceste cazuri variaţia lor în populaţie este determinată de întâmplare şi nu de selecţie. În schimb, mutaţiile cu efecte negative, defavorabile, sunt cu certitudine supuse selecţiei, care uneori este foarte eficientă.

Alelele mutante dominante sunt supuse direct selecţiei, care acţionează rapid în sensul eliminării mutaţiei. În schimb, genele mutante recesive sunt nemanifeste la heterozigoţi, iar efectul selecţiei este foarte lent.

Selecţia naturală şi mutaţiile intervin concomitent pentru a crea în populaţie un echilibru genetic stabil. Acesta poate fi realizat prin două mecanisme: presiunea de selecţie = presiunea de mutaţie - rata de eliminarea a caracterului anormal este

echilibrată de apariţia unor mutaţii noi; presiunea de selecţie = presiunea de mutaţie + avantajul selectiv al heterozigoţilor - rata

mutaţiilor este mică, dar frecvenţa genei mutante este crescută, datorită avantajului selectiv al heterozigoţilor.

Teoretic există patru moduri de acţiune a selecţiei naturale: contra mutaţiilor dominante autosomale, contra homozigoţilor (sau hemizigoţilor) recesivi, contra heterozigoţilor şi în favoarea heterozigoţilor. Primele trei tipuri duc la o incapacitate în transmiterea genei, prin reducerea duratei de supravieţuire şi/sau sterilitate (infertilitate), indicele de fertilitate scăzând spre zero. Frecvenţele actuale ale alelelor mutante sunt rezultatul echilibrului între "pierdere" prin selecţie şi "câştig" prin mutaţii noi. Al patrulea tip de acţiune al selecţiei naturale favorizează heterozigoţii comparativ cu ambele tipuri de homozigoţi.

Selecţia contra mutaţiilor dominante autosomale acţionează astfel încât gena defavorabilă este supusă direct selecţiei, deoarece ea se manifestă fenotipic atât la heterozigoţi, cât şi la homozigoţi. Selecţia acţionează rapid, iar transmiterea mutaţiei la generaţiile următoare depinde de aptitudinile de supravieţuire şi reproducere ale indivizilor ce au mutaţia. În bolile dominant autosomale cu indice de fertilitate 0 cazurile noi rezultă doar prin mutaţii de novo. În bolile dominante subletale, cu rată de reproducere redusă, numai o parte din genele anormale trec de la o generaţie la alta. Restul cazurilor de boală sunt consecinţa unor mutaţii noi.

Selecţia contra mutaţiilor recesive defavorabile este mai puţin eficientă şi foarte lentă, deoarece numai o mică proporţie a acestor gene sunt manifeste (la homozigoţi) În majoritatea cazurilor, gena este nemanifestă, fiind prezentă la heterozigoţi, care au un indice de fertilitate normal.


187

În mutaţiile recesive ale genelor situate pe cromosomul X selecţia se face contra bărbaţilor hemizigoţi. În unele boli recesive letale, precum în distrofia musculară Duchenne, bărbaţii afectaţi nu se reproduc, iar gena mutantă este transmisă exclusiv de femeile purtătoare. În aceste boli, 1/3 din genele mutante dispar în fiecare generaţie, fiind înlocuite prin mutaţii noi. În bolile recesive cu transmitere legată de cromosomul X mai puţin severe, precum hemofilia, o parte dintre bărbaţii afectaţi se pot reproduce, transmiţând gena anormală la toate fiicele, iar proporţia de bolnavi rezultaţi prin mutaţii noi este de aproximativ 15 %.

Selecţia contra heterozigoţilor este rareori prezentă. De exemplu, în cazul sistemului de grup sanguin Rh a existat o astfel de selecţie la femeile Rh negative (dd) o selecţie contra feţilor Rh pozitivi, heterozigoţi (Dd) care dezvoltă boala hemolitică a nou-născutului. La ora actuală, în condiţiile în care incompatibilitatea materno-fetală poate fi prezentă, selecţia contra heterozigoţilor nu va mai avea loc şi, în timp, va creşte incidenţa alelei recesive.

Selecţia în favoarea heterozigoţilor apare în anumite boli în care aceste persoane au un avantaj selectiv faţă de ambele tipuri de genotipuri homozigote. În aceste condiţii apare o creştere a frecvenţei genei anormale, chiar dacă mutaţia reduce sever supravieţuirea şi reproducerea la homozigoţii recesivi (aa). Exemplul clasic de astfel de avantaj este cele al heterozigoţilor pentru sicklemie (dreponocitoză) care sunt rezistenţi la malarie. În regiunile în care malaria este endemică (bazinul Mediteranean, Asia de Sud-Est) homozigoţii normali (NN) sunt vulnerabili la infecţie şi vor avea o fertilitate mai redusă comparativ cu heterozigoţii, în eritrocitele cărora nu se pot dezvolta paraziţii din specia Plasmodium. În consecinţă, în aceste regiuni, frecvenţa genei mutante pentru HbS a crescut în timp. Protecţia heterozigoţilor contra malariei reprezintă o explicaţie plauzbilă şi pentru frecvenţele crescute ale altor gene mutante cu efect asupra hematiilor: hemoblobina C, talasemie, deficit de glucozo-6-fosfatdehidrogenază (G6PD).

Selecţia reprezintă acţiunea factorilor de mediu asupra unui anumit genotip; Există patru moduri de acţiune a selecţiei naturale: contra mutaţiilor dominante autosomale, contra homozigoţilor (sau hemizigoţilor) recesivi, contra heterozigoţilor şi în favoarea heterozigoţilor.

5. MIGRAŢIILE ŞI FLUXUL GENIC

Migraţiile unui grup etnic dintr-o zonă geografică în alta şi căsătoriile mixte cu populaţia indigenă (cu o structură genetică diferită) pot modifica frecvenţele alelice în cele două populaţii. Se produce fenomenul de flux genic, definit ca o difuziune lentă a genelor dincolo de barierele rasiale. Procesul implică populaţii mari şi o modificare gradată a frecvenţelor genice. În urma imigrării, fondul genic al populaţiei gazdă se îmbogăţeşte.

O dovadă a fluxului genic este scăderea gradată a frecvenţei grupului sanguin B de la 25-30 % în Estul Asiei la 6-8 % în populaţiile Europei de Vest, datorită în mare măsură migraţiilor grupurilor asiatice de la Est la Vest şi amestecului acestora cu populaţiile europene.

În general, se apreciază că 70-80 % din totalul genelor noi dintr-o populaţie sunt gene "imigrate", migraţia fiind considerată o sursă importantă de variaţii ereditare.

Migraţiile modifică frecvenţele genice prin introducerea de alele noi într-o populaţie;

Distribuţia frecvenţelor alelice frecvent reflectă evenimente istorice, bariere geografice şi diferenţe lingvistice.


188

D. MODUL DE APLICARE A LEGII HARDY - WEINBERG ÎN BOLILE MONOGENICE

1. BOLI DOMINANT AUTOSOMALE

În cazul bolilor dominant autosomale, legea Hardy - Weinberg se aplică ţinând cont de următoarele particularităţi: frecvenţa p a genei mutante A, este foarte mică faţă de frecvenţa q a genei normale n; frecvenţa heterozigoţilor An (2pq) este mult mai mare decât frecvenţa homozigoţilor

anormali AA (p2).

În condiţiile în care p2<<2pq poate fi explicată prezenţa unui număr foarte mic de homozigoţi afectaţi. În acelaşi timp, deoarece p este foarte mic, q se aproximează cu 1, iar frecvenţa bolii va fi de aproximativ două ori frecvenţa genei mutante (2p).

2. BOLI RECESIV AUTOSOMALE

În bolile recesiv autosomale, legea Hardy - Weinberg permite calcularea frecvenţei heterozigoţilor folosind frecvenţa genei anormale sau a bolii în populaţie. În astfel de boli afecţiunea este prezentă exclusiv la homozigoţii aa şi astfel frecvenţa bolii va fi egală cu frecvenţa homozigoţilor aa, reprezentată prin termenul q2;

În bolile recesive rare, q este foarte mic, iar p se aproximează cu 1, astfel că frecvenţa heterozigoţilor este aproximativ 2q, fiind mult mai mare decât frecvenţa bolii (2pq >> q2). În aceste condiţii, majoritatea genelor mutante din populaţie se găsesc la heterozigoţii Na.

3. BOLI RECESIVE CU TRANSMITERE LEGATĂ DE CROMOSOMUL X

În bolile recesive legate de X, legea Hardy - Weinberg se poate aplica numai la femei, deoarece acestea au 2 alele pentru fiecare locus de pe cromosomul X. Bărbaţii au numai o copie a fiecărei gene de pe cromosomul X, iar frecvenţa genotipurilor XNY şi XaY este dată de termenii p şi q. Astfel la bărbaţi, frecvenţa genei anormale (q) este egală cu frecvenţa bolii. Numărul de femei afectate (XaXa) este mult mai mic decât cel al bărbaţilor afectaţi (XaY) deoarece q>q2, aspect accentuat în bolile recesive rare. În schimb numărul de heterozigote XNXa, sănătoase (2q) este dublu comparativ cu bărbaţii afectaţi (q).

În populaţia generală aproximativ 2/3 din genele mutante recesive de pe cromosomul X se găsesc la femeile purtătoare, iar 1/3 la bărbaţii afectaţi.

II. APLICAŢIILE PRACTICE 1. Estimarea frecvenţei purtătorilor sănătoşi (Na) ai unei gene recesive autosomale se face uşor când se cunoaşte frecvenţa bolii. De exemplu, când frecvenţa bolii este 1/ 10.000, frecvenţa heterozigoţilor Na este de aproximativ 1/50. q2 = 1/ 10.000 → q = 1/ 100 p + q = 1 → p = 1 – q = 99/100 → p≈1 Ţinând cont de relaţiile de mai sus: 2pq = 2 x 1 x 1/100 = 1/ 50.

2. Estimarea ratei mutaţiilor se poate face folosind două metode: directă sau indirectă. Metoda directă se poate aplica în bolile dominant autosomale cu penetranţă completă, când

afecţiunea este întotdeauna prezentă la heterozigoţi. În aceste cazuri aprecierea ratei mutaţiilor se poate face prin raportarea numărului de cazuri noi la numărul total de naşteri. Metoda se aplică, de asemenea,


189

în bolile dominant autosomale în care capacitatea reproductivă este complet compromisă (indice de fertilitate 0) în care toate cazurile noi sunt rezultatul unor mutaţii de novo.

Metoda indirectă se aplică în bolile dominant autosomale în care capacitatea reproductivă nu este complet compromisă, iar boala se află în echilibru Hardy - Weinberg. În această situaţie, genele pierdute datorită reproducerii scăzute a indivizilor afectaţi sunt înlocuite de mutaţiile noi. Frecvenţa mutaţiilor noi se poate calcula folosind diferite formule matematice.

3. Determinarea potenţialului mutagen este necesară pentru aprecierea efectelor mutagenice ale radiaţiilor ionizante sau ale unor agenţi chimici. În acest caz, trebuie estimată rata mutaţiilor şi modul în care acestea modifică incidenţa bolii în populaţie.


A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI: Populaţie Legea Hardy-Weinberg Căsătorie panmictică Încrucişare asortativă Coeficient de înrudire Coeficient de consanguinitate Deriva genetică Efect de fondator Mutaţii letale Mutaţii subletale Selecţia Indicele de fertilitate Migraţiile

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Enunţaţi legea Hardy- Weinberg. 2. Care sunt condiţiile în care se aplică legea Hardy- Weinberg? 3. Care sunt factorii care pot modifica echilibrul Hardy- Weinberg? 4. Enunţaţi şi comentaţi câteva aplicaţii ale legii Hardy- Weinberg. 5. Care sunt particularităţile legii Hardy- Weinberg pentru boli autosomal dominante, autosomal

recesive şi recesive legate de X? 6. Ce nu se întâmplă într-o populaţie aflată în echilibru Hardy- Weinberg? 7. Cum este folosită ecuaţia Hardy- Weinberg pentru a prezice recurenţa trăsăturilor recesive legate

de X? 8. Exemplificaţi cum modifică frecvenţele genice din echilibrul Hardy- Weinberg fiecare din

următorii factori: căsătoriile neîntâmplătoare; migraţia; căsătoriile asortative; deriva genetică; mutaţiile.

9. De ce persistă în populaţie o alelă mutantă atunci când este în stare homozigotă? 10. Daţi un exemplu de alelă mutantă care protejează împotriva bolilor infecţioase.

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate ("complement simplu"):

1. Fibroza chistică este cea mai comună boală recesiv autosomală la populaţia albă, având o frecvenţă de 1/ 2.500 nou-născuţi. Care este frecvenţa purtătorilor heterozigoţi de fibroză chistică în această populaţie? A. 1/ 25; B. 2/ 25; C. 1/ 50; D. 1/ 2.500; E. 2/ 2.500.

2. Pentru o boală recesiv autosomală cu frecvenţa heterozigoţilor 1/ 500, care este frecvenţa bolii în populaţie? A. 1/ 100; B. 1/ 1.000.000; C. 1/ 1.000; D. 1/ 10.000; E. Oricare răspuns.


190

3. Incidenţa genei pentru mucoviscidoză este 1/ 50. Care este incidenţa heterozigoţilor în populaţie: A. 1/ 1.250; B. 1/ 625; C. 1/ 50; D. 1/ 25; E. 1/ 10.

4. În cazul unei boli recesive legate de cromosomul X frecvenţa în populaţie a bărbaţilor afectaţi este 1/200. Care este frecvenţa femeilor purtătoare în populaţie? A. 1/40.000; B. 1/100; C. 1/10.000; D. 1/200; E. 1/50.

5. Frecvenţa genei anormale pentru o boală autosomal dominantă este 1/500. Care este frecvenţa indivizilor afectaţi în acea populaţie? A. 1/100; B. 1/1.000; C. 1/250; D. 1/250.000; E. 1/50.

6. Într-o populaţie pentru un anumit locus există două alele: A şi a. Cunoscând că frecvenţa genei A este 0,7 calculaţi care este frecvenţa persoanelor homozigote aa? A. 5/100 B. 3/100 C. 9/100 D 1/1000 E. 1/50

6. Într-o populaţie în echilibru există trei genotipuri în următoarele proporţii: A/A, 0,81; A/a, 0,18; a/a. 0,01.

a. Care sunt frecvenţele genelor A şi a? A. 50%/50% B.60%/40% C. 70%/30% D. 80%/20% E. 90%/10% b. Care vor fi frecvenţele lor generaţia următoare? A. 50%/50% B.60%/40% C. 70%/30% D. 80%/20% E. 90%/10%

7. Frecvenţa beta talasemiei în populaţia italiană este de 4%. Care este : a. Frecvenţa genei mutante pentru beta talasemie (presupunând că există numai o mutaţie în această populaţie); A. 50% B.40% C. 30% D. 20% E.10%

b. Incidenţa feţilor sau nou născuţilor afectaţi din această populaţie; A. 50% B.4% C. 15% D. 20% E.10%

c. Incidenţa beta talasemiei printre urmaşii cuplurilor în care ambii membri sunt heterozigoţi. A. 50% B.100% C. 75% D. 25% E.10%

8. La consult genetic se prezintă cuplul Popescu Ion (sănătos, în vârstă de 35 de ani) şi Popescu Maria (sănătoasă, în vârstă de 30 de ani) care doreşte să afle riscul de a avea un descendent afectat, deoarece în familia lor există cazuri de mucoviscidoză. Anamneza reproductivă a cuplului relevă: un băiat sănătos, o fată sănătoasă, un avort spontan cu făt sănătos, iar în prezent Maria este însărcinată, sarcină în vârstă de 20 de săptămâni cu făt de sex masculin. Ion şi Maria sunt veri de gradul II (bunicul patern a lui Ion şi bunica maternă a Mariei au fost fraţi). Părinţii lui Ion şi părinţii Mariei sunt toţi sănătoşi. Ion are o soră mai mare Elena, sănătoasă, măritată cu un bărbat sănătos neînrudit, care momentan este însărcinată, sarcină în vârstă de 10 săptămâni. Maria este cea mai mare dintr-o fratrie de 3 persoane. Ea are un frate mai mic, Emil, sănătos, căsătorit cu o femeie sănătoasă neînrudită. Cei doi au două fete gemene monozigote sănătoase, iar momentan soţia lui Emil este însărcinată, sarcină în vârstă de 16 săptămâni, cu făt de sex feminin. Maria are şi o soră mai mică Rodica, afectată, care este măritată cu un bărbat sănătos, neînrudit. Rodica are un băiat sănătos şi două fete sănătoase. Bunicul patern a lui Ion şi bunica maternă a Mariei au mai avut o soră mai mică afectată, care a murit datorită unei infecţii respiratorii grave. Ştiind că frecvenţa bolii în populaţia caucaziană este de 1/2500 de nou-născuţi, răspundeţi la următoarele întrebări: a. Care este tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familie ? Justificaţi opţiunea. A. Recesiv autosomal. B. Recesiv legat de cromosomul X C Dominant autosomal. B. Dominant legat de cromosomul X b. Care este riscul cuplului consultant de a avea un copil afectat ? A. 1/4 B. 1/8 C. 1/24 D. 1/50 E. 1/100 c. Care ar fi riscul lui Ion de a avea o fată bolnavă, dacă s-ar fi căsătorit cu o femeie neînrudită ? A. 1/4 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100


191

d. Care este riscul Elenei de a avea un copil afectat ? A. 1/4 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100 e. Care este riscul soţiei lui Emil de a avea un copil bolnav la sarcina în curs ? A. 1/150 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100 f. Care este riscul Rodicăi de a avea un copil bolnav ? A. 1/4 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/50 E. 1/100

9. Cuplul Vasile şi Ana se prezintă la consultaţie, deoarece sora Anei, Maria, are o formă de mucopolizaharidoză (sindrom Hurler) şi ei vor să ştie dacă au risc să aibă un copil cu această afecţiune. Sindromul Hurler este o afecţiune cu transmitere autosomal recesivă, cu o frecvenţă în populaţie de 1/90.000. a. Dacă Vasile şi Ana nu sunt consangvini, care este riscul pentru ca primul lor copil să aibă sindromul Hurler? A. 1/200 B. 1/400 C. 1/24 D. 1/900 E. 1/100

b.Dacă ei sunt veri de gradul întâi, care este riscul? A. 1/4 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100

10. Tirozinemia de tip autosomal recesiv are o incidenţă de 1/625 într-o populaţie din Moldova şi 1/10.000 în altă populaţie. Care este frecvenţa alelei mutante în cele 2 grupuri? A. 1/25 şi 1/50; B. 1/50 şi 1/5 C. 1/50 şi 1/100 D.1/2 şi 1/4 E. 1/8 şi 1/64

11. În Finlanda, frecvena purtătorilor genei anormale pentru epilepsia de tip mioclonic (boală cu transmitere recesiv autosomală) este de 1%. Două persoane neînrudite, care nu au cazuri de boală în familie doresc să afle riscul de a avea un copil afectat. Care este valoarea acestui risc? A. 1/400 B. 1/2.000 C. 1/24.000 D. 1/40.000 E. 1/100.000 12. Hemofilia prin deficit al factorului IX al coagulării afectează 1/190 evrei din Israel şi 1/1.000.000 de bărbaţi din alte grupe populaţionale (japonezi, chinezi, germani, italieni, afro-americani, englezi, indieni şi arabi). a. Care este frecvenţa genei mutante în populaţia din Israel? A. 1/400 B. 1/2.000 C. 1/24 D. 1/40 E. 1/190

b. Care este frecvenţa alelei normale în această populaţie? A. 399/400 B. 1.999/2.000 C. 23/24 D. 39/40 E. 189/190

c. Calculaţi proporţia de femei heterozigote în populaţia din Israel. A. 1/400 B. 1/1.000 C. 1/12 D. 1/40 E. 1/95

10. CONSULTUL GENETIC

I. DATE TEORETICE Consultul genetic este un act medical specializat şi complex, care vizează stabilirea

unui diagnostic de certitudine a bolii, precizarea implicării factorilor genetici în patogenia afecţiunii şi care, obligatoriu, trebuie finalizat prin acordarea sfatului genetic atât bolnavului, cât şi familiei acestuia.

Consultul genetic este realizat de un medic specialist în Genetică medicală şi, de obicei, este consecutiv unui consult clinic efectuat de un medic cu o altă specialitate.

A. PARTICULARITĂŢILE CARACTERELOR EREDITARE Caracterele ereditare – caractere care pot fi “moştenite” – pot fi normale sau

anormale (boli ereditare). În cazul caracterelor ereditare, există întotdeauna o componentă genetică, uneori extrem de importantă, alteori abia detectabilă. Identificarea prezenţei componentei ereditare este esenţială în cazul consultului genetic, dar deseori este dificilă. Prezenţa acestei componente poate fi sugerată de existenţa unora dintre următoarele particularităţi: distribuţia familială, transmiterea genealogică, manifestarea congenitală, identitatea caracterului la gemenii monozogoţi, asocierea cu un marker genetic, prezenţa de proteine anormale, prezenţa unor anomalii cromosomice sau frecvenţa diferită în populaţii diferite. Totuşi este important de reţinut că nici unul dintre criteriile prezentate mai jos, luat separat, nu are valoare absolută şi nu permite stabilirea naturii ereditare a unui caracter, acest lucru fiind posibil numai în condiţiile în care mai multe particularităţi sunt prezente concomitent.

1. DISTRIBUŢIA FAMILIALĂ

Distribuţia familială a unui caracter ereditar este reprezentată de frecvenţa mai mare a anomaliei la membrii unei familii comparativ cu populaţia generală. Acest criteriu nu este absolut şi nici suficient pentru a stabili natura ereditară a unei boli, deoarece: uneori o boală ereditară poate apare sporadic, fiind consecinţa unei mutaţii de novo; există boli neereditare care au concentrare familială crescută, cum ar fi: guşa endemică,

tuberculoza, intoxicaţiile etc.

Pentru aprecierea distribuţiei familiale a unui caracter se foloseşte testul concentrării familiale, care reprezintă raportul dintre incidenţa afecţiunii la rudele probanzilor, faţă de incidenţa afecţiunii/ caracterului în populaţia generală. O valoare mai mare de 2 indică o participare importantă a factorilor genetici.

2. TRANSMITEREA GENEALOGICĂ

Transmiterea genealogică se caracterizează prin moştenirea unui caracter de la părinţi şi transmiterea lui la descendenţi. Nu este un criteriu absolut, deoarece:

Consultul genetic

193

pot exista caractere ereditare care nu se transmit la descendenţi – de exemplu disgeneziile gonadice de tipul 45,X (sindrom Turner) şi 47,XXY (sindrom Klinefelter) deşi sunt afecţiuni genetice, datorită sterilităţii primare pe care o induc nu se pot transmit la descendenţi, o situaţie similară fiind întâlnită în bolile genetice care determină decesul persoanelor afectate în timpul copilăriei, înainte de a atinge vârsta reproductivă, când ar fi posibilă transmiterea mutaţiei la descendenţi;

unele caractere neereditare pot fi transmise transplacentar de la mamă la copii, mimând o transmitere genealogică – de exemplu, o femeie cu sifilis va naşte un copil cu sifilis congenital, datorită trecerii parazitului Treponema pallidum prin bariera placentară;

3. MANIFESTAREA CONGENITALĂ

Manifestarea congenitală, caracterizată prin prezenţa unei anumite afecţiuni încă de la naştere, nu este valabilă pentru toate bolile ereditare, deoarece unele boli de natură ereditară nu se manifestă la naştere – de exemplu hipodonţia sau anomaliile aparatului reproductiv. Pe de altă parte, nu orice caracter congenital este şi ereditar, deoarece există numeroase malformaţii congenitale datorite acţiunii factorilor de mediu asupra fătului – de exemplu focomelia42 indusă de tratamentul simptomatic cu talidomidă a greţurilor din timpul sarcinii.

4. IDENTITATEA CARACTERULUI LA GEMENII MONOZIGOŢI

Gemenii monozigoţi sunt genetic identici, deoarece provin din aceeaşi celulă, în timp ce gemenii dizigoţi diferă genetic, fiind doi fraţi obişnuiţi care însă s-au dezvoltat în acelaşi timp. Datorită acestor particularităţi, în cazul prezenţei unei afecţiuni provocate exclusiv de modificări genetice, concordanţa afectării este de 100% la gemenii monozigoţi. Dacă afecţiunea sau caracterul normal este multifactorial, concordanţa la gemenii monozigoţi scade, dar valoarea acesteia este mai mare decât cea observată la gemenii dizigoţi. Prin compararea concordanţelor la gemenii monozigoţi şi dizigoţi se poate identifica valoarea participării componentei genetice (vezi capitolul Ereditatea multifactorială).

5. ASOCIEREA CU UN MARKER GENETIC

În unele cazuri, prin studii statistice, a fost identificată asocierea unei boli genetice cu un caracter fenotipic normal, considerat marker genetic, asociere care este mai frecventă decât cea presupusă pe baza analizei frecvenţei separate a celor două caractere. Asocierea poate fi explicată astfel: genele pentru cele două caractere sunt înlănţuite, ocupând loci învecinaţi; una dintre gene favorizează apariţia unei tulburări independente – astfel poate fi frecvenţa

crescută a ulcerului duodenal la persoanele cu grup sanguin 0; o genă are efecte multiple (pleiotrope).

6. APARIŢIA SPONTANĂ

În multe boli genetice există în diverse familii cazuri izolate, a căror apariţie poate fi explicată de prezenţa unor mutaţii noi. Această particularitate trebuie obligatoriu analizată asociat cu alte particularităţi.

7. PREZENŢA ANOMALIILOR CROMOSOMICE 42 Focomelie – anomalie congenitală caracterizată prin ataşarea mâinilor şi plantelor direct la centura scapulară, respectiv pelvină, celălalte segmente ale membrelor fiind absente

Consultul genetic

194

Orice anomalie cromosomică este şi genetică, deoarece implică afectarea unor segmente mai mari sau mai mici de material genetic. Totuşi, analiza cromosomică nu este obligatorie în toate afecţiunile presupuse genetice, deoarece metoda este incapabilă să detecteze mutaţii genice. De aceea, un cariotip normal nu exclude prezenţa unui caracter anormal la subiectul cercetat.

8. FRECVENŢA DIFERITĂ ÎN POPULAŢII DIFERITE

Frecvenţa diferită a genelor în diverse populaţii este rezultatul unei selecţii naturale, al cărei efect a fost concentrarea anumitor gene într-o anumită regiune geografică. De exemplu, unele mutaţii genice, precum cele care determină deficienţa în glucozo-6-fosfat-dehidrogenază sau unele hemoglobinopatii sunt mai frecvente în zonele în care malaria este o maladie endemică, deoarece heterozigoţii pentru aceste afecţiuni sunt imuni la acţiunea parazitului (Plasmodium falciparum) care determină paludismul. În condiţiile în care mult timp malaria a fost o boală incurabilă, heterozigoţii pentru bolile citate mai sus aveau o speranţă de viaţă mai mare decât cea a indivizilor normali, iar prin căsătoria lor cu indivizi de asemenea heterozigoţi a fost favorizată perpetuarea şi creşterea frecvenţei mutaţiei în populaţia respectivă. O altfel de situaţie există în cazul izolatelor umane din punct de vedere geografic, etnic sau religios, în care prin căsătoriile consanguine s-a realizat un fond comun de gene mutante.

B. OBIECTIVELE CONSULTULUI GENETIC Consultul genetic vizează trei obiective principale: stabilirea diagnosticului bolii,

stabilirea implicării factorilor genetici în patogenia bolii şi acordarea sfatului genetic. Este obligatoriu ca diagnosticul bolii să fie corect şi complet. Pentru realizarea unui

diagnostic corect trebuie stabilită o asociere corectă a semnelor şi simptomelor, punând accent pe semnele esenţiale ale afecţiunii. În caz contrar se poate ajunge la ipoteze eronate de diagnostic. Diagnosticul complet implică verificarea tuturor aparatelor şi sistemelor, astfel încât să nu fie ignorate o serie de localizări mai puţin obişnuite. Pentru realizarea acestor deziderate sunt necesare colaborări interdisciplinare cu alţi clinicieni sau specialişti în explorări, geneticianul fiind cel care stabileşte diagnosticul final.

Stabilirea naturii sau a componentei genetice a bolii este o activitate specifică medicului genetician, care trebuie să diferenţieze bolile genetice de cele condiţionat genetice sau negenetice. Aceasta se realizează prin două categorii de acţiuni: anamneza familială şi explorările genetice. Anamneza familială este o activitate ce poate fi realizată de orice medic specialist, dar

trebuie realizată impecabil; orice evaluare superficială a unor membri ai familiei poate duce la concluzii greşite cu stabilirea unui diagnostic etiologic incorect; o anamneză familială bună presupune nu numai contorizarea datelor furnizate de consultant, ci şi examinarea documentelor medicale ale altor persoane afectate din familie şi a fotografiilor de familie, care pot pune în evidenţă unele trăsături familiale sau existenţa unor dismorfii sugestive pentru diagnostic;

Explorările genetice asigură studierea materialului genetic – cromosomi, prin efectuarea cariotipului sau gene, prin diverse teste moleculare - precum şi a efectelor genei mutante la nivel de proteină, ţesut sau organ.

Sfatul genetic este un act medical specific prin care bolnavul sau rudele cu risc primesc informaţii de la medicul genetician referitoare la natura şi consecinţele bolii, riscul de recurenţă şi căile prin care riscul poate fi redus sau prevenit (vezi capitolul 12 Sfatul genetic).

Consultul genetic

195

Consultul genetic este un act medical specializat şi complex prin care se evaluează diagnosticul bolii (diagnostic corect şi complet prin colaborări interdisciplinare) se precizează implicarea componentei genetice (prin anamneza familială şi teste genetice) şi se acordă sfat genetic bolnavului sau familiei sale.

1. CADRU ORGANIZATORIC

Consultul genetic este realizat de către un medic genetician care trebuie să aibă pe lângă cunoştinţe medicale vaste, necesare înţelegerii diagnosticului iniţial al altor specialişti şi o pregătire specifică în domeniul Geneticii medicale care să-i permită recunoaşterea numeroaselor sindroame din domeniu, a criteriilor de diferenţiere între entităţi asemănătoare, indicarea investigaţiilor specifice obligatorii pentru stabilirea unui diagnostic corect şi complet, aprecierea riscului de recurenţă şi a posibilităţilor de tratament (acolo unde este posibil). În plus, medicul genetician trebuie să posede calităţi psihologice pentru a putea depăşi situaţiile dificile din domeniu, cu care deseori se confruntă.

Consultul genetic se realizează în centre de Genetică medicală (în spitale universitare) sau în cabinete de Genetică medicală (pentru spitalele judeţene). Centrele de genetică medicală trebuie să îndeplinească anumite condiţii: să fie localizate într-un spital mare unde să fie posibilă explorarea completă clinică şi

paraclinică; spitalul trebuie să conţină o unitate de ambulator de specialitate şi să permită colaborări interclinice de calitate;

să permită accesul liber al pacienţilor; să fie dotat cu capacităţi proprii de explorare (investigaţii la nivel cromosomic, biochimic şi

molecular).

Consultul genetic este realizat de medicul genetician care trebuie să aibă bună pregătire medicală de bază, la care se adaugă o pregătire temeinică de genetică medicală, asociată cu certe calităţi psihologice;

Consultului genetic are loc în centre sau cabinete de genetică medicală care permit explorarea completă clinică şi paraclinică, accesul liber al pacienţilor şi sunt dotate cu capacităţi proprii de explorare.

2. INDICAŢIILE CONSULTULUI GENETIC

În mod obişnuit, consultul genetic debutează cu prezentarea la medicul genetician a unui pacient sau a unui cuplu.

În cazul pacienţilor unici care se adresează geneticianului pot exista două situaţii: Pacientul este sănătos, circumstanţă întâlnită de obicei premarital, în condiţiile în care există

o anamneză familială pozitivă, cei doi membri ai viitorului cuplu fac parte din aceeaşi familie (căsătorie consanguină) sau consultantul solicită un diagnostic presimptomatic;

Pacientul este bolnav, prezentând o anomalie congenitală, o boală monogenică, retard mintal, tulburări de sexualizare sau reproducere, o formă de cancer ereditar.

Adresarea cuplurilor către un centru de genetică medicală se produce în următoarele situaţii: preconcepţional când există: anamneză familială pozitivă sau consanguinitate, vârstă

parentală înaintată (maternă mai mare de 35 ani, paternă mai mare de 45 de ani) expunere la agenţi mutageni;

Consultul genetic

196

prenatal în condiţia expunerii mamei la agenţi teratogeni sau depistarea unor semne ecografice de alarmă;

postnatal în situaţia în care cuplul consultant are un copil afectat. Indicaţiile practice ale consultului genetic sunt următoarele:

Anamneză familială pozitivă, mai ales dacă cuplul consultant este consanguin: în cazul existenţei unor persoane afectate în familie, riscul de recurenţă al bolii este mai

mare comparativ cu cel al cuplurilor cu anamneză familială negativă; în cazul căsătoriilor consanguine riscul cuplului de a avea un descendent afectat este

crescut, deoarece probabilitatea celor doi părinţi de a fi heterozigoţi pentru o mutaţie recesiv autosomală este mai mare decât cea din populaţia generală.

Vârstă maternă avansată (peste 35 ani) creşte riscul cuplului de a avea un copil cu trisomie, în special cu trisomie 21 (sindrom Down) datorită existenţei unei corelaţii certe între creşterea frecvenţei nedisjuncţiilor meiotice şi creşterea vârstei materne;

Tulburări de sexualizare sau reproducere – de multe ori aceste manifestări patologice sunt consecinţa unor anomalii cromosomice echilibrate prezente la unul dintre părinţi, care deşi este normal fenotipic, poate avea copii cu anomalii cromosomice neechilibrate, care se pot manifesta clinic prin: Sterilitate – un cuplu este considerat steril, în condiţiile în care femeia nu a avut nici o

sarcină după 2 ani de viaţă sexuală normală, ritmică, în absenţa folosirii unor mijloace contraceptive;

Avorturi spontane, precoce (până la sfârşitul lunii a doua de sarcină) şi repetate; Nou născuţi morţi plurimalformaţi (vezi capitolul 5 Anomaliile şi bolile cromosomice);

Anomalii congenitale multiple: Prezenţa unei anomalii congenitale unice nu implică un risc de transmitere la

descendenţi, deoarece în majoritatea cazurilor acestea sunt produse de factori de mediu;

Anomaliile congenitale multiple (asocierea a mai mult de trei anomalii) sunt frecvent produse de defecte genice sau cromosomice, iar riscul de recurenţă este semnificativ.

Retard mintal cu sau fără tulburări de comportament: Retardul mintal uşor este datorit unor factori nefavorabili de mediu, aspect dovedit de

dispariţia progresivă a deficitului la scoaterea individului din mediul social sau familial, iar riscul de recurenţă este cvasinul.

Majoritatea cazurilor de retard mintal moderat sau sever sunt produse de anomalii genetice (monogenice sau cromosomice) ceea ce implică un risc crescut la descendenţi.

Boală monogenică - indivizii afectaţi de o astfel de boală au un risc semnificativ de a avea descendenţi bolnavi, riscul depinzând de tipul bolii (recesivă sau dominantă) şi de sexul persoanei afectate (vezi capitolul 12 Sfatul genetic)

Boală multifactorială - riscul este crescut în cazul în care există rude de gradul întâi afectate; Diagnostic prenatal - depistarea unor semne ecografice de alarmă la examenul ecografic sau

valori anormale ale triplu testului reprezintă o indicaţie majoră de consult genetic (vezi capitolul 14 Screenigul şi diagnosticul prenatal).

Pentru consult genetic se poate adresa o persoană (sănătoasă sau bolnavă) sau un cuplu (preconcepţional, prenatal sau postnatal);

Indicaţiile consultului genetic sunt: anamneză familială pozitivă sau consangvinitate, vârstă maternă avansată, tulburări de sexualizare sau reproducere, anomalii congenitale multiple, retard mintal, boală genetică sau diagnostic prenatal.

Consultul genetic

197

3. ETAPELE CONSULTULUI GENETIC

Consultul genetic se desfăşoară în mai multe etape, secvenţa lor fiind următoarea: 1. Înregistrarea datelor personale şi a motivelor de consult - în cadrul acestei etape sunt

analizate şi documentele medicale existente; 2. Anamneza familială, materno- fetală, neonatală şi postnatală; 3. Examenul fizic – corelarea datelor anamnestice cu rezultatele examenului fizic permit

stabilirea unor ipoteze de diagnostic; 4. Examenele paraclinice, inclusiv cele genetice; 5. Analiza şi sinteza datelor clinice şi paraclinice permit stabilirea diagnosticului pozitiv şi

a celui diferenţial; 6. Evaluarea prognosticului, a posibilităţilor de recuperare şi a riscului genetic; 7. Comunicarea verbală şi scrisă a rezultatelor - comunicarea acestor date trebuie făcută

individualizat, verificând dacă persoanele care s-au adresat geneticianului au înţeles interpretarea datelor medicale şi valoarea riscului de recurenţă; comunicarea rezultatului consultului genetic se face în scris atât pacientului (pentru a sublinia încă o dată datele importante), cât şi medicului de familie sau medicului specialist care a trimis pacientul sau cuplul la consultaţie.

Deosebit de importantă este urmărirea evoluţiei bolii la pacienţii diagnosticaţi atât datorită expresivităţii variabile a multor boli genetice, cât şi datorită apariţiei de noi posibilităţi de explorare, diagnostic şi tratament.

a. ÎNREGISTRAREA DATELOR MEDICALE ALE PACIENTULUI

Înregistrarea datelor personale se face sistematizat, pentru a nu scăpa din vedere detalii ce vor fi ulterior necesare pentru comunicarea cu pacientul şi familia sa. Cu această ocazie se înregistrează şi documentele medicale furnizate de specialistul ce trimite pacientul pentru consultaţie.

b. ANAMNEZA FAMILIALĂ

Anamneza familială se face în mod diferit dacă pacientul este copil sau dacă este adult. În cazul unui copil mic se pune accent pe anamneza materno-fetală, neonatală şi postnatală, în timp ce la adulţi accentul se pune pe dezvoltarea pubertară, anamneza reproductivă şi istoricul propriu-zis al bolii.

Realizarea unei anamneze corectă implică: o bună experienţă clinică, cunoştinţe despre evoluţia normală fetală şi postnatală, abilitate de comunicare, acordarea unui timp suficient pentru a putea culege toate datele esenţiale din istoricul afecţiunii.

Anamneza familială furnizează informaţii utile în următoarele domenii: diagnostic (mai ales în bolile cu expresivitate variabilă) – deseori este întâlnită situaţia când

persoane din aceeaşi familie prezintă semne diferite ce sunt interpretate eronat ca entităţi separate, dar care la un examen genetic atent se dovedesc a fi manifestări diferite ale aceleiaşi boli (caracter pleiotrop);

originea genetică a bolii – anamneza familială identifică uneori persoana la care a apărut mutaţia şi în raport cu aceasta se poate stabili riscul de recurenţă al maladiei;

modul de transmitere – analiza arborelui genealogic este particulară în bolile monogenice, fiind utilă pentru stabilirea unui diagnostic corect (de exemplu transmitere tată- fiu în bolile autosomal dominante sau mamă- fiică în bolile autosomal recesive); în bolile comune ale adultului (afecţiuni multifactoriale) deseori este prezentă o agregare familială, fiind posibilă calcularea empirică a riscului de recurenţă.

Consultul genetic

198

Anamneza familială se realizează pe baza informaţiilor furnizate de pacient sau de alţi membri ai familiei, punându-se accent asupra rudelor până la III. Deosebit de utile sunt documentele medicale care atestă informaţiile furnizate de pacient şi examenul direct al membrilor familiei (mai ales al rudelor de gradul I). De asemenea, este utilă examinarea fotografiilor de familie care pot să sugereze existenţa unor trăsături familiale sau existenţa în familie şi a altor persoane afectate (nediagnosticate până în prezent).

În cadrul anamnezei familiale trebuie înregistrate următoarele date: vârsta maternă, paternă şi a bunicilor în momentul concepţiei – vârsta maternă înanintată

este asociată cu un risc crescut de aneuploidii, în timp ce vârsta paternă avansată este asociată cu un risc crescut de mutaţii gametice cu transmitere dominant autosomală;

originea etnică şi religioasă – unele boli sunt mai frecvente în anumite comunităţi; prezenţa în familie a altor boli sau simptome asemănătoare sau nu cazului index - aceste

boli (boli cronice, retard mintal, cancer) pot fi entităţi diferite, dar pot reprezenta alte forme de manifestarea ale aceleiaşi afecţiuni (boli cu expresivitate variabilă);

decese în familie – se cer date referitoare la: cauze, vârstă, rezultate necroptice; tulburări de reproducere – sterilitate, avorturi spontane repetate, nou născuţi morţi; caractere morfologice familiale – este utilă examinarea fotografiilor de familie.

Pe baza datelor anamnezei familiale va fi realizat arborele genealogic. Arborele genealogic reprezintă o prezentare schematică a persoanelor dintr-o familie şi a relaţiilor de rudenie dintre acestea, folosind o serie de simboluri convenţionale, valabile pe plan mondial şi care au fost standardizate la Conferinţele internaţionale de genetică. Simbolurile folosite pentru întocmirea arborelui genealogic sunt prezentate în figura 10.1.

În raport cu rezultatele obţinute, anamneza familială poate fi: pozitivă - când există şi alte cazuri de boală în familie; negativă, dar semnificativă (de exemplu consanguinitate parentală); fals negativă - din diferite motive (date insuficiente, nonpaternitate, mutaţii noi, expresivitate

variabilă); real negativă.

Anamneza materno-fetală furnizează informaţii referitoare la toate stadiile evolutive ale produsului de concepţie, atât prenatal, cât şi postnatal.

Concepţia

Datele anamnestice referitoare la concepţie care trebuie analizate sunt: Antecedentele reproductive ale cuplului - tratamente pentru sterilitate, metode

anticoncepţionale, alte sarcini şi evoluţia lor (avorturi spontane, nou născuţi morţi, copii afectaţi);

Vârsta părinţilor la momentul concepţiei, fiind cunoscut că vârsta maternă avansată (peste 35-38 ani) predispune la anomalii cromosomice numerice, iar vârsta paternă avansată (peste 50-55 ani) la mutaţii genice;

Bolile cronice ale mamei şi în special: diabetul zaharat (hiperglicemia este teratogenă, fiind necesară o monitorizare continuă a diabetului în timpul sarcinii) epilepsia (multe dintre medicamentele anticonvulsivante sunt teratogene, fiind recomandată evitarea folosirii lor sau utilizarea de preparate mai puţin nocive în primele 3 luni de sarcină);

Persoană sănătoasă de sex masculin Persoană afectată de sex masculin

Persoană sănătoasă de sex feminin Persoană bolnavă de sex feminin

Individ sănătos cu sex necunoscut Individ afectat cu sex necunoscut

4 3

S S S

Consultul genetic

199

Indivizi sănătoşi care fac prate din aceeaşi fratrie43

Sarcină cu făt de sex masculin, feminin, respectiv necunoscut

Avort spontan cu făt neafectat, respectiv afectat

Întrerupere de sarcină cu făt neafectat, respectiv afectat

Copil adoptat Heterozigot cert

Proband Consultant P P

Gemeni monozigoţi Gemeni dizigoţi

Gemeni cu zigoţie necunoscută

Individ decedat datorită unei cauze negenetice

Individ decedat datorită unei cauze genetice

Căsătorie Căsătorie consanguină

Legătură nelegitimă Căsătorie întreruptă Linia fratriei Cuplu steril

Figura 10.1. Simboluri internaţionale folosite pentru întocmirea arborelui genealogic

Obiceiurile nocive ale mamei, precum consumul de alcool sau droguri, respectiv fumatul afectează dezvoltarea fătului;

Grupele sanguine ABO şi Rh pentru depistarea precoce a unei incompatibilităţi materno- fetale.

Evoluţia sarcinii

Principalele elemente anamnestice referitoare la evoluţia sarcinii sunt: Faptul dacă sarcina a fost planificată sau nu; în cazul sarcinilor nedorite, prin aplicarea unor

metode abortive inadecvate este posibilă apariţia unor anomalii congenitale la copil; Data ultimului ciclu menstrual pentru aprecierea corectă a vârstei gestaţionale şi a

dezvoltării somatometrice a fătului; Expunerile la teratogene în trimestrul I – expunerile cele mai frecvente sunt:

43 Fratrie – toţi copiii unui cuplu parental

Consultul genetic

200

alcoolul - expunerea zilnică la doze mari produce sindromul alcool fetal, caracterizat prin retard mintal, cu hiperactivitate şi întârzierea apariţiei limbajului, microcefalie, microftalmie şi anomalii cardiace;

hipertermia – menţinerea unei stări febrile, cu temperaturi peste 39ºC, timp de mai mult de 2-3 zile poate produce diverse anomalii congenitale;

Primele mişcări fetale, în mod normal, sunt percepute de la vârsta de 4-5 luni, cresc în intensitate până în luna 7-8, apoi scad în intensitate; mişcările fetale diminuate apar în boli cerebrale, boli neuro- musculare sau diminuarea spaţiului intrauterin (pot produce artrogripoză şi deformaţii); în cazul primei sarcini mişcările fetale sunt percepute mai tardiv;

Cantitatea de lichid amniotic – oligohidramniosul (deficitul de lichid amniotic) poate semnifica existenţa unei malformaţii renale) iar polihidramniosul (excesul de lichid amniotic) poate semnifica existenţa unei atrezii esofagiene;

Ecografia fetală: apreciază dimensiunile şi morfologia fătului, aspectul placentei (poziţie, dimensiuni, morfologie) şi al cordonului ombilical, cantitatea de lichid amniotic;

Alte metode de diagnostic prenatal (dacă au fost aplicate) şi rezultatele acestora.

Naşterea

Pentru realizarea unui diagnostic corect trebuie culese următoarele date anamnestice referitoare la naştere: Vârsta gestaţională:

este stabilită în raport cu data ultimei menstruaţii şi prin examen ecografic, prin măsurarea diametrului biparietal şi a lungimii femurului fetal;

exactitatea datelor este deosebit de importantă pentru aprecierea corectă a dezvoltării antropometrice a fătului - de exemplu, când nou-născutul are greutate mică, este important să stabilim dacă acesta este prematur sau dismatur;

Durata travaliului - un travaliu mai lung de 6 ore poate provoca suferinţă fetală, cu apariţia ulterioară de fenomene neurologice şi retard mintal;

Prezentaţia - o prezentaţie distocică (pelvină, transversală) poate produce deformaţii sau suferinţă fetală, în condiţiile în care naşterea se produce pe cale naturală;

Anomaliile cordonului ombilical sau ale placentei pot cauza un retard de creştere intrauterină printr-o suferinţă fetală cronică;

Scorul APGAR – valori scăzute ale acestui indice sau necesitatea reanimării la naştere sunt date anamnestice deosebit de importante, care atrag atenţia asupra unei suferinţe fetale, care pot determina ulterior semne neurologice şi retard mintal;

Datele morfometrice (talia, greutatea, perimetrul cranian, perimetrul toracic) sunt esenţiale atât pentru evaluarea copilului la naştere, cât şi pentru urmărirea în dinamică a dezvoltării lui (de exemplu un perimetru cranian care creşte rapid atrage atenţia asupra unei hidrocefalii).

Anamneza neonatală furnizează date despre parametrii copilului în prima lună de viaţă, perioadă deosebit de importantă pentru dezvoltarea ulterioară. Parametrii care se iau în discuţie sunt: Respiraţia (frecvenţa respiratorie, amplitudinea şi regularitatea respiraţiilor, existenţa

semnelor de dispnee) activitatea cardiacă (frecvenţa şi ritmicitatea zgomotelor cardiace, apariţia cianozei la efort de plâns sau supt) tonusul muscular, aspectul tegumentelor (roz, cianotice sau palide) şi reactivitatea la stimuli (pe baza acestor date se stabileşte scorul APGAR);

Consultul genetic

201

Permeabilitatea esofagului şi anusului – poate fi identificată de la naştere prin evidenţierea eliminării de meconiu;

Adaptarea respiratorie şi alimentară; Particularităţile icterului neonatal (se înregistrează momentul apariţiei, intensitatea, durata

lui şi eventualul tratament); Existenţa convulsiilor poate sugera o cauză metabolică, precum hipoglicemia sau

hipocalcemia; Vărsăturile şi regurgitările pot atrage atenţia asupra unei despicături velo- palatine sau a

unei stenoze hipertrofice de pilor. Anamneza postnatală furnizează date despre dezvoltarea individului în special în

primii ani de viaţă. Principalele date anamnestice care trebuie analizate sunt: Dezvoltarea psihomotorie, cu evidenţierea datelor principalelor achiziţii

un copil normal ţine capul la 3 luni, stă în şezut singur la 6 luni, merge şi vorbeşte la un an; regresia cu pierderea achiziţiilor sugerează existenţa unei boli de metabolism;

Creşterea staturală, ponderală şi a perimetrului cranian este apreciată comparativ cu curbele de creştere corespunzătoare populaţiei respective; în paralel se apreciază viteza de creştere, dezvoltarea staturo- ponderală fiind dependentă şi de dimensiunile antropometrice ale părinţilor;

Erupţia dentară – în mod normal incisivii centrali inferiori erup la 6 luni, cei laterali superiori la 8 luni, cei mediani la 9 luni etc;

Dezvoltarea pubertară – trebuie analizată diferenţiat în funcţie de sexul pacientului: la o persoană de sex feminin trebuie evidenţiată vârsta menarhei, cea a debutului

dezvoltării glandelor mamare, ritmicitatea ciclurilor menstruale, momentul apariţiei pilozităţii sexuale;

la o persoană de sex masculin trebuie notate vârsta apariţiei pilozităţii sexuale, a schimbării tonalităţii vocei, a momentului primei poluţii etc.

c. EXAMENUL CLINIC

Pentru desfăşurarea în condiţii bune a examenului fizic este necesară îndeplinirea unor criterii: Condiţiile să fie optime – pacientul trebuie să fie relaxat şi cooperant, lumina şi temperatura

trebuie să fie în parametri optimi, în cazul în care pacientul este copil trebuie să fie prezentă mama sau altă persoană în care copilul are încredere;

Tehnică impecabilă, care să includă: evaluare generală: talie, perimetru cranian, dimensiunile unor segmente şi proporţia

dintre segmente, evoluţia achiziţiilor motorii şi psihice, evoluţia pubertăţii; evaluare metodică: a tuturor aparatelor şi sistemelor asociată cu un examen locoregional

amănunţit al regiunilor de interes; examinare completă: examenul trebuie să cuprindă şi organele de simţ şi sistemul nervos

(tonus, reflexe, examinarea nervilor cranieni); examen minuţios pentru evidenţierea unor semne minore evocatoare pentru unele boli

sau sindroame (îngustează aria diagnosticului diferenţial); Reevaluarea pacientului (+/- spitalizare) este necesară în condiţiile unui examen iniţial

incomplet; a incertitudinii diagnosticului iniţial, a introducerii unei metodologii speciale de diagnostic sau pentru aprecierea evoluţiei pacientului.

Obiectivarea datelor se realizează prin: măsurători generale (pe segmente şi regiuni) fotografierea pacientului (permite definirea mai corectă a anomaliilor, comparaţii cu alte cazuri şi realizarea unei bănci de date);

Consultul genetic

202

Înregistrarea datelor impune descrierea precisă, cu o terminologie adecvată (conform unei semiologii malformative) şi descrierea completă (inclusiv înregistrarea datelor normale sau absenţa unor semne patologice).

O situaţie particulară o reprezintă examenul fizic al nou născutului mort. În acest caz sunt foarte importante următoarele etape: stabilirea vârstei gestaţionale; măsurarea taliei, greutăţii, perimetrului cranian; examinarea fătului, a cordonului ombilical (posibilitatea existenţei unei artere ombilicale

unice) şi a placentei (mare, mică, prezenţa altor modificări); fotografierea generală şi pe segmente; efectuarea unei radiografii de schelet; necropsia sistematică şi atentă efectuată de către un fetopatolog; puncţia cardiacă (permite prelevarea unei cantităţi de sânge) sau biopsia cutanată în vederea

obţinerii de celelule ce pot fi cultivate in vitro, care ar permite efectuarea unui cariotip (incidenţa anomaliilor cromosomice la nou-născuţii morţi este de circa 1/30).

Examenul fizic şi anamneza trebuie să permită stabilirea unor supoziţii de diagnostic pozitiv şi diferenţial, care să fie validate ulterior de rezultatele investigaţiilor paraclinice.

d. INVESTIGAŢII PARACLINICE

Pentru explorarea completă a pacientului sunt necesare următoarele acţiuni: Consultarea altor specialişti (cardiolog, neuropsihiatru, endocrinolog, oftalmolog, psiholog

etc) care vor aprecia cu exactitate anomaliile din domeniul lor de activitate, ceea ce va contribui la stabilirea unui diagnostic corect.

Realizarea de explorări imagistice: radiografii pentru vârstă osoasă sau modificări ale oaselor lungi; ecografie pentru aspectul viscerelor; tomografie computerizată, RMN pentru aprecierea malformaţiilor cerebrale etc.

Examenele biochimice sau hormonale vor completa diagnosticul afecţiunilor metabolice sau endocrine;

Testele serologice sunt utile în diagnosticul unor embriopatii; Testele genetice citogenetice (analiză cromosomică pre- sau postnatală pe cromosomi

marcaţi sau prin tehnica FISH) şi moleculare (identificarea mutaţiei sau a proteinei anormale) confirmă etiologia genetică a bolii diagnosticate clinic şi paraclinic.

e. ANALIZA ŞI SINTEZA DATELOR

Diagnosticul bolilor genetice şi al sindroamelor plurimalformative este de obicei dificil, principalele probleme de diagnostic fiind generate de vârsta mică a pacienţilor şi existenţa de boli cu expresivitate variabilă. Stabilirea unui diagnostic corect şi complet este esenţială în bolile genetice, deoarece acesta rămâne valabil întreaga viaţă. După stabilirea diagnosticului este obligatorie întocmirea unui program de urmărire a pacientului pentru depistarea precoce a complicaţiilor, adaptarea tratamentului şi acordarea sfatului genetic. În majoritatea cazurilor diagnosticul nu este o urgenţă, dar părinţii sunt nerăbdători şi de aceea este utilă stabilirea unui diagnostic preliminar, cu menţionarea anomaliilor identificate.

Pentru elaborarea diagnosticului pozitiv al unei afecţiuni genetice se efectuează următoarele operaţiuni: se rememorează şi se ordonează datele provenite din diferite surse; se stabilesc elementele prezente şi absente (certe şi probabile) sunt identificate aparatele şi sistemele afectate şi se încearcă stabilirea de chei, algoritmi şi scoruri de diagnostic, iar în final se face o documentare amplă, pe baza datelor existente în diverse tratate de genetică medicală, a celor stocate în programele de diagnostic computerizat (POSSUM, Oxford Medical Databases) sau a celor furnizate de diferite site-uri de Internet.

Consultul genetic

203

În condiţiile în care stabilirea unui diagnostic specific este imposibilă, este obligatorie urmărirea în timp a pacientului pentru a evidenţia apariţia de noi semne relevante pentru o anumită afecţiune.

O atenţie deosebită trebuie acordată erorilor de diagnostic, determinate de o tehnică deficitară sau de cunoaşterea incompletă a datelor din domeniu.

Principalele etape ale consultului genetic sunt: înregistrarea datelor personale şi a motivelor de consult; anamneza familială, materno- fetală, natală, postnatală, examenul fizic; examenele paraclinice; analiza şi sinteza datelor; evaluarea prognosticului, a posibilităţilor de recuperare şi a riscului de recurenţă; comunicarea verbală şi scrisă a rezultatelor.

Anamneza familială furnizează informaţii legate de diagnostic, originea genetică a bolii şi modul de transmitere şi asigură înregistrarea: vârstei parentale, originii etnice şi religioase, existenţei altor cazuri de boală, deceselor şi tulburărilor reproductive prezente în familie; aceasta poate fi pozitivă; negativă semnificativă; fals negativă sau real negativă.

Anamneza materno- fetală trebuie să înregistreze date legate de concepţie, evoluţia sarcinii şi naştere;

Anamneza neonatală apreciază starea copilului imediat după naştere şi înregistrează următoarele elemente: scorul APGAR; permeabilitatea esofagului şi anusului; adaptarea respiratorie şi alimentară; existenţa icterului, convulsiilor, a vărsăturilor sau regurgitărilor.

Anamneza postnatală apreciază dezvoltarea copilului după naştere şi înregistrează: dezvoltarea psihomotorie, creşterea staturo- ponderală, erupţia dentară şi dezvoltarea pubertară.

Examenul clinic al pacientului necesită: condiţii optime, tehnică impecabilă reevaluarea pacientului, obiectivarea şi înregistrarea datelor;

Paleta explorărilor paraclinice conţine: examene clinice de specialitate, explorări imagistice, teste biochimice, hormonale, serologice şi nu în ultimul rând, teste genetice (citogenetice şi moleculare).


A. ANAMNEZA FAMILIALĂ 1 Cuplul Popescu Ion (sănătos, în vârstă de 42 ani) şi Maria (sănătoasă, 37 ani), se prezintă la

consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat sănătos (Gheorghe, 18 ani) o fată bolnavă (Ioana, 16 ani) un băiat bolnav (Vasile, 12 ani), un avort spontan cu făt sănătos, iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin tegumente, fanere şi iris decolorate, fiind catalogată de medicul genetician ca fiind albinism.

Ion şi Maria sunt veri de gradul I, mama lui Ion şi tatăl Mariei fiind fraţi. Ion face parte dintr-o fratrie de 3 persoane. Prima din fratrie este Elena (sănătoasă, 45 ani), care

este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 48 ani). Cei doi au un băiat sănătos (Constantin, 22 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 18 ani). Al doilea în fratria consultantului este Daniel (sănătos, 44 ani) care iniţial a fost căsătorit cu o femeie sănătoasă (Vasilica) – cuplu steril. Daniel a divorţat şi are o relaţie nelegitimă cu o femeie sănătoasă (Violeta, 38 ani), din care a rezultat un băiat sănătos (Ciprian, 14 ani), după care cei doi au înfiat o fată sănătoasă (Matilda, 12 ani).

Părinţii consultantului, Elisabeta (69 ani) şi Toma (74 ani) sunt amândoi sănătoşi.

Consultul genetic

204

Maria face parte dintr-o fratrie de trei persoane, fiind cea mai mare. În fratrie, după Maria urmează o soră afectată (Svetlana, 33 ani) şi un frate bolnav (Marius, 31 ani). Svetlana este măritată cu un bărbat sănătos, iar anamneza reproductivă a cuplului indică: doi gemeni monozigoţi sănătoşi (Cornel şi Costel, 11 ani), o întrerupere de sarcină cu făt sănătos, o fată sănătoasă (Domnica, 9 ani) şi un băiat sănătos (Dorel, 5 ani). Marius este însurat cu o femeie afectată (Florica, 30 ani) cei doi având două gemene dizigote afectate (Corina şi Dorina, 9 ani), o întrerupere de sarcină cu făt afectat, un avort spontan cu făt afectat, iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex feminin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni).

Părinţii Mariei, Costache (66 ani) şi Ecaterina (62 ani) sunt amândoi sănătoşi. Bunicii comuni ai consultanţilor, Toader (92 ani) şi Maria (88 ani) sunt, de asemenea, sănătoşi.

1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.2.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). I 1 2 II 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 IV S S

Figura 10.2. Arborele genealogic stabilit pe baza anamnezei familiale 1

Boala prezentă în familia consultanţilor este recesivă deoarece: frecvenţa bolii în familie este redusă, transmiterea afecţiunii în familie este discontinuă, există consanguinitate, doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi (cuplul III.6. – III.7.), iar doi părinţi bolnavi au toţi copii afectaţi (cuplul III.10. – III.11.). Afecţiunea este recesiv autosomală deoarece: doi părinţi sănătoşi (cuplul III.6. – III.7.) au o fată afectată (IV.6.) iar un cuplu în care tatăl este sănătos şi mama afectată (cuplul III.8. – III.9.) are băieţi sănătoşi (IV.10., IV.11., IV.14.).

B. ANAMNEZA FAMILIALĂ 2 Cuplul Ionescu Ion (afectat, în vârstă de 46 ani) şi Maria (afectată, 40 ani), se prezintă la

consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat bolnav (Gheorghe, 20 ani) o fată bolnavă (Ioana, 17 ani) un băiat sănătos (Vasile, 12 ani), iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin deformaţii osoase grave la nivelul craniului, toracelui şi membrelor, deficit de creştere, hipofosfatemie şi absenţa răspunsului terapeutic la administrarea de vitamină D. Diagnosticul stabilit de medicul genetician a fost de rahitism rezistent la administrarea de vitamină D.

Ion este cel mai mic dintr-o fratrie de 2 persoane. Prima din fratrie este Elena (afectată, 50 ani), care este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 52 ani). Cei doi au un băiat sănătos (Constantin, 28 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 26 ani).

Părinţii consultantului: Elisabeta a fost afectată şi a decedat la vârsta de 69 ani şi Toma, sănătos (77 ani).

Maria face parte dintr-o fratrie de trei persoane, fiind cea mai mare. În fratrie, după Maria urmează o soră afectată (Svetlana, 36 ani) şi un frate sănătos (Marius, 31 ani). Svetlana este măritată cu un bărbat sănătos, iar anamneza reproductivă a cuplului indică: o fată sănătoasă (Domnica, 14 ani) şi un băiat sănătos (Cornel 13 ani). Marius este însurat cu o femeie sănătoasă (Florica, 30 ani) cei doi având

Consultul genetic

205

doi gemeni dizigoţi sănătoşi (Corina şi Dorin, 9 ani), un avort spontan cu făt sănătos, iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex feminin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni).

Părinţii Mariei, tatăl, Costache, a fost afectat şi a decedat la vârsta de 66 ani, iar mama, Ecaterina, are 69 ani şi este sănătoasă. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.3.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7).

I 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 III S S


Boala prezentă în familia consultanţilor este dominantă deoarece: frecvenţa bolii în familie este mare, transmiterea afecţiunii în familie este continuă, nu există consanguinitate, doi părinţi sănătoşi au toţi copii sănătoşi (cuplul II.7. – II.8.), iar doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi (cuplul II.3. – II.4.). Afecţiunea este dominată legată de cromosomul X deoarece: un cuplu în care tatăl este afectat şi mama este sănătoasă (cuplul I.3. – I.4.) are toţi băieţii sănătoşi (II.7.), iar tatăl bolnav (I.3.) are toate fetele afectate (II.4., II.6.).

C. ANAMNEZA FAMILIALĂ 3 Cuplul Ionescu Ion (afectat, în vârstă de 47 ani) şi Maria (afectată, 43 ani), se prezintă la

consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat sănătos (Gheorghe, 22 ani) o fată sănătoasă (Ioana, 19 ani) un băiat bolnav (Vasile, 15 ani), iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin elasticitate excesivă a pielii, hiperlaxitate şi hipermobilitate articulară, fragilitate tegumentară şi vasculară cu sângerări mari la traumatisme minime. Diagnosticul stabilit de medicul genetician a fost de sindrom Ehlers-Danlos tip I.

Ion este cel mai mic dintr-o fratrie de 3 persoane. Prima din fratrie este Elena (sănătoasă, 50 ani), care este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 52 ani). Cei doi au un băiat sănătos (Constantin, 29 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 23 ani). Al doilea în fratria consultantului este Valeria (49 ani) sănătoasă, măritată cu un bărbat sănătos, cuplul fiind steril.

Părinţii consultantului: mama, Elisabeta, are 69 ani şi este sănătoasă, iar tatăl Toma are 72 ani şi este afectat.

Maria face parte dintr-o fratrie de două persoane, fiind cea mai mare. În fratrie, după Maria urmează un frate bolnav (Marius, 41 ani). Marius este însurat cu o femeie sănătoasă (Florica, 30 ani) cei doi având două gemene dizigote afectate (Corina şi Dorina, 12 ani), iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex masculin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni).

Părinţii Mariei, tatăl, Costache, are 66 ani şi este sănătos, iar mama, Ecaterina, are 69 ani şi este bolnavă. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.4.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). 1 2 3 4

I

Consultul genetic

206

1 2 3 4 5 6 8 9 II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 III S S


Boala prezentă în familia consultanţilor este dominantă deoarece: frecvenţa bolii în familie este mare, transmiterea afecţiunii în familie este continuă, nu există consanguinitate, doi părinţi sănătoşi au toţi copii sănătoşi (cuplul II.1. – II.2.), iar doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi (cuplul II.5. – II.6.). Afecţiunea este dominat autosomală deoarece: doi părinţi afectaţi (cuplul II.5. – II.6.) au fată sănătoasă (III.4.) un cuplu în care tatăl este afectat şi mama este sănătoasă (cuplul I.1. – I.2.) are băieţi bolnavi (II.5.), iar tatăl bolnav (I.1.) are fete sănătoase (II.2., II.4.).

D. ANAMNEZA FAMILIALĂ 4 Cuplul Vasilescu Ion (sănătos, în vârstă de 42 ani) şi Maria (sănătoasă, 37 ani), se prezintă la

consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat sănătos (Gheorghe, 18 ani) o fată sănătoasă (Gabriela, 16 ani) un băiat bolnav (Nicolae, 12 ani), un avort spontan cu făt sănătos, iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin anemie, sângerări masive la traumatisme minime, blocări articulare la nivelul articulaţiilor genunchilor, secundare unor hemartroze. Analiza sângelui a indicat un timp de coagulare anormal şi absenţa factorului de coagulare VIII, ceea ce a permis medicului genetician stabilirea diagnosticului hemofilie tip A.

Ion şi Maria sunt veri de gradul I, mama lui Ion şi tatăl Mariei fiind fraţi. Ion face parte dintr-o fratrie de 2 persoane. Prima din fratrie este Elena (sănătoasă, 45 ani), care

este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 48 ani). Cei doi au un băiat afectat (Constantin, 22 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 18 ani).

Părinţii consultantului, Elisabeta (69 ani) şi Toma (74 ani) sunt amândoi sănătoşi. Maria face parte dintr-o fratrie de două persoane, fiind cea mai mare. Ea are un frate sănătos

(Marius, 31 ani). Marius este însurat cu o femeie afectată (Florica, 30 ani) cei doi băieţi afectaţi (Caludiu, 10 ani şi Dorin, 9 ani), iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex feminin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni).

Părinţii Mariei, Costache (66 ani) şi Ecaterina (62 ani) sunt amândoi sănătoşi. Bunicii comuni ai consultanţilor, Toader (92 ani) are hemofilie tip A, iar Maria (88 ani) este

sănătoasă. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.5.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). 1 2 I 1 2 3 4 II 1 2 3 4 5 6 III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 IV

Consultul genetic

207


Boala prezentă în familia consultanţilor este recesivă deoarece: frecvenţa bolii în familie este redusă, transmiterea afecţiunii în familie este discontinuă, există consanguinitate şi doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi (cuplul III.3. – III.4.). Afecţiunea este recesivă legată de cromosomul X deoarece: doi părinţi sănătoşi (cuplul III.3. – III.4.) au doar băieţi afectaţi (IV.5.) iar un cuplu în care tatăl este sănătos şi mama afectată (cuplul III.5. – III.6.) are toţi băieţii afectaţi (IV.8., IV.9.).


A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI: Manifestare congenitală Consult genetic Anamneză familială Anamneză neonatală Anamneză postnatală Arbore genealogic

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1 Care sunt particularităţile caracterelor ereditare? 2 Care sunt simbolurile convenţionale internaţionale pentru următoarele situaţii: legătură nelegitimă,

divorţ, cuplu steril, sarcină cu făt de sex feminin în vârstă de 28 săptămâni, întrerupere de sarcină, nou născut mort de sex feminin, băiat adoptat.

3 Care sunt indicaţiile consultului genetic? 4 Ce elemente trebuie să înregistreze anamneza familială? 5 Care sunt elementele anamnestice ce trebuie avute în vedere în evaluarea unui copil în vârstă de o

lună? Dar la o femeie în vârstă de 32 ani? 6 Cum se apreciază dezvoltarea postnatală a unui individ? 7 Cum se examinează un nou născut mort? 8 Presupunând că sunteţi medic de familie, pe care dintre următorii pacienţi îi veţi trimite pentru

consult genetic? g. Cuplu tânăr, neînrudit, care are 2 copii sănătoşi, dar planifică o nouă sarcină; h. Cuplu consangvin (verişori de gradul doi); i. Cuplu steril; j. Cuplu aparent sănătos, cu 3 copii sănătoşi, în prezent femeia fiind însărcinată (luna a doua);

femeia are 42 ani; k. Cuplu tânăr, neînrudit, cu 3 avorturi spontane (lună mică) în antecedente.

9 Se prezintă la consultaţie un cuplu tânăr, neînrudit, care cer informaţii privind riscul pentru o eventuală sarcină. Anamneza reproductivă a cuplului arată că ei au un băiat sănătos, un avort spontan în luna a doua şi o fată cu dismorfie facială (hipotelorism, despicătură labio- maxilo- palatină) şi polidactilie postaxială. Ultimul copil a decedat la vârsta de o lună. Examenul necroptic a evidenţiat anomalii la nivel cerebral (holoprozencefalie) şi cardiac. Cariotipul efectuat în acest caz a arătat o trisomie 13 prin translocaţie 13/21. În prezent, cuplul ar mai dori un copil, motiv pentru care se prezintă la consultaţie. a. Care sunt principalele etape de abordare a situaţiei din această familie? b. Pentru clarificarea situaţiei, doriţi să efectuaţi teste genetice? Care anume? La cine? c. Care este riscul ca următoarea sarcină să fie afectată? Cum ar trebui comunicat acest risc?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate ("complement simplu"): 1. Doamna X.A. (22 ani) şi domnul X.B. (27 ani) se prezintă pentru consult genetic deoarece au un copil cu retard al dezvoltării psiho-motorii. În prezent doamna X este însărcinată (6 săptămâni) şi ar vrea să ştie riscul ca şi această sarcină să fie afectată. Anamneza familială relevă faptul că o verişoară

Consultul genetic

208

primară a doamnei X a avut 2 avorturi spontane şi un copil (momentan decedat) diagnosticat cu sindrom Patau (trisomie 13). Medicul genetician a examinat copilul X, a remarcat existenţa semnelor clinice sugestive pentru diagnosticul de sindrom Down şi a indicat efectuarea cariotipului la copil şi la mamă. a. De ce a cerut geneticianul efectuarea cariotipului la mamă? A. vârsta mare a mamei. B. vârsta mare a tatălui. C. contextul familial D. toate răspunsurile sunt corecte. E. nici unul dintre răspunsuri nu este corect b. Dintre variantele posibile de cariotip la copil, care este mai probabilă, având în vedere contextul familial? A. trisomie 21 omogenă B. trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană 13/21 C. trisomie 21 în mozaic C. trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană 21/21 E. trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană 15/21 c. Cariotipurile efectuate la mamă şi copil au relevat existenţa unei translocaţii robertsoniene 13/21 echilibrată la mamă şi neechilibrată la copil. Ce investigaţii suplimentare sunt necesare pentru un management corect al familiei X? A. efectuarea cariotipului la tată B. efectuarea cariotipului la verişoara mamei C. efectuarea cariotipului la soţul verişoarei D. toate răspunsurile sunt corecte E. nici un răspuns corect d. Dacă s-ar efectua cariotipul fetal şi testul ar evidenţia existenţa unui băiat, cu 45 cromosomi şi prezenţa translocaţiei, care ar fi prognosticul pentru această sarcină? A. băiatul va avea sindrom Down B. băiatul va avea sindrom Patau C. băiatul va avea sindrom Turner D. băiatul va fi fenotipic normal E. nici unul dintre răspunsuri nu estecorect 2. Cuplul Z (tineri, aparent sănătoşi) se prezintă pentru consult genetic deoarece au un copil afectat cu fibroză chistică (mucoviscidoză, boală autosomal recesivă) şi îşi mai doresc un copil. Anamneza familială relevă că domnul şi doamna Z sunt verişori de gradul doi. a. Care este genotipul părinţilor? A. ambii sunt homozigoţi NN B. ambii sunt heterozigoţi Na C. ambii sunt homozigoţi aa D. unul este homozigot NN şi unul heterozigot Na E. unul este homozigot aa şi unul heterozigot Na b. Care este riscul lor de a avea un copil afectat? A. 100% B. 50% C. 25% D. 10% E. 0% c. Ce analize paraclinice ar trebui geneticianul să indice în cazul cuplului Z? A. efectuarea cariotipului B. efectuarea testului cromatinei X C. efectuarea dozării clorurii de potasiu în sudoare D. determinarea glicemiei E. aplicarea unei metode de analiză molecualră pentru identificarea precisă a mutaţiei

11. DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL BOLILOR GENETICE

I. DATE TEORETICE

A. DEFINIŢIE. OBIECTIVE. Orice boală este definită ca entitate clinică prin mai multe caracteristici: una sau mai

multe cauze (factori etiologici), un proces patogenic care determină manifestările clinice şi tabloul clinic şi paraclinic specific (fenotipul specific). Cu cât aceste elemente sunt mai bine definite, cu atât diagnosticul este mai precis, iar strategiile terapeutice şi preventive sunt mai clar direcţionate.

În medicina clasică, procesul diagnostic este bazat pe identificarea unui fenotip clinic şi analiza anatomopatologică in vitro a celulelor sau ţesuturilor, a modificărilor biochimice sau a unor agenţi infecţioşi. Cu toate că analiza fenotipică a fost constant îmbunătăţită, prin aplicarea unor tehnici şi metode noi, ca microscopia, spectrometria, enzimologia sau imunohistochimia, multe boli nu au putut fi complet definite din punct de vedere etiopatogenic în absenţa studiilor la nivelul ADN-ului sau ARN-ului celular.

Conceptul de diagnostic molecular se referă la noile tehnologii de diagnostic, al căror obiect de studiu este ADN-ul sau ARN-ul celular. În prezent, metodele de analiză a mutaţiilor şi polimorfismelor genice reprezintă un sprijin important în identificarea cauzelor de boală. În ultimii ani au fost clonate numeroase gene şi au fost identificate mutaţiile care cauzează unele dintre bolile genetice frecvente. Aceste boli pot fi identificate acum la nivel genomic. În plus, analiza acizilor nucleici s-a dovedit utilă pentru diagnosticul unor boli multifactoriale (polimorfisme genice sau gene majore de susceptibilitate), unor forme de cancer (deleţii sau amplificări genice, fuziuni genice ca urmare a unor rearanjamente cromosomice), unor boli infecţioase (prezenţa genomurilor patogene) sau pentru identificarea precisă a persoanelor (amprenta genetică – DNA fingerprinting) (figura 11.1.).

În esenţă, diagnosticul molecular al bolilor genetice urmăreşte identificarea mutaţiilor la nivelul genomului uman.

Obiectivele diagnosticului molecular al bolilor genetice sunt: diagnosticul genotipic al bolnavilor cu boli monogenice (identificarea alelelor); diagnosticul prenatal al unor boli genetice; diagnosticul presimptomatic al purtătorilor de gene dominante cu expresie tardivă; identificarea purtătorilor sănătoşi (heterozigoţi) de gene recesive; identificarea persoanelor purtătoare de premutaţii (pentru afecţiunile determinate de

mutaţii dinamice); identificarea unor mutaţii genice sau rearanjamente cromosomice în vederea evaluării

stadiului şi prognosticului unor tumori sau hemopatii maligne.

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

210

Figura 11.1. Diagnosticul molecular ca parte integrantă a procesului de diagnostic (după Strachan şi Reed, 1999)

În funcţie de nivelul cunoştinţelor referitoare la substratul genetic al afecţiunii, numărul şi frecvenţa populaţională a mutaţiilor, se disting două categorii de metode de diagnostic molecular: Metodele directe – aplicabile atunci când gena şi/sau mutaţia sunt cunoscute - urmăresc

evidenţierea unei mutaţii la nivelul genotipului unui individ. Probele (ADN, ARN, proteine, etc.) provenite de la consultant sunt testate pentru identificarea unui anumit genotip (un anumit tip de mutaţie); testul este individual şi furnizează informaţii doar despre respectivul individ.

Metodele indirecte – aplicabile atunci când gena nu a fost secvenţializată sau este greu accesibilă diagnosticului direct - urmăresc transmiterea intrafamilială a unor markeri genetici înlănţuiţi cu locusul morbid, pentru a descoperi dacă consultantul a moştenit sau nu alela mutantă de la un părinte heterozigot; testul vizează toată familia şi furnizează informaţii referitoare la segregarea unui anumit segment cromosomic în această familie.

Fenotip

Semne, simptome +/- rezultate de

laborator

Diagnostic clinic

Transmitere mendeliană?

Genă localizată?

Genă clonată?

Câteva mutaţii frecvente

Baza de calcul pentru riscul de

recurenţă

Risc empiric

Legile lui Mendel

Elemente de diagnostic

Imagistică medicală Cariotip Teste biochimice

Analiza înlănţuirii genice

(“gene tracking”)

Identificarea directă a mutaţiei sau înlănţuire

Detecţia mutaţiei specifice


211

Diagnosticul molecular se bazează pe noi metode de diagnostic ce permit analiza directă a ADN-ului şi ARN-ului;

Diagnosticul molecular are aplicabilitate pentru identificarea alelelor mutante, a heterozigoţilor în boli recesive, a indivizilor cu premutaţie în boli produse prin mutaţii dinamice, în cancere;

Există două categorii de tehnici de analiză moleculară: directă (pentru gene cunoscute) şi indirectă (pentru gene nesecvenţializate)

B. TEHNICI DE DIAGNOSTIC MOLECULAR Diagnosticul molecular la nivel de ADN necesită izolarea ADN genomic din celule.

Metodele de izolare impun înlăturarea ARN-ului, proteinelor, lipidelor şi nucleazelor, care pot interfera cu activitatea enzimelor de restricţie, ligazelor sau polimerazei. Detecţia mutaţiilor este realizată prin metode, bazate pe: digestia cu enzime de restricţie, electroforeza ADN-ului în gel, amplificarea in vitro a ADN-ului (PCR) şi hibridarea acizilor nucleici.

1. DIGESTIA CU ENZIME DE RESTRICŢIE

Dificultăţile legate de izolarea şi purificarea unei gene au fost depăşite prin descoperirea enzimelor de restricţie. Acestea sunt enzime bacteriene care clivează ADN-ul dublu catenar în situsuri specifice, definite de secvenţa nucleotidică locală. Enzimele de restricţie pot cliva ADN-ul în două moduri: tăiere asimetrică a situsului de recunoaştere cu generarea unor capete monocatenare 5’ şi 3’ (sticky ends) sau tăiere simetrică a situsului cu generarea de capete identice (blunt ends). Enzimele de restricţie sunt numite după bacteria din care au fost izolate (figura 11.2., tabelul 11.1.).

Figura 11.2. Modalitatea de acţiune a diferitelor tipuri de enzime de restricţie 1 capete drepte; 2 capăt proeminent 5’ GATC; 3 capăt proeminent 5’ GATC; 4 capăt

proeminent 3’ TGCA

5’---GG CC---3’

3’---CC GG---5’

5’---GA TC---3’

3’---CT AG---5’

Enzima de restricţie

Situs de restricţie Fragmente rezultate

HaeIII1

MboI2

5’ GG—CC

3’

5’ GATC---3’

3’---CTAG 5’

5’---GGA TCC---3’

3’---CCT AGG---5’BamHI3 5’GATCC—G 3’

3’G—CCTAG 5’

5’---CTG CAG---3’

3’---GAC GTC---5’PstI4 5’ G—CTGCA 3’

3’ACGTC—G 5’


212

Tabelul 11.1. Enzime de restricţie

Enzima1 Bacteria Secvenţa specifică2

Alu I Artrobacter lutesu AGCT Hae III Haemophilus aegyptus GGCC Taq I Thermus aquaticus TCGA Mn/I Moraxella nonliquefaciens CCTC/GAGG Hind III Hemophilus influenzae Rd AAGCTT EcoRI Escherichia coli R factor GAATTC BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC

1 Denumirea indică: specia şi ordinea descoperirii enzimei de restricţie. (De exemplu, EcoRI:Esherichia coli, prima restrictază descoperită; Hind III: Haemophilus influenzae) 2 A – adenină, G – guanină, C – citozină; T – timină; N – oricare nucleotidă

Enzima de restricţie este incubată cu ADN-ul într-o soluţie ionică. Deoarece enzima recunoaşte o anumită secvenţă nucleotidică, sub acţiunea ei vor rezulta fragmente caracteristice de lungimi diferite. Aceste fragmente de ADN pot fi identificate, după separare prin electroforeză în gel, alcătuind “hărţi de restricţie” ale moleculelor de ADN, ce permit compararea moleculelor de ADN de la diferiţi indivizi, fără a fi necesară determinarea în detaliu a secvenţei nucleotidice. Pe această bază pot fi identificate mutaţiile care anulează un situs de restricţie sau generează situsuri de restricţie noi.

O a doua aplicaţie majoră a enzimelor de restricţie este ingineria genetică, în cadrul căreia acestea sunt folosite pentru tăierea unor fragmente de ADN (izolarea unor gene sau fragmente de genă) şi transferarea lor în alte molecule în scopul de a genera noi secvenţe de ADN (ADN recombinant).

2. SEPARAREA FRAGMENTELOR DE ADN PRIN ELECTROFOREZĂ ÎN GEL

În prezenţa unui câmp electric continuu, fragmentele de ADN vor migra spre anod, datorită prezenţei grupurilor fosfat, încărcate negativ. În gel frecarea modifică viteza migrării, astfel că moleculele mai mari se vor deplasa mai încet, deoarece trec mai greu prin pori decât moleculele mici. Pot fi utilizate trei tehnici de electroforeză în gel: electroforeza în gel de agaroză, electroforeza în gel de poliacrilamidă şi electroforeza în gel în câmp electric pulsatil (pulse-field gel electrophoresis). Astfel, pot fi separate fragmente de ADN cu lungimi cuprinse între 5 nucleotide şi 5000000 de nucleotide.

a. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ

Metoda implică utilizarea unei plăci-suport, introdusă într-o cuvă de electroforeză, pe care este fixat gelul de agaroză, la nivelul căruia sunt formate godeuri în care va fi depozitat ADN-ul. Cuva de electroforeză este conectată la o sursă de curent electric continuu care asigură migrarea fragmentelor. Trebuie ales un raport optim între tensiunea şi intensitatea sursei de curent şi dimensiunea cuvei, astfel încât migrarea să se producă suficient de repede, dar benzile să fie clar conturate.

Eşantioanele de ADN sunt amestecate cu o soluţie tampon ce conţine un colorant (de exemplu bromură de etidium) pentru detecţia migrării şi sunt introduse, cu o micropipetă, în godeuri. Benzile obţinute, prin electroforeză în gel, sunt comparate cu cele obţinute la migrarea unei soluţii martor a căror fragmente au greutate moleculară cunoscută.


213

Electroforeza în gel de agaroză este folosită în scop analitic (pentru a determina cantitatea de ADN sau rezultatul unei digestii enzimatice sau a unei reacţii PCR), sau în scop preparativ (pentru a purifica un fragment de ADN dintr-un complex de produse ale digestiei enzimatice sau ale PCR).

b. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDĂ

Separarea elecroforetică a ADN în gel de poliacrilamidă este similară celei în gel de agaroză, migrarea făcându-se spre anod, iar discriminarea pe baza mărimii porilor. Gelurile de poliacrilamidă pot separa molecule cuprinse între 6 şi 2.000 de nucleotide. Spre deosebire de electroforeza în gel de agaroză, această metodă poate fi utilizată atât pentru ADN-ul bicatenar, cât şi pentru cel monocatenar.

c. ELECTROFOREZA ÎN CÂMP ELECTRIC PULSATIL

Electroforeza în gel de agaroză sau poliacrilamidă nu poate separa molecule de ADN mai mari de 750 kb. Separarea unor molecule de până la 2 Mb poate fi realizată prin alternarea direcţiei câmpului electric. Aceasta determină moleculele de ADN să îşi schimbe orientarea înainte de a putea migra în noua direcţie impusă de noul câmp electric. Cu cât molecula este mai mare, cu atât timpul necesar reorientării este mai mare. Această metodă este frecvent utilizată în cartografierea genică şi la clonarea YACs-ilor (yeast artificial chromosomes - cromosomi artificiali de levuri).

3. AMPLIFICAREA IN VITRO A SECVENŢELOR DE ADN

Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR - polymerase chain reaction) permite amplificarea enzimatică exponenţială a ADN-ului, pornind de la cantităţi foarte mici de material, mimând mecanismul de bază al replicării ADN. Amplificarea in vitro a ADN prin PCR este un proces ciclic, ce implică: denaturare, legarea amorselor şi extensia acestora.

Denaturarea se realizează prin încălzirea ADN-ului la peste 90°C timp de cel puţin 60 s. În a doua fază, temperatura este redusă la 40-68°C, timp de 60-120 s, pentru a permite amorselor oligonucleotidice să se lege la secvenţele de ADN complementare de pe catenele produse în faza de denaturare. Ultima fază a unui ciclu constă într-o reacţie de extensie enzimatică, în direcţia 5’ – 3’, a amorselor cu producerea unor copii complementare ale ADN-ului bicatenar la care acestea s-au legat. Această reacţie are loc la 72°C şi durează 60-180 s, fiind realizată de o ADN-polimerază termostabilă denumită Taq, de la bacteria Thermophilus Aquaticus.

Repetarea de 25-40 ori a acestor cicluri duce la amplificarea unei secvenţe originale de ADN de până la 1.000.000 ori în 3-4 ore (figura 11.3.).

Reactivii necesari amplificării PCR sunt: ADN polimerază, amorse oligonucleotidice şi deoxiribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Amorsele sunt oligonucleotide (15-30 baze) complementare secvenţelor care flanchează regiunea ţintă. Confirmarea mărimii produsului amplificat se realizează de obicei prin electroforeză în gel.

Tehnica PCR este utilizată pentru manipularea genică, deoarece generează cantităţi mari dintr-un anumit fragment de ADN şi dă posibilitatea de a modifica ADN-ul prin crearea de noi situsuri de restricţie sau prin producerea de mutaţii în vederea studierii efectelor acestora asupra funcţiei proteinei modificate. PCR-ul poate fi utilizat şi pentru a amplifica fragmente de ARN mesager pentru identificarea genei care codifică un anumit produs. Această reacţie duce la producţia de ADN complementar (ADNc) secvenţei de ARN, cu ajutorul unei amorse specifice, dNTP şi a transcriptazei inverse.

PCR-ul este frecvent utilizat ca metodă de diagnostic în medicină, deoarece permite detecţia directă sau indirectă a mutaţiilor genice.


214

Figura 11.3. Schema reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)

4. SECVENŢIALIZAREA ADN

Cunoaşterea secvenţei ADN-ului este esenţială pentru înţelegerea modului în care este controlată expresia genelor şi a mecanismelor moleculare implicate în patologia umană.

Secvenţializarea ADN-ului se bazează pe replicarea controlată, in vitro, a ADN-ului. În cursul secvenţializării sunt folosite dideoxinucleotide (ddNTP) cărora le lipseşte grupul 3’-OH, necesar pentru extensia lanţului de către ADN polimerază. În momentul încorporării unui ddNTP în ADN, sinteza se încheie. În reacţie se folosesc 4 tipuri de ddNTP corespunzătoare fiecărui tip de nucleotid: ddATP, ddCTP, ddGTP şi ddTTP.

Într-un set de patru reacţii, fiecare conţinând cele patru nucleotide (dNTP), dar un singur tip de ddNTP, fragmentele rezultate din reacţie vor începe în acelaşi punct (la nivelul amorsei), dar se vor termina în funcţie de ddNTP incluse în reacţie. Dacă se păstrează un echilibru corespunzător între dNTP şi ddNTP (raport molar de aprox. 200:1), atunci reacţia va produce toate lanţurile posibile cu lungimi cuprinse între 1-1.000 baze, numărate de la poziţia primerului.

Denaturare termică

5’

5’3’

3’

5’

5’ 3’

3’

Hibridare cuamorsă specifică

5’3’

5’

5’3’

3’5’

5’ 3’

3’

Polimerizare în prezenţaTaq polimerazei

5’

5’3’

3’5’

5’ 3’

3’

Cic

lul I

5’ 3’5’3’

5’ 3’5’3’

5’ 3’ 5’ 3’5’3’ 5’3’

Ciclul II


215

Produsele reacţiei pot fi detectate prin încorporarea în reacţie (în amorsă sau în nucleotide) a unor markeri, urmată de electroforeza în gel de poliacrilamidă.

Există două tipuri de marcaj: radioactiv sau fluorescent. Metoda clasică utilizează marcajul radioactiv, fragmentele fiind marcate prin încorporarea unui dNTP radioactiv (de obicei dATP). Cei mai utilizaţi izotopi sunt 35S şi 33P. După electroforeză şi uscarea gelului, fragmentele sunt vizualizate prin autoradiografie. În cazul marcajului fluorescent pot fi folosiţi 4 fluorocromi, specifici celor patru baze azotate sau un fluorocrom nespecific, care se fixează la nucleotidul modificat. Unul din avantajele acestei metode este că informaţia referitoare la secvenţă poate fi colectată chiar în timpul electroforezei, prelungirea timpului acesteia permiţând extragerea unei cantităţi mai mari de date. Dezavantajul secvenţializării cu marcaj fluorescent este sensibilitatea redusă.

5. HIBRIDAREA ACIZILOR NUCLEICI

Detecţia şi identificarea unor secvenţe specifice de acid nucleic constituie o procedură de rutină în biologia moleculară. O astfel de metodă se bazează pe faptul că, în condiţii favorabile, două molecule monocatenare de acizi nucleici pot forma o moleculă hibrid, în funcţie de gradul de complementaritate a secvenţelor lor nucleotidice. Formarea duplexului se realizează prin legături de hidrogen între guanozină şi citozină, respectiv între adenozină şi timidină (sau uracil, în cazul ARN-ului). Astfel, hibridarea moleculară asociată cu o metodă de marcare şi detecţie devine utilă pentru identificarea unor secvenţe identice cu o secvenţă nucleotidică de referinţă (probă).

a. SOUTHERN BLOTTING

În cazul metodei Southern blot, ADN-ul conţinând secvenţa ţintă este digerat cu una sau mai multe enzime de restricţie, după care fragmentele sunt separate în funcţie de mărime prin electroforeză în gel. Moleculele migrate în gel sunt denaturate prin tratament cu alcali, apoi neutralizate şi transferate prin capilaritate pe o membrană de hibridare (“blotting”), utilizând o soluţie ionică concentrată. Ulterior, ADN-ul este fixat ireversibil la membrană, devenind disponibilă pentru hibridarea cu o probă marcată (radioactiv sau fluorescent) de ADN monocatenar. După înlăturarea hibridărilor nespecifice, moleculele hibride sunt detectate fie prin autoradiografie, fie prin metode de detecţie non-radioactive (figura 11.4.).

De la introducerea metodei, în 1975, analiza ADN-ului prin Southern blotting a devenit o tehnică de rutină în analiza organizării genelor, identificarea şi clonarea unor secvenţe specifice, studiul mutanţilor, caracterizarea genotipurilor prin RFLP, diagnosticul bolilor genetice şi al cancerului, detecţia unor microorganisme, sau identificarea genetică în medicina legală (“DNA fingerprinting”).

b. NORTHERN BLOTTING

Analiza ARN-ului prin Northern blot asigură obţinerea de informaţii privind expresia genelor în organismele multicelulare, deoarece detectează cantitativ secvenţa de acid ribonucleic dintr-un ţesut sau celulă. Interpretarea datelor obţinute trebuie să ţină cont de particularităţile tisulare ale transcripţiei genei, a maturării, transportului şi stabilităţii ARNm rezultat în transcripţie şi de modificările translaţionale şi posttranslaţionale ale peptidului sintetizat. În ciuda limitărilor sale, metoda este utilizată în continuare pentru studiul specificităţii de ţesut/organ a expresiei genice, în analiza activităţii genelor endogene sau exogene în organismele transgenice, şi pentru studiul expresiei genice în cursul dezvoltării organismelor.

Principiul analizei este similar metodei Southern blot, fiind bazat pe capacitatea moleculelor complementare monocatenare de ARN şi ADN de a forma molecule hibrid. Moleculele de ARN separate pe baza mărimii (prin electroforeză în gel de agaroză) şi


216

transferate pe un filtru (membrană de nylon sau nitroceluloză) sunt hibridate cu o probă de acid nucleic, cu secvenţă cunoscută, marcată radioactiv sau non-radioactiv. După spălarea probei nehibridate sau legate nespecific, moleculele de ARN hibride sunt identificate prin autoradiografie sau detecţia semnalelor fluorescente.

Figura 11.4. Principiul metodei Southern blotting

Transferul ADN-ului pemembrană

Sonda de ADNADN ţintă

Clivare cu enzime derestricţie

Fixare pe un gel de agaroză

–

+

Denaturare în soluţii alcaline

Aplicarea unei membrane denitroceluloză sau nylon

Marcaj specific izotopic

Denaturare termică

Hibridare cu ADN-ul ţintă fixat pe membrană

Spălare pentru îndepărtarea excesului deprobă

Aplicarea unui film radiografic

Developarea filmului


217

Digestia cu enzime de restricţie a unui fragment cromosomic permite secţionarea acestuia într-un număr de fragmente cu capete identice, în raport cu secvenţa nucleotidică specifică situsului de restricţie;

Separarea fragmentelor de ADN, generate de enzimele de restricţie, este asigurată prin elecroforeză în gel de agaroză, gel de poliacrilamidă sau câmp electric pulsatil;

Identificarea precisă a fragmentelor genice impune, în prealabil, obţinerea unui număr suficient de mare de probe, deziderat asigurat prin aplicarea metodei de polimerizare în lanţ (PCR);

Stabilirea secvenţei genice (secvenţializare) este posibilă prin replicarea controlată a ADN-ului, folosind dideoxinucleotide marcate radiactiv sau fluorescent;

Detecţia secvenţelor cunoscute de acizi nucleici se face prin aplicarea metodelor Southern blott (pentru ADN) sau Northern blott (pentru ARN)

C. METODE DE DIAGNOSTIC MOLECULAR Identificarea unei mutaţii cunoscute poate fi realizată prin mai multe metode,

prezentate în tabelul 11.2.

Tabelul 11.2. Metode de identificare a unei mutaţii cunoscute

Metoda Comentarii Digestie enzimatică a ADN-ului, amplificat prin PCR şi evaluarea fragmentelor prin electroforeză în gel

În situaţiile în care mutaţia creează sau anulează un situs de restricţie natural sau unul introdus prin utilizarea unor amorse PCR speciale

Hibridarea ADN-ului amplificat cu oligonucleotide specifice de alelă (ASO)

Detectează mutaţii punctiforme cunoscute

PCR cu amorse cu specificitate de alelă (ARMS)

Metodă generală pentru mutaţii punctiforme; Poate fi adaptat pentru tehnologia cipurilor.

Test de legare a oligonucleotidelor (OLA)

Metodă generală pentru mutaţii punctiforme determinate.

PCR cu amorse situate de o parte şi de alta al unui punct de translocaţie

Amplificarea reuşită indică prezenţa rearanjamentului cromosomic suspicionat.

Evaluarea numărului de repetiţii nucleotidice

Pentru boli prin mutaţii dinamice; expansiunile nucleotidice mari sunt identificate prin Southern blot, cele mai mici prin PCR.

Mutaţiile punctiforme ale unei gene pot fi detectate cu ajutorul PCR, dacă secvenţa genică din vecinătatea mutaţiei este cunoscută. În acest caz, amorsele utilizate sunt specifice (complementare) fie alelei normale (ASO-N), fie celei mutante (ASO-M), fiind denumite oligonucleotide cu specificitate de alelă (figura 11.5.). Cele două oligonucleotide diferă doar printr-o singură bază, dar acest fapt este suficient pentru ca hibridarea oligonucleotidelor să fie specifică pentru o anumită alelă. Când se realizează detecţia unei mutaţii, proba de ADN este amplificată concomitent cu 3 martori corespunzători: unui homozigot normal (NN), unui heterozigot (Na) şi unui homozigot mutant (aa). Produsele PCR sunt transferate pe filtre de nitroceluloză ("dot blot") şi apoi sunt hibridate (separat, în două reacţii) cu cele două oligonucleotide specifice, marcate radioactiv (cu 32P). Dacă o probă de ADN este recunoscută de oligonucleotidul specific alelei mutante,


218

înseamnă ca persoana este purtătoarea a cel puţin unei gene mutante. Diferenţierea între heterozigoţi şi homozigoţii mutanţi se realizează prin analiza filtrului cu oligonucleotidul normal, hibridarea acestuia cu acelaşi specimen de ADN semnificând faptul că persoana este heterozigotă.

PCR-ul poate fi utilizat şi pentru detecţia indirectă a mutaţiilor, prin analiza polimorfismului confor-maţiei catenelor unice de ADN (single-strand conformational polymorphism - SSCP) sau prin analiza înlănţuirii cu secvenţe scurte de ADN repetate în tandem (variable number of tandem repeats - VNTR). Avantajul principal al SSCP constă în faptul că nu este necesară cunoaşterea precisă a mutaţiei sau a secvenţei complete a genei. ADN-ul amplificat prin PCR este denaturat şi apoi aplicat imediat pe un gel. În gel, catenele rămân separate, dar formează structuri secundare prin legături de hidrogen, deoarece ADN-ul bicatenar este mai stabil decât cel linear, monocatenar. Prezenţa unei mutaţii punctiforme determină modificarea legăturilor de hidrogen din interiorul moleculei şi deci şi a conformaţiei moleculei. Catenele cu structuri diferite au mobilitate electroforetică diferită, SSCP

putând detecta o diferenţă de o bază dintr-o catenă de 500 nucleotide. Izolarea din gel a fragmentului de ADN cu migrare anormală permite secvenţializarea şi determinarea precisă a modificării nucleotidice. Această modificare poate fi sau nu cauza unei afecţiuni, ştiut fiind că orice polimorfism poate genera o modificare conformaţională a ADN-ului.

În ceea ce priveşte secvenţele scurte repetate în tandem, acestea sunt secvenţe de ADN repetitiv, răspândite în întreg genomul, cel mai frecvent constituite din două nucleotide. Numărul de repetiţii dinucleotidice este variabil, polimorfismul unei astfel de secvenţe, asociat unui anumit locus, putând servi la urmărirea transmiterii unei alele specifice într-o familie.

Pentru "tiparea" unei alele sunt necesare amorse complementare secvenţelor care flanchează secvenţa repetitivă, urmată de amplificarea PCR a specimenelor de ADN de la membrii familiei. Produsele PCR pot fi marcate fie radioactiv, fie fluorescent. Diferenţierea între alele se face pe baza mărimii secvenţelor amplificate, prin electroforeză în gel, urmată de autoradiografie sau detecţie într-un aparat de secvenţializare automată.

Analiza unei gene pentru identificarea unei mutaţii necunoscute se poate face prin mai multe metode (tabelul 11.3.).

Figura 11.5. Principiul metodei ASO


219

Tabelul 11.3. Metode de scanare a unei gene pentru identificarea mutatiilor

Metoda Avantaje Dezavantaje Southern blot; hibridare cu probe de ADNc

Identifică deleţiile mari sau rearanjamentele.

Metodă laborioasă, scumpă. Necesită câteva μg de ADN.

Secvenţializare Mutaţiile sunt caracterizate complet.

Costisitoare. Poate fi dificil de interpretat.

Migrare electroforetică a heteroduplexurilor

Metodă simplă şi ieftină. Numai pentru secvenţe sub 200pb. Sensibilitate limitată.

HPLC denaturant Metodă rapidă, cantitativă. Echipament costisitor. Nu relevă poziţia mutaţiilor.

Polimorfismul conformaţiei ADN monocatenar (SSCP)

Metodă simplă, echipament necostisitor.

Numai pentru secvenţe sub 200pb. Sensibilitate limitată. Nu relevă poziţia anomaliilor.

Electroforeză în gel-gradient denaturant (DGGE)

Metodă sensibilă. Alegerea primerilor este critică. Primerii sunt costisitori. Nu relevă poziţia anomaliei.

Testul de trunchiere a proteinelor (PTT)

Identifică mutaţiile cu terminare prematură a translaţiei. Identifică poziţia mutaţiei.

Numai pentru mutaţii cu încheiere prematură a lanţului. Metodă costisitoare, dificilă. Necesită ARN.

Dideoxy fingerprinting Mare sensibilitate. Dificil de interpretat. Gene chips Metodă rapidă, eficientă.

Poate defini toate mutaţiile. Echipament costisitor. Gamă limitată de gene..

Principalele metode de identificare directă a unei mutaţii cunoscute sunt: digestia enzimatică a ADN-ului, cu amplificare prin PCR, hibridarea ADN-ului cu oligonucleotide specifice de alelă, PCR cu amorse cu specificitate de alelă, testul de legare al oligonucleotidelor;

Detecţia indirectă a mutaţiilor, bazată pe PCR, se face prin analiza polimorfismului catenelor unice de ADN (SSCP) sau analiza înlînţuirii cu secvenţe scurte de ADN, repetate în tandem (VNTR).

D. URMĂRIREA TRANSMITERII MUTAŢIEI Urmărirea transmiterii genealogice a unei mutaţii se face prin studii de înlănţuire

genică. Pentru aplicarea metodei este necesară îndeplinirea următoarelor condiţii: cromosomul pe care este situată gena mutantă trebuie să fie cartografiat, astfel încât să fie

cunoscuţi markerii genetici care sunt înlănţuiţi strâns cu locusul morbid; recombinarea intracromosomică stabileşte acurateţea metodei: markerii aleşi trebuie să

prezinte o rată a recombinărilor cu locusul morbid de cel mult 1% (situaţi la cel mult 1Mb distanţă). Se utilizează frecvent markeri polimorfici intragenici, dar se pot utiliza şi combinaţii de markeri situaţi de o parte şi de alta a genei ("flanking / bridging markers").

structura arborelui genealogic şi probele de ADN disponibile să permită determinarea "fazei" (asocierea dintre o anumită variantă a markerului şi alela mutantă).

familiile analizate să fie suficient de mari pentru a fi posibilă obţinerea de date concludente. să fie cunoscută cu precizie etiologia afecţiunii, pentru a fi eliminată posibilitatea existenţei

unui tip de heterogenitate genetică.


220

Etapele care sunt urmărite pentru stabilirea înlănţuirii genice dintre un locus morbid şi un locus marker sunt următoarele: diferenţierea celor doi cromosomi omologi la cuplul proband (găsirea unui marker strâns

înlănţuit cu alela mutantă pentru care părinţii sunt heterozigoţi); determinarea "fazei" - identificarea cromosomului purtător al genei mutante; identificarea setului de cromosomi primit de consultant de la părinţi.

Categoriile de markeri genetici utilizaţi sunt: microsateliţi polimorfici (repetiţii bi-, tri- sau tetranucleotidice), detectaţi prin PCR; minisateliţi (VNTR) (repetiţii succesive ale unor scurte secvenţe de ADN 0,1-1 kb) - foarte

polimorfici, detectaţi prin digestie cu enzime de restricţie, electroforeză în gel de agaroză şi Southern blot;

RFLP (polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie); există cel mult două variante pentru fiecare locus. Se detectează prin digestie cu enzime de restricţie, electroforeză în gel de agaroză şi Southern blot.


1. CAZ CLINIC 1

La consult genetic se prezintă familia P. Ion şi Maria, ambii sănătoşi, care se interesează de posibilităţile de diagnostic molecular, în condiţiile în care cei doi au un copil cu mucoviscidoză. Ancheta familială a relevat că Maria a avut trei sarcini, din care au rezultat o fată afectată, un băiat sănătos şi o fată sănătoasă (figura 11.6.a). La ora actuală se cunoaşte că în mucoviscidoză, cea mai frecventă mutaţie la nivelul genei CFTR este mutaţia ΔF 508. Această mutaţie, localizată la nivelul exonului 10, se caracterizează prin deleţia codonului 508, care codifică fenilalanina, efectul mutaţiei fiind sinteza unui canal anormal transmembranar de clor. I 1 2 II 1 2 3 a.

b

Figura 11.6. Arborele genealogic al familiei P

Ţinând cont de aceste date, în cazul familiei P, în condiţiile în care există posibilităţi de diagnostic molecular, trebuie încercată detecţia ţintită a mutaţiei ΔF 508. În acest scop este utilă amplificarea prin tehnica PCR a secvenţei genice cuprinsă de exonul 10 al genei CFTR. Acest exon cuprinde în mod normal 50 pb, în timp ce la persoanele care au mutaţia ΔF 508 exonul are doar 47 pb.

Prin analiza PCR pe gel de poliacrilamidă a probelor recoltate de la membrii familiei P au fost obţinute rezultatele prezentate în figura 11.6.b.


221

Analizând rezultatele analizei moleculare se pot desprinde următoarele concluzii: Persoana II.1. este homozigotă pentru alele mutantă, purtătoare a deleţiei ΔF 508, aspect confirmat de

existenţa unei singure benzi electroforetice, corespunzătoare exonului cu 47 pb; Ambii consultanţi sunt heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie, prezentând două benzi electroforetice; Ceilalţi doi copii ai familiei sunt cert homozigoţi normali (NN) deoarece prezintă doar banda

electroforetică corespunzătoare exonului cu 50 pb.

2. CAZ CLINIC 2

La consult genetic se prezintă familia M. Paul şi Nicoleta, ambii sănătoşi. Ei doresc să afle dacă pentru maladia genetică prezentă în familia lor există posibilităţi de diagnostic molecular. Cei doi soţi au un copil care prezintă semne clinice de acondroplazie (nanism dizarmonic cu membre scurte, în special la nivelul segmentului proximal şi cap mare cu rădăcină nazală turtită). Momentan Nicoleta este însărcinată şi doreşte să afle dacă viitorul copil va fi şi el afectat. Anamneza familială a relevat absenţa altor cazuri de boală în familie şi faptul că Paul este mai în vârstă decât soţia lui cu 25 de ani, având la momentul consultului vârsta de 49 de ani (figura 11.7.a). Afecţiunea prezintă o transmitere dominant autosomală, dar majoritatea cazurilor de boală sunt consecinţa unor mutaţii noi, deoarece persoanele afectate au o fertilitate redusă. Mutaţiile de novo sunt asociate cu vârsta paternă înaintată în momentul concepţiei. Aproape toţi indivizii afectaţi prezintă o mutaţie la nivelul codonului 380 al genei receptorului factorului de creştere fibroblastică 3 (FGFR3 – fibroblast growth factor receptor 3). Această mutaţie punctiformă are ca efect substituţia glicinei cu arginina la nivelul proteinei.

Ţinând cont de datele anamnestice se poate presupune că în familia analizată există o mutaţie de novo produsă la nivelul liniei germinale a consultantului şi că probabil acesta prezintă un mozaic germinal. Pentru determinarea prezenţei mutaţiei se poate aplica digestia genei cu enzimă de restricţie EcoNI, urmată de amplificarea secvenţelor rezultate prin PCR, deoarece mutaţia de la nivelul codonului 380 a genei FGFR3 determină apariţia unui situs de restricţie nou.

Aplicând cele două tehnici au fost obţinute rezultatele prezentate în figura 11.7.b. I 1 2 1 2 II

a

b

Figura 11.7. a – Arborele genealogic al familiei M; b – rezultatele analizei moleculare efectuată prin digestia genei FGFR3 cu enzima de restricţie EcoNI, urmată de

amplificare prin PCR

Analizând această figură se poate concluziona următoarele: Copilul afectat al familiei M. prezintă mutaţia căutată, aspect confirmat de existenţa a două

fragmente genice; Cei doi consultanţi şi viitorul lor copil nu prezintă mutaţia, aspect confirmat de existenţa unei

singure benzi electroforetice (absenţa noului situs de restricţie EcoNI).


222


A. DEFINIŢI URMĂTORII TERMENI Diagnostic genotipic Enzimă de restricţie Hartă de restricţie Reacţie de polimerizare în lanţ Oligonucleotide cu specificitate de alelă Southern Blotting ADNc Northern blotting

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Care sunt obiectivele diagnosticului molecular? 2. Care sunt metodele de diagnostic molecular? 3. Prin ce se caracterizează metodele directe de diagnostic molecular? 4. Prin ce se caracterizează metodele indirecte de diagnostic molecular? 5. Care sunt metodele care permit detecţia mutaţiilor? 6. Ce sunt enzimele de restricţie? Câte tipuri de enzime de restricţie cunoaşteţi ? 7. Câte tipuri de electroforeză pot fi aplicate pentru analiza ADN-ului? Care sunt acestea? 8. Care sunt etapele metodei PCR? 9. ADN-polimeraza utilizată la reacţia PCR este termostabilă? (adevărat sau fals) 10. Cum sunt nucleotidele folosite pentru secvenţializarea ADN-ului? Ce grupare funcţională le

lipseşte? 11. Care sunt modalităţile de detecţie a secvenţializării? 12. Câte metode de hibridare moelculară cunoaşteţi? Care este substratul molecular al metodei

Southern blot? Dar a metodei Northern blot? 13. Care sunt aplicaţiile metodei Southern blot? 14. Prin metoda Northern blot ce se poate analiza: structura sau funcţia unei gene? 15. Care este principiul metodei ASO?

3. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate.

1. Care dintre următoarele afirmaţii nu constituie o indicaţie pentru diagnosticul molecular? A. diagnosticul genotipic al bolnavilor cu boli monogenice; B. identificarea persoanelor purtătoare de premutaţii C. identificarea purtătorilor sănătoşi de gene recesive D. diagnosticul prenatal al bolilor monogenice E. diagnosticul prenatal al aneuploidiilor

2. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la metodele directe de diagnostic molecular sunt adevărate?

A. au aplicabilitate când gena şi/sau mutaţia sunt cunoscute B. evidenţiază mutaţia la nivelul genotipului unui singur individ C. testul este individual D. testul nu furnizează informaţii refritoare la familie E. Toate răspunsurile sunt corecte.

II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B, dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3 C, dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4 D, dacă este corect răspunsul 4 E, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4

3. Care dintre următoarele metode sunt folosite pentru detecţia mutaţiilor 1. digestia cu enzime de restricţie 2. electroforeza ADN-ului în gel


223

3. amplificarea in vitro a ADN-ului (PCR) 4. hibridarea acizilor nucleici. 5. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la tehnica PCR sunt false

1. permite amplificarea enzimatică exponenţială a ADN-ului; 2. se realizează la temperatura camerei; 3. necesită cantităţi minime de probă; 4. se realizează in vivo.

6. Care dintre următoarele afirmaţii constituie aplicaţii ale tehnicii PCR 1. identificarea şi clonarea unor secvenţe specifice; 2. caracterizarea genotipurilor prin RFLP; 3. diagnosticul bolilor genetice şi al cancerului; 4. detecţia trisomiei 21.

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A: dacă cele două propoziţii sunt adevărate şi între ele există o relaţie tip cauză-efect B: dacă cele două propoziţii sunt adevărate dar nu există o relaţie tip cauză-efect C: dacă prima propoziţie este adevărată şi a doua este falsă D: dacă prima propoziţie este falsă şi a doua este adevărată E: dacă ambele propoziţii sunt false

7. Enzimele de restricţie sunt folosite în tehnologia ADN recombinant, deoarece aceste enzime determină formarea de segmente de ADN cu capete diferite în organisme diferite

8. Separarea electroforetică a fragmentelor de ADN cu dimensiuni cuprinse între 750kb şi 2 Mb este posibilă doar în câmp pulsatil, deoarece fragmentele mari au o inerţie proporţională cu dimensiunea la schimbarea direcţiei de mişcare

12. SFATUL GENETIC

I. DATE TEORETICE

A. DEFINIŢIE Termenul de sfat genetic a fost introdus în 1947 pentru a descrie relaţia dintre

genetician şi pacienţii cărora le furnizează informaţii referitoare la etiologia, evoluţia şi riscul de recurenţă al bolilor ereditare. Conform Societăţii Americane de Genetică Umană, sfatul genetic reprezintă un proces de comunicare, în conexiune cu problemele legate de apariţia şi riscul de recurenţă al unei boli genetice în familie. Acest proces este asigurat de una sau mai multe persoane special pregătite în acest domeniu şi vizează următoarele probleme: ajutarea familiei sau persoanei implicate să înţeleagă aspectele medicale legate de

diagnosticul bolii, evoluţia acesteia şi modalităţile posibile de tratament; aprecierea implicării factorilor genetici în etiologia bolii şi a riscului de recurenţă la alţi

membri ai familiei; identificarea modalităţilor de prevenire a apariţiei unor cazuri noi de boală, în concordanţă cu

interesele familiei, dependent de particularităţile etnice şi religioase; ajutarea familiei să aleagă cele mai bune opţiuni pentru persoana afectată, dependent de

riscul de recurenţă, evoluţia şi posibilităţile de tratament ale maladiei în cauză. Pe baza acestei definiţii este evident că, la acordarea sfatului genetic, medicul

genetician are mai multe sarcini: stabilirea diagnosticului afecţiunii şi a modalităţilor de influenţare a evoluţiei bolii; stabilirea ponderii factorilor genetici în determinismul bolii; determinarea riscului de recurenţă, dependent de tipul de transmitere al bolii; discutarea cu membrii familiei a opţiunilor reproductive, respectând autonomia şi conceptele

religioase sau etnice ale familiei – în acest caz este deosebit de important faptul că geneticianul sfătuieşte familia, dar nu el este cel care ia decizia (principiul nondirectiv);

asigurarea unui suport psihologic adecvat, necesar datorită existenţei impactului major al bolii asupra pacientului şi membrilor familiei acestuia.

B. CIRCUMSTANŢE DE ACORDARE A SFATULUI GENETIC

Sfatul genetic poate fi acordat în mai multe cazuri (tabelul 12.1), dar cel mai frecvent acest lucru se întâmplă în cazul apariţiei unui copil afectat de o boală genetică sau în cazul în care cuplul consultant prezintă numeroase eşecuri reproductive (avorturi spontane repetate şi/sau nou-născuţi morţi plurimalformaţi).

Circumstanţele de acordare a sfatului genetic pot fi împărţite în două categorii: sfat genetic premarital şi sfat genetic postmarital.

Sfatul genetic

226

Tabelul 12.1. Categorii de afecţiuni pentru care este solicitat sfatul genetic

Anomalii congenitale unice majore Anomalii congenitale multiple sindromice sau nu Ambiguitate sexuală Debilitate mentală de cauză neprecizată Tulburări de creştere şi dezvoltare Afecţiuni monogenice dominante sau recesive Erori înnăscute de metabolism Cancere familiale cu debut precoce

Sfatul genetic premarital poate fi acordat în următoarele situaţii: unul sau ambii membri ai cuplului sunt afectaţi de o boală genetică, în familia unuia dintre viitorii soţi există cazuri de boală genetică, viitorul cuplu este consanguin, femeia are vârsta mai mare de 35 de ani, unul dintre membrii cuplului prezintă o anomalie cromosomică structurală echilibrată, unul sau ambii membri ai viitorului cuplu lucrează într-un mediu mutagen.

Sfatul genetic postmarital este acordat de obicei în următoarele circumstanţe: cuplul consultant are un copil afectat de o boală genetică, cuplul prezintă tulburări reproductive manifestate prin sterilitate (masculină, feminină sau de cuplu) infertilitate (avorturi spontane repetate sau nou-născuţi morţi malformaţi) sau femeia are o afecţiune de bază, al cărei tratament poate influenţa dezvoltarea fătului.

C. ETAPELE ACORDĂRII SFATULUI GENETIC Etapele acordării sfatului genetic sunt prezentate în figura 12.1. Acordarea sfatului genetic începe prin stabilirea cu exactitate a diagnosticului

afecţiunii analizate. În acest scop, geneticianul trebuie să facă un examen clinic detaliat care permite depistarea unor semne minore de boală sau a unor particularităţi dismorfice. Acest consult este completat cu examene clinice de alte specializări şi analize paraclinice.

Cea de-a doua etapă a sfatului genetic o constituie identificarea componentei genetice implicate în determinismul afecţiunii analizate. Pentru stabilirea naturii genetice a afecţiunii de maximă importanţă este efectuarea anchetei familiale, completată cu anamneza personală amănunţită a pacientului (cuplului).

După încheierea anamnezei familiale se întocmeşte arborele genealogic, etapă de regulă greu de realizat, datorită lipsei de informaţii sau a informaţiilor eronate furnizate de proband (consultant). Arborele genealogic trebuie să cuprindă cel puţin trei generaţii, iar în cadrul generaţiei din care face parte probandul (consultantul) este necesar a fi notate toate rudele de gradul I şi II.

Datorită frecvenţei reduse a majorităţii afecţiunilor genetice şi a numărului crescut de astfel de boli, pentru stabilirea unui diagnostic corect este utilă consultarea programelor de diagnostic computerizat (POSSUM, OMD) sau a unor situri de internet (OMIM, ORPHANET).

Pentru identificarea componentei genetice sunt utile diferite investigaţii paraclinice în funcţie de tipul de boală suspectat. De exemplu, în cazul unui sindrom plurimalformativ de etiologie necunoscută, în special când există şi retard mental, este utilă analiza cromosomică. În schimb, în cazul unor malformaţii izolate, a unei afecţiuni monogenice sau a uneia multifactoriale efectuarea analizei cromosomice este inutilă.

Analiza datelor clinice şi paraclinice permite stabilirea unui diagnostic corect, pe baza căruia se face evaluarea prognosticului, modalităţilor de tratament şi a riscurilor de recurenţă în cazul afecţiunii respective şi se pot stabili opţiunile reproductive ale cuplului consultant.

Sfatul genetic

227

Figura 12.1. Etapele acordării sfatului genetic

În următoarea etapă de acordare a sfatului genetic se stabileşte riscul de recurenţă a bolii. Stabilirea categoriei de risc genetic se face dependent de tipul afecţiunii, fiind mai simplă în cazul bolilor cu transmitere monogenică sau mitocondrială şi dificilă în bolile multifactoriale şi în unele afecţiuni cromosomice. Riscurile genetice pot fi clasificate în cinci categorii: total, foarte mare, mare, moderat şi mic (vezi următoarele paragrafe).

Ultima etapă a acordării sfatului genetic o constituie comunicarea concluziilor. Comunicarea rezultatelor trebuie realizată de o echipă complexă (geneticieni, psihologi etc.) şi necesită stabilirea unei relaţii afective adecvate cu membrii cuplului consultant. Rezultatele trebuie comunicate atât oral, cât şi în scris.

Pentru comunicarea orală a concluziilor trebuie respectate o serie de condiţii, astfel încât impactul psihologic al comunicării să fie cât mai limitat: în momentul comunicării datelor trebuie să fie prezenţi ambii membri ai cuplului; comunicarea nu trebuie făcută în grabă; comunicarea trebuie realizată într-o încăpere cu aspect diferit de cel spitalicesc; medicul şi consultanţii trebuie să stea aşezaţi;

Consultul pacientului

ANAMNEZĂ Gestaţională Familială

ASISTENŢĂ Educaţională Familială Religioasă Grupuri de pacienţi

CONSULT MEDICAL Consult primar Consult de specialitate Examen radiologic Examene de laborator

SFAT MEDICAL Alegerea tratamentului

DIAGNOSTIC

ETIOLOGIE Date referitoare la boală Terapie posibilă

DATE INFORMATIVE Risc de recurenţă Opţiuni reproductive

EVALUARE Prognostic Complicaţii posibile Profilaxie

SFAT GENETIC

Sfatul genetic

228

comunicarea nu trebuie realizată prea curând după un eveniment traumatizant pentru cuplu (naşterea unui copil malformat, decesul unui copil, pierderea unei sarcini dorite);

comunicarea trebuie efectuată în termeni care să fie pe înţelesul consultantului. În cadrul comunicării trebuie subliniate particularităţile bolii (simptomatologie,

evoluţie, prognostic, tratament, posibilităţi de profilaxie) şi explicată natura genetică a afecţiunii şi riscul de recurenţă al acesteia la următoarele sarcini. De obicei, este util a compara riscul de recurenţă al cuplului cu riscurile prezente în populaţia generală (tabelul 12.2.).

Un alt aspect important este acela de a combate o serie de “false adevăruri” referitoare la afecţiunile ereditare (tabelul 12.3.).

Tabelul 12.2. Riscuri în populaţia generală

Afecţiune Risc general Cancer în perioada adultă 1/4 Avort spontan 1/6 Malformaţii congenitale majore 1/33 Handicap mental major 1/50 Deces perinatal 1/30 – 1/100 Deces neonatal 1/150 Deces în primul an de viaţă 1/500

Tabelul 12.3. False adevăruri referitoare la afecţiunile ereditare

Absenţa cazurilor de boală în familie înseamnă că boala nu este ereditară şi viceversa Orice afecţiune congenitală este şi genetică Traumele mentale sau psihice în cursul sarcinii produc malformaţii Toate bolile genetice sunt netratabile Dacă în familie există doar femei sau bărbaţi afectaţi boala are transmitere legată de un cromosom sexual Dacă cuplul consultant are un copil afectat de o boală recesivă, însemană că următorii trei copii vor fi sănătoşi deoarece riscul de recurenţă este de 1/4 Toate bolile genetice pot fi detectate prin analiză cromosomică

După comunicarea riscului de recurenţă geneticianul trebuie să detalieze opţiunile reproductive, dependent de nivelul riscului. În condiţiile în care riscul nu este mult diferit de cel din populaţia generală trebuie combătută teama nejustificată. În schimb, dacă riscul de recurenţă este important (mare, foarte mare sau total) trebuie luate în discuţie alte opţiuni reproductive într-o şedinţă ulterioară, în situaţia în care cuplul hotărăşte să-şi asume riscul (figura 12.2.).

Când riscul nu este total, iar diagnosticul prenatal al bolii este posibil, cuplul poate să aibă o nouă sarcină, în condiţiile în care există condiţii pentru eliminarea produsului de concepţie afectat. Dacă pacienţii sunt hotărâţi să nu aibă un alt copil, este obligatorie consilierea contraceptivă, cu scopul alegerii metodei optime.

Un aspect deosebit al sfatului genetic este acela că medicul sfătuieşte cuplul consultant, dar nu ia decizii în locul acestuia.

Important este ca membrii cuplului consultant să conştientizeze toate implicaţiile bolii şi să ia deciziile cunoscând toate informaţiile referitoare la aceasta.

CAZ DE BOALĂ

Reducerea riscului Ignorarea sau acceptarea riscului

Sfatul genetic

229

Figura 12.2. Opţiunile reproductive în cazul prezenţei unei afecţiuni genetice (modificat după Connor şi Fergusson-Smith, 1997)

Sfatul genetic reprezintă un proces de comunicare, corelat cu problemele legate de apariţia şi riscul de recurenţă al unei boli genetice în familie;

Medicul genetician are mai multe sarcini: stabilirea diagnosticului afecţiunii, a ponderii factorilor genetici, determinarea riscului de recurenţă a afecţiunii, discutarea cu membrii familiei a opţiunilor reproductive şi asigurarea unui suport psihologic adecvat;

Sfatul genetic este acordat cel mai frecvent în cazul apariţiei unui copil afectat de o boală genetică sau în cazul în care cuplul consultant prezintă numeroase eşecuri reproductive;

Etapele acordării sfatului genetic sunt: stabilirea cu exactitate a diagnosticului afecţiunii, identificarea componentei genetice, stabilirea riscului de recurenţă al afecţiunii şi comunicarea rezultatelor la membrii familiei.

D. RISCUL DE RECURENŢĂ ÎN BOLI GENETICE

1. RISCUL GENETIC ÎN BOLI CROMOSOMICE

Sfatul genetic în bolile cromosomice prezintă dificultăţi legate de tipul anomaliei cromosomice, sexul pacientului la care este prezentă anomalia, gradul de afectare a reproducerii, modalitatea de segregare a cromosomilor în cursul meiozei şi viabilitatea produşilor de concepţie.

a. SFATUL GENETIC ÎN FAMILIILE CU BOLI CROMOSOMICE

În cazul existenţei unui pacient cu o aneuploidie este important a determina tipul anomaliei, deoarece aceasta influenţează riscul de recurenţă a bolii la următorii descendenţi ai părinţilor pacientului.

Un exemplu în acest sens este sindromul Down, al cărui diagnostic clinic este uşor de stabilit, dar la care riscul de recurenţă depinde de tipul anomaliei: trisomie 21 liberă omogenă, trisomie 21 liberă în mozaic sau trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană neechilibrată.

Sfatul genetic

230

În cazul trisomiei 21 libere omogene un factor deosebit de important pentru calcularea riscului de recurenţă îl reprezintă vârsta maternă în momentul concepţiei. Datele epidemiologice au evidenţiat existenţa unei corelaţii între vârsta maternă crescută şi incidenţa sindromului Down la copii acestor femei (tabelul 12.4.).

Tabelul 12.4. Corelaţia între vârsta maternă în momentul concepţiei şi riscul de sindrom Down la descendenţi (după Hecht şi Hook, 1994)

Vârsta maternă (ani)

Prevalenţa sindromului Down la naştere ‰ 1/ nn

20 0,65 1560 25 0,74 1350 30 1,12 890 33 1,83 545 35 2,81 355 36 3,57 280 37 4,59 220 38 5,98 170 39 7,84 130 40 10,4 97 41 13,8 73 42 18,3 55 43 24,5 41 44 32,8 30 45 44,1 23 46 59,1 17 47 79,7 13 48 107 9 49 145 7 50 195 5

Riscul de apariţie al sindromului Down, prin trisomie 21 liberă omogenă, la copiii unei femei este de 0,1% la 30 de ani, de 0,3% la 35 de ani şi de 1% la 40 de ani, ceea ce reflectă o creştere geometrică a riscului după vârsta de 30 de ani. Practic, înainte de 30 de ani riscul de apariţie al sindromului Down este nesemnificativ. Pe baza acestor date în majoritatea ţărilor a fost stabilită vârsta de 35 de ani ca limită minimă de vârstă pentru aplicarea diagnosticului prenatal citogenetic.

La femeile care au un copil cu sindrom Down prin trisomie 21 liberă omogenă este utilă efectuarea analizei cromosomice prenatale la următoarele sarcini, indiferent de vârsta mamei, deoarece riscul de recurenţă al afecţiunii este de aproximativ 1%.

În cazul în care în fratrie există mai multe cazuri de sindrom Down prin trisomie omogenă, estimarea riscului de recurenţă se face empiric, valoarea acestuia fiind de 10-20%, fiind posibilă prezenţa la unul dintre părinţi a unui mozaic germinal.

În cazurile de sindrom Down prin trisomie 21 în mozaic, riscul de recurenţă a afecţiunii este nesemnificativ, deoarece anomalia este rezultatul unui accident mitotic în primele etape ale dezvoltării embrionare, puţin probabil a se repeta.

Prezenţa unui caz de sindrom Down prin translocaţie Robertsoniană impune obligatoriu efectuarea analizei cromosomice la ambii părinţi. În cazul în care translocaţia este de novo, ambii părinţi având cariotip normal, riscul de recurenţă a bolii este mai mic de 1%.

Sfatul genetic

231

Dacă unul dintre părinţi prezintă o translocaţie Robertsoniană echilibrată riscul de recurenţă depinde de doi factori: sexul purtătorului de translocaţie şi tipul translocaţiei. În cazul în care translocaţia este prezentă la bărbat, riscul de recurenţă este mai mic de 1%, deoarece prezenţa anomaliei cromosomice induce o dereglare a formării veziculei sexuale, ceea ce cauzează blocarea meiozei masculine cu hipofertilitate sau chiar sterilitate.

În cazul în care translocaţia este prezentă la femeie, riscul de recurenţă depinde de tipul anomaliei. În translocaţiile Robertsoniene între cromosomi acrocentrici neomologi, riscul de naştere al unui nou copil cu sindrom Down este de 10%, iar probabilitatea detecţiei trisomiei 21 prin amniocenteză este de 15%. În schimb, în cazul prezenţei unei translocaţii Robertsoniene (21;21) riscul de recurenţă este total de 100%.

În cazul celorlalte aneuploidii viabile (trisomiile 13, 18, X, XXY, XYY şi monosomia X) riscul de recurenţă este mai mic de 1%. În aceste cazuri, este indicată efectuarea analizei cromosomice prenatale mai mult din motive psihologice.

În cazul prezenţei în antecedente a unei sarcini cu făt poliploid asociat cu molă hidatiformă, riscul de recurenţă al anomaliei este de 1-1,5%, dar creşte la 20% dacă au existat mai mult de 2 sarcini anormale.

b. SFATUL GENETIC ÎN ANOMALII CROMOSOMICE STRUCTURALE ECHILIBRATE

În translocaţiile reciproce echilibrate riscul purtătorului de a avea un descendent cu o anomalie cromosomică structurală neechilibrată (asociere între trisomia parţială a unuia dintre cromosomii implicaţi şi monosomia parţială a celuilalt cromosom) este de circa 5-10%, dependent de tipul anomaliei şi sexul purtătorului.

Riscul de transmitere a anomaliei este mic la bărbaţii purtători de translocaţie, deoarece deseori aceştia sunt sterili, fiind blocată gametogeneza. De regulă, meioza feminină nu este afectată de existenţa unor translocaţii, astfel că prin malsegregarea cromosomilor derivativi rezultă zigoţi anormali, neviabili, care vor fi avortaţi.

Calcularea riscului în translocaţiile echilibrate impune considerarea următorilor factori: istoricul familial, modelul de segregare, sexul purtătorului translocaţiei şi nivelul aneuploidiei determinate de malsegregare.

Majoritatea aneuploidiilor viabile (96%) conţin monosomii parţiale mai mici de 2% din materialul genetic al unui set haploid de cromosomi sau trisomii parţiale mai mici de 4% din materialul genetic al unui set haploid de cromosomi.

Produşii de concepţie cu anomalii cromosomice intens dezechilibrate sunt avortaţi. Riscul unui purtător de translocaţie ca sarcina să se încheie prin avort spontan este mai mare decât în populaţia generală, fiind de aproximativ 20-30%.

O situaţie particulară apare în cazul existenţei unor translocaţii ce implică cromosomul X. În aceste situaţii, fertilitatea este deseori afectată la heterozigoţii şi hemizigoţii cu translocaţie X-autosom. În cazul femeilor fertile, purtătoare de translocaţii X-autosom, riscul de a avea un copil anormal este de 20-40%.

În cazul translocaţiilor Robertsoniene echilibrate, riscul depinde de sexul purtătorului anomaliei şi de tipul anomaliei. De regulă, bărbaţii au un risc mai mic de 1%, deoarece sunt sterili. Femeile au un risc de 1-10%, dependent de tipul anomaliei, riscul fiind mai mare când în translocaţie sunt implicaţi cromosomii 21 sau 13, a căror trisomie este uneori viabilă. Un caz special există în translocaţiile Robertsoniene între cromosomi omologi, când riscul de apariţie a unui copil afectat este de 100%

Inserţiile reprezintă rearanjamentele cromosomice cu cel mai mare risc de copii anormali. Riscul global în inserţiile intracromosomice este de 15%. Dependent de tipul inserţiei riscul poate varia între 50 şi 0%.

Sfatul genetic

232

Riscul unui purtător de inserţie de a avea un copil anormal depinde, în special, de dimensiunea fragmentului inserat şi de conţinutul genic al acestuia. Inserţiile mari se asociază cu recombinări intracromosomice, ce conduc la produşi de concepţie cu dezechilibre genetice, care vor fi avortaţi. În cazul inserţiilor mici, prin recombinare intracromosomică rezultă produşi de concepţie cu trisomie parţială viabili, riscul de recurenţă al anomaliei fiind de 10-20%.

Riscul de recurenţă la descendenţii purtătorilor de inversii pericentrice depinde de: tipul inversiei, cromosomii implicaţi, lungimea fragmentelor interesate, sexul purtătorului de translocaţie. Riscul general al unui pacient cu o inversie pericentrică de a avea un descendent cu anomalie cromosomică neechilibrată datorită recombinării intracromosomice este de circa 5-10%.

Purtătorii de inversii paracentrice nu au descendenţi cu anomalii cromosomice structurale neechilibrate, deoarece prin crossing-over la nivelul buclei de inversie rezultă gameţi cu cromosomi acentrici sau dicentrici.

Sfatul genetic în bolile cromosomice depinde de tipul anomaliei, sexul pacientului, gradul de afectare a reproducerii, segregarea meiotică a cromosomilor şi viabilitatea produşilor de concepţie;

În sindromul Down prin trisomie liberă omogenă riscul de recurenţă creşte exponenţial cu vârsta maternă, fiind nesemnificativ înainte de 30 ani;

În trisomia 21 prin mozaic şi în cele prin translocaţii Robertsoniene de novo riscul de recurenţă a afecţiunii este mai mic de 0,1%;

În cazul translocaţiilor Robertsoniene între cromosomul 21 şi un alt cromosom prezente la unul dintre părinţi, riscul de recurenţă este: <1% dacă anomalia este la tată şi 10-12% dacă este prezentă la mamă;

În translocaţiile Robertsoniene între cromosomi 21 riscul de recurenţă este de 100%;

În cazul celorlalte aneuploidii riscul de recurenţă este mai mic de 1%; În translocaţii reciproce echilibrate riscul de recurenţă este de 5-10%; În inversiile pericentrice riscul de recurenţă este de 5-10%, în timp ce în inversiile paracentrice riscul este cvasinul;

În inserţii există un risc important care variază între 0 şi 50%, dependent de tipul anomaliei.

2. RISCUL GENETIC ÎN BOLI MONOGENICE

În bolile monogenice, calcularea riscului de recurenţă este în principiu o problemă uşoară, când se cunosc genotipurile persoanelor consultate. Dacă genotipurile nu sunt cunoscute trebuie aplicate legile probabilităţii şi teorema Bayes (aproximare bayesiană).

a. CALCULUL PROBABILISTIC ÎN BOLILE MONOGENICE

Legea adunării

Această lege se aplică atunci când două evenimente se exclud reciproc. Legea susţine că probabilitatea de apariţie a unuia din cele 2 evenimente, indiferent care, este egală cu suma celor două probabilităţi (relaţia 12.1.).

21 ppp relaţia 12.1.

De exemplu, în cazul unui cuplu heterozigot pentru o boală recesiv autosomală, probabilitatea cuplului de a avea un copil sănătos (NN sau Na) este 3/4, fiind egală cu suma

Sfatul genetic

233

probabilităţilor de a avea un copil sănătos homozigot (1/4) respectiv heterozigot (1/2).

N a N NN Na a Na aa

PCS = PNN + PNa = 1/4 + 1/2 = 1/4 + 2/4 = 3/4

Legea multiplicării

Legea multiplicării se aplică în condiţiile în care 2 sau mai multe evenimente se produc independent unul de celălalt. Legea susţine că probabilitatea de producere concomitentă a două sau mai multe evenimente independente este egală cu produsul probabilităţilor celor două evenimente (relaţia 12.2.):

21 ppp relaţia 12.2.

De exemplu într-o boală recesiv autosomală, probabilitatea unui cuplu sănătos, neînrudit, care provine din familii în care nu există cazuri de boală, de a avea un copil bolnav este egală cu produsul a trei probabilităţi: probabilitatea mamei de a fi heterozigotă, Na; probabilitatea tatălui de a fi heterozigot, Na; probabilitatea unui cuplu heterozigot de a avea un copil bolnav (relaţia 12.3.).

2224

122 qqppqpqPPPP CTMB relaţia 12.3.

unde: PB - probabilitatea copilului de a fi afectat, PM - probabilitatea mamei de a fi heterozigotă, PT - probabilitatea tatălui de a fi heterozigot, PC - probabilitatea unui cuplu heterozigot de a avea un copil afectat, 2pq - frecvenţa heterozigoţilor în populaţie, q2 - frecvenţa bolii în populaţie (vezi capitolul Genetica populaţiilor).

Teorema Bayes

Teorema Bayes permite calcularea probabilităţii apariţiei unui eveniment luând în considerare o serie de informaţii care pot modifica probabilităţile diverselor evenimente componente. În cadrul teoremei sunt luate în calcul patru categorii de probabilităţi: probabilitatea iniţială ("anterioară") a unui eveniment; probabilitatea condiţională reprezintă probabilitatea modificată ("posterioară") a

evenimentului luat în calcul; probabilitatea combinată reprezintă produsul înmulţirii dintre probabilitatea iniţială şi

probabilitatea condiţională a fiecărui eveniment considerat; probabilitatea relativă reprezintă raportul dintre probabilitatea conjugată a unui eveniment şi

suma tuturor probabilităţilor conjugate ale tuturor posibilităţilor De exemplu, dacă notăm cu P(a) probabilitatea iniţială de apariţie a unui eveniment,

cu P(na) probabilitatea iniţială ca acel eveniment să nu apară, cu P(c) probabilitatea condiţională ca un alt eveniment să fie asociat cu evenimentul luat în discuţie şi cu P(nc) probabilitatea condiţională ca un al doilea eveniment să nu fie asociat cu evenimentul luat în discuţie, atunci probabilitatea relativă de apariţie a evenimentului luat în discuţie, asociat cu cel de-al doilea eveniment este dată de relaţia 12.4.:

ncnaca

car PPPP

PPP

relaţia 12.4.

Un exemplu, care arată că în practică lucrurile nu sunt la fel de complicate este următorul. O femeie (III2) a cărui frate (III3) şi unchi matern (II3) sunt afectaţi de distrofie

PNN = 1/4; PNa = 1/2

Sfatul genetic

234

musculară Duchenne, doreşte să afle riscul de a avea un băiat bolnav (IV4) în condiţiile în care are deja trei băieţi sănătoşi (IV1, 2, 3) (figura 12.3.). I 1 2 II 1 2 3 III 1 2 3 IV 1 2 3 4

Figura 12.3. Arborele genealogic al unei familii în care există cazuri de distrofie musculară Duchenne

În această situaţie, dacă facem abstracţie de cei trei băieţi sănătoşi ai consultantei, riscul ei de a avea un băiat bolnav ar fi de 1/4, deoarece probabilitatea femeii de a fi heterozigotă este de 1/2, iar probabilitatea ei de a transmite gena anormală la băieţi este de asemenea 1/2 (relaţia 12.5.).

4

1

2

1

2

1424

YXIVXXIIIBIV aaN PPP relaţia 12.5.

Aplicând teorema Bayes găsim următoarele probabilităţi: probabilitatea iniţială a femeii III2 de a fi heterozigotă XNXa este de 1/2 (Pa), identică cu cea

de a fi homozigotă sănătoasă XNXN (Pna); ţinând cont că femeia are trei copii sănătoşi, al căror risc de a fi afectaţi a fost pentru fiecare

de 1/2, probabilitatea condiţională a femeii de a fi heterozigotă (Pc) este obţinută prin înmulţirea celor trei probabilităţi, fiind de 1/8 (1/2 x 1/2 x 1/2);

în acelaşi timp, probabilitatea condiţională ca femeia să fie nepurtătoare a genei anormale (Pnc), ţinând cont de prezenţa celor trei băieţi sănătoşi, este de 1 (1 x 1 x 1);

probabilitatea conjugată a băiatului IV4 de a fi afectat va fi de 1/16 (1/2 x 1/8), în timp ce probabilitatea conjugată a aceluiaşi individ de a fi neafectat este de 1/2 (1/2 x 1).

În aceste condiţii, probabilităţile relative a femeii de a fi heterozigotă, respectiv nepurtătoare a genei anormale sunt date de relaţiile 12.6. şi 12.7.:

9

1

16

916

1

16

8

16

116

1

2

1

16

116

1

12

1

8

1

2

18

1

2

1

ncnaca

caXrX PPPP

PPP aN relaţia 12.6.

9

8

16

92

1

16

8

16

12

1

2

1

16

12

1

12

1

8

1

2

1

12

1

ncnaca

ncnaXrX PPPP

PPP NN

relaţia 12.7. Ţinând cont de aceste probabilităţi relative, rezultă că riscul copilului IV.4. de a fi

afectat este 1/2 x 1/9 = 1/18, mult mai mic decât cel de 1/4 obţinut fără a ţine cont de datele suplimentare furnizate de analiza arborelui genealogic.

S

Sfatul genetic

235

În concluzie, teorema Bayes constituie o metodă de calcul a probabilităţilor ţinînd cont de probabilitatea tuturor evenimentelor posibile. Pentru aceasta este nevoie a se ţine cont de următoarele observaţii: trebuie luate în considerare toate posibilităţile relevante; probabilitatea iniţială a fiecărei posibilităţi se calculează pe baza unor informaţii

"anterioare"; probabilitatea condiţională se bazează pe o serie de informaţii care fac posibilitatea iniţială

mai mult sau mai puţin probabilă pentru fiecare eventualitate probabilitatea condiţională este calculată comparativ cu

probabilităţile condiţionale ale celorlalte evenimente, astfel încât să fie posibilă calcularea unei probabilităţi relative pentru fiecare eveniment luat în calcul;

toate informaţiile relevante trebuie utilizate o singură dată;

b. Sfatul genetic în boli dominante

Boli dominante fără manifestări variabile

Calcularea riscului de recurenţă al afecţiunii în boli dominante este uşor de calculat în condiţiile în care boala are penetranţă completă şi este lipsită de expresivitate variabilă.

În aceste condiţii riscul este următorul: doi părinţi bolnavi heterozigoţi (An) au un risc de 3/4 de a avea un descendent afectat

A n A AA An n An nn

un cuplu în care un părinte este bolnav heterozigot (An) iar celălalt sănătos are un risc de 1/2 de a avea un descendent afectat

A n n An nn n An nn

doi părinţi sănătoşi (nn) au un risc 0 de a avea un descendent afectat44 n n

n nn nn n nn nn

Boli dominante cu penentranţă incompletă

În numeroase boli dominante a fost observat fenomenul de penetranţă incompletă, caracterizat prin absenţa manifestărilor clinice la o parte dintre heterozigoţi. Penetranţa, notată P, reprezintă raportul dintre numărul de indivizi afectaţi de o boală dominantă şi numărul de indivizi purtători ai genei anormale (AA + An) înmulţit cu 100 (relaţia 12.8.).

100P

AnAA

B relaţia 12.8.

Pentru bolile cu penetranţă incompletă, la calcularea riscului de recurenţă a afecţiunii trebuie să se ţină cont şi de valoarea P. De exemplu, pentru otoscleroză P are valoarea de 50%, în timp ce în cazul retinoblastomului valoarea lui P este de 80-90%.

În cazul unei persoane afectate heterozigotă (I1) căsătorită cu o femeie sănătoasă (I2), riscul de a avea un copil afectat (II1) va fi dat de produsul 1/2 x P (figura 12.4.).

44 riscul real este egal cu rata mutaţiei genei respective în populaţia generală, dar de obicei acest risc este insignifiant

PB = 3/4; PS = 1/4

PB = 1/2; PS = 1/2

PB = 0; PS = 1

Sfatul genetic

236

I 1 2

II 1

Figura 12.4. Arborele genealogic al unei familii cu o boală dominant autosomală

În condiţiile în care un individ sănătos are un părinte afectat de o boală dominant autosomală cu penetranţă incompletă şi doreşte să afle riscul copiilor săi de a fi afectaţi, trebuie aplicată teorema Bayes (figura 12.5., tabelul 12.5.).

I 1 2

II 1

III 1

Figura 12.5. Arbore genealogic al unei familii în care există o boală dominantă cu penetranţă incompletă

Tabelul 12.5. Calcularea probabilităţilor pentru individul II.1 din figura 12.5.

Probabilitate II.1. heterozigot II.1. neheterozigot iniţială 1/2 1/2 condiţională - clinic normal 1P 1 combinată 1/2 (1P) 1/2

Pe baza datelor din tabelul 12.5., rezultă următoarele: probabilitatea individului II.1 de a fi heterozigot este (1P)/(2P) (relaţia 12.9.)

P2

P1

2

1P1

2

1

P12

1

.1.

AnIIp relaţia 12.9.

probabilitatea individului III.1. de a fi afectat poate fi determinată calculând produsul următoarelor probabilităţi: probabilitatea relativă a individului II.1 de a fi heterozigot ori penetranţa P ori probabilitatea individului III.1 de a moşteni oricare din genele unuia dintre părinţi (relaţia 12.10.)

2P4

p-pP

2

1

P2

P1P

2

1

2

1P1

2

1

P12

12

.1.

BIIIp relaţia 12.10.

probabilitatea individului III.1. de a fi heterozigot poate fi determinată calculând produsul următoarelor probabilităţi: probabilitatea relativă a individului II.1 de a fi heterozigot ori probabilitatea individului III.1 de a moşteni oricare din genele unuia dintre părinţi (relaţia 12.11.)

S

S

Sfatul genetic

237

2P4

p-1

2

1

P2

P1

2

1

2

1P1

2

1

P12

1

.1.

AnIIIp relaţia 12.11.

Folosind formulele de mai sus se poate construi tabelul 12.6. în care sunt prezentate probabilităţile copiilor unui individ afectat de o boală dominant autosomală cu penetranţă incompletă de a fi heterozigoţi şi a nepoţilor acestui individ de a fi heterozigoţi, respectiv afectaţi, dependent de valoarea penetranţei

Tabelul 12.6. Probabilitatea descendenţilor unui individ afectat cu o boală dominant autosomală cu penetranţă incompletă de a fi heterozigoţi, respectiv afectaţi, dependent

de valoarea penetranţei

Penetranţă Probabilitatea copiilor de a fi

heterozigoţi 1-P/2-P

Probabilitatea nepoţilor de a fi

heterozigoţi (1-P/2-P)x1/2

Probabilitatea nepoţilor de a fi bolnavi

P-P2/4-2P

0,1 0,474 0,237 0,024 0,2 0,444 0,222 0,044 0,3 0,412 0,206 0,062 0,4 0,375 0,188 0,075 0,5 0,333 0,167 0,083 0,6 0,286 0,143 0,086 0,7 0,231 0,116 0,080 0,8 0,167 0,084 0,066 0,9 0,091 0,046 0,041

Pe baza datelor din tabelul de mai sus se poate observa că riscul nepotului unui individ, afectat de o boală dominant autosomală cu penetranţă incompletă, de a fi de asemenea bolnav, în condiţiile în care tatăl (mama) este clinic sănătos, nu depăşeşte valoarea de 0,086 ≈ 1/12.

Expresivitatea variabilă

O mare parte dintre maladiile dominant autosomale se caracterizează prin expresivitate variabilă, persoanele bolnave din familii diferite sau chiar din aceeaşi familie având un grad diferit de afectare. În aceste condiţii, persoanele mediu afectate îşi pun problema care este riscul descendenţilor lor de a avea o formă gravă de afectare. Acest risc poate fi uşor de calculat în condiţiile în care incidenţa în populaţie a formei severe de afectare este cunoscută. În această situaţie, se aplică următoarea formulă (relaţia 12.12.):

%)incidenta(2

1p relaţia 12.12.

În tabelul 12.7. sunt prezentate incidenţa celor mai frecvente complicaţii în unele boli dominant autosomale, cu expresivitate variabilă.

Tabelul 12.7. Principalele complicaţii ale unor boli dominant autosomale, cu expresivitate variabilă

Boala Complicaţia Incidenţă (%)

Sfatul genetic

238

Distrofia musculară facio-scapulo-humerală

Afectare severă la vârsta de 40 ani 20

Neuropatia senzorială şi motorie ereditară tip I

dificultăţi majore de mers înainte de 40 de ani

5-10

Exostoze multiple sarcoame 3 Neurofibromatoza tip I tumori maligne

educare în şcoli speciale 3 10

Osteogenesis imperfecta tip I surditate necesitatea unui scaun pe rotile

40 3

Retinoblastom osteosarcom 6 Scleroza tuberoasă epilepsie

retard mental 60 40

Sindrom Waardenburg tip I tip II

surditate 25 50

Boli dominant autosomale cu anticipaţie

Într-o serie de afecţiuni dominant autosomale a fost evidenţiat fenomenul de anticipaţie, caracterizat prin debutul mai precoce şi existenţa de forme de boală mai grave la descendenţii unei persoane afectate. Majoritatea acestor afecţiuni sunt determinate de mutaţii dinamice, caracterizate prin amplificarea unor repetiţii trinucleotidice în cursul meiozei indivizilor afectaţi, astfel încât descendenţii lor moştenesc un număr sporit de repetiţii.

Calcularea riscului în astfel de afecţiuni se poate realiza doar în mod empiric, deoarece la momentul actual nu există nici o metodă concretă de apreciere a riscului.

De exemplu, în boala Huntington, determinată de amplificarea unei secvenţe CAG, au fost stabilite, pe baza datelor epidemiologice, următoarele corelaţii: 40 trinucleotide - vârstă de debut 56 ani; 45 trinucleotide - vârstă de debut 37 de ani; 50 trinucleotide - vârstă de debut 26 ani, dar totuşi nu se pot face estimări exacte.

c. Sfatul genetic în bolile recesiv autosomale

În general, calcularea riscului de recurenţă şi acordarea sfatului genetic într-o afecţiune cu transmitere recesiv autosomală este relativ uşor de acordat.

Există o serie de situaţii particulare pe care le vom discuta în continuare.

Doi părinţi sănătoşi au un copil afectat

În cazul unui astfel de cuplu, calcularea riscului este deosebit de facilă. În condiţiile în care copilul afectat al acestui cuplu este homozigot aa, cei doi părinţi sunt obligatoriu heterozigoţi Na. Astfel, riscul lor de a avea un nou copil afectat este de 1/4 (figura 12.6., tabelul 12.8.).

Tabelul 12.8. Modalităţile de asociere ale gameţilor la doi indivizi heterozigoţi

N a N NN Na a Na aa

1 2

I

Sfatul genetic

239

II 1 2

Figura 12.6. Arborele genealogic al unei familii în care există un caz de boală recesiv autosomală

De asemenea, luând în considerare aceeaşi familie, pe baza tabelului 12.8. se poate calcula şi probabilitatea fiecărui descendent sănătos al cuplului din figura 12.6. de a fi hetrozigot Na. Această probabilitate este de 2/3.

O situaţie frecventă în afecţiunele recesiv autosomale este cea a căsătoriei a doi indivizi sănătoşi, unul provenind dintr-o familie afectată, iar celălalt din populaţia generală.

Condiţia obligatorie ca doi indivizi sănătoşi să aibă un copil afectat de o boală recesiv autosomală este ca ambii membri ai cuplului să fie heterozigoţi. Astfel, pentru ambii membri trebuie calculată probabilitatea de a fi heterozigoţi. Pentru individul care provine din populaţia generală, probabilitatea de a fi heterozigot este de 2pq ≈ 2q, unde p este frecvenţa genei normale în populaţia generală, iar q este frecvenţa genei anormale (recesivă) în populaţia generală (vezi capitolul Genetica populaţiilor). În cazul persoanei care provine din familia în care există cazuri de boală, calcularea probabilităţii de a fi heterozigotă depinde de gradul de înrudire cu individul afectat (figura 12.7., tabelul 12.9.).

I ½ ½ ½ ½ II ½ 1 1 ½ III ¼ 2/3 ¼

IV 1/8 1 1/3 1/8

Figura 12.7. Probabilitatea de a fi heterozigot a membrilor unei familii în care există un caz de boală recesiv autosomală

Tabelul 12.9. Probabilitatea de a fi heterozigot Na a rudelor unui individ bolnav aa

Relaţie Na Părinţi, copii 1 Frate - soră 2/3 Bunici, unchi, mătuşi, nepoţi de la copii 1/2 Nepoţi de la frate sau soră 1/3 Verişori primari 1/4 Copiii verişorilor primari 1/8

În aceste condiţii calcularea riscului de recurenţă al bolii se poate face simplist folosind produsul probabilităţilor din relaţia 12.3. De exemplu, dacă luăm în considerare un cuplu în care fratele soţului (II.1) este afectat de fenilcetonurie, iar soţia (II.3) provine din populaţia generală, frecvenţa bolii în populaţia caucaziană fiind de 1/10.000, riscul copilului (III.1) unui astfel de cuplu de a fi afectat este de 1/300 (relaţia 12.13., figura 12.8.). Pe de altă parte riscul unui individ bolnav de a avea un copil afectat se calculează conform relaţiei 12.14. (figura 12.9.).

Sfatul genetic

240

300

1

4

1

3

2

50

1PPPP

50

1

100

2

100

122q2pq

100

1

10000

1q

10000

1q

cptmc

2

relaţia 12.13.

Na Na I 1 2

II 1 2 3 aa 2/3 Na 1/50 Na

III 1

1/300 aa

Figura 12.8. Calcularea riscului unui individ care are un frate afectat de o boală recesiv autosomală de a avea un copil bolnav

200

1

4

11

50

1PPPP

50

1

100

2

100

122q2pq

100

1

10000

1q

10000

1q

cptmc

2

relaţia 12.14.

Na Na I 1 2 II 1 2 3 Na aa 1/50 Na

III 1 1/200 aa

Figura 12.9. Riscul unei persoane afectate de o boală recesiv autosomală de a avea un copil afectat

În cazul bolilor recesiv autosomale o altă situaţie care creşte riscul de recurenţă a bolii este cea a consanguinităţii. În cazul cuplurilor consanguine, cei doi membri ai cuplului posedă o serie de alele identice, moştenite de la un strămoş comun. În cazul în care unele din aceste gene sunt mutante, având transmitere recesiv autosomală, membrii cuplului consanguin au o probabilitate crescută de a transmite fiecare gena mutantă la descendenţi care vor fi homozigoţi aa, afectaţi.

De exemplu, în cazul căsătoriei între doi veri primari, care au avut un bunic afectat de o boală recesiv autosomală, riscul de recurenţă al bolii la descendenţi este de 1/16 (figura 12.10.).

În cazul căsătoriei între doi veri de gradul II, unul dintre ei având un frate afectat de o boală recesiv autosomală, riscul de recurenţă al afecţiunii la descendenţi este de 1/96 (figura 12.11.)

aa I 1 2

Sfatul genetic

241

Na Na II 1 2 3

½ Na ½ Na ½ Na III 1 2 3

1/16 aa IV 1

Figura 12.10. Riscul unui cuplu format din doi veri primari de a avea un copil bolnav în condiţiile în care bunica comună a fost afectată

I 1 2

½ Na ¼ Na II 1 2

Na Na 1/8 Na III 1 2 3

aa 2/3 Na 1/16 Na IV 1 2 3

1/96 aa V 1

Figura 12.11. Riscul unui cuplu format din doi veri primari de a avea un copil bolnav în condiţiile în care unul dintre ei are un frate afectat

O situaţie posibilă, deşi destul de rară, este aceea în care un cuplu de părinţi sănătoşi (I.1, I.2) au doi copii afectaţi, fiecare având o altă boală recesiv autosomală. În aceste condiţii, fiecare dintre cei doi părinţi sunt dublu heterozigoţi (Na1, Na2) iar cei doi copii au genotipurile a1a1 (II.1) respectiv a2a2 (II.2.). Dacă cei doi loci sunt neînlănţuiţi, probabilitatea următorilor descendenţi de a fi afectaţi de una din cele două maladii este de ¼ (tabelul 12.10.) iar cea de a fi sănătoşi de ¾. Probabilitatea următorilor copii de a fi dublu afectaţi se obţine prin înmulţirea celor două riscuri ¼ x ¼ = 1/16. În acelaşi timp, probabilitatea copiilor de a nu prezenta nici una dintre afecţiuni este de ¾ x ¾ = 9/16. Probabilitatea copiilor de a fi afectaţi de una dintre boli şi să nu prezinte semnele clinice ale celeilalte boli este de ¼ x ¾ = 3/16 (figura 12.12., tabelul 12.10.).

I 1 2

II 1 2 3

a1a1 a2a2

Figura 12.12. Arborele genealogic al unei familii în care există doi copii afectaţi de boli recesiv autosomale diferite

După cum se poate observa riscul global al unui astfel de cuplu este de 7/16 (43%) care este mai mare decât riscul separat al fiecărei boli de ¼ (25%).

Tabelul 12.10. Probabilitatea individului II.3. din figura 12.12. de a avea una din cele două boli ale fraţilor săi, de a avea ambele boli concomitent şi de a fi sănătos

Sfatul genetic

242

Boala 1 Boala 2 Probabilitate combinată Afectat Afectat Sănătos Sănătos

Afectat Sănătos Afectat Sănătos

¼ x ¼ = 1/16 ¼ x ¾ = 3/16 ¾ x ¼ = 3/16 ¾ x ¾ = 9/16

d. Boli recesive cu transmitere legată de cromosomul X

În bolile recesive cu transmitere legată de cromosomul X există două situaţii speciale legate de acordarea sfatului genetic: există un singur caz de boală în familie există mai multe cazuri de boală în familie.

În ambele situaţii calcularea riscului de recurenţă se face pe baza teoremei Bayes. În situaţia în care există un singur caz de boală în familie, riscul de recurenţă este

diferenţiat dacă boala este consecinţa unei mutaţii germinale, produsă la mama pacientului sau mama este purtătoare a genei mutante (figura 12.13.).

Calcularea probabilităţii unei femei de a fi heterozigotă XNXa se face în raport cu rata mutaţiei, notată μ. Probabilitatea ca o femeie să fie heterozigotă (pf) reprezintă suma a trei probabilităţi: probabilitatea ei de a moşteni gena anormală de la mama heterozigotă (pm), probabilitatea apariţiei unei mutaţii germinale la mamă (mm) şi probabilitatea apariţiei unei mutaţii germinale la tată (mt) (relaţia12.15.). I 1 2 II 1 2

Figura 12.13. Arborele genealogic al unei familii în care există un singur caz de boală cu transmitere recesivă legată de cromosomul X

p p m mf m m p

12

relaţia 12.15.

În condiţiile în care rata mutaţiei este identică la cel două sexe, fiind reprezentată de μ şi se presupune că rata mutaţiei nu se modifică de la o generaţia la alta, probabilitatea femeii de a fi heterozigotă este 4μ (relaţia 12.16.)

p12 p p

p2 p

p2

p2 pf f f

ff

f ff

2 2 2 4

relaţia 12.16. Aplicând teorema Bayes pentru o astfel de femeie putem afla probabilitatea ei de a fi

heterozigotă respectiv nepurtătoare a mutaţiei (tabelul 12.11.) Pe baza teoremei Bayes, se poate calcula probabilitatea diferitelor femei din arborele

genealogic din figura 12.14. de a fi heterozigote. O a doua situaţie particulară unei boli cu transmitere recesivă legată de cromosomul X

este aceea în care în familie există mai multe cazuri de boală şi o femeie sigur purtătoare a mutaţiei, doreşte să afle riscul fetelor sale de a fi heterozigote (figura 12.15.).

Tabelul 12.11. Calcularea probabilităţii unei femei de fi heterozigotă pentru o mutaţie recesivă legată de cromosomul X folosind teorema Bayes

Sfatul genetic

243

Ipoteza I Femeie purtătoare

Ipoteza II Femeie nepurtătoare

Probabilitate iniţială 4 μ 1 - 4μ ≈ 1 Probabilitate condiţională 1/2 μ Probabilitate combinată 4μ x ½ = 2μ 1 x μ = μ Probabilitate relativă

3

2

2

2

3

1

2

I 1 1/3

II 1 2 2/3 1/6

III 1 2 3 4 1/3 1/12 1/12

IV 1

1/6

Figura 12.14. Arborele genealogic al unei familii în care există un singur caz de boală cu transmitere recesivă legată de cromosomul X şi probabilităţile rudelor de sex

feminin ale bolnavului de a fi heterozigote

XaY XNXa

I 1 2 1 2

XNXa XNXa XaY XaY II 1 2 3 1 2 3 4

III 1 2 3 4 5 1 2 3 4

a b

Figura 12.15. Arborii geanealogici ai unor famili în care există mai multe cazuri de boală cu transmitere recesivă legată de cromosomul X

Examinând figura 12.15.a, se observă că probabilitatea femeii III.4. de a fi heterozigotă, ştiind că mama ei este cert heterozigotă, este de ½.

Pentru arborele genealogic din figura 12.15.b, fără a aplica teorema Bayes, se observă că persoana III.4. are o probabilitate de a fi heterozigotă de ¼, ştiind că bunica sa maternă este cert heterozigotă.

Aplicând teorema Bayes obţinem tabelul 12.12., în condiţiile în care luăm în considerare faptul că femeia II.2. are trei băieţi sănătoşi. Dacă femeia II.2. este heterozigotă, la orice sarcină cu făt de sex masculin ea are un risc de ½ de a avea un băiat bolnav. Ţinând cont de informaţia suplimentară că femeia II.2. are trei băieţi sănătoşi, obţinem o probabilitate condiţională de ½ x ½ x ½ = 1/8.

Sfatul genetic

244

Se observă clar că prin aplicare teoremei Bayes probabilitatea femeii II.2. de a fi purtătoare este de 1/9 (≈11%), iar cea a fiicei sale de 1/9 x ½ = 1/18 (≈5,5%), mult mai mică decât cea de ¼ (25%) obţinută făcând abstracţie de faptul că mama sa a născut 3 băieţi sănătoşi.

Tabelul 12.12. Calcularea probabilităţii femeii III.4 din figura 12.15.b de fi heterozigotă pentru o mutaţie recesivă legată de cromosomul X folosind teorema Bayes

Ipoteza I Femeia II.2. purtătoare

Ipoteza II Femeie II.2. nepurtătoare

Probabilitate primară 1/2 1/2 Probabilitate condiţională (1/2)3=1/8 1 Probabilitate conjugată 1/2 x 1/8 = 1/16 1/2 x 1 = 1/2 Probabilitate posterioară

9

1

16/9

16/1

2/116/1

16/1

9

8

16/9

2/1

2/116/1

2/1

Calcularea riscului de recurenţă în bolile monogenice se face ţinând cont de legile lui Mendel, folosind calculul probabilistic şi teorema Bayes;

În bolile dominant autosomale, lipsite de manifestări variabile, riscul a doi părinţi afectaţi (de obicei heterozigoţi An) de a avea un copil bolnav este de 75%, riscul unui cuplu în care un părinte este afectat este de 50%, iar riscul unui cuplu de părinţi sănătoşi (nn) este 0;

În bolile dominant autosomale cu penetranţă incompletă riscul trebuie multiplicat cu indicele p, dar indiferent de valoarea acestuia nepotul unui individ afectat de a fi el însuşi bolnav este mai mic de 1/12;

În bolile dominant autosomale cu expresivitate variabilă riscul copilului unei persoane afectate de a face o formă severă de boală este egal cu produsul dintre riscul obţinut pe baza legilor Mendel şi valoarea incidenţei în populaţie a formelor grave de afecţiune;

În bolile dominant autosomale cu anticipaţie, majoritatea produse de mutaţii dinamice, riscul este calculat empiric, vârsta de debut a afecţiunii fiind cu atât mai mică cu cât mutaţia este prezentă în familie de mai multe generaţii;

În bolile recesiv autosomale riscul unui cuplu care are un copil bolnav de a avea un alt descendent afectat este de 25%, iar probabilitatea copiilor sănătoşi de a fi purtători ai mutaţiei este de 2/3;

În bolile recesiv autosomale riscul este amplificat în cazul unei căsătorii consanguine, dar acest risc devine nesemnificativ în condiţiile în care gradul de înrudire este mai mare de III;

În bolile recesive cu transmitere legată de cromosomul X calcularea probabilităţii unei femei de a fi heterozigotă se face conform teoremei Bayes;

În astfel de boli, dacă există doar un singur caz de boală, este posibil ca acesta să fie consecinţa unei mutaţii germinale (maternă sau paternă) probabilitatea mamei de a fi heterozigotă este de 2/3, iar a fetelor acestora este de 1/3;

În cazul în care există în familie mai multe cazuri de boală riscul depinde pe de o parte de gradul de rudenie între femeia care solicită sfatul genetic şi persoanele afectate, iar pe de altă parte de numărul de băieţi sănătoşi prezenţi în descendenţa acesteia

3. RISCUL GENETIC ÎN BOLI MULTIFACTORIALE

Sfatul genetic

245

În cazul bolilor multifactoriale, în determinismul afecţiunii intervin pe de o parte factori genetici, iar pe de altă parte factori de mediu.

Factorii genetici implicaţi sunt reprezentaţi de mai multe perechi de gene, care au o acţiune redusă, dar aditivă. În plus, în majoritatea bolilor poligenice mecanismul patogenic nu este complet descifrat şi necesită studii moleculare aprofundate. În aceste condiţii, singura posibilitate de calculare a riscului de recurenţă al afecţiunii se bazează pe date empirice, rezultate din studii populaţionale, efectuate pe loturi mari de pacienţi. Bineînţeles, că în unele familii riscul calculat va fi supra sau subestimat în raport cu riscul empiric.

Pentru acordarea sfatului genetic în bolile multifactoriale trebuie respectate o serie de principii generale: Riscul de recurenţă la rudele de gradul I este mult mare decât la alte persoane din familie; Riscul empiric, folosit pentru determinarea riscului în familia căreia i se acordă sfatul

genetic, reprezintă o medie a riscului pentru boala respectivă în populaţia din care face parte familia şi astfel acest risc este posibil să nu fie identic cu cel real;

Riscul de recurenţă al afecţiunii este crescut în următoarele situaţii: Prezenţa în familie a mai mult de un caz de boală; Prezenţa unei forme severe de boală; Debutul bolii s-a produs mai precoce; Există în familie persoane afectate de un anumit sex la care boala respectivă în mod

normal este mai puţin frecventă; Există căsătorii consanguine;

În condiţiile folosirii unei metode de calcul empirice trebuie evitate o serie de greşeli, care pot supraestima riscul real: În condiţiile în care un individ care are un copil cu o anomalie congenitală se căsătoreşte

cu o altă persoană, copiii din cea de-a doua căsătorie sunt în raport cu copilul afectat rude de gradul II şi nu rude de gradul I şi astfel, riscul lor de a prezenta aceeaşi afecţiune este de aproximativ 1% şi nu 5%;

Când o persoană neafectată, care este unchiul sau mătuşa unui copil care prezintă o boală multifactorială, se interesează de riscul descendenţilor săi de a prezenta aceeaşi afecţiuni, trebuie luat în considerare faptul că descendenţii persoanei care solicită sfat genetic sunt în raport cu bolnavul rude de gradul III şi nu rude de gradul II, ceea ce semnifică că riscul este mult diminuat

De exemplu, în cazul calculării riscului pentru un defect de tub neural (anencefalie, spina bifida, mielomeningocel) se cunoaşte că incidenţa unei astfel de anomalii în populaţia caucaziană este de aproximativ 0,3%.

În condiţiile în care un cuplu are deja un copil cu o astfel de afecţiune, riscul său la următoarele sarcini va fi 4% şi nu 0,3%. În plus, în condiţiile în care sexul copilului afectat este feminin, iar următoarea sarcină este de asemenea cu făt de sex feminin riscul de recurenţă ajunge la 6%.

Comparativ cu riscul din populaţia generală riscul din această familie se menţine ridicat până la nivel de rude de gradul II (tabelul 12.13.).

Totuşi, chiar şi în aceste condiţii, riscul de recurenţă al afecţiunii poate fi redus prin suplimentarea dietei gravidei cu acid folic, care stimulează închiderea tubului neural.

O situaţie similară se întâlneşte şi în cazul despicăturii labio-palatine (tabelul 12.13.)

Tabelul 12.13. Riscul de recurenţă (exprimat în procente) pentru despicătura labio-palatină şi defecte de tub neural

Rude afectate Despicătură Defect de tub

Sfatul genetic

246

labio-palatină neural Nici un alt caz de boală în fratrie Ambii părinţi indemni Un părinte afectat Ambii părinţi afectaţi

0,1 3

34

0,3 4,5 30

Un caz de boală în fratrie Ambii părinţi indemni Un părinte afectat Ambii părinţi afectaţi

3

11 40

4

12 38

Două cazuri de boală în fratrie Ambii părinţi indemni Un părinte afectat Ambii părinţi afectaţi

8

19 45

10 20 43

Un caz de boală în fratrie şi unul la o rudă de gradul II Ambii părinţi indemni Un părinte afectat Ambii părinţi afectaţi

6

16 43

7

18 42

Un caz de boală în fratrie şi unul la o rudă de gradul III Ambii părinţi indemni Un părinte afectat Ambii părinţi afectaţi

4

14 44

5,5 16 42

În bolile multifactoriale riscul de recurenţă al afecţiunii se poate calcula doar empiric, deoarece nu se cunosc toţi factorii etiologici, iar pe de altă parte nu este cunoscută ponderea acestora în determinismul bolii;

Riscul reprezintă o medie a riscului pentru boala respectivă în populaţia generală;

Riscul de recurenţă la rudele de gradul I este mult mare decât la alte persoane din familie;

Riscul de recurenţă al afecţiunii este crescut când în familie există mai multe cazuri de boală, există forme severe de boală, debutul bolii s-a produs mai precoce, persoana afectată aparţine sexului la care boala respectivă este mai puţin frecventă, există căsătorii consanguine;

4. CATEGORII DE RISC GENETIC

Pe baza datelor prezentate în paragrafele precedente, riscurile de recurenţă în bolile genetice pot fi clasificate în 5 categorii: Risc total – 100% - apare în următoarele situaţii:

Un cuplu format din doi părinţi afectaţi de o boală recesiv autosomală are toţi copii homozigoţi afectaţi

+ , aa aa aa aa

Unul dintre membrii cuplului este homozigot pentru o mutaţie dominant autosomală cu penetranţă completă– toţi copiii vor fi heterozigoţi afectaţi;

+ , AA nn An An

Sfatul genetic

247

Unul dintre membrii cuplului, de obicei soţia, este purtătoare a unei translocaţii Robertsoniene echilibrate între doi cromosomi omologi (13 sau 21) – toţi copiii vor prezenta sindrom Patau, respectiv Down;

+ , 46,XY 45,XX,-21,-21+rob(21q;21q) 46,XY(XX)-21,+rob(21q;21q) Risc foarte mare – 50-75%;

Ambii soţi sunt heterozigoţi pentru o mutaţie dominant autosomală cu penentranţă completă – risc 75% - copiii afectaţi fiind homozigoţi sau heterozigoţi

+ , + ,

An An AA, An nn 25% 50% 25%

Ambii soţi sunt heterozigoţi pentru o mutaţie dominant autosomală cu penentranţă incompletă – risc cuprins în intervalul 50-75%, dependent de gradul de penetranţă al mutaţiei, boala fiind prezentă la toţi descendenţii homozigoţi şi la o parte dintre heterozigoţi

+ , + ,

An An AA, An An, nn 25% 25%

Ambii soţi afectaţi, soţia fiind heterozigotă pentru o mutaţie dominantă cu transmitere legată de cromosomul X – risc 75% - toate fetele şi jumătate dintre băieţi fiind afectaţi

+ + + XAY XAXn XAY, XAXA, XAXn XnY 25% 25% 25% 25%

Unul dintre soţi afectat, iar celălalt heterozigot pentru o mutaţie recesiv autosomală – risc 50% - jumătate dintre copii vor fi homozigoţii aa

+ , + , aa Na aa Na 50% 50%

Soţul afectat şi soţia heterozigotă pentru o mutaţie cu transmitere recesivă legată de cromosomul X – risc 50% - jumătate dintre fete şi jumătate dintre băieţi vor fi afectaţi

+ , + , XaY XNXa XaY XaXa XNY XNXa

25% 25% 25% 25% Unul dintre membrii cuplului este heterozigot afectat de o boală cu transmitere

dominant autosomală cu penetranţă completă – risc 50% - jumătate dintre copii vor fi purtători ai mutaţiei

+ , + ,

An nn An nn 50% 50%

Tatăl bolnav şi mama sănătoasă în cazul unei boli cu transmitere dominantă legată de cromosomul X – risc 50% - toate fetele vor fi afectate

+ + XAY XnXn XAXn XnY 50% 50%

Sfatul genetic

248

Risc mare – 25-50%; Unul dintre membrii cuplului este heterozigot afectat de o boală cu transmitere dominant

autosomală cu penetranţă incompletă – risc 25-50%,

+ , + ,

An nn An An + nn 50%

Mama purtătoare a unei translocaţii reciproce echilibrate între cromosomul X şi un autosom – risc 20-40% - copiii prezentând fenotip de sindrom Klinefelter, sindrom triplo X sau de disomie uniparentală parţială a cromosomului X

Ambii părinţi sunt sănătoşi, dar heterozigoţi pentru o mutaţie cu transmitere recesiv autosomală – risc 25% - copiii afectaţi fiind atât fete, cât şi băieţi

+ , + ,

Na Na aa NN, Na 25% 25% 50%

Ambii părinţi sunt sănătoşi, dar mama este heterozigotă pentru o mutaţie cu transmitere recesivă legată de cromosomul X – risc 25% - toate fetele vor fi sănătoase, în timp ce jumăttate dintre băieţi vor fi afectaţi

+ + +

XNY XNXa XaY XNY XNXN, XNXa

25% 25% 25% 25% Ambii părinţi afectaţi de o boală multifactorială – risc 30-40%, dependent de tipul

afecţiunii şi de prezenţa altor cazuri de boală în familie Risc moderat – 10-25%;

Prezenţa în acceaşi familie a mai mult de două cazuri de sindrom Down prin trisomie 21 liberă omogenă – risc 10-20%

Unul dintre soţi este purtător al unei inserţii echilibrate – risc mediu 10-20% Unul dintre soţi este afectat de o boală multifactorială, iar în familie mai există încă cel

puţin două cazuri de boală – risc mediu 10-20% Risc mic – 3-10%

Unul dintre soţi este purtător al unei translocaţii autosomale reciproce echilibrate – risc mediu 5-10%

Unul dintre soţi este purtător al unei inversii pericentrice – risc mediu 5-10% Unul dintre soţi este purtător al unei translocaţii Robertsoniene echilibrată ce implică

cromosomul 21– copiii acestui cuplu au un risc de aproximativ 10% de a avea sindrom Down

Cuplul consultant este indemn şi există cel mult două cazuri de boală multifactorială în familie – risc 3-10%, dependent de tipul afecţiunii şi gradul de rudenie în raport cu persoanele bolnave


A. CAZ CLINIC 1 – BOALĂ DOMINANT AUTOSOMALĂ

Sfatul genetic

249

La consult genetic este trimis, de către medicul de familie, un cuplu de tineri sănătoşi, care doresc să afle riscul lor de a avea un copil afectat, în condiţiile în care în familia soţului există cazuri de infarcte miocardice survenite în a patra deacadă de viaţă. Ancheta familială efectuată în urma consultului genetic a furnizat informaţiile sistematizate în arborele genealogic din figura 12.16.

I 1 2 3 4 5 6 7 8 II 1 2 3 4 5 6 7 8 III 1,2 3-5 6 7 8-10 11 12 13 14 15 16

IV

1-2 3 4 5 6

Figura 12.16. Arborele genealogic al familiei C.

Cei doi tineri, Ioana şi Vasile C., constituie un cuplu neînrudit şi au amândoi vârsta de 27 de ani. Până la momentul actual, deşi sunt căsătoriţi de 2 ani de zile, Ioana nu a avut nici o sarcină în condiţiile în care au fost utilizate metode contraceptive.

Părinţii Ioanei sunt amândoi sănătoşi, iar bunicii acesteia, atât cei materni, cât şi cei paterni au murit de cauze naturale.

Ioana are un frate (23 de ani) şi o soră (19 ani) mai mici, amândoi sănătoşi, necăsătoriţi. Tatăl lui Vasile, Gheorghe, în vârstă de 55 de ani, este pensionat pe caz de boală, deoarece a prezentat

în antecedente 2 infarcte miocardice, survenite la vârsta de 39 şi, respectiv, 47 de ani. Situaţia lui este staţionară în condiţiile în care evită stressul şi eforturile prelungite.

Mama lui Vasile, Ştefania este sănătoasă, la fel ca şi părinţii acesteia, iar în familia Ştefaniei nu au existat cazuri de infarct miocardic sau moarte subită.

Tatăl lui Gheorghe a decedat subit la vârsta de 43 de ani, fără a exista o analiză anatomo-patologică, în timp ce mama lui, Anastasia, în vîrstă de 87 de ani este indemnă

Gheorghe face parte dintr-o fratrie de 5 persoane, el fiind cel mai mic: Cel mai mare din fratrie, Ion, este în vârstă de 70 de ani, nu a prezentat nici un semn de afectare

cardiacă şi are cinci copii (doi băieţi şi trei fete) sănătoşi; A doua în fratrie, Ecaterina, a decedat la vârsta de 46 de ani prin accident vascular cerebral. Ea

are o fată, Viorica – în vârstă de 37 de ani, aparent sănătoasă, care are doi băieţi sănătoşi – şi un băiat, Grigore, care a prezentat un infarct miocardic în urmă cu două săptămâni, la vârsta de 36 de ani; acesta nu este căsătorit şi nu are copii;

Al treilea din fratrie, Mihai, a murit subit la 41 de ani, iar examenul anatomo-patologic a relevat zone întinse de ateroscleroză la nivelul arterelor coronariene, cerebrale şi renale. Acesta a fost căsătorit şi are trei fete toate sănătoase;

A patra în fratrie, Ilinca, a murit la 6 ani, cauza decesului fiind febra tifoidă Vasile are doi fraţi mai mari:

Panait, sănătos, în vârstă de 33 de ani, căsătorit, care are două fete sănătoase; Aurel, sănătos, în vârstă de 29 de ani, aparent sănătos, căsătorit, care are un băiat şi o fată

sănătoşi. Pe baza datelor din arborele genealogic de mai sus poate fi stabilit tipul de transmitere al

afecţiunii: dominant autosomal. Pe baza datelor clinice şi anatomo-patologice (infarcte miocardice,

3

2

2 3

Sfatul genetic

250

morţi subite, ateroscleroză întinsă) se poate suspiciona prezenţa în familia analizată a hipercolesterolemiei familiale45.

Dozările de laborator efectuate au relevat niveluri crescute ale colesterolului seric la toate persoanele afectate din familia C (II.5 şi III.7). În plus, nivelul colesterolului a fost de 450 mg% (normal 150-280 mg%) la persoana III.6. În schimb, dozările efectuate la cuplul consultant au relevat niveluri normale ale colesterolului seric.

În condiţiile date, riscul cuplului consultant este simplu de calculat. Deoarece ambii soţi au un nivel normal al colesterolului, ei au un genotip normal nn, iar riscul copiilor lor de a fi afectaţi de hipercolesterolemie familială este aproape 0.46

În schimb, mătuşa consultantului, III.6., are un risc crescut - 50% - de a transmite gena mutantă la descendenţi.

B. CAZ CLINIC 2 – BOALĂ RECESIV AUTOSOMALĂ La consult genetic se prezintă un cuplu tânăr, F. Maria şi F. Dan, deoarece vor să afle riscul

lor de a avea un copil afectat. În familia celor doi există rude afectate de mucoviscidoză. Ancheta familială efectuată de medicul genetician a relevat următoarele aspecte, sistematizate în arborele genealogic din figura 12.17.

I 1 2

II 1 2

1 2 3 4 III

IV 1 2 3 4 5 6 V 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 12.17. Arborele genealogic al familiei F.

Cuplul consultant este consanguin, fiind veri de gradul II, bunicul matern al consultantului şi bunica paternă a consultantei fiind fraţi;

Cuplul consultant are doi copii sănătoşi (un băiat şi o fată) iar consultanta este însărcinată, fără a fi cunoscut sexul viitorului copil;

Părinţii consultanţilor sunt sănătoşi;

45 Boala este una din cele mai frecvente maladii monogenice în populaţia caucaziană şi are o incidenţă de aproximativ 1/500 de persoane, majoritatea indivizilor afectaţi având un genotip An. Boala este considerată o afecţiune moleculară, deoarece se cunosc atât gena mutantă, cât şi proteina anormală codificată de aceasta, precum şi mecanismul patogenic al maladiei. Gena mutantă este gena care codifică receptorul pentru LDL (Low Density Lypoprotein) iar efectul mutaţiei poate varia de la absenţa receptorului, până la sinteza unui receptor nefuncţional. În absenţa recptorului sau în prezenţa unui receptor anormal lipoproteinele nu mai pot descărca lipidele transportate şi, în special, colesterolul, a cărui concentraţie serică va fi aproape dublă în raport cu cea a persoanelor normale. Colesterolul aflat în exces se va depune pe pereţii vasculari, determinând apariţia plăcilor ateromatoase. Dezvoltarea ateroamelor produce două efecte: rigidizarea peretelui vascular şi îngustarea lumenului vascular, principalele teritorii afectate fiind: cordul, creierul şi rinichii. Efectul final este o hipoirigare a celor trei organe, ceea ce determină infarcte şi moarte subită. Boala poate fi diagnosticată înainte de apariţia complicaţiilor letale prin determinarea nivelului colesterolului seric. 46 Riscul cuplului este egal cu frecvenţa mutaţiilor de novo în populaţia caucaziană

Sfatul genetic

251

Dan are un frate mai mare, Grigore, care prezintă semne clinice de mucoviscidoză47 (infecţii respiratorii repetate, asociate cu o secreţie bronşică vâscoasă, respectiv diverse episoade de tulburări ale digestiei intestinale şi crize de diskinezie biliară) afecţiune probată paraclinic prin nivelul crescut al concentraţiei clorurii de sodiu în sudoare;

Fratele consultantului este căsătorit cu o persoană sănătoasă, ce provine din populaţia generală, cei doi având un băiat şi o fată, ambii sănătoşi, iar momentan soţia lui Grigore este însărcinată (sarcină în vârstă de 12 săptămâni, sex necunoscut);

Maria are un frate mai mic, Vasile, sănătos, care este căsătorit cu o femeie sănătoasă provenită din populaţia generală; cei doi au un băiat sănătos şi o fată afectată, iar momentan femeia este însărcinată, sarcină în vârstă de 8 săptămâni, sex necunoscut;

În familie, probabil a mai existat un al treilea caz de boală la străbunicul comun al consultanţilor, decedat în urma unui episod de bronhopneumonie acută, survenit pe un fond de infecţii respiratorii repetate

Analiza arborelui genealogic de mai sus a permis geneticianului identificarea tipului de transmitere al bolii: recesiv autosomal, aspect concordant cu tipul de transmitere al mucoviscidozei.

În cazul acestei familii este necesară acordarea sfatului genetic la cele trei cupluri din generaţia IV: În cazul cuplului consultant, pe baza analizei arborelui genealogic, putem stabili următoarele aspecte:

Probabilitatea persoanei IV.3 (Dan) de a fi heterozigotă Na este de 2/3 în condiţiile în care acesta are un frate afectat (aa) şi ambii părinţii sunt cert heterozigoţi (vezi tabelul 12.8.);

Probabilitatea persoanei IV.4. (Maria) de a fi heterozigotă Na este de 1/2 în condiţiile în care fratele ei este cert heterozigot, având un copil bolnav;

În condiţiile în care facem abstracţie de prezenţa în descendenţa cuplului consultant a celor doi copii sănătoşi, riscul Mariei de a avea un copil afectat este dat de relaţia 12.17.

p p p pc m t cp 12

23

14

224

112

relaţia 12.17.

În schimb, dacă luăm în considerare prezenţa celor doi copii sănătoşi şi aplicăm teorema Bayes, obţinem următoarele tabele (tabelele 12.14. şi 12.15.)

Ţinând cont de teorema Bayes riscul cuplului IV.3 – IV.4. de a avea un copil bolnav este dată de relaţia 12.18.

p p p pc m t cp 15

817

14

8340

185

relaţia 12.18.

Tabelul 12.14. Determinarea probabilităţii femeii IV.4. de a fi heterozigotă folosind teorema Bayes

Femeia IV.4. purtătoare Femeia IV.4. nepurtătoare Probabilitate iniţială 1/2 1/2 Probabilitate condiţională (1/2)2=1/4 1 Probabilitate combinată 1/2 x 1/4 = 1/8 1/2 x 1 = 1/2

47 Mucoviscidoza este o afecţiune monogenică cu transmitere recesiv autosomală, determinată de mutaţia genei CFTR, localizată 7q31. Gena codifică un canal transmembranar de clor. Prezenţa mutaţiei în stare homozigotă sau dublu heterozigotă modifică legarea ATP-ului la canalul de clor, determinând imposibilitatea recuperării clorului din lumenul glandelor exocrine. Prezenţa unui nivel crescut de clor la acest nivel antrenează secundar trecerea în lumenul glandular al unei cantităţi echimolare de ioni de sodiu. Mecanismele prin care excesul de clorură de sodiu determină aspectele fenotipice ale bolii nu sunt complet elucidate. Din punct de vedere clinic, maladia se caracterizează prin: infecţii respiratorii recurente pe fondul existenţei unei secreţii bronşice permanent îngroşate, prezenţa unei maldigestii şi malabsorbţii intestinale cronice pe fondul unui deficit funcţional al pancreasului exocrin şi al secreţiei biliare şi prin prezenţa la majoritatea bărbaţilor a unei sterilităţi, induse de absenţa congenitală a ducturilor deferente. Diagnosticul paraclinic este certificat de identificarea unui nivelcrescut de cloruruă de sodiu în transpiraţie (testul sudorii)

Sfatul genetic

252

Probabilitate posterioară

5

1

8/5

8/1

2/18/1

8/1

5

4

8/5

2/1

2/18/1

2/1

Tabelul 12.15. Determinarea probabilităţii bărbatului IV.3. de a fi heterozigot folosind teorema Bayes

Bărbatul IV.3. purtător Bărbatul IV.3. nepurtător Probabilitate iniţială 2/3 1/3 Probabilitate condiţională (2/3)2=4/9 1 Probabilitate combinată 2/3 x 4/9 = 8/27 1/3 x 1 = 1/3 Probabilitate posterioară

17

8

27/17

27/8

3/127/8

27/8

17

9

27/17

27/9

3/127/8

3/1

Din datele prezentat mai sus, se observă că riscul cuplului de a avea un copil afectat conform teoremei Bayes este de aproximativ 7 ori mai redus decât cel obţinut făcând abstracţie de prezenţa celor doi copii sănătoşi.

În cazul cuplului IV.1. – IV.2. pe baza analizei arborelui genealogic obţinem următoarele date: Persoana IV.1. are cert genotipul aa, deoarece este afectat; Persoana IV.2. care provine din populaţia generală are o probabilitate de 1/25 de a fi

heterozigotă Na, cunoscând că incidenţa mucoviscidozei în populaţia caucaziană este de aproximativ 1/2500 de nou-născuţi

În condiţiile în care facem abstracţie de prezenţa în descendenţa cuplului analizat a celor doi copii sănătoşi, riscul soţiei lui Grigore de a avea un copil afectat este dat de relaţia 12.19.

p p p pc m t cp 125 1

14

1100

relaţia 12.19.

În schimb, dacă luăm în considerare prezenţa celor doi copii sănătoşi şi aplicăm teorema Bayes, obţinem tabelul 12.16.

Tabelul 12.16. Determinarea probabilităţii femeii IV.2. de a fi heterozigotă folosind teorema Bayes

Femeia IV.2. purtătoare Femeia IV.2. nepurtătoare Probabilitate iniţială 1/25 24/25 Probabilitate condiţională (1/25)2=1/625 1 Probabilitate combinată 1/25 x 1/625 = 1/15625 24/25 x 1 = 24/25 Probabilitate posterioară

15001

1

15625/15001

15625/125/2415625/1

15625/1

15001

15000

15625/15001

25/2425/2415625/1

25/24

Din datele de mai sus se poate observa că aplicând teorema Bayes riscul cuplului analizat devine practic zero.

În cazul cuplului IV.5. – IV.6. pe baza analizei arborelui genealogic obţinem următoarele date: Persoana IV.1. are cert genotipul Na, deoarece are un copil afectat; Persoana IV.2. are cert genotipul Na, deoarece are un copil afectat În acest caz, riscul soţiei lui Vasile de a avea un copil afectat este dat de relaţia 12.20.


14

relaţia 12.20.

C. CAZ CLINIC 3 – BOALĂ RECESIVĂ CU TRANSMITERE LAGATĂ DE CROMOSOMUL X

Sfatul genetic

253

La consult genetic se prezintă un cuplu tânăr, G. Paula şi G. Dumitru, deoarece vor să afle riscul lor de a avea un copil afectat. În familia celor doi există rude afectate de distrofie musculară Duchenne. Ancheta familială efectuată de medicul genetician a relevat următoarele aspecte, sistematizate în arborele genealogic din figura 12.18.

I 1 2

II 1 2 III 1 2 3 4

IV 1 2 3 4 5 6

V 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 12.18. Arborele genealogic al familiei F.

Cuplul consultant este consanguin, fiind veri de gradul II, bunicul matern al consultantului şi bunica maternă a consultantei fiind fraţi;

Cuplul consultant are doi copii sănătoşi (un băiat şi o fată) iar momentan consultanta este însărcinată, vârsta sarcinii fiind de 10 săptămâni, fără a fi cunoscut sexul viitorului copil;

Părinţii consultanţilor sunt sănătoşi; Dumitru are un frate mai mare sănătos, Sergiu, care are un băiat care prezintă semne clinice de distrofie

Duchenne48 (deficit funcţional progresiv la nivelul musculaturii membrelor, cu progresie dinspre periferie spre centurile scapulară şi pelvină) afecţiune probată paraclinic prin observarea unui nivel foarte crescut al creatininei serice şi prin imposibilitatea detecţiei distrofinei în ţesutul muscular;

Sergiu mai are o fată sănătoasă şi este căsătorit cu o femeie sănătoasă neînrudită, care momentan este însărcinată (sarcină în vârstă de 12 săptămâni, sex necunoscut);

Paula are un frate mai mic, Ion, afectat, care este căsătorit cu o femeie sănătoasă provenită din populaţia generală; cei doi au un băiat sănătos şi o fată afectată, iar momentan femeia este însărcinată, sarcină în vârstă de 8 săptămâni, sex necunoscut;

În familie, probabil a mai existat un al treilea caz de boală la străbunicul comun al consultanţilor, decedat la vârsta de 25 de ani prin insuficienţă respiratorie acută, după ce ultimii 3 ani de viaţă i-a petrecut imobilizat în pat.

Analiza arborelui genealogic de mai sus a permis geneticianului identificarea tipului de transmitere al bolii: recesiv cu transmitere legată de cromosomul X, aspect concordant cu tipul de transmitere al distrofiei Duchenne.

În cazul acestei familii este necesară acordarea sfatului genetic la cuplurile din generaţia IV: În cazul cuplului consultant, pe baza analizei arborelui genealogic, putem stabili următoarele aspecte:

48 Distrofia musculară Duchenne este o afecţiune recesivă cu transmitere legată de cromosomul X şi o incidenţă de 1/4.500 nou-născuţi băieţi. Boala este determinată de deleţia genei distrofinei (localizată Xp21) care induce absenţa sintezei distrofinei, ceea ce conduce la: leziuni membranare ale fibrei musculare şi anomalii ale joncţiunii sinaptice, fibrele musculare fiind înlocuite cu ţesut conjunctiv. Diagnosticul clinic se bazează pe: apariţia de slăbiciune musculară la nivelul membrelor inferioare, asociată cu probleme de mers (urcatul scărilor) şi greutăţi la ridicatul de pe scaun, începând cu vârsta de 3 ani, urmată de o paralizie a membrelor inferioare începând cu vârsta de 10 –12 ani şi deces la 20-25 de ani prin insuficienţă respiratorie sau cardiacă. Diagnosticul paraclinic se bazează pe identificarea unui nivel crescut de 50-100 de ori al creatininei serice, absenţa distrofinei în muşchi şi identificarea mutaţiei prin tehnici de analiză a ADN-ului.

Sfatul genetic

254

Probabilitatea persoanei IV.3 (Dumitru) de a fi purtător al mutaţiei (XaY) este zero, deoarece bărbatul este sănătos;

Probabilitatea persoanei IV.4. (Paula) de a fi heterozigotă XNXa este de 1/2 în condiţiile în care mama ei este cert heterozigotă, având un băiat bolnav;

În condiţiile în care facem abstracţie de prezenţa în descendenţa cuplului consultant a celor doi copii sănătoşi, riscul Mariei de a avea un copil afectat este dat de relaţia 12.21.


14

18

relaţia 12.21.

În schimb, dacă luăm în considerare prezenţa băiatului sănătos (V.4.) şi aplicăm teorema Bayes, obţinem tabelul 12.17.

Tabelul 12.17. Determinarea probabilităţii femeii IV.4. de a fi heterozigotă

Femeia IV.4. purtătoare Femeia IV.4. nepurtătoare Probabilitate iniţială 1/2 1/2 Probabilitate condiţională (1/2)1=1/2 1 Probabilitate combinată 1/2 x 1/2 = 1/4 1/2 x 1 = 1/2 Probabilitate posterioară

3

1

4/3

4/1

2/14/1

4/1

3

2

4/3

2/1

2/14/1

2/1

Ţinând cont de teorema Bayes riscul cuplului IV.3 – IV.4. de a avea un copil bolnav este dată de relaţia 12.22.


14

112

relaţia 12.22.

Din datele prezentat mai sus, se observă că riscul cuplului de a avea un copil afectat conform teoremie Bayes este de 1,5 ori mai redus decât cel obţinut făcând abstracţie de prezenţa băiatului sănătos.

În cazul cuplului IV.1. – IV.2. pe baza analizei arborelui genealogic obţinem următoarele date: Persoana IV.1. are cert genotipul XNY, deoarece este sănătos; Persoana IV.2. are cert genotipul XNXa, deoarece are un băiat afectat (V.1.); Astfel, riscul lui Sergiu de a avea un copil afectat este dat de relaţia 12.23.


14

relaţia 12.23.

În cazul cuplului IV.5. – IV.6. pe baza analizei arborelui genealogic obţinem următoarele date: Persoana IV.1. are cert genotipul XaY, deoarece este afectat; Persoana IV.2. care provine din populaţia generală şi este sănătoasă are o probabilitate de

1/2250 de a fi heterozigotă, deoarece boala afectează 1/4500 băieţi; În acest caz, riscul soţiei lui Vasile de a avea un copil afectat este dat de relaţia 12.24.

p p p pc m t cp 1

2250 112

14500

relaţia 12.24.

Din relaţia 12.24. se poate observa că riscul femeii IV.6. de a avea un copil bolnav este egal cu incidenţa bolii în populaţia generală.

D. CAZ CLINIC 4 – SINDROM DOWN La consult genetic se prezintă o femeie însărcinată, în vârstă de 38 de ani, care doreşte să afle

riscul sarcinii actuale de a se finaliza prin naşterea unui copil afectat de sindrom Down. Consultanta are doi băieţi sănătoşi şi nu există alte cazuri de sindrom Down, nici în familia ei şi nici în familia soţului.

În condiţiile date, riscul femeii de a avea un copil afectat de sindrom Down este egal cu cel al incidenţei bolii la copiii femeilor în vârstă de 38 de ani. Examinând tabelul 12.4. se poate observa că riscul acestei femei este de 1/170 (5,98‰).

Dacă în schimb, unul dintre cei doi copii ai femeii ar fi avut sindrom Down, datele problemei s-ar fi schimbat, calcularea riscului fiind dependentă de rezultatul cariotipului la copilul afectat:

Sfatul genetic

255

Dacă cariotipul identificat la băiatul afectat a fost 47,XY,+21, riscul femeii de a avea un al doilea copil afectat este de aproximativ 1%, femeia având o predispoziţie pentru o nedisjuncţie meiotică, care se accentuează odată cu înaintarea în vârstă;

Dacă cariotipul copilului afectat a fost 46,XY/47,XY,+21, riscul femeii de a avea un alt copil afectat este egal cu cel al oricărei femei în vârstă de 38 de ani, deoarece anomalia existentă la băiatul bolnav este consecinţa unui accident postzogotic;

Dacă cariotipul copilului afectat a fost 46,XY,-14,+rob(21q;14q) riscul femeii de avea un al doilea copil afectat este de aproximativ 10%;

În oricare din cazurile prezentate mai sus ar trebui aplicate cel puţin una din metodele de screening sau diagnostic prenatal: triplul test, ecografia fetală, amniocenteză sau puncţia vilozităţilor coriale, urmată de analiza cromosomilor din celulele cultivate in vitro (vezi capitolul Screening-ul şi diagnosticul prenatal al bolilor genetice).


A. DEFINIŢI URMĂTORII TERMENI Sfat genetic Risc de recurenţă Legea multiplicării Legea adunării Teorema Bayes Probabilitatea iniţială Probabilitate condiţională Probabilitate combinată Probabilitate relativă

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Care sunt etapele acordării sfatului genetic? 2. Care sunt circumstanţele premaritale în care se acordă sfatul genetic? 3. Care sunt circumstanţele postmaritale în care se acordă sfatul genetic? 4. Care sunt principalele afecţiuni pentru care se solicită acordarea sfatului genetic? 5. Pe baza căror investigaţii poate fi stabilită ponderea componentei genetice a unei afecţiuni? 6. Care sunt condiţiile necesare în momentul comunicării către familie a rezultatelor sfatului genetic? 7. Care sun aşa-numitele “adevăruri false” referitoare la bolile ereditare? 8. Care sunt opţiunile reproductive ale cuplului care a solicitat sfat genetic? 9. Cine hotărăşte opţiune a reproductivă: geneticianul sau cuplul consultant? Care este rolul

geneticianului în acest caz? 10. În cazul sindromului Down prin trisomie liberă omogenă riscul depinde de vârsta maternă sau de

cea paternă? 11. În cazul prezenţei în descendeţă a unui copil cu sindrom Down prin trisomie 21 în mozaic care

este riscul de recurenţă al afecţiunii? Dar dacă copilul a prezentat o translocaţie Robertsoniană 21/14? Dar în condiţiile unei translocaţii Robertsoniene 21/21?

12. Care tip de inversii prezintă un risc semnificativ de descendenţi afectaţi? Care sunt factorii care influenţează acest risc?

13. Care este riscul unui purtător de translocaţie reciprocă echilibrată de a avea un copil afectat? Care sunt factorii care influenţează acest risc?

14. Care este riscul unui purtător de inserţie de a avea un copil afectat? Care sunt factorii care influenţează acest risc?

15. În bolile dominant autosomale care este riscul unei persoane afectate de a avea un copil de asemenea bolnav? Dar care este riscul unui cuplu în care ambii soţi sunt afectaţi?

16. În cazul unei boli recesiv autosomale, care este riscul unui cuplu care are un copil afectat de a avea un al doilea copil bolnav? Care este probabilitatea acestui cuplu de a avea un copil heterozigot, dacă sarcina se termină prin naşterea unui copil sănătos?

17. Care este riscul unei persoane, a cărei soră este afectată de o boală recesiv autosomală, de avea un copil bolnav, dacă se căsătoreşte cu vărul său primar? Dar dacă se căsătoreşte cu o persoană din populaţia generală, cunoscând că frecvenţa bolii în populaţia caucaziană este de 1/6400 nou-născuţi?

Sfatul genetic

256

18. Care este riscul unei femei, al cărei frate are o boală recesivă cu transmitere legată de cromosomul X, de a avea un copil bolnav? Care este riscul femeii, ştiind că are deja patru băieţi sănătoşi?

19. Cum se calculează riscul de recurenţă în bolile multifactoriale? 20. Care sunt factorii care cresc riscul de recurenţă al unei afecţiuni multifactoriale?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1. Care este riscul unui purtător de translocaţie Robertsoniană între cromosomii 21 de a avea un copil bolnav cu sindrom Down ? A. 0% B. 25% C. 50% D. 75% E.100 % 2. Care dintre următoarele anomalii cromosomice structurale echilibrate nu se asociază cu naşterea unor descendenţi purtători ai unei anomalii cromosomice neechilibrate ? A. Translocaţii reciproce echilibrate B. Translocaţii Robertsoniene C. Inversii paracentrice D. Inversii pericentrice E. Inserţii 3. Care este riscul unei femei tinere, care a născut cu un copil cu sindrom cu Down prin trisomie 21 în mozaic, de a avea un al doilea copil afectat ? A. 10% B. 20% C. 30% D. 100% E. aproape 0% 4. Care este riscul unui bolnav de neurofibromatoză tip I (boală dominant autosomală) a cărui mamă şi soţie sunt sănătoase, de a avea un descendent afectat ? A. 0% B. 25% C. 50% D. 75% E.100% 5. Care este riscul unui cuplu de indivizi heterozigoţi, afectaţi de hipercolesterolemie familială (boală dominant autosomală), de a avea un copil bolnav ? A. 0% B. 25% C. 50% D. 75% E.100% 6. Care este riscul unei persoane afectate de osteogenesis imperfecta tip I (boală dominant autosomală) de a avea un copil care să fie surd, în condiţiile în care frecvenţa acestei complicaţii este de 40%, iar soţia sa este indemnă ? A. 0% B. 10% C. 20% D. 30% E.60% 7. Care este probabilitatea copilului sănătos, al unui cuplu de indivizi heterozigoţi pentru o boală recesiv autosomală, de a fi de asemenea heterozigot ? A. 0% B. 1/2 C. 1/3 D. 2/3 E.100% 8. Care este probabilitatea unui cuplu de veri primari sănătoşi, a căror bunică comună a fost afectată de albinism (boală recesiv autosomală) de a avea un copil afectat ? A. 0% B. 1/2 C. 1/8 D. 1/16 E.100% 9. Care este probabilitatea unei femei, a cărui tată a prezentat hemofilie A (boală recesivă cu transmitere recesivă legată de cromosomul X) de a avea un copil afectat, ştiind că ecografia fetală a relevat că viitorul copil va fi băiat ? A. 0% B. 1/2 C. 1/8 D. 1/16 E.100% 10. Care dintre următoarele situaţii nu se asociază cu creşterea riscului de apariţie a unui copil afectat de o boală multifactorială ? A.În familie există 4 cazuri de boală B. Cuplul parental este consanguin C. Debutul bolii s-a produs tardiv în raport cu vârsta obişnuită de apariţie a bolii D. Persoanele bolnave aparţin sexului mai puţin afectat E. În familie există cazuri grave de boală II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"):

A, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B, dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3 C, dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4 D, dacă este corect răspunsul 4 E, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4

11. Care dintre următoarele atribuţii aparţin medicului genetician în cursul acordării sfatului genetic ?

1. stabilirea exactă a diagnosticului afecţiunii;

Sfatul genetic

257

2. stabilirea ponderii factorilor genetici în determinisimul maladiei; 3. determinarea riscului de recurenţă al bolii la alţi membri ai familiei; 4. să decidă opţiunea reproductivă în cazul familiilor în care riscul este mare

12. Care din următoarele trisomii pot fi observate la nou-născuţii afectaţi ai unui purtător de translocaţie Robertsoniană echilibrată ? 1. trisomie 14; 2. trisomie 21; 3. trisomie 22; 4. trisomie 13 13. În cazul căror anomalii cromosomice structurale echilibrate femeia purtătoare are un risc de 10% de a avea un copil afectat:

1. translocaţie Robertsoniană între cromosomi neomologi 2. translocaţie Robertsoniană între cromosomi 21 3. translocaţie reciprocă echilibrată între doi autosomi 4. inversie paracentrică

14. Care dintre următoarele cupluri au un risc de 50% de a avea un copil afectat: 1. un părinte este afectat de neurofibromatoză, iar celălalt este sănătos; 2. ambii soţi au un părinte afectat de albinism 3. un părinte este afectat de mucoviscidoză, iar în cazul celuilalt membru al familiei mama a

prezentat aceeaşi afecţiuni 4. femeia însărcinată are tatăl afectat de hemofilie B, iar sexul viitorului copil este masculin

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A: dacă cele două propoziţii sunt adevărate şi între ele există o relaţie tip cauză-efect B: dacă cele două propoziţii sunt adevărate dar nu există o relaţie tip cauză-efect C: dacă prima propoziţie este adevărată şi a doua este falsă D: dacă prima propoziţie este falsă şi a doua este adevărată E: dacă ambele propoziţii sunt false

15. Sfatul genetic este acordat exclusiv postmarital, deoarece numai în această situaţie cei doi membri ai cuplului devin interesaţi de viitorul descendenţilor lor 16. Sfatul genetic nu este util în diverse forme de cancer cu debut precoce, deoarece etiologia proceselor neoplazice nu este complet elucidată 17. Riscul de apariţie al unui copil cu sindrom Down prin trisomie 21 liberă omogenă depinde atât de vîrsta mamei, cât şi de vârsta tatălui în momentul concepţiei, deoarece separarea cromosomilor în meioză este un proces independent de factorii exogeni 18. Purtătorii de inversii pericentrice nu au nici un risc de a avea copii bolnavi, deoarece segregarea cromosomilor în meioză se produce normal IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, răspunsurile din coloana din dreapta, notate cu litere. 19. Asociaţi cuplurile parentale din coloana din stânga cu riscurile de recurenţă aferente la descendenţi

1. Mama este purtătoare de translocaţie Robertsoniană echilibrată între cromosomi 21 0% 2. Ambii părinţi sunt heterozigoţi, fiind afectaţi de hipercolesterolemie familială 25% 3. Soţul este afectat de hemofilie A, aceeaşi afecţiune fiind prezentă la tatăl soţiei 50% 4. Ambii soţi sunt sănătoşi, dar au câte un părinte afectat de fibroză chistică 75% 5. Un partener are neurofibromatoză, iar celălat este sănătos 100%

13. SCREENING-UL POPULA]IONAL AL BOLILOR GENETICE

I. DATE TEORETICE

A. DEFINIŢIE. PRINCIPIILE SCREENING-ULUI POPULAŢIONAL.

Analiza frecvenţei populaţionale a bolilor genetice şi a implicaţiilor majore ale acestor afecţiuni, nu numai asupra pacienţilor şi familiilor lor, ci chiar la nivelul întregii societăţi (prin handicapurile majore şi costurile pe care le ridică) au impus programe speciale de prevenţie. În cadrul acestora se înscrie şi screening-ul genetic.

Screening-ul genetic reprezintă metoda de identificare, la nivelul unei populaţii, a persoanelor cu genotipuri asociate unei boli sau predispoziţii la boală sau care pot duce la apariţia unei boli la descendenţi (National Academy of Sciences, USA, 1975).

Scopul screening-ului este de recunoaştere precoce a afecţiunii, astfel încât intervenţia medicală să prevină sau să corecteze procesul patogenic (de exemplu, screening-ul neonatal pentru erori înnăscute de metabolism) sau ca individul să poată lua o decizie conştientă şi informată asupra reproducerii sale (programele de depistare a heterozigoţilor pentru unele mutaţii recesive).

Pentru a decide dacă un program de screening pentru o anumită boală este adecvat sau nu se consideră următoarele criterii: Caracteristicile bolii. Boala trebuie să fie gravă şi relativ frecventă. Aceste elemente fac ca

beneficiile programului de screening să justifice costurile. De asemenea, este important ca evoluţia naturală a bolii să fie cunoscută şi să existe un tratament eficient şi acceptabil (sau, în unele boli genetice, să existe posibilitatea diagnosticului prenatal).

Caracteristicile testului. Testul trebuie să fie acceptabil de către membrii populaţiei, uşor de efectuat şi eficient. Este esenţial ca testul screening să furnizeze rezultate cât mai corecte. Validitatea testului se referă la capacitatea sa de a diferenţia indivizii care au o anumită boală de cei care nu o au. Ea este cuantificată prin două componente: sensibilitatea – capacitatea de a identifica precis indivizii cu o boală genetică, exprimată

prin proporţia bolnavilor pentru care testul este pozitiv (rezultate pozitive reale) specificitatea – capacitatea de a identifica în mod precis indivizii care nu au boala

genetică, exprimată prin proporţia indivizilor neafectaţi care au un test negativ (rezultate negative reale);

sensibilitatea şi specificitatea sunt măsurate prin compararea rezultatelor screening-ului cu cele ale unui test diagnostic definitiv. Testele screening nu au niciodată o sensibilitate sau specificitate de 100%, deoarece valorile testului în populaţia afectată se suprapun parţial peste cele ale populaţiei normale. De aceea se stabileşte o anumită valoare-limită pentru separarea celor două populaţii, prin luarea în consideraţie atât a

Screening-ul populaţional al bolilor genetice

259

implicaţiilor non-detecţiei (creşterea frecvenţei rezultatelor fals negative) cât şi pe cele ale specificităţii reduse (creşterea frecvenţei rezultatelor fals pozitive);

un alt element important este valoarea predictivă a testului, adică acurateţea unui rezultat pozitiv la testul screening (proporţia persoanelor cu rezultate pozitive care au într-adevăr afecţiunea în cauză).

Caracteristicile sistemului. Este important ca în momentul începerii testării să existe o strategie pentru comunicarea eficientă a rezultatelor, precum şi resurse disponibile şi accesibile pentru diagnosticul şi tratamentul afecţiunii respective.

Ramura geneticii medicale care se ocupă cu screening-ul şi prevenirea bolilor genetice la nivel populaţional este cunoscută sub denumirea de medicină comunitară.

B. SCREENING-UL NEONATAL Screening-ul neonatal are drept scop depistarea nou-născuţilor cu anumite boli

genetice, nemanifeste la naştere şi a căror evoluţie poate fi oprită sau controlată prin acţiuni medicale. Pentru ca o boală genetică să poată fi subiectul unui program de screening neonatal, trebuie îndeplinite criteriile de eficienţă generale (tabelul 13.1.).

Tabelul 13.1. Criterii pentru un program de screening neonatal

Boala incidenţă crescută în populaţia ţintă consecinţe importante asupra sănătăţii tratabilă sau cu posibilităţi de prevenire

Testul neinvaziv şi uşor de realizat precis necostisitor

Programul disponibilitate largă şi echitabilă participare voluntară acceptabil pentru populaţia ţintă informaţii complete şi sfat genetic

Există multe boli care se pretează pentru screening-ul neonatal, dar particularităţile epidemiologice ale populaţiilor din diferite regiuni ale globului fac ca programele de screening din diferite ţări să aibă ţinte distincte. De exemplu, în Europa, screening-ul neonatal este aplicat pentru următoarele afecţiuni, frecvente în populaţia caucaziană: fenilcetonuria, hipotiroidia congenitală, mucoviscidoza şi galactozemia (tabelul 13.2.).

1. FENILCETONURIA

Fenilcetonuria, denumită şi oligofrenie fenilpiruvică, este o afecţiune datorită unui defect în metabolismul fenilalaninei. Acest aminoacid esenţial este convertit, în ficat, în tirozină, sub influenţa fenilalanin-hidroxilazei. Boala, determinată de deficitul de fenilalanin-hidroxilază, este transmisă recesiv autosomal şi are o frecvenţă de 1/5.000 – 1/16.000 nou-născuţi. Gena implicată este localizată pe braţul lung al cromosomului 12 (12q22-q24). Frecvenţa purtătorilor de genă mutantă este de aproximativ 2%.

Afecţiunea este o enzimopatie, blocarea metabolismului intermediar al fenilalaninei la nivelul hidroxilării sale hepatice în tirozină ducând la: acumularea de fenilalanină în amonte de blocajul metabolic; aceasta este transformată în

metaboliţi secundari, precum acidul fenilpiruvic, care este toxic în special pentru neuroni; reducerea metaboliţilor normali ai fenilalaninei (tirozina şi derivaţii săi: serotonina,

catecolaminele, melanina) în aval de blocaj.


260

Boala se manifestă printr-o encefalopatie progresivă, evidentă după primul an de viaţă sub forma unui retard mintal sever la 95% dintre copiii afectaţi netrataţi de la naştere. În forma clasică de boală, nivelul rezidual al activităţii fenilalanin hidroxilazei este sub 1%, iar fenilalanina serică atinge nivele de peste 20 mg/dl (1,2 mmol/l). Baza tratamentului constă în realizarea unui aport de fenilalanină sub 350 mg/zi pe toată perioada maturizării cerebrale (10 ani). Restricţia trebuie aplicată la femeile cu fenilcetonurie, minim cu un an înainte de concepţie şi pe parcursul întregii sarcini, pentru a evita interesarea fetală.

Screening-ul nou-născuţilor pentru fenilcetonurie se poate realiza prin testul Guthrie (efectuat la câteva zile după naştere, copiii primind diete cu conţinut proteic normal) sau alte metode. Testul Guthrie are o sensibilitate de 98% şi o specificitate de aproape 100%.

Tabelul 13.2. Caracteristici ale unor programe de screening neonatal

Boală Transmitere Prevalenţa Test Cost per pacient

Tratament

Fenilcetonuria RA 1/10.000 Guthrie 1,25$ Dietă cu restricţie la fenilalanină

Hipotiroidismul congenital

Sporadică 1/4.000 Măsurarea T4 sau TSH

1,50$ Substituţie hormonală

Galactozemia RA 1/50.000 Testul transferazei

1,00$ Dietă cu restricţie la galactoză

Fibroză chistică RA 1/2.500 RIA pentru tripsină

? Fizioterapie şi profilaxie cu antibiotice

2. HIPOTIROIDIA CONGENITALĂ

Deficitul de hormoni tiroidieni are consecinţe grave asupra dezvoltării intelectuale. Screening-ul neonatal este adecvat pentru această afecţiune, deoarece boala este suficient de frecventă (1 la 4.000 de nou-născuţi) iar tratamentul de înlocuire, prin administrarea pe termen lung a hormonilor tiroidieni (tiroxină), este eficient în prevenirea tulburărilor de dezvoltare intelectuală, asociate tabloului clasic de “cretinism guşogen”. Cauzele cele mai frecvente ale hipotiroidiei congenitale sunt absenţa glandei tiroide şi erorile în metabolismul hormonilor tiroidieni. Absenţa congenitală a glandei tiroide nu este determinată de regulă de factori genetici, în timp ce defectele în metabolismul hormonilor tiroidieni se transmit de obicei recesiv autosomal. Screening-ul se bazează pe dozarea T4 sau TSH.

3. GALACTOZEMIA

Galactozemia este o boală rară (1:50.000 nou-născuţi) dar cu consecinţe grave asupra individului. Diagnosticul precoce al galactozemiei şi aplicarea unei diete adecvate pot preveni moartea sau complicaţiile pe termen lung (retardul mintal, ciroza hepatică sau cataracta) fapt care justifică încadrarea acestei afecţiuni în programele de screening.

4. MUCOVISCIDOZA

Mucoviscidoza este una dintre cele mai frecvente boli în populaţia europeană (1:2.500 nou-născuţi) şi are consecinţe grave asupra individului, datorită afectării cronice pulmonare, pancreatice, a diabetului şi sterilităţii prezente la unii pacienţi de sex masculin. Deşi nu există un tratament propriu-zis, raţiunea screening-ului neonatal este utilizarea precoce a metodelor de fizioterapie şi antibioticoterapie, care permit îmbunătăţirea prognosticului pe termen lung.


261

Metoda utilizată cel mai frecvent pentru screening-ul neonatal se bazează pe detectarea imunologică a unor nivele sanguine de tripsină crescute, consecinţă a blocării canalelor pancreatice in utero. Deşi până în prezent au fost identificate peste 700 de mutaţii diferite ale genei CFTR, care determină mucoviscidoza, frecvenţa mare a unei anumite mutaţii - mutaţia ΔF508, întâlnită la până la 70% dintre bolnavi - a permis introducerea unor teste moleculare de screening neonatal şi chiar a screening-ulului populaţional pentru depistarea heterozigoţilor, aceştia având în unele regiuni o pondere de 1 la 22 indivizi.

Screening-ul neonatal este utilizat pe scară largă pentru fenilcetonurie şi hipotiroidia congenitală. În funcţie de specificul populaţiei există teste cu specific regional pentru alte afecţiuni.

Participarea la programele de screening neonatal trebuie să fie voluntară şi fiecare program trebuie să fie disponibil pe scară largă, echitabil distribuit în populaţia ţintă şi susţinut prin informaţii complete şi sfat genetic.

C. DEPISTAREA PURTĂTORILOR DE MUTAŢII Una din problemele majore legate de sfatul genetic este identificarea indivizilor care,

deşi sunt aparent sănătoşi, au risc crescut de a transmite o boală genetică descendenţilor lor. Recunoaşterea unui anumit mod de transmitere a unei boli genetice, pe baza examenului clinic, permite uneori estimarea prezenţei genei mutante. În aceste situaţii sunt folosite teste de laborator (biochimice, anatomo-patologice) sau teste de diagnostic molecular (detecţia directă sau indirectă a mutaţiei) pentru o predicţie cât mai exactă a genotipului şi riscului genetic cu care se confruntă individul.

Termenul de purtător se referă la un individ care posedă în stare heterozigotă o genă mutantă implica, în producerea unei boli ereditare, dar care este (aparent) sănătos la momentul studiului. Acest termen poate fi valabil în boli recesive autosomale (heterozigoţi de ambele sexe), boli recesive legate de cromosomul X (exclusiv la fete - purtătoare ale mutaţiei) sau în boli dominant autosomale (în afecţiuni cu penetranţă incompletă sau manifestări clinice tardive) (tabelul 13.3.).

Tabelul 13.3. Riscul genetic pentru purtătorii de mutaţii (boli monogenice)

Transmitere ereditară Riscul genetic pentru descendenţii purtătorului Recesivă autosomală Foarte redus, cu excepţia situaţiilor în care afecţiunea este

relativ frecventă, căsătoria este consanguină sau aceeaşi afecţiune este prezentă în familia partenerului de cuplu

Recesivă legată de X 50% pentru băieţi; posibilitatea unei expresii variabile la fete Dominantă autosomală 50% sau mai redus în funcţie de penetranţa mutaţiei

Este important de subliniat că uneori simpla examinare a arborelui genealogic poate releva care dintre membrii familiei sunt purtători obligatorii (siguri) ai mutaţiei. În bolile recesive autosomale, purtători obligatorii sunt părinţii şi toţi copiii indivizilor

afectaţi. În bolile recesive legate de X sunt purtătoare obligatorii fiicele bărbaţilor afectaţi, dar nu

neapărat şi mamele acestora deoarece există posibilitatea ca afecţiunea să fie rezultatul unei mutaţii noi.

În bolile dominante autosomale sunt purtători obligatorii indivizii care au atât un părinte, cât şi un descendent afectat, chiar dacă la momentul studiului nu manifestă ei înşişi semne de boală.


262

Aplicarea testelor de screening purtătorilor obligatorii este inutilă, cu excepţia cazurilor în care se urmăreşte evaluarea unui nou test, iar purtătorii obligatorii reprezintă populaţia de referinţă.

1. DEPISTAREA HETEROZIGOŢILOR PENTRU MUTAŢII RECESIVE

Bolile recesive autosomale furnizează în mod cert cel mai mare număr de purtători sănătoşi de mutaţii. Orice persoană din populaţie este purtătoarea a cel puţin unei mutaţii recesive asociată unei boli grave şi a mai multor mutaţii recesive asociate cu anomalii letale. Identificarea purtătorilor sănătoşi de mutaţii autosomale recesive, în special în familiile bolnavilor, poate fi utilă în cazul bolilor relativ comune, în care frecvenţa mare a heterozigoţilor în populaţie (tabelul 13.4.) face ca riscul genetic să fie uşor crescut, chiar dacă consanguinitatea este redusă.

Tabelul 13.4. Depistarea purtătorilor de mutaţii pentru unele boli recesive autosomale

Boala Testul de screening pentru purtători Deficitul de alfa1-antitripsină Dozarea electroforetică a alfa1-antitripsinei;

teste ADN. Hiperplazia congenitală de suprarenală Teste ADN Fibroza chistică Teste ADN Galactozemia Dozarea galactoz-1-fosfat uridil transferazei

eritrocitare; teste ADN. Mucopolizaharidoza tip I (Hurler) Dozarea alfa-iduronidazei în leucocite; teste

ADN. Fenilcetonuria Test de încărcare cu fenilalanină; raportul

fenilalanină/ tirozină în ser; teste ADN. Deficitul de pseudocolinesterază Activitatea pseudocolinesterazei serice Boala Tay-Sachs Dozarea hexozaminidazei A în leucocite; teste

ADN. Talasemii, alte hemoglobinopatii Morfologia eritrocitelor; electroforeza

hemoglobinei; teste ADN. De exemplu, pentru fenilcetonurie, boală cu o incidenţă de 1:10.000 de indivizi, riscul

fratelui unui individ afectat de a avea la rândul său un copil afectat este de aproximativ 1:300 (dacă partenerul nu este consanguin); evidenţierea faptului că fratele este purtător de mutaţie face ca riscul să crească la 1:200, iar excluderea acestei posibilităţi face ca riscul să fie aproape nul.

Pe de altă parte, screening-ul pentru identificarea heterozigoţilor pentru mutaţii recesive rare, deşi uneori posibil, este de evitat, deoarece nu există beneficii evidente (riscul genetic este redus dacă se evită căsătoriile consanguine) şi are un efect psihologic negativ.

În ceea ce priveşte bolile recesive legate de cromosomul X, ele reprezintă cele mai importante aplicaţii ale programelor de screening pentru depistarea heterozigoţilor. Explicaţia stă în faptul că femeile purtătoare de mutaţii sunt sănătoase, apte să se reproducă şi, spre deosebire de bolile recesive autosomale, au un risc de 50% de a avea băieţi afectaţi, indiferent de partenerul ales. Posibilitatea depistării femeilor heterozigote este extrem de importantă pentru sfatul genetic, în special în boli mai frecvente şi cu consecinţe grave, cum sunt distrofiile musculare legate de X şi hemofiliile.


263

Modalităţile de depistare a heterozigoţilor cu mutaţii recesive constau în evidenţierea unor manifestări clinice minore, decelarea de modificări histopatologice sau fiziopatologice, evidenţierea de defecte biochimice, detecţia prezenţei mutaţiei prin analiza ADN-ului.

a. Evidenţierea unor manifestări clinice minore

În unele boli recesive (bolile pielii, retinei etc) heterozigoţii pot avea manifestări clinice minore, în special în bolile transmise legat de cromosomul X (tabelul 13.5.) datorită inactivării întâmplătoare a cromosomului X. De exemplu, femeile heterozigote pentru albinismul ocular transmis recesiv legat de X, pot prezenta o pigmentare retiniană în mozaic. Majoritatea bolilor recesive autosomale sau legate de X nu au însă nici o manifestare la heterozigoţi, aspectele întâlnite suprapunându-se peste variaţiile întâlnite în populaţia generală.

b. Evidenţierea de modificări histo- sau fiziopatologice

Examenul microscopic al ţesutului muscular, prelevat prin biopsie, poate releva prezenţa unor modificări musculare subclinice la purtătoarele mutaţiei pentru distrofia musculară Duchenne. Examenul frotiului de sânge permite identificarea purtătorilor de mutaţii pentru hemoglobinopatii (sicklemie, talasemii, etc.).

c. Evidenţierea unor modificări biochimice

Este metoda cea mai importantă de evidenţiere a heterozigoţilor pentru afecţiuni recesive autosomale sau gonosomale.

În unele situaţii modificarea biochimică este reprezentată de produsul primar al genei. De exemplu, purtătorii pentru boala Tay-Sachs au un nivel al activităţii enzimatice intermediar între nivelele întâlnite la persoanele sănătoase şi cele bolnave (tabelul 13.5.).

În multe boli monogenice însă, anomalia biochimică utilizată în depistarea heterozigoţilor nu este rezultatul direct al acţiunii produsului genic, ci efectul secundar sau terţiar al acesteia. De exemplu, în distrofia musculară Duchenne există o creştere a permeabilităţii membranei musculare ca urmare a procesului distrofic, cu eliberare crescută de enzime musculare în sânge. Creşterea nivelelor creatin kinazei serice (CK) este una dintre modalităţile de confirmare a diagnosticului la bolnavi. Femeile heterozigote au activitatea CK în ser crescută în comparaţie cu restul populaţiei feminine. Există însă o suprapunere parţială a nivelelor întâlnite la heterozigotele obligatorii cu cele ale femeilor normale nepurtătoare, ceea ce face ca o activitate crescută a CK serice să nu semnifice întotdeauna starea de purtătoare. În plus, inactivarea întâmplătoare a cromosomului X la heterozigote poate face ca modificarea biochimică să fie discretă sau absentă (numai 2/3 dintre purtătoarele mutaţiei în gena pentru distrofină au nivele crescute ale CK în ser), complicând şi mai mult depistarea heterozigotelor pentru afecţiuni recesive gonosomale.

d. Detecţia mutaţiei la nivel de ADN

Detecţia directă a mutaţiei

Stabilirea metodologiei de secvenţializare a ADN a permis identificarea mutaţiilor genice care stau la originea multor boli genetice. Recent au fost introduse tehnici noi, care permit identificarea directă a unei anumite mutaţii pe baza specificităţii hibridării secvenţelor de acizi nucleici (ASO, ARMS) (vezi capitolul Diagnosticul molecular al bolilor genetice). Aplicarea acestor metode nu este întotdeauna posibilă, chiar dacă gena a fost localizată şi secvenţializată, datorită fenomenului de heterogenitate genetică. De exemplu, în cazul mucoviscidozei mutaţia cea mai frecventă este F508 (40-70%) dar uneori statusul de


264

purtător este greu de determinat, deoarece pe lângă aceasta există alte peste 700 de mutaţii care pot altera locusul CF.

Tabelul 13.5. Anomalii clinice şi biochimice utilizate pentru depistarea heterozigoţilor în unele afecţiuni transmise recesiv legat de cromosomul X

Anomalii clinice Albinismul ocular Retinopatie pigmentară Coroideremia Sindromul Lowe Sindromul Alport Boala Fabry

Aspect în mozaic al pigmentării retiniene Pigmentare retiniană în mozaic, Electroretinogramă anormală Opacităţi ale cristalinului Hematurie microscopică Modificări cutanate Opacităţi corneene

Anomalii biochimice Hemofilia A Hemofilia B Distrofia Duchenne Deficitul de G6PDH Sindromul Lowe Sindromul Lesch-Nyhan Mucopolizaharidoza tip II (Hunter) Boala Fabry

Reducerea activităţii factorului VIII al coagulării Reducerea nivelelor factorului IX al coagulării Creşterea activităţii creatin kinazei serice Reducerea activităţii G6PD eritrocitare Aminoacidurie Activitate redusă a hipoxantin-guanin fosforibozil transferazei în fibroblaştii din piele Dozare enzimatică în foliculii piloşi şi ser Reducerea activităţii α-galactozidazei în foliculii piloşi

Detecţia indirectă a mutaţiei

Principala metodă de detecţie indirectă a unei mutaţii o reprezintă studiul înlănţuirii genice dintre locusul morbid şi un marker ADN polimorf.

Există câteva surse potenţiale de eroare în cazul utilizării unor markeri polimorfici înlănţuiţi: Recombinarea între markerul ADN polimorf şi locusul morbid. Pentru reducerea acestui risc

trebuie identificat fie un marker intragenic, fie markeri ce flanchează locusul morbid. Totuşi chiar şi într-o astfel de variantă, pentru locusul DMD (distrofie musculară Duchenne) poate apare o rată de 12% de recombinare, ceea ce impune asocierea rezultatului acestui test cu rezultatele dozării creatin-kinazei şi analiza arborelui genealogic.

Disponibilitatea probelor. Metoda markerilor ADN polimorfi înlănţuiţi necesită cooperarea membrilor familiei. De aceea, în familiile cu boli ereditare letale precum DMD, este necesară stocarea ADN (sau a materialului bioptic) de la pacienţi.

Variaţia polimorfică şi structura familiei. Familiile trebuie să aibă o variaţie suficient de importantă a markerilor utilizaţi pentru ca înlănţuirea să fie informativă (vezi capitolul Diagnosticul molecular al bolilor genetice).

Determinarea statusului heterozigot pentru afecţiunile recesive autosomale sau legate de X implică examinarea clinică detaliată pentru depistarea unor semne minore, investigaţii paraclinice de specialitate sau studii privind înlănţuirea locusului morbid cu markeri ADN polimorfi.

2. DIAGNOSTICUL PRESIMPTOMATIC ÎN BOLI DOMINANTE


265

În practică, aproape orice heterozigot pentru o mutaţie cu efect dominant este bolnav şi de aceea, termenul de purtător se aplică în acest caz numai indivizilor care au semne minore de boală (uneori greu de detectat) sau heterozigoţilor pentru mutaţii cu manifestare clinică tardivă (tabelul 13.6.). O mare parte dintre afecţiunile monogenice transmise dominant autosomal care prezintă forme fruste sau debutează la vârste avansate pot fi diagnosticate înaintea apariţiei simptomelor caracteristice bolii prin examen clinic, examene paraclinice, teste biochimice sau detecţia mutaţiei la nivelul ADN. Chiar dacă în prezent pentru majoritatea acestor afecţiuni nu există acţiuni medicale care să prevină complet manifestarea clinică, diagnosticul presimptomatic poate fi util pentru aplicarea unor măsuri terapeutice precoce şi este esenţial pentru ca persoanele afectate să poată lua decizii informate în ceea ce priveşte reproducerea.

Tabelul 13.6. Boli autosomal dominante pentru care este posibil diagnosticul presimptomatic deoarece prezintă debut tardiv şi/sau forme fruste

Boala Testul de diagnostic presimptomatic Neurofibromatoza tip I Boala Von Hippel-Lindau Distrofia miotonică Distrofia facio-scapulo-humerală Boala polichistică renală a adultului autosomal dominant (ADPKD) Polipoza adenomatoasă familială Sferocitoza ereditară Hipercolesterolemia familială Porfirii

Pete “café au lait”; noduli Lisch; teste ADN. Leziuni retiniene Hipotonie musculară; opacităţi cristaliene; electromiografie; teste ADN. Uşoară astenie musculară; teste ADN. Ecografie renală; teste ADN. Colonoscopie; teste ADN. Morfologia eritrocitului; fragilitate osmotică; electroforeza membranelor eritrocitare. Dozarea LDL şi colesterolului; teste ADN. Dozări enzimatice specifice

a. Examinarea clinică

Examenul clinic poate fi util pentru diagnosticul presimptomatic în unele boli dominante. De exemplu, în neurofibromatoza de tip 1 (NF1), persoanele care au moştenit gena mutantă prezintă o serie de semne caracteristice: neurofibroame cutanate, pete cutanate “café au lait”, noduli Lisch la nivelul irisului. De aceea, este indicată examinarea clinică a rudelor sănătoase ale indivizilor cu NF1 pentru a vedea dacă ele prezintă asemenea semne, care ar confirma existenţa afectării.

b. Investigaţiile paraclinice

Demonstrarea interesării organice în afecţiuni transmise dominant autosomal poate fi utilizată ca o modalitate de diagnostic presimptomatic.

De exemplu, în distrofia miotonică, afecţiune musculară dominantă, în care persoanele afectate au o incapacitate de relaxare normală, efectuarea electromiogramei (EMG) permite depistarea purtătorilor de genă mutantă, prin evidenţierea unor descărcări spontane care apar la inserţia electrodului în muşchi (figura 13.1.). Aceste descărcări nu apar la persoanele normale. De aceea, EMG poate fi utilizată ca test presimptomatic, deşi acesta poate fi realizat şi prin analiza mutaţiei specifice a genei DMPK - expansiune trinucleotidică CTG la capătul 3' al genei.


266

Figura 13.1. Electromiograma unei persoane cu distrofie miotonică ce evidenţiază o descărcare electrică spontană la inserţia electrodului în muşchi

Persoanele cu distrofie miotonică prezintă, de asemeni, un risc crescut de dezvoltare a cataractei precoce. Tipul de cataractă întâlnit în distrofia miotonică este diferit de varianta comună (cataractă senilă) şi poate fi detectată prin examinarea cu lampa cu fantă, care evidenţiază opacităţi refractile. Prezenţa unui asemenea tip de cataractă la o persoană asimptomatică, dar cu risc pentru distrofia miotonică va confirma prezenţei genei mutante.

Absenţa elementelor clinice sau a modificărilor la examenele paraclinice nu exclude diagnosticul, însă reduce riscul ca persoana respectivă să fi moştenit gena mutantă.

c. Teste biochimice

Evidenţierea modificării calitative sau cantitative a produsului primar al genei mutante sau identificarea efectelor metabolice secundare sunt metode eficiente şi putin costisitoare, folosite pentru diagnosticul multor boli dominante. Un exemplu este dozarea colesterolului la persoanele cu risc de hipercolesterolemie familială, resepctiv dozarea porfirinelor urinare sau a unor enzime specifice în diverse porfirii dominante.

d. Analize de înlănţuire genică

Pentru astfel de teste pot fi utilizaţi markeri biochimici sau markeri ADN polimorfi care se transmit înlănţuit cu gena morbidă. Astfel de teste au aplicabilitate în cazul bolilor monogenice transmise dominant autosomal, pentru care gena a fost localizată, dar nu a fost încă clonată. În alte cazuri, precum boala Huntington, clonarea genei responsabile a condus în mare parte la înlocuirea utilizării markerilor ADN polimorfici înlănţuiţi.

Diagnosticul presimptomatic al persoanelor cu risc de boli autosomal dominante cu penetranţă redusă sau vârstă tardivă de debut se poate realiza prin examinare clinică atentă, investigaţii paraclinice sau utilizarea unor teste de înlănţuire a polimorfismelor ADN sau a markerilor biochimici.


A. SCREENING-UL NEONATAL AL FENILCETONURIEI Screening-ul neonatal al fenilcetonuriei se poate realiza prin următoarele tehnici: Evidenţierea eliminării urinare a acidului fenilpiruvic prin depistarea unui viraj spre verde al culorii la

folosirea perclorurii de fier sau a reactivului Phenistix. Excreţia urinară de fenilcetone este variabilă şi, de aceea, testul trebuie repetat în perioada neonatală.

Testul bacteriologic Guthrie, realizat pe baza unei probe de sânge recoltate în a 5-a sau a 6-a zi de la naştere prin puncţia calcaneului. Este un test simplu şi puţin costisitor, care se bazează pe inhibarea, de către β2-tienilalanină, a creşterii bacteriei Bacillus subtilis, inhibiţie ce este anulată


267

de fenilalanină. Picăturile de sânge sunt recoltate pe rondele de hârtie de filtru, care sunt puse pe suprafaţa unui mediu de creştere, alături de rondele martor cu cantităţi titrate de fenilalanină. Plăcile sunt introduse în termostat la 37°C, timp de 16 ore. Prezenţa fenilalaninei este evidenţiată de apariţia unor colonii bacteriene în jurul rondelei de hârtie de filtru, iar nivelul seric al fenilalaninei este estimat prin comparare cu probele martor. Este obligatoriu ca înaintea efectuării testului copilul să nu primească nici un antibiotic activ pe Bacillus subtilis.

Testul fluorimetric Caman şi Robins. Este un test rapid, simplu, dar costisitor. Metoda de bazează pe analiza spectrofluorimetrică a fenilalaninei complexate şi este realizată pe un disc de sânge coagulat.

B. CAZ CLINIC Doamna J este anunţată de medicul pediatru că testul screening neonatal, efectuat la copilul

său nou-născut, indică posibilitatea prezenţei mucoviscidozei. Medicul pediatru recomandă efectuarea testului sudorii şi apoi analiza moleculară. Testul transpiraţiei a fost normal (clorurile din secreţia sudorală nu sunt crescute). Rezultatele analizei moleculare au indicat faptul că nou-născutul este heterozigot pentru alela mutantă CF ΔF508. Studiile moleculare, efectuate la părinţi, au arătat că mama este purtătoare a aceleiaşi mutaţii a genei CF. Deoarece copilul este heterozigot, el necesită doar o supraveghere pediatrică de rutină, ca orice alt copil sănătos. Este important ca părinţii copilului să înţeleagă faptul că acesta nu este bolnav şi nu va fi bolnav nici ulterior.

Deşi fibroza chistică este frecventă, cu o incidenţă de 1 la 2.500 nou-născuţi vii, screening-ul neonatal este controversat. Există o rată crescută de rezultate fals pozitive pentru testul folosit curent, iar puţinele date existente nu pot demonstra existenţa vreunui beneficiu al acţiunii medicale în ceea ce priveşte prevenirea manifestărilor clinice. De aceea, screening-ul neonatal pentru fibroza chistică este utilizat în prezent doar în câteva ţări.

C. IDENTIFICAREA HETEROZIGOŢILOR PRIN STUDIUL ÎNLĂNŢUIRII CU MARKERI ADN POLIMORFI

Markerii ADN polimorfi sunt utilizaţi frecvent pentru determinarea statusului de heterozigot al femeilor, în familiile cu risc pentru distrofia musculară Duchenne. Un exemplu este evidenţiat în figura 13.2., în care persoana III3, care se prezintă pentru sfat genetic, doreşte să ştie dacă este purtătoare, având astfel risc de a naşte băieţi cu DMD. Analiza arborelui genealogic arată că mama sa II4, împreună cu sora sa, II1 şi bunica maternă, I2, sunt purtătoare ale mutaţei. Analizele PCR efectuate au permis evidenţierea la persoanele din această familie a unei repetiţii dinucleotidice CA polimorfe (numită Dys 5'II) situată în imediata vecinătate (5') a genei pentru distrofină. Mutaţia în gena pentru distrofină în această familie segregă cu alela 1 şi, deoarece persoana III3 a moştenit această alelă de la mama sa, rezultă că este purtătoare.

Markerii ADN polimorfici pot fi utilizaţi în acest caz şi pentru diagnosticul prenatal, pentru a demonstra dacă fătul de sex masculin va fi afectat de DMD, chiar în absenţa identificării mutaţiei specifice în gena pentru distrofină.


A. DEFINIŢI URMĂTORII TERMENI: Screening genetic Sensibilitate Specificitate Valoare predictivă Medicină comunitară Test Guthrie

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Care sunt caracteristicile unei boli pentru care este posibilă aplicarea unei metode de screening

populaţional?


268

Figura 13.2. O familie cu DMD în care se evidenţiază segregarea repetiţiei CA de la

extremitatea 5' (cunoscută şi sub numele de Dys 5'II) cu gena pentru distrofină

2. Care trebuie să fie particularităţile unei investigaţii pentru a putea fi utilizată ca test screening? 3. Care sunt criteriile ce trebuie respectate în cadrul unui program de screening neonatal? 4. Care sunt principalele afecţiuni care beneficiază în ţările dezvoltate de programe naţionale de

screening neonatal? 5. Care sunt particularităţile fenilcetonuriei? Care este principalul test folosit pentru screening-ul

neonatal? 6. Pe ce se bazează screening-ul neonatal al hipotiroidiei? Există posibilităţi terapeutice în această

afecţiune? 7. Care sunt particularităţile fibrozei chistice? Care este cea mai frecventă mutaţie a genei CFTR? 8. Care sunt tipurile de boli pentru care se realizează screening-ul purtătorilor de mutaţie? 9. Care sunt modalităţile de evidenţiere a heterozigoţilor în bolile recesiv autosomale? Dar în cele

recesive cu transmitere legată de cromosomul X? 10. Poate fi detectată o mutaţie la nivel de ADN? Care ar fi metodele ce trebuie aplicate în acest caz? 11. De ce este utilă detecţia presimptomatică în bolile dominant autosomale? Ce fel de metode pot fi

aplicate pentru aceasta?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1. În vederea instituirii unui program nou de screening neonatal, un medic este rugat să evalueze un nou test pentru o afecţiune biochimică fatală în copilărie. Pe care din următorii factori se bazează decizia de a introduce acest nou test de screening neonatal?

A.testul este sensibil şi specific; B. testul este simplu şi ieftin; C. informaţia poate fi utilă părinţilor în planificarea următoarelor sarcini; D. există un tratament eficient al bolii dacă aceasta este diagnosticată precoce; E. nici o variantă nu este corectă.

II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B, dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3 C, dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4 D, dacă este corect răspunsul 4 E, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4


269

2. Fenilcetonuria este o afecţiune: 1. transmisă autosomal dominant; 2. în absenţa tratamentului evoluează spre o encefalopatie gravă; 3. uşor depistabilă în statusul heterozigot în perioada neonatală; 4. aparţine grupului aminoacidopatiilor.

3. Testul Guthrie pentru depistarea hiperfenilalaninemiilor:

1. utilizează un inhibitor de creştere al bacteriilor: β-2-tienilalanina; 2. foloseşte o cultură de Bacillus cereus; 3. poate fi falsificat de prezenţa antibioticelor în sângele fetal; 4. testul pozitiv înseamnă absenţa creşterii bacteriene.

14. SCREENING-UL {I DIAGNOSTICUL PRENATAL

I. DATE TEORETICE Screening-ul prenatal cuprinde investigaţiile de rutină realizate în cursul sarcinii

prin care este evidenţiată suspiciunea unei afecţiuni fetale. Diagnosticul prenatal completează screening-ul prenatal, cuprinde metodele de investigaţie utilizate pentru identificarea în cursul sarcinii a unor boli genetice sau anomalii congenitale prezente la produsul de concepţie. Diagnosticul prenatal se aplică şi în situaţiile în care mama ori cuplul parental au un risc crescut de a da naştere unui copil cu o afecţiune ereditară.

A. SCREENING-UL PRENATAL În momentul diagnosticării clinice a unei sarcini, gravida ar trebui supusă unui

examen medical complet, care să fie însoţit de o anamneză medicală şi familială detaliată. Astfel, pot fi depistate: afecţiuni materne care se pot transmite la făt (de exemplu, boli cu transmitere sexuală,

precum sifilisul sau infecţia cu HIV); afecţiuni cronice care se pot complica în cursul sarcinii (hipertensiunea arterială, boala

coronariană, obezitatea) afecţiuni care pot avea efecte teratogene asupra produsului de concepţie în mod direct

(diabetul zaharat, toxoplasmoza) sau secundar terapiei de întreţinere pe care îl primeşte mama (medicaţia anticonvulsivantă în epilepsie, tratamentul citostatic pentru cancer).

Anamneza permite, de asemenea, identificarea unor boli ereditare prezente în familie, care se pot transmite la copil sau a unor expuneri teratogene datorite modului de viaţă (fumat, consum de alcool) sau condiţiilor de muncă ale mamei.

Primul examen medical al gravidei certifică vârsta sarcinii şi estimează riscul acesteia, atât pentru mamă, cât şi pentru produsul de concepţie. Estimarea vârstei sarcinii se face în raport cu prima zi a ultimei menstruaţii (aproximativ două săptămâni înainte de momentul propriu-zis al concepţiei). În situaţiile neclare, estimarea vârstei sarcinii se face pe baza măsurării înălţimii uterului deasupra ombilicului sau pornind de la data la care au fost înregistrate prima oară bătăile inimii fetale. O estimare precisă este dată de examenul ecografic, dar numai dacă ritmul creşterii fetale este normal.

Îngrijirea medicală de rutină a femeii însărcinate necesită evaluarea periodică, la intervale de timp care descresc odată cu apropierea termenului de naştere. Monitorizarea presupune evaluarea stării de sănătate a mamei, măsurarea creşterii în greutate, documentarea creşterii şi a ritmului cardiac al fătului. Testele de laborator efectuate în cursul oricărei sarcini includ: hemoleucograma, examenul de urină, urocultura, determinarea grupelor sanguine, testul Coombs pentru detectarea izoimunizării, testele pentru evidenţierea bolilor cu transmitere sexuală, măsurarea glicemiei pentru evidenţierea diabetului, depistarea

Screening-ul şi diagnosticul prenatal

271

anticorpilor anti-toxoplasma etc. Efectuarea testului triplu în serul matern şi ecografia fetală sunt proceduri de screening mai costisitoare, dar care îşi justifică costul prin identificarea sarcinilor cu risc genetic sau malformativ crescut.

1. DOZAREA -FETOPROTEINEI ŞI TESTUL TRIPLU

Dozarea -fetoproteinei în serul matern sau testul triplu (determinarea -fetoproteinei, a gonadotropinei corionice umane şi a estriolului neconjugat) sunt utilizate pentru screening-ul prenatal al unor anomalii congenitale sau al unor boli cromosomice, pe baza probelor de sânge matern, recoltate de regulă în a 16-a săptămână de gestaţie.

α-fetoproteina este echivalentul fetal al albuminei de la adult, fiind principala proteină din sânge în perioada de început a vieţii fătului, treptat ea fiind înlocuită de albumină.

Orice defect fetal care permite trecerea -fetoproteinei în lichidul amniotic (defecte ale tubului neural, defecte ale peretelui abdominal, anomalii renale cu proteinurie, defecte de dimensiuni mari ale pielii – tabelul 14.1.) determină creşterea nivelului -fetoproteinei în lichidul amniotic şi în serul matern. Dozarea acestei proteine în serul matern (şi exprimarea valorilor în multipli ai medianei pentru o anumită vârstă gestaţională, cu corecţii pentru apartenenţa etnică, obezitate, diabet, tipul de sarcină – unică sau multiplă) şi, eventual, în lichidul amniotic (după amniocenteză) permite diagnosticul defectelor deschise de tub neural doar în 80-95% din cazuri, deoarece curbele de distribuţie ale acestora se suprapun parţial în sarcinile normale şi patologice (figura 14.1.).

Tabelul 14.1. Anomalii congenitale care determină creşteri ale nivelelor α-fetoproteinei în lichidul amniotic şi serul matern

Defectele deschise ale tubului neural - spina bifida Decesul spontan intrauterin Omfalocelul şi gastroschizisul Atrezia esofagiană sau intestinală Sindromul nefrotic congenital Hipoplazia dermică focală sau alte defecte cutanate Sindromul Meckel

Figura 14.1. Distribuţia logaritmică a nivelelor α-FP serice materne în săptămâna 16 de gestaţie exprimată în multipli ai valorii medii corespunzătoare vârstei sarcinii

O altă corelaţie importantă a fost stabilită între nivelul scăzut al -fetoproteinei în serul matern şi bolile cromosomice ale fătului. Completarea dozării -fetoproteinei cu o serie de dozări hormonale – testul triplu - a permis creşterea sensibilităţii şi specificităţii metodei.


272

Testul triplu constă în dozarea în serul matern a α-fetoproteinei, estriolului neconjugat şi a gonadotropinei corionice umane (hCG – fracţiunea β). Atunci când primele două au valori scăzute, iar hCG este crescut, triplul test este considerat pozitiv (tabelul 14.2.). Triplul test pozitiv permite identificarea a cel puţin 60% din sarcinile cu feţi având sindrom Down.

Tabelul 14.2. Rezultatele triplului test în câteva boli cromosomice fetale

Boala α-fetoproteina Estradiolul hCG Sindromul Down ↓ ↓ ↑ Trisomia 18 ↓ ↓ ↓ Sindromul Turner ↓ ↓ ↑

Recent, la acest test s-a adăugat şi dozarea unui alt marker biochimic, inhibina A (proteina A specifică gestaţiei), ale cărei creşteri în prezenţa unui test triplu pozitiv permite identificarea a circa 75% dintre sarcinile cu feţi având sindrom Down.

Evaluarea celor 4 markeri în săptămânile 16-18 de gestaţie, cu aplicarea corecţiilor pentru vârsta maternă şi completarea cu examenul ecografic (care poate detecta creşterea „transparenţei” la nivelul cefei, semnificând prezenţa unor pliuri cutanate), duc la identificarea a până la 90% dintre feţii cu sindrom Down. Aplicarea aceleiaşi strategii la 10-12 săptămâni de sarcină (în primul trimestru) are o rată de detecţie de numai 60-65%.

Nu trebuie omise problemele etice pe care le ridică aplicarea metodei, fiind necesară explicarea atât a avantajelor, cât şi a posibilităţilor de eroare: cuplul parental trebuie să fie conştient de existenţa unui număr semnificativ de teste fals-pozitive (5%), respectiv fals-negative (10-20%), ca şi de posibilitatea efectuării diagnosticului prenatal (de exemplu cariotipul fetal după amniocenteză) pentru confirmarea/ infirmarea rezultatului.

2. ECHOGRAFIA FETALĂ

Ecografia fetală de rutină este o metodă valoroasă pentru că este neinvazivă şi nu prezintă nici un risc pentru făt şi mamă. Necesită însă un echipament costisitor şi multă experienţă. Se bazează pe plasarea unui transductor care emite ultrasunete pe abdomenul mamei, unde ce sunt reflectate de ţesuturile fetale dependent de densitatea acestora. Undele reflectate sunt prezentate pe un monitor, ceea ce permite vizualizarea fătului în timp real.

Ecografia (de nivel I) este un examen de rutină pentru toate femeile însărcinate în jurul vârstei gestaţionale de 12 săptămâni şi apoi la 24 săptămâni. Metoda este utilizată pentru aprecierea unor aspecte generale (numărul de embrioni, dimensiunile şi ritmul de creştere, aspectul placentei şi al cordonului ombilical sau cantitatea de lichid amniotic).

Ecografia fetală de nivel I este o metodă care poate eşua în detectarea multor anomalii datorită timpului limitat şi al rezoluţiei reduse a aparatului. De aceea, este important ca mama să înţeleagă limitele metodei, iar în cazul sarcinilor cu risc crescut pentru anumite anomalii congenitale sau boli genetice cu anomalii caracteristice să se recomande un examen ultrasonografic de nivel II (în cadrul diagnosticului prenatal).

Screening-ul reprezintă metode eficiente de profilaxie a bolilor genetice şi anomaliilor congenitale, deoarece sugerează prezenţa acestor anomalii la produsul de concepţie. În faţa unui rezultat pozitiv (prezenţa unei anomalii), cuplul parental poate opta în mod conştient pentru întreruperea sau continuarea sarcinii.


273

Screening-ul prenatal cuprinde metode noninvazive, lipsite de riscuri care pot fi aplicate la orice sarcină. Astfel de metode sunt dozarea nivelului matern al α-fetoproteinei pentru depistarea defectelor de tub neural, testul triplu pentru sindromul Down sau ecografia fetală pentru anomalii morfologice sau structurale majore.

B. DIAGNOSTICUL PRENATAL Identificarea prin sfat genetic/ anamneză familială sau screening prenatal a unei

sarcini cu risc genetic sau malformativ crescut impune utilizarea unei metode de diagnostic prenatal, adecvată anomaliei în cauză (tabelul 14.3.).

Tabelul 14.3. Tehnici utilizate pentru diagnosticul prenatal

Tehnica Vârsta gestaţională (săptămâni)

Indicaţii (exemple)

Diagnosticul preimplantator

2 (fertilizare in

vitro)

Trisomii cromosomice (13, 18, 21) Boli monogenice diagnosticate prin PCR: polipoza adenomatoasă colică; sindromul Marfan, fibroză chistică, sindromul X-fragil

Biopsia vilozităţilor corionice

8-10 Boli cromosomice care pot fi identificate prin cariotip cu marcaj în benzi

Amniocenteza precoce

12-14

Sindroame produse prin microdeleţii cromosomice (diagnosticate prin citogenetică moleculară)

Amniocenteza obişnuită (uneori consecutivă unui examen ecografic sau unui test triplu anormal)

16-18 Anomalii cromosomice Boli monogenice determinate de alele mutante caracteristice sau predominante: Osteogenesis imperfecta; sicklemia; distrofia musculară Duchenne; sindromul X-fragil Boli monogenice caracterizate prin proteine anormale sau deficite enzimatice: boală Hurler, sindrom Lesch-Nyhan, deficit de ornitin-carbamil-transferază

Ecografia de nivel II

14-18 Cele mai multe anomalii congenitale dacă ecografia este direcţionată pe organul în cauză Boli mendeliene cu semne ecografice caracteristice (osteogenesis imperfecta fracturi fetale multiple)

Cordonocenteza (după rezultateanormale sau incerte la testele anterioare)

20-40 Boli cromosomice Boli monogenice cu alele mutante sau proteine anormale caracteristice

Defectele structurale (malformaţii) sau bolile monogenice care prezintă anomalii structurale caracteristice pot fi diagnosticate prin metode neinvazive, precum ecografia de nivel II (direcţionată pe organul-ţintă).

În schimb, bolile care necesită efectuarea cariotipului (anomaliile cromosomice, unele boli monogenice legate de cromosomul X) sau a unor analize biochimice (erorile de metabolism) sau moleculare impun prelevarea de ţesuturi fetale prin biopsie de vilozităţi


274

corionice, amniocenteză sau cordonocenteză (recoltare de sânge fetal din cordonul ombilical) metodele respective prezentând însă un anumit risc de declanşare a unui avort spontan.

Diagnosticul prenatal reprezintă o opţiune pentru viitorii părinţi, aceştia fiind singurii în măsură să decidă asupra efectuării testelor şi consecinţelor asupra sarcinii după aflarea rezultatelor.

1. ECOGRAFIA DE NIVEL II ŞI ECOCARDIOGRAFIA FETALĂ

Ecografia fetală de nivel II este o metodă neinvazivă extrem de eficientă în depistarea anomaliilor congenitale ale fătului, atunci când există un risc malformativ crescut pentru un anumit organ sau sistem fetal. De obicei, ea este efectuată la 24 săptămâni de gestaţie, dar ecografele performante pot furniza date relevante chiar şi la 12-16 săptămâni.

La 14-16 săptămâni pot fi măsuraţi ventriculii cerebrali şi pot fi identificate cu uşurinţă defectele de tub neural (anencefalia sau spina bifida) a căror prezenţă este sugerată de creşterea -fetoproteinei în serul matern. În acelaşi interval se poate efectua ecocardiografia fetală cu sistem Doppler, pentru diagnosticul malformaţiilor cardiace.

Ecografia fetală este totodată o metodă utilă pentru detectarea anomaliilor scheletice, ca şi pentru determinarea sexului fătului prin vizualizarea organelor genitale externe (determinare utilă pentru sarcinile cu risc pentru boli monogenice legate de cromosomul X) (tabelul 14.4.).

Tabelul 14.4. Anomalii diagnosticate ecografic în trimestrul II de sarcină

Complexe simptomatice Abdomen / Pelvis Hidropsul fetal Atrezia gastro-intestinală Oligohidramniosul Gastroschizisul Polihidramniosul Omfalocelul Întârzierea în dezvoltarea intrauterină Agenezia renală

Sistem nervos central Rinichiul polichistic Anencefalia Hidronefroza Encefalocelul Anomalii craniofaciale Holoprozencefalia Despicătura labio-palatină Hidrocefalia Anomalii scheletice

Torace Amputaţii ale membrelor Malformaţii congenitale cardiace Osteocondrodisplazii Hernia diafragmatică Osteogenesis imperfecta

O serie de anomalii/semne ecografice sunt semne de alarmă pentru boli cromosomice şi impun amniocenteza şi cariotipul fetal (tabelul 14.5., figura 14.2.)

Tabelul 14.5. Aspecte ecografice care sugerează o anomalie cromosomică

Modificarea ecografică observată Anomalia cromosomică sugerată Edem la nivelul gâtului Trisomia 21, monosomia X (sindromul Turner) Defecte cardiovasculare Trisomiile 13, 18, 21 Pumni flectaţi Trisomia 18 Higroma chistică sau hidrops fetal Trisomiile 13, 18, 21 şi monosomia X Atrezia duodenală Trisomia 21 Omfalocelul Trisomiile 13 şi 18 Călcâiul proeminent (“în piolet”) Trisomia 18


275

a b

Figura 14.2. a. Ecografie fetală (18 săptămâni) - aspect proeminent al călcâiului. b. Aspectul piciorului la nou-născutul diagnosticat cu trisomie 18.

2. BIOPSIA VILOZITĂŢILOR CORIONICE

Biopsia corionului (placentei primitive), structură derivată, la fel ca şi embrionul, din blastocist, este o metodă care permite diagnosticul prenatal în cursul primului trimestru de sarcină, de regulă la 8-11 săptămâni de gestaţie. Ea este realizată sub control ecografic, fie pe cale transabdominală, fie transcervical (figura 14.3.). Probele obţinute conţin atât celule fetale derivate din trofoblast, cât şi celule din decidua maternă, care trebuie îndepărtate înainte de analiză.

Figura 14.3. Biopsia vilozităţilor corionice

Analiza cromosomilor poate fi realizată fie direct (celulele corionice se divid rapid), fie după o cultură prealabilă. Analiza directă permite un diagnostic provizoriu în 24-36 de ore. Ţesutul recoltat poate fi folosit şi pentru diagnosticul unor boli monogenice prin analize biochimice sau ADN (tabelul 14.6.). Avantajul major al metodei este stabilirea


276

diagnosticului în cursul primului trimestru de sarcină. Totuşi, în 1-3% din cazuri poate fi decelat un mozaic cromosomic, uneori irelevant, care poate fi rezultatul: contaminării celulelor fetale cu celule materne (mai ales în cazul culturilor); unor artefacte date de condiţiile de cultură; acestea pot fi evitate prin realizarea concomitentă

a mai multor culturi; existenţei unui mozaic fetal adevărat.

Tabelul 14.6. Boli monogenice care pot fi diagnosticate prin teste moleculare

Boala Metoda de diagnostic molecular Neurofibromatoza tip I Analize de înlănţuire, detecţie directă a mutaţiilor Distrofia miotonică Detecţie directă a mutaţiilor Fibroza chistică Detecţie directă a mutaţiilor Sicklemia Detecţie directă a mutaţiilor Sindromul X fragil Detecţie directă a mutaţiilor Hemofilia A Analize de înlănţuire, Coreea Huntington Analize de înlănţuire, detecţie directă a mutaţiilor Distrofia musculară Duchenne Analize de înlănţuire, detecţie directă a mutaţiilor Cancerul de sân familial Analize de înlănţuire, secvenţializare Galactozemia Dozarea galactoz-1-uridil transferazei Boala Tay-Sachs Dozarea hexozaminidazei A Sindromul Lesch-Nyhan Dozarea hipoxantin-guanin fosforibozil transferazei Glicogenoza de tip 2 Dozarea α-glucozidazei Acidemia metilmalonică Dozarea metilmalonic CoA mutazei Hemocromatoza Analize de înlănţuire, detecţie directă a mutaţiilor

Detectarea unui mozaic cromosomic impune monitorizarea sarcinii şi repetarea cariotipului după recoltarea de celule fetale prin amniocenteză sau cordonocenteză.

Riscurile metodei sunt: posibila apariţie a unor anomalii ale membrelor fătului (mai ales dacă metoda este aplicată înainte de 10 săptămâni de gestaţie) avortul spontan, hemoragii gestaţionale sau infecţii embrionare (ultimele riscuri pot fi evitate în condiţiile efectuării corecte, în condiţii de asepsie a tehnicii).

3. AMNIOCENTEZA

Amniocenteza implică aspirarea a 10 – 20 ml de lichid amniotic, transabdominal, sub control ecografic (figura 14.4.) de regulă între 16 şi 18 săptămâni de gestaţie.

Lichidul amniotic este centrifugat, supernatantul fiind utilizat pentru unele dozări enzimatice, iar concentratul celular este resuspendat într-un mediu de cultură special, necesar stimulării creşterii celulare. Rata de multiplicare este redusă, astfel că abia după 7-21 zile există un număr suficient de celule pentru analiza cromosomilor.

Analiza cromosomică clasică a amniocitelor poate fi precedată de aplicarea unei metode citogenetice de screening bazată pe metoda FISH. Astfel, prin folosirea unor sonde corespunzătoare cromosomilor 13, 18, 21, X şi Y poate fi suspectată prezenţa aneuploidiilor acestor cromosomi, care reprezintă mai mult de 95% din anomaliile cromosomice prezente la făt.

De asemenea, pot fi efectuate dozări enzimatice, precum cele ale α-fetoproteinei şi a acetil-colinesterazei pentru diagnosticul prenatal a defectelor de tub neural, respectiv a fosfatazei alcaline intestinale pentru diagnosticul fibrozei chistice.


277

Metoda prezintă riscuri reduse (0,5-1% risc de pierdere a sarcinii şi 0,5-1% rezultate false) şi permite corelarea rezultatelor citogenetice şi moleculare cu cele ale ecografiei de înaltă rezoluţie, dar permite întreruperea sarcinii, atunci când rezultatele sunt pozitive, abia în a doua jumătate a trimestrului II de sarcină. În plus, este o metodă costisitoare, costul variind între 300 şi 500 $ pentru un caz.

Mai recent, amniocenteza se poate realiza precoce, la 11-14 săptămâni de gestaţie, cu rate comparabile ale rezultatelor şi acelaşi risc de eroare. Metoda are avantajul că în cazul depistării unei anomalii cromosomice, sarcina poate fi întreruptă într-o perioadă mai precoce, astfel încât repercusiunile asupra mamei sunt mai mici.

4. CORDONOCENTEZA

Este o metodă care constă în puncţia transabdominală sau transvaginală a cordonului ombilical, sub control ecografic, în vederea obţinerii unor mici cantităţi de sânge fetal (figura 14.5.). Metoda are aplicabilitate în săptămânile 20-24 de sarcină şi este utilă în situaţiile prezentate în tabelul 14.7..

Figura 14.4. Amniocenteza Figura 14.5. Cordonocenteza

Tabelul 14.7. Indicaţii ale utilizării cordonocentezei în diagnosticul prenatal

Indicaţii absolute Talasemii Alte hemoglobinopatii Hemofiliile A şi B Incompatibilitatea materno-fetală în sistemul Rh Sindroame cu instabilitate cromosomică (anemia Fanconi)

Indicaţii relative Boli caracterizate prin deficite imune Detecţia unui mozaic cromosomic la nivelul vilozităţilor corionice Infecţii congenitale (rubeolă, citomegalovirus)

5. FETOSCOPIA ŞI BIOPSIA UNOR ŢESUTURI FETALE

Este o metodă care se utilizează în special în cursul celui de-al doilea trimestru de sarcină pentru diagnosticul prenatal al unor afecţiuni ereditare grave limitate numai la


278

anumite organe sau ţesuturi (boli ale pielii, precum epidermoliza buloasă, tulburări metabolice care interesează ficatul, precum deficienţa de ornitin transcarbamilază, boli musculare etc.).

Fetoscopia are un risc de 3-5% rezultate false, iar acesta, alături de alte dezavantaje, explică de ce metoda este utilizată doar în centrele de diagnostic prenatal înalt specializate. Fetoscopia poate fi utilizată şi pentru tratamentul intrauterin al unor afecţiuni fetale

6. METODE NOI DE DIAGNOSTIC PRENATAL

a. Detecţia celulelor fetale în circulaţia maternă

Utilizând anticorpi faţă de antigene specifice din trofoblastul fetal a fost demonstrată prezenţa unor celule fetale în circulaţia maternă încă din cursul primului trimestru de sarcină. Spre deosebire de hematiile adulte, hematiile fetale sunt nucleate şi pot fi cultivate in vitro. Metoda este utilă pentru diagnosticul prenatal al unui număr redus de boli, precum incompatibilitatea în sistemul Rh.

b. Diagnosticul genetic preimplantator

În cazul acestei metode se obţine un ovocit de la partenera cuplului, care este apoi fertilizat in vitro. Zigotul rezultat este apoi crescut in vitro până la stadiul de 8 celule (blastomer). În acest moment se izolează o singură celulă care este analizată prin PCR pentru depistarea afecţiunii pentru care există un risc crescut. Dacă produsul de concepţie nu este afectat, este implantat în uterul matern. Metoda poate fi utilizată în prezent numai în câteva situaţii, de exemplu pentru determinarea sexului genetic al zigotului în cazul unui cuplu cu risc pentru distrofia musculară Duchènne, pentru diagnosticul fibrozei chistice sau al distrofiei miotonice. Metoda aduce rezultate corecte doar în 80-90% din cazuri. Pentru confirmarea rezultatului se recomandă utilizarea ulterioară a unei metode invazive de diagnostic prenatal, precum biopsia vilozităţilor corionice.

Diagnosticul prenatal este aplicat în sarcinile cu risc genetic sau malformativ crescut, depistat anamnestic sau prin screening. El cuprinde metode neinvazive (ecografia de înaltă rezoluţie) şi metode invazive care asigură recoltarea de ţesuturi fetale (amniocenteza sau biopsia vilozităţilor corionice) care vor fi folosite pentru identificarea unor anomalii cromosomice prin cariotipare sau boli monogenice prin diagnostic la nivel ADN sau teste enzimatice.

Metodele invazive de diagnostic prenatal prezintă riscuri pentru produsul de concepţie sau mamă şi pot genera rezultate false, dar aceste dezavantaje sunt reduse comparativ cu beneficiul de a identifica anomaliile înainte de naşterea copilului anormal.

C. INDICAŢIILE DIAGNOSTICULUI PRENATAL Este de dorit ca identificarea cuplurilor cu risc crescut de a avea copii cu boli genetice

sau anomalii congenitale să se facă înainte de apariţia unei sarcini (preconcepţional), astfel încât cuplul să poată lua deciziile reproductive cunoscând caracteristicile bolii şi riscul de recurenţă, opţiunile reproductive şi metodele de diagnostic prenatal disponibile. O alternativă mai puţin satisfăcătoare este identificarea cât mai precoce a sarcinilor cu risc genetic sau malformativ ridicat, pentru a beneficia de modalităţile de diagnostic prenatal existente.

Indicaţiile pentru diagnosticul prenatal sunt următoarele (tabelul 14.8.):


279

Tabelul 14.8. Indicaţiile diagnosticului prenatal

Indicaţia Risc de anomalie

Proceduri disponibile

Screening prenatal de rutină

1:500 Testul triplu (markeri biochimici în serul matern);Ecografia fetală (de nivel I)

Vârstă maternă peste 35 ani 1:200 Ecografie fetală şi triplu test, urmate de biopsie devilozităţi coriale/ amniocenteză, cariotipare

Copil cu boală cromosomică

1:100 Biopsie de vilozităţi coriale / amniocenteză,cariotipare

Unul dintre părinţi purtător al unei translocaţii echilibrate

1 – 10% Analiza unui blastomer prin FISH (diagnosticpreimplantaţional); Biopsie de vilozităţi coriale /amniocenteză, cariotipare

Rudă cu defect de tub neural

1:25 Dozarea -fetoproteinei în serul matern şi lichidul amniotic; Ecografie fetală

Rudă cu defect cardiac sau malformaţie unică

1:25 Ecografie fetală (nivel II), ecocardiografie fetală

Boli dominante autosomale diagnosticate biochimic sau molecular

1:2 Analiza preimplantatorie a blastomerului prin PCR;Analize ADN sau enzimatice ale celulelor recoltateprin biopsie de trofoblast sau amniocenteză

Boli recesive autosomale sau legate de X, diagnosticate biochimic sau molecular

1:4 Analiza preimplantatorie a unui blastomer prinPCR; Analize ADN sau enzimatice ale celulelorrecoltate prin biopsie de trofoblast sauamniocenteză

Boli recesive legate de X pentru care nu există diagnostic molecular sau enzimatic

1:4 FISH preimplantator sau PCR pentru diagnosticul de sex; Biopsie de corion sau amniocenteză pentrustabilirea sexului genetic

Boli monogenice cu anomalii caracteristice

1:2 - 1:4 Ecografie fetală de nivel II

Vârsta maternă înaintată peste 35-38 ani (risc crescut pentru naşterea unui copil cu sindrom Down sau altă trisomie);

Existenţa în familie a unui copil cu o anomalie cromosomică - riscul de recurenţă depinde de natura rearanjamentului cromosomic care a dus la naşterea copilului respectiv şi de segmentele cromosomice specifice implicate;

Istoric familial de anomalii cromosomice. Impune confirmarea anomaliei cromosomice la individul afectat printr-o metodă invazivă de diagnostic prenatal;

Istoric familial de boală monogenică: în cazul bolilor pentru care este posibil diagnosticul prenatal prin metode genetice sau dozări enzimatice (tabelul 14.6.);

Boli genetice transmise legat de cromosomul X − majoritatea bolilor sunt recesive şi afectează în special sexul masculin − când gravida este cert heterozigotă este utilă determinarea sexului fetal prin metode citogenetice sau moleculare.

Istoric familial pozitiv pentru defecte de tub neural. Riscul poate fi apreciat empiric pe baza analizei arborelui genealogic. În situaţiile cu risc empiric crescut se utilizează dozarea α-fetoproteinei în lichidul amniotic, în serul matern sau examinarea ecografică;

Istoric familial pozitiv pentru alte anomalii congenitale − examinare ecografică amănunţită pentru anomalii specifice, realizată la 16-18 săptămâni de gestaţie;


280

Anomalii identificate în cursul sarcinii. Când există modificări ecografice sau ale testului triplu, se recomandă o metodă invazivă de diagnostic prenatal;

Alţi factori de risc crescut. Consangvinitatea determină creşterea riscului pentru boli ereditare sau anomalii congenitale. Istoricul obstetrical cu peste trei avorturi spontane sau naşterea anterioară a unui copil mort poate indica existenţa la unul dintre părinţi a unei anomalii cromosomice echilibrate. Dintre afecţiunile materne diabetul zaharat insulino-dependent prost echilibrat sau epilepsia tratată cu anticonvulsivante cu acţiune antifolică determină un risc crescut pentru anomalii structurale fetale şi sunt indicaţii pentru ecografia prenatală detaliată.

Indicaţia cea mai frecventă pentru diagnosticul prenatal este vârsta maternă mai mare de 35 de ani în momentul concepţiei. Alte indicaţii includ anamneza familială pozitivă pentru anomalii cromosomice sau boli monogenice, ca şi evidenţierea unui rezultat anormal prin unele teste screening.


A. CAZUL 1 O femeie de 25 de ani este trimisă de către medicul obstetrician către un centru de genetică

medicală în vederea efectuării amniocentezei, deoarece are un nepot (fiul surorii ei) cu retard mintal. Amniocenteza este o metodă utilă pentru diagnosticul prenatal al unor afecţiuni asociate cu

retard mintal (boli cromosomice sau monogenice). Metoda nu permite însă screening-ul pentru toate situaţiile ce determină retard mintal. Pentru a putea fi depistată afecţiunea respectivă, trebuie să existe o modificare detectabilă în culturile celulare (de exemplu, o anomalie cromosomică sau un defect enzimatic) sau să fie evidenţiat în lichidul amniotic un produs metabolic anormal.

Alternativ, dacă boala poate fi diagnosticată prin teste moleculare directe sau prin analize de înlănţuire, celulele din lichidul amniotic pot fi utilizate pentru identificarea mutaţiei suspectate.

În cazul de faţă, primul pas este obţinerea acordului medical al nepotului pentru identificarea cauzei retardului său mintal. Dacă nepotul are o afecţiune negenetică, pacienta poate fi asigurată că riscul de a da naştere unui copil cu handicap mental nu este mai crescut decât al altei persoane din populaţie (3:1.000 pentru un retard mintal sever sau mediu, 30:1.000 pentru un retard mintal uşor). Dacă nepotul are sindromul X fragil, se indică evaluarea pacientei pentru a determina dacă este heterozigotă pentru mutaţia respectivă. În acest caz amniocenteza, urmată de diagnosticul molecular pentru identificarea directă a mutaţiei este o metodă eficientă de diagnostic.

O altă posibilitate este ca nepotul să aibă o boală genetică legată de cromosomul X pentru care nu există nici un test pentru evidenţierea heterozigotelor. În această situaţie pacienta poate alege aminocenteza pentru determinarea sexului fătului şi întreruperea sarcinilor cu feţi de sex masculin.

Acest caz demonstrează că amniocenteza este un test diagnostic şi nu unul de screening. El este util numai când se cunoaşte cu precizie un anumit diagnostic. De asemenea, el nu poate garanta naşterea unui copil “normal”. Pentru orice sarcină există un risc genetic şi malformativ de 2-3%. Amniocenteza poate exclude doar anomaliile precise pentru care se realizează testarea, nu toate cauzele.

B. CAZUL 2 O femeie de 30 de ani solicită diagnosticul prenatal cromosomic deoarece are un frate cu

sindrom Down. Primul pas în această situaţie este determinarea tipului de anomalie cromosomică ce a

determinat sindromul Down la fratele consultantei. Dacă anomalia prezentă la frate este o trisomie 21 liberă omogenă sau în mozaic, femeia are un risc nesemnificativ de a naşte un copil cu sindrom Down (aproximativ 1/1.000).


281

Dacă însă fratele său are o trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană neechilibrată, atunci femeia are un risc crescut de a fi purtătoare a unei translocaţii Robertsoniene echilibrate. În această situaţie, se impune efectuarea cariotipului la femeia însărcinată.

Dacă femeia are o translocaţie 14:21 echilibrată, riscul său de a avea un copil cu sindrom Down este de aproximativ 10% şi va fi indicată efectuarea biopsiei vilozităţilor corionice şi a cariotipului fetal. Mai mult, riscul unui rezultat fals în cazul acestui procedeu (1 la 200) este semnificativ mai mare decât riscul copilului de a fi afectat. În această circumstanţă, este esenţială dorinţa pacientului, după informarea în prealabil a posibilităţilor existente. În funcţie de aceasta, se poate recurge la un test screening - testul triplu, până la biopsia vilozităţilor corionice, atunci când există o preocupare importantă pentru reducerea la maxim a riscului naşterii unui copil cu sindrom Down.

C. CAZUL 3 O femeie de 25 de ani se prezintă la medicul de familie la 16 săptămâni de gestaţie, solicitând

diagnostic prenatal. Istoricul său reproductiv evidenţiază naşterea în urmă cu 2 ani a unui copil cu mielomeningocel.

Pentru un cuplu care are un copil cu un defect de tub neural, riscul de recurenţă a anomaliei la sarcinile următoare este de 2-3%. Defectele de tub neural deschise pot fi detectate prin dozarea α-fetoproteinei în lichidul amniotic, care permite depistarea a 95% dintre anomalii. Dacă se asociază şi dozarea în lichidul amniotic a acetilcolinesterazei (o proteină cu specificitate neurală), rata de depistare a defectelor de tub neural este de 99%.

Ecografia de înaltă rezoluţie, efectuată de un ecografist cu multă experienţă, reprezintă o soluţie alternativă pentru părinţii care au un copil cu defect de tub neural. În centrele cu multă experienţă, ecografia permite evidenţierea a 90-95% din defectele de tub neural, o rată de detecţie care nu este cu mult diferită de cea obţinută prin amniocenteză. Astfel, consultanta poate beneficia atât de amniocenteză, cât şi de ecografia de înaltă rezoluţie (care poate depista defecte de dimensiuni mici sau închise). Alegerea metodei va fi realizată de femeie în urma discuţiei cu medicul specialist.

Măsurarea nivelului α-fetoproteinei în serul matern depistează doar 80% din defectele de tub neural deschise şi trebuie utilizată doar ca test de screening pentru sarcinile în care nu există un risc mai mare decât cel din populaţia generală de a avea un copil cu defect de tub neural (adică 1-2 la 1000).


A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI diagnostic prenatal diagnostic genetic preimplantator amniocenteză cordonocenteză biopsia vilozităţilor corionice triplul test

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Care sunt afecţiunile genetice care se pretează la aplicarea unor tehnici de screening şi diagnostic

prenatal? 2. Care sunt dozările biochimice ce constituie testul triplu? 3. Cum sunt valorile dozărilor biochimice ale testul triplu în sarcinile cu embrion cu sindrom Down? 4. Care sunt avantajele şi dezavantajele ecografiei fetale? 5. Care sunt elementele patologice ce pot fi relevate de ecografia fetală de nivel II, respectiv de

ecocardiografia fetală? 6. Când se face puncţia vilozităţilor coriale? Cum pot fi analizate celulele obţinute prin această

metodă? Ce riscuri prezintă investigaţia? 7. Când se face amniocenteza? Cum pot fi analizate celulele obţinute prin această metodă? Ce riscuri

prezintă investigaţia? 8. Ce este cordonocenteza şi care sunt indicaţile absolute ale acesteia? 9. Care sunt indicaţiile efectuării diagnosticului prenatal?


282

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate: 1. În care din situaţiile următoare este indicată biopsia vilozităţilor corionice?

A. cuplul are anterior un copil cu spina bifida; B. la 20 de săptămâni de gestaţie a fost detectat prin ecografie un omfalocel fetal; C. tatăl este purtătorul unei translocaţii t(14;21); D. fratele pacientului are sindrom Down; E. dozarea -fetoproteinei în serul matern a relevat o valoare redusă.

2. Doamna Z are 40 de ani şi un lung istoric de infertilitate; în prezent este purtătoarea unei sarcini de 10 săptămâni. Testul diagnostic recomandat este:

A. screening-ul mai multor markeri biochimici în serul matern; B. amniocenteza; C. cordonocenteza; D. ecografia de înaltă rezoluţie; E. oricare din aceste metode.

3. Toate din următoarele situaţii sunt indicaţii pentru efectuarea examenului citogenetic în celule fetale, CU EXCEPŢIA:

A. vârsta maternă peste 35 de ani; B. un copil născut anterior cu sindrom Down; C. un fetus la care s-a evidenţiat ecografic higroma chistică; D. gravida are un văr de gradul doi cu spina bifida; E. translocaţie robertsoniană echilibrată, diagnosticată la mamă.

4. Dintre enzimele următoare, dozabile în lichidul amniotic, care are importanţă pentru diagnosticul prenatal al mucoviscidozei?

A. α-chimotripsina intestinală; B. fosforibozil-transferaza; C. fosfataza alcalină intestinală; D. acetilcolinesteraza; E. nici una dintre cele de mai sus.

II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel:

A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4.

5.Care dintre următoarele tipuri de anomalii ar putea fi identificate prin ecografie fetală?

1. defectul septal ventricular; 2. osteogenesis imperfecta; 3. hidronefroza fetală; 4. mucoviscidoza.




283

6. Dozarea -fetoproteinei în serul matern este utilă pentru identificarea defectelor de tub neural ale fătului, deoarece această proteină este specific fetală. 7. Celulele amniotice pot fi utilizate pentru diagnosticul citogenetic direct, deoarece aceste celule se divid activ. 8. Amniocenteza este metoda de elecţie pentru diagnosticul hemoglobinopatiilor, deoarece este posibilă electroforeza hemoglobinei din lichidul amniotic. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: Pentru fiecare din următoarele tehnici de diagnostic prenatal asociaţi vârsta gestaţională pentru care este indicată: 9. biopsia vilozităţilor corionice; A. 20-24 săptămâni; 10. cordonocenteza; B. 10-12 săptămâni; 11. amniocenteza clasică; C. 12-14 săptămâni; 12. triplul test; D. 16-18 săptămâni; 13. ecografia de înaltă rezoluţie; E. 18-20 săptămâni.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVÃ

1. ***, Nature, 2001, 409, 6822 2. Alberts B., Bray D., Roberts K., Watson J., Raff M., Lewis J., Molecular Biology of the

Cell, 2nd Ed., Garland Publisher, New York, 1989 3. Beaundet A.L., Introduction to Human Biochemical and Molecular Genetics, McGraw

Hill, New York, 1990 4. Brock D.J.H., Molecular Genetics for the Clinician, Cambridge University Press, 1993 5. Cassidy S.B., Allanson J.E., Management of Genetic Syndromes, Wiley-Liss, New

York, 2001 6. Connor M., Ferguson-Smith M., Medical Genetics, 5th Ed., Blackwell Science, Oxford,

1997 7. Covic M., Angheloni T., Dimofte Iuliana, Genetică umană – lucrări practice, Litografia

IMF Iaşi, 1976 8. Covic M., Biologie şi genetică medicală, Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti,

1981 9. Daries K.E., Human Genetic Disease Analysis, IRL Press, Oxford, 1993 10. Elles R., Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Totowa, NJ, 1996 11. Feingold J., Serre J.L., Genetique humaine, Paris, INSERM 1993 12. Friedman J.M., Dill F.J., Hayden M.R., McGillivray B.C., Genetics, 2nd Ed., National

Medical Series for Independnet Study, Williams and Wilkins, Baltimore, 1996 13. Gelehrter T.D., Collins F.S., Ginsburg D., Principles of Medical Genetics, 2nd Ed.,

Williams and Wilkins, Baltimore, 1998 14. Gorduza Valeria Marta, Tofan Lavinia, Şuteu Daniela, Gorduza E. V., Biomateriale,

Biotehnologii, Biocontrol, Editura CERMI, Iaşi, 2002 15. Harper P.S., Practical Genetic Counseling, 5th Ed., Butter Worth Heinemann, Oxford,

1998 16. Hofee P.A., Medical Molecular Genetics, Fence Creek Publishing, Madison, 1998 17. Jameson J.L. (ed), Principles of Molecular Medicine, Humana Press, Totowa, NJ, 1998 18. Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J., Whyte R.L., Medical Genetics, Mosby Inc, St.

Louis, 1999 19. Korf B.R., Human Genetics – a Problem-based Approach, Blackwell Science,

Cambridge, MA, 1996 20. Lyonnet S., Munnich A. (eds.) Genetique pediatrique, Doin Editeurs, Paris 1997 21. Maximilian C., Ioan Doina, Genetică medicală, Ed. Medicală, Bucureşti 1986 22. Maximilian C., Ionescu B., Citogenetică medicală umană, Editura Academiei Române,

Bucureşti, 1978 23. Mueller R.F., Young J.D., Emery’s Elements of Medical Genetics, 10th Ed., Churchill

Livingstone, London, 1999 24. Nussbaums R.L., McInnes R.R., Willard H.F. (eds.), Thompson &Thompson Genetics in

Medicine, 6th Edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2001 25. Passarge E., Color Atlas of Genetics, Thieme Verlag Stuttgart, 1995

Bibliografie

285

26. Raicu P., Genetică generală şi umană, Editura Humanitas, Bucureşti, 1997 27. Rimoin D., Connor M., Pyeritz R., Emery’s Principles and Practice of Medical

Genetics, Churchill Livingstone, 1997 28. Schwartzacher T., Heslop-Harrison P., Practical in situ hybridization, BIOS Scientific

Publisher lImited, Oxford, 2000 29. Scriver Ch., Beaudet A., Sly W., Valle D., The metabolic and molecular basis of

inherited disease, McGraw Hill Comp., 1995 30. Strachan T., Read A.P., Human Molecular Genetics, 2nd Ed., BIOS Scientific Publisher

Limited, Oxford, 1999 31. Tudose Olimpia, Belengeanu Valerica, Puiu Maria, Stoicănescu Dorina, Gug Cristina,

Moga Mirela, Genetică medicală, Editura Orizonturi Universitare, Timişoara, 2000 32. Wilson G.N., Clinical Genetics a Short Course, Wiley-Liss Inc., New York, 2000 33. Young I.D., Introduction to Risk Calculation in Genetic Counseling, Oxford University

Press, 1999

CUPRINS

INTRODUCERE……………………………………………………………………1 1. APARATUL GENETIC AL CELULEI ........................................................... 3

I. Date teoretice………………………………………………………………….3 A. Genetica - ştiinţa eredităţii şi variabilităţii……………………………………3

1. Definiţii…………………………………………………………………………..3 a. Ereditatea……………………………………………………………………………...3 b. Variabilitatea ............................................................................................................... 3

2. ADN - substratul biochimic al eredităţii ............................................................ 3 B. Aparatul genetic al celulei ................................................................................... 5

1. Nucleul .................................................................................................................. 5 2. Mitocondriile ........................................................................................................ 6

C. Ciclul celular .......................................................................................................... 6 1. Definiţie. Perioade. Durată ................................................................................. 6

a. Interfaza ....................................................................................................................... 6 b. Diviziunea celulară ..................................................................................................... 6 c. Durata ciclului celular ............................................................................................... 6

2. Fazele ciclului celular mitotic............................................................................ 6 a. Faza G1 ........................................................................................................................ 6 b. Faza S .......................................................................................................................... 8 c. Faza G2 ........................................................................................................................ 9 d. Faza M ......................................................................................................................... 9

3. Evoluţia celulelor rezultate prin diviziune ......................................................... 9 a. Proliferarea .................................................................................................................. 9 b. Diferenţierea ................................................................................................................ 9 c. Stadiul de repaus........................................................................................................ 9

4. Controlul ciclului celular .................................................................................... 9 D. Nucleul ................................................................................................................... 12

1. Nucleul interfazic .............................................................................................. 12 a. Compoziţia chimică a cromatinei .......................................................................... 13 b. Aspectul cromatinei la microscopul optic ............................................................ 13 c. Aspectul cromatinei la microscopul electronic .................................................... 13

2. Nucleul în diviziune ......................................................................................... 13 a. Numărul cromosomilor ............................................................................................ 13 b. Cromosomii omologi ..................................................... Error! Bookmark not defined. c. Morfologia cromosomilor ......................................................................................... 14

II. Aplicaţii practice........................................................................................... 15 A. Aspectul celulelor pe parcursul ciclului celular ............................................ 15 B. Schimburile dintre cromatidele surori ............................................................ 15

1. Principiul metodei SCE .................................................................................... 15 2. Identificarea SCE .............................................................................................. 15

C. Evaluarea replicării asincrone a ADN ................. Error! Bookmark not defined. 1. Principiul metodei autoradiografice .................. Error! Bookmark not defined.

Cuprins

II

2. Identificarea replicării tardive ............................ Error! Bookmark not defined. D. Condensarea prematură a cromosomilor ................. Error! Bookmark not defined. E. Compoziţia chimică a cromatinei ..................................................................... 15 F. Aspectul cromatinei la microscopul optic ............................................................ 16 G. Morfologia cromosomilor ................................................................................... 16

III. Verificarea cunoştinţelor ............................................................................ 16 A. Definiţi noţiunile următoare: ............................................................................. 16 B. Întrebări cu răspuns simplu .............................................................................. 16 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................. 17

2. DIVIZIUNEA CELULEI ............................................................................... 19 I. Date teoretice .................................................................................................. 19

A. Generalităţi ........................................................................................................... 19 B. Mitoza .................................................................................................................... 19

1. Fazele mitozei .................................................................................................. 19 a. Profaza ........................................................................................................................ 19 b. Prometafaza ............................................................................................................... 20 c. Metafaza ..................................................................................................................... 21 d. Anafaza ...................................................................................................................... 21 e. Telofaza ...................................................................................................................... 21

2. Erori de distribuţie a materialului genetic în mitoză ............................................ 22 a. Nedisjuncţia cromatidiană ....................................................................................... 22 b. Întârzierea anafazică ............................................................................................. 23 c. Clivarea transversală a centromerului ...................................................................... 24 d. Absenţa citokinezei ................................................................................................... 24 e. Consecinţele erorilor mitotice ................................................................................. 24

C. Meioza .................................................................................................................... 25 1. Meioza I ............................................................................................................. 25

a. Profaza I .................................................................................................................... 25 b. Metafaza I .................................................................................................................. 28 c. Anafaza I .................................................................................................................... 28 d. Telofaza I ................................................................................................................... 29

2. Meioza II ........................................................................................................... 29 a. Profaza II. .................................................................................................................. 29 b. Metafaza II. ............................................................................................................... 29 c. Anafaza II. ................................................................................................................. 29 d. Telofaza II. ................................................................................................................ 29

3. Particularităţile meiozei la bărbat şi femeie ................................................... 30 4. Accidente de distribuţie a materialului genetic în meioză şi consecinţele lor ..... 32

a. Nedisjuncţia ................................................................................................................ 32 b. Întârzierea anafazică ................................................................................................ 33 c. Nesepararea "citelor" de ordin II ......................................................................... 33

II. Aplicaţii practice ........................................................................................... 33 III. Verificarea cunoştinţelor ............................................................................ 35

A. Definiţi noţiunile următoare: ............................................................................. 35 B. Întrebări cu răspuns simplu .............................................................................. 36

3. CROMATINA SEXUALA ................................................................................. 38 I. Date teoretice ................................................................................................... 38

A. Generalităţi ............................................................................................................ 38 B. Cromatina X ......................................................................................................... 39

1. Studiul cromatinei x pe frotiul de mucoasă bucală .............................................. 40

Cuprins

III

a. Morfologie .................................................................................................................. 40 b. Frecvenţa .................................................................................................................... 40 c. Interpretare ................................................................................................................ 40

2. Studiul cromatinei X pe frotiul de sânge periferic în polimorfonucleare neutrofile . 41 a. Morfologie .................................................................................................................. 42 b. Frecvenţa .................................................................................................................... 42 c. Interpretare ................................................................................................................ 43

C. Cromatina Y ........................................................................................................ 43 1. Morfologie .......................................................................................................... 43 2. Frecvenţa ............................................................................................................ 43 3. Interpretare ......................................................................................................... 44

D. Valoarea practică a testului cromatinei sexuale (indicaţii şi limite) .......... 44 II. Aplicaţii practice........................................................................................... 46

A. Tehnica de studiu a cromatinei X pe frotiul de mucoasă bucală ............. 46 B. Tehnica de studiu a cromatinei X în polimorfonuclearele neutrofile ........ 47 C. Analiza unor preparate microscopice .............................................................. 47 D. Discutarea indicaţiilor practice ale testului cromatinei sexuale ................... 47

III. Verificarea cunoştinţelor ............................................................................ 48 A. Definiţi noţiunile următoare:............................................................................. 48 B. Întrebări cu răspuns simplu ............................................................................. 48 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................. 48

4. CROMOSOMII UMANI ................................................................................... 50 I. Date teoretice ................................................................................................... 50

A. Generalităţi ............................................................................................................ 50 B. Metode de studiu a cromosomilor umani ....................................................... 50

1. Obţinerea de celule în diviziune ......................................................................... 50 2. Blocarea diviziunilor în metafază .................................................................... 50 3. Obţinerea preparatelor cromosomice ................................................................... 51

C. Identificarea cromosomilor umani ................................................................... 52 1. Criterii morfologice de identificare .................................................................. 52

B. Identificarea cromosomilor prin marcaj în benzi ......................................... 55 C. Tehnici de citogenetică moleculară ................................................................... 58 D. Nomenclatura cromosomilor umani .................................................................... 60 E. Variaţiile cariotipului la persoane cu fenotip normal - polimorfismul cromosomic ................................................................................................................. 62

II. Aplicaţii practice........................................................................................... 63 III. Întrebări şi teste pentru verificarea cunoştinţelor ....................................... 63

A. Definiţi noţiunile .................................................................................................. 63 B. Întrebări cu răspuns simplu ............................................................................. 64 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................. 65

5. ANOMALIILE ŞI BOLILE CROMOSOMICE........................................... 66 I. Date teoretice ................................................................................................. 66

A. Clasificare ............................................................................................................. 66 B. Anomalii numerice .............................................................................................. 67

1. Poliploidiile ........................................................................................................ 68 2. Aneuploidiile ...................................................................................................... 68

a. Etiologia aneuploidiilor ............................................................................................ 68 b. Mecanismele de apariţie ale aneuploidiilor ......................................................... 69

Cuprins

IV

C. Anomaliile de structură ale cromosomilor ..................................................... 70 1. Cauzele şi mecanismele de producere ale anomaliilor cromosomice structurale 71 2. Anomalii cromosomice structurale echilibrate ................................................ 71

a. Inversiile ..................................................................................................................... 71 b. Translocaţiile ............................................................................................................... 73

3. Anomalii cromosomice structurale neechilibrate ............................................ 77 a. Deleţiile ....................................................................................................................... 78 b. Duplicaţiile .................................................................................................................. 79 c. Cromosomii inelari...................................................................................................... 79 d. Cromosomii dicentrici ................................................................................................ 80 e. Isocromosomii.............................................................................................................. 80

4. Consecinţele anomaliilor cromosomice neechilibrate ...................................... 81 5. Disomiile uniparentale ......................................................................................... 82

D. Sindroame cromosomice ..................................................................................... 84 1. Sindromul Down .................................................................................................. 84 2. Sindromul Edwards ............................................................................................ 87 3. Sindromul Patau ................................................................................................. 88 4. Trisomia 8 ........................................................................................................... 88 5. Sindromul cri du chat .......................................................................................... 89 6. Sindromul Wolf-Hirschhorn ................................................................................ 90 7. Sindromul Turner ................................................................................................ 90 8. Sindromul Klinefelter .......................................................................................... 93 9. Sindromul triplo X ............................................................................................... 95 10. Sindromul dublu Y ........................................................................................... 95 11. Sindromul X fragil ............................................................................................. 95 12. Modificări cromosomice în cancer .................................................................... 96 13. Stările intersexuale........................................................................................... 97

E. Indicaţiile practice ale studiului cromosomilor umani ....................................... 97 II. Aplicaţii practice ........................................................................................... 98 III. Verificarea cunoştinţelor .......................................................................... 102

A. Definiţi următorii termeni ............................................................................... 102 B. Răspundeţi la următoarele întrebări.............................................................. 102 C. Teste cu alegere multiplă ................................................................................ 103

6. CARACTERE EREDITARE NORMALE CU DETERMINISM MONOGENIC ...................................................................................................... 105

I. Date teoretice ................................................................................................. 105 A. Definiţii. Particularităţi ....................................................................................... 105 B. Tipuri de caractere normale monogenice ........................................................ 107

1. Grupele sanguine ............................................................................................. 107 a. Sistemul de grup sanguin AB0 ............................................................................. 108 b. Sistemul de grup sanguin Rh ................................................................................... 109 c. Sistemul de grup sanguin MNSs .............................................................................. 112 d. Sistemul de grup sanguin Xg ................................................................................... 112

2. Grupe din secreţii ............................................................................................. 113 3. Grupele serice .................................................................................................. 113

a. Haptoglobinele .......................................................................................................... 114 b. Transferinele ............................................................................................................. 114 c. Grupul component specific .................................................................................... 114

4. Grupele enzimatice ........................................................................................... 114

Cuprins

V

5. Grupele tisulare ............................................................................................... 115 6. Sensibilitatea gustativă .................................................................................... 116

C. Valoarea teoretică şi practică a studiului caracterelor ereditare normale ..... 117 II. Aplicaţii practice........................................................................................... 119

A. Stabilirea paternităţii şi filiaţiei ..................................................................... 119 1. Determinarea grupelor sanguine posibile la copii ....................................... 119 2 Determinarea grupelor sanguine posibile la părinţi ............................................ 120 3. Determinarea filiaţiei şi paternităţii ................................................................... 120

B. Determinarea compatibilităţii transfuzionale .................................................... 121 C. Determinarea statusului secretor .................................................................... 122 D. Determinarea sensibilităţii gustative la feniltiocarbamidă ......................... 123

III. Verificarea cunoştinţelor .......................................................................... 123 A. Definiţi noţiunile următoare:............................................................................ 123 B. Intrebări cu răspuns simplu ............................................................................ 123 C. Teste cu alegere multipl| .................................................................................. 124

7. TRANSMITEREA EREDITARÃ A CARACTERELOR MONOGENICE ANORMALE. BOLI MONOGENICE. .............................................................. 133

I. Date teoretice ................................................................................................. 133 A. Generalităţi .......................................................................................................... 133 B. Transmiterea dominantă .................................................................................... 135

1. Transmiterea dominantă autosomală ................................................................. 136 2. Transmiterea dominantă legată de cromosomul x ............................................. 138

C. Transmiterea recesivă ......................................................................................... 140 1. Transmiterea recesivă autosomală ..................................................................... 142 2. Transmiterea recesivă legată de cromosomul x ................................................. 143

D. Manifestări variabile ale mutaţiilor genice ....................................................... 146 1. Penetranţa .......................................................................................................... 146 2. Expresivitatea .................................................................................................... 147 3. Specificitatea de organ ...................................................................................... 149

E. Pleiotropia şi heterogenitatea genetică .............................................................. 149 F. Consanguinitatea şi rolul ei în bolile recesive autosomale ................................ 149

II. Aplicaţii practice........................................................................................... 152 A. Identificarea modului de transmitere al unei boli ereditare şi evaluarea riscului de recurenţă .............................................................................................. 152

1. Cazul clinic 1 ..................................................................................................... 152 2. Cazul clinic 2 ..................................................................................................... 153 3. Cazul clinic 3 ..................................................................................................... 154

B. Evaluarea unui caz sporadic ............................................................................... 155 III. Verificarea cunoştinţelor ............................................................................ 157

A. Definiţi termenii următori: ................................................................................. 157 B. Răspundeţi la următoarele întrebări: ................................................................ 157 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................... 158

8. EREDITATEA MULTIFACTORIALĂ ........................................................ 161 I. Date teoretice ................................................................................................. 161

A. Tipuri de ereditate multifactorială ................................................................ 161 1. Ereditatea multifactorială a caracterelor cantitative (modelul distribuţiei continue)161 2. Ereditatea multifactorială cu prag (caractere cu distribuţie discontinuă) ... 163

Cuprins

VI

B. Riscul de recurenţă în afecţiunile multifactoriale ....................................... 164 C. Ereditatea oligogenică ....................................................................................... 165 D. Metode de apreciere a determinismului genetic al unui caracter multifactorial 166

1. Studiul gemenilor ............................................................................................ 167 2. Studiile de adopţie .......................................................................................... 167

E. Identificarea genelor implicate în determinismul caracterelor multifactoriale ... 168 F. Dermatoglifele – exemplu de caracter normal cu determinism multifactorial ... 169

1. Dermatoglifele digitale ...................................................................................... 169 2. Dermatoglifele palmare ................................................................................... 170 3. Aspectul dermatoglifelor în unele sindroame cromosomice ........................ 171

II. Aplicaţii practice ......................................................................................... 172 A. Calculul coeficientului ereditar pentru unele caractere multifactoriale .. 172 B. Metode de studiu al dermatoglifelor ............................................................. 173

III. Verificarea cunoştinţelor ........................................................................... 174 A. Definiţi următoarele noţiuni: ........................................................................... 174 B. Întrebări cu răspuns simplu ................................................................................ 174 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................... 174

9. GENETICA POPULA]IILOR ......................................................................... 178 I. Date teoretice .................................................................................................. 178

A. Obiectivele geneticii populaţiilor ........................................................................ 178 B. Legea Hardy - Weinberg ..................................................................................... 179 C. Factorii care modifică echilibrul Hardy - Weinberg ........................................ 182

1. Căsătoriile neîntâmplătoare ............................................................................... 182 2. Populaţiile reduse ............................................................................................ 184 3. Mutaţiile ............................................................................................................ 184 4. Selecţia .............................................................................................................. 185 5. Migraţiile şi fluxul genic ................................................................................... 187

D. Modul de aplicare a legii Hardy -Wweinberg în bolile monogenice ............... 188 1. Boli dominant autosomale ............................................................................. 188 2. Boli recesiv autosomale ................................................................................. 188 3. Boli recesive cu transmitere legată de cromosomul X ................................. 188

II. Aplicaţiile practice ........................................................................................ 188 III. Verificarea cunoştinţelor ............................................................................ 189

A. Definiţi următoarele noţiuni: ........................................................................... 189 B. Întrebări cu răspuns simplu ................................................................................ 189 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................... 189

10. CONSULTUL GENETIC ............................................................................ 192 I. Date teoretice ................................................................................................ 192

A. Particularităţile caracterelor ereditare ........................................................... 192 1. Distribuţia familială ........................................................................................... 192 2. Transmiterea genealogică ................................................................................. 192 3. Manifestarea congenitală .................................................................................. 193 4. Identitatea caracterului la gemenii monozigoţi .............................................. 193 5. Asocierea cu un marker genetic ..................................................................... 193 6. Apariţia spontană .............................................................................................. 193 7. Prezenţa anomaliilor cromosomice .................................................................. 193 8. Frecvenţa diferită în populaţii diferite ........................................................... 194

B. Obiectivele consultului genetic.......................................................................... 194

Cuprins

VII

1. Cadru organizatoric ........................................................................................ 195 2. Indicaţiile consultului genetic .......................................................................... 195 3. Etapele consultului genetic ............................................................................ 197

a. Înregistrarea datelor medicale ale pacientului .................................................. 197 b. Anamneza familială ................................................................................................ 197 c. Examenul clinic ....................................................................................................... 201 d. Investigaţii paraclinice ........................................................................................... 202 e. Analiza şi sinteza datelor ...................................................................................... 202

II. Aplicaţii practice ....................................................................................... 203 A. Anamneza familială 1 .......................................................................................... 203 B. Anamneza familială 2 .......................................................................................... 204 C. Anamneza familială 3 .......................................................................................... 205 D. Anamneza familială 4 .......................................................................................... 206

III. Verificarea cunoştinţelor ......................................................................... 207 A. Definiţi următoarele noţiuni: ............................................................................. 207 B. Întrebări cu răspuns simplu ............................................................................... 207 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................... 207

11. DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL BOLILOR GENETICE .......... 209 I. Date teoretice ............................................................................................... 209

A. Definiţie. Obiective. ........................................................................................... 209 B. Tehnici de diagnostic molecular ..................................................................... 211

1. Digestia cu enzime de restricţie .................................................................... 211 2. Separarea fragmentelor de ADN prin electroforeză în gel ........................ 212

A. Electroforeza în gel de agaroză ............................................................................... 212 B. Electroforeza în gel de poliacrilamidă .................................................................... 213 C. Electroforeza în câmp electric pulsatil ................................................................... 213

3. Amplificarea in vitro a secvenţelor de ADN ................................................ 213 4. Secvenţializarea ADN ..................................................................................... 214 5. Hibridarea acizilor nucleici ............................................................................ 215

A. Southern blotting ..................................................................................................... 215 B. Northern blotting ..................................................................................................... 215

C. Metode de diagnostic molecular ...................................................................... 217 D. Urmărirea transmiterii genealogice a mutaţiei…………………………….219

II. Aplicaţii practice......................................................................................... 220 1. Caz clinic 1 ..................................................................................................... 220 2. Caz clinic 2 ..................................................................................................... 221

III. Verificarea cunoştinţelor .......................................................................... 221 A. Definiţi următorii termeni ............................................................................... 222 B. Întrebări cu răspuns simplu ........................................................................... 222 C. Teste cu alegere multiplă……………………………………………………..222

12. SFATUL GENETIC ....................................................................................... 225 I. Date teoretice ............................................................................................... 225

A. Definiţie ............................................................................................................... 225 B. Circumstanţe de acordare a sfatului genetic ................................................ 225 C. Etapele acordării sfatului genetic ....................................................................... 226 D. Riscul de recurenţă în boli genetice .............................................................. 229

1. Riscul genetic în boli cromosomice .............................................................. 229 a. Sfatul genetic în familiile cu boli cromosomice ............................................... 229 b. Sfatul genetic în anomalii cromosomice structurale echilibrate ..................... 231

Cuprins

VIII

2. Riscul genetic în boli monogenice ................................................................ 232 a. Calculul probabilistic în bolile monogenice ....................................................... 232 b. Sfatul genetic în boli dominante ......................................................................... 235 c. Sfatul genetic în bolile recesiv autosomale .............................................................. 238 d. Boli recesive cu transmitere legată de cromosomul X ................................... 242

3. Riscul genetic în boli multifactoriale ............................................................. 244 4. Categorii de risc genetic ................................................................................ 246

II. Aplicaţii practice ......................................................................................... 248 A. Caz clinic 1 – boală dominant autosomală ..................................................... 248 B. Caz clinic 2 – boală recesiv autosomală ........................................................ 250 C. Caz clinic 3 – boală recesivă cu transmitere lagată de cromosomul X ........ 252 D. Caz clinic 4 – sindrom down ............................................................................ 254

III. Verificarea cunoştinţelor .......................................................................... 255 A. Definiţi următorii termeni ............................................................................... 255 B. Întrebări cu răspuns simplu ............................................................................ 255 C. Teste cu alegere multiplă ................................................................................ 256

13. SCREENING-UL POPULAŢIONAL AL BOLILOR GENETICE ...... 258 I. Date teoretice ................................................................................................ 258

A. Definiţie. Principiile screening-ului populaţional. ........................................ 258 B. Screening-ul neonatal .......................................................................................... 259

1. Fenilcetonuria ................................................................................................... 259 2. Hipotiroidia congenitală .................................................................................... 260 3. Galactozemia ..................................................................................................... 260 4. Mucoviscidoza .................................................................................................. 260

C. Depistarea purtătorilor de mutaţii .................................................................... 261 1. Depistarea heterozigoţilor pentru mutaţii recesive ............................................ 262

a. Evidenţierea unor manifestări clinice minore ................................................... 263 b. Evidenţierea de modificări histo- sau fiziopatologice ........................................ 263 c. Evidenţierea unor modificări biochimice ................................................................ 263 d. Detecţia mutaţiei la nivel de adn ......................................................................... 263

2. Diagnosticul presimptomatic în boli dominante ........................................... 264 a. Examinarea clinică .................................................................................................. 265 b. Investigaţiile paraclinice ......................................................................................... 265 c. Teste biochimice ...................................................................................................... 266 d. Analize de înlănţuire genică ................................................................................. 266

II. Aplicaţii practice ........................................................................................... 266 A. Screening-ul neonatal al fenilcetonuriei ............................................................ 266 B. Caz clinic .............................................................................................................. 267 C. Identificarea heterozigoţilor prin studiul înlănţuirii cu markeri ADN polimorfi 267

III. Verificarea cunoştinţelor .......................................................................... 267 A. Definiţi următorii termeni: .............................................................................. 267 B. Întrebări cu răspuns simplu ............................................................................. 267 C. Teste cu alegere multiplă ................................................................................... 268

14. SCREENING-UL {I DIAGNOSTICUL PRENATAL ................................ 270 I. Date teoretice .................................................................................................. 270

A. Screening-ul prenatal .......................................................................................... 270 1. Dozarea -fetoproteinei şi triplul test ........................................................... 271 2. Echografia fetală .............................................................................................. 272

B. Diagnosticul prenatal ......................................................................................... 273

Cuprins

IX

1. Ecografia de nivel II şi ecocardiografia fetală ............................................ 274 2. Biopsia vilozităţilor corionice ........................................................................ 275 3. Amniocenteza ................................................................................................... 276 4. Cordonocenteza ................................................................................................ 277 5. Fetoscopia şi biopsia unor ţesuturi fetale ..................................................... 277 6. Metode noi de diagnostic prenatal ................................................................ 278

a. Detecţia celulelor fetale în circulaţia maternă .................................................. 278 b. Diagnosticul genetic preimplantator .................................................................... 278

C. Indicaţiile diagnosticului prenatal .................................................................. 278 II. Aplicaţii practice........................................................................................... 280

A. Cazul 1 .................................................................................................................. 280 B. Cazul 2 .................................................................................................................. 280 C. Cazul 3 .................................................................................................................. 281

III. Verificarea cunoştinţelor ........................................................................... 281 A. Definiţi următoarele noţiuni ............................................................................ 281 B. Întrebări cu răspuns simplu…………………………………………………….281 C. Teste cu alegere multiplă .................................................................................. 2812

BIBLIOGRAFIE SELECTIVÃ ......................................................................... 284 CUPRINS ................................................................................................................... I

carte lp genetica 2003

Documents