capitolul i. stadiul actual al cercetărilor în domeniul ... · biosenzori - considerații...
TRANSCRIPT
1
Capitolul I. Stadiul actual al cercetărilor în domeniul problematicii
biosenzorilor şi al materialelor folosite la realizarea acestora
1.1. Introducere
Cererea mare de metode de analiză sensibile, specifice, rapide şi precise a motivat
interesul pentru dezvoltarea de materiale a senzorilor şi biosenzorilor electrochimici ca
instrumente de analiză. Capacitatea acestora de a furniza în mod continuu şi reversibil un
răspuns selectiv şi rapid faţă de prezenţa unui compus specific dintr-un amestec complex de
compuşi este exploatată nu doar în industria alimentară ci şi în medicină, agricultură, mediu,
farmacie [1].
I.1.1. Biosenzori - considerații generale și clasificare
Biosenzorii pot fi clasificaţi în funcţie de elementul biologic ce conferă specificitatea,
sau în funcţie de tipul traductorului utilizat: se cunosc biosenzori electrochimici, optici,
termici şi piezoelectrici [2]. În Fig.I.1 este redată schema de principiu al unui biosenzor
amperometric.Traductorii electrochimici şi în special cei amperometrici sunt cel mai bine
descrişi în literatura de specialitate, preferaţi datorită avantajelor pe care le oferă, şi anume:
sensibilitate crescută, preţ scăzut, posibilitatea de miniaturizare şi integrare în aparate
portabile, sunt uşor de utilizat [3-5].
Conform definiţiei dată de IUPAC [6,7], un biosenzor chimic este un dispozitiv
capabil să furnizeze informaţii analitice cantitative sau semicantitative, folosind un element
biologic (receptor biochimic) aflat în contact direct cu un traductor fizic [8 -10].
Biosenzorii chimici sunt compuşi din două unităţi funcţionale de bază: un bioreceptor
şi un traductor. Bioreceptorul are rolul de a transforma informaţia chimică într-o formă de
energie ce poate fi măsurată de traductor, în timp ce traductorul transformă energia respectivă
într-un semnal analitic util.
Fig.I.1. Schemă reprezentând principiile funcţionale ale unui biosenzor amperometric [11]
Elementul biologic asigură fenomenul de recunoaştere specifică a analitului, iar
traductorul, aflat sub potenţialul aplicat, generează un semnal asociat cu recunoaşterea
specifică. Tehnologia biosenzorilor amperometrici a cunoscut progrese importante în ultimele
decenii, timp în care au fost studiaţi şi realizaţi cu succes biosenzori de mai multe tipuri,
pentru diferiţi analiţi. Astăzi, biosenzorii amperometrici se dezvoltă ca instrumente analitice
importante pentru testele în laboratoare clinice, monitorizare a proceselor biologice şi a
mediului. Problematica biosenzorilor o reprezintă dezvoltarea unui material ideal de electrod,
2
care să fie compatibil cu o componentă biologică, să prezinte stabilitate, posibilitate de
miniaturizare şi capacitatea de a răspunde rapid. Limitările majore în dezvoltarea
biosenzorilor sunt cauzate de compatibilitatea dintre materialul suprafeţei traductorului şi
componenta biologică [12-13]. În perioada de început a fabricării biosenzorilor, materialul
avea rolul de matrice suport pentru înglobarea elementului biologic de recunoaştere.
În ultimile două decenii, datorită progreselor înregistrate în ştiinţa materialelor, au fost
realizate noi metode de imobilizare a enzimelor şi a mediatorilor, cu transfer de electroni.
Actualmente, principalele direcţii de cercetare în domeniul biosenzorilor au drept scop
realizarea unor noi materiale de electrod care să permită adaptarea proprietăţilor, astfel încât
să fie aplicabile pentru detecţia unui număr mare de analiţi. Atunci când sunt complet
optimizaţi, biosenzorii sunt uşor de utilizat şi nu necesită personal specializat şi nici efort de
manevrare mare, pot fi integraţi în aparate portabile şi folosiţi în afara unui laborator
specializat [13]. Elementul cel mai problematic la orice tip de biosenzor este traductorul
sarcina lui principală este aceea de a furniza un semnal de tensiune și de curent proporţional
cu concentraţia analitului. Aceasta nu este însă singura sa sarcină astfel el trebuie să fie:
- selectiv ceea ce înseamnă ca mărimea de ieşire electrică să nu fie influenţată de
alte specii chimice sau biologice prezente în analit.
- sa prezinte sensibilitate ridicată ceea ce permite limite de detecţie bune
- sa prezinte reproductibilitate bună a datelor
- sa prezinte timp de răspuns rapid
În continuare sunt prezentaţi biosenzorii potenţiometrici şi cei amperometrici precum şi
problematica de materiale utilizate.
a) Biosenzori potenţiometrici
Măsurătorile potenţiometrice implică determinarea diferenţei de potenţial dintre un
electrod de lucru şi un electrod de referinţă, sau între doi electrozi de referinţă separaţi de o
membrană permselectivă prin care nu circulă un curent electric semnificativ. Traductorul
poate fi un electrod ion selectiv (ISE), un electrod de pH, un electrod selectiv pentru gaze
(CO2, NH3) etc.
Atunci cînd stratul biocatalizator este plasat pe traductorul potenţiometric, trebuie să
se aibă în vedere:
transportul reactanţilor la suprafaţa biosenzorului
difuzia reactanţilor în stratul sensibil
reacţia analitului cu specia biologică
difuzia produşilor de reacţie din stratul catalitic la suprafaţa electrodului
variaţia de potenţial indusă detectorului [14].
Dependenţa de potenţial şi concentraţia (activitatea) analitului este logaritmică [15].
b) Biosenzori amperometrici
Biosenzori amperometrici se bazează pe măsurarea curentului de electroliză rezultat
la oxidarea sau reducerea unor specii electroactive pe suprafaţa electrodului de lucru, atunci
cînd se lucrează la un potenţial constant [8].Curentul rezultat este corelat direct cu
concentraţia speciei detectate. Biosenzorul amperometric are un timp de răspuns mai scurt,
este mai sensibil şi precis decât cel potenţiometric, iar răspunsul este o funcţie liniară de
concentraţia analitului.
Selectivitatea traductorului amperometric este dată de potenţialele redox ale speciilor
electroactive prezente [1]. Prima generaţie de biosenzori amperometrici măsurau consumul
de oxigen sau producerea de apă oxigenată într-o reacţie enzimatică; un exemplu este
3
determinarea glucozei utilizând glucozoxidaza şi electrodul de oxigen de tip Clark [16].
Pentru a ameliora performanţele biosenzorilor amperometrici, electrodul de lucru poate fi
modificat cu mediatori electrochimici.
I.2. Materiale de electrod folosite la realizarea biosenzorilor
O atenţie deosebită se acordă naturii materialului de electrod, datorită faptului că
structura şi proprietăţile acestuia determină proprietăţile traductorului, precum şi ale
interfeţei traductor.
Materialele utilizate în construcţia biosenzorilor electrochimici pot fi clasificate în:
i) material pentru electrozi şi substratul suport
ii) materiale pentru imobilizarea elementelor de recunoaştere biologică
iii) elemente biologice [17].
Dezvoltarea rapidă a tehnologiei materialelor de electrod a permis extinderea
domeniului de compuşi detectabili. La ora actuală, sunt necesare noi materiale care să
îmbunătăţească stabilitatea mecanică şi chimică a senzorilor pentru aplicaţii practice în
condiţii variate şi totodată, care să simplifice metodologia de imobilizare a biomoleculelor,
asigurînd controlul spaţial al acestora. Cele mai importante materiale folosite pentru
construcţia senzorilor şi biosenzorilor chimici constau în polimeri organici, materialele sol-
gel, materiale semiconductoare şi compozite.
I.2.1. Proprietăţile materialelor ideale folosite pentru realizarea biosenzorilor
Un domeniu de cercetare din ce în ce mai dezvoltat în ultimul timp este reprezentat de
implementarea a noi materiale, utilizate în construcţia biosenzorilor, biocipurilor,
nanosenzorilor şi a altor traductori [18]. Se efectuează cercetări pentru găsirea materialului
ideal, care să asigure biosenzorului caracteristicile optime.
În principiu, în construcţia unui biosenzor trebuie respectate o serie de cerinţe în
selectarea materialului de electrod.
i) compatibilitate cu elementul biologic
ii) absenţa barierelor de difuzie
iii) stabilitate la modificările de temperatură, pH
iv) sensibilitate şi selectivitate satisfăcătoare pentru analitul de interes
v) cost mic şi posibilitate de producţie în masă.
De asemenea, materialele de electrod trebuie să prezinte grupările funcţionale
necesare pentru ataşarea biomoleculelor, sau să permită cu uşurinţă introducerea de grupări
funcţionale. Există situaţii când biosenzorii sunt aplicaţi şi utilizaţi în condiţii severe, în
aceste cazuri fiind necesare materiale cu rezistenţă mecanică şi chimică specială.
De asemenea, un material de electrod ideal trebuie să prezinte o bună conductibilitate,
pentru a asigura un transfer rapid de electroni. Electrozii de lucru utilizaţi în realizarea
biosenzorilor sunt în general solizi. Electrodul de mercur este singurul electrod lichid la
temperatura camerei, însă folosirea acestuia la biosenzori electrochimici este frecvent [19].
Materialele de electrod cele mai utilizate pentru construcţia biosenzorilor sunt platina,
cărbunele vitros şi aurul, folosite în special pentru oxidarea anodică a apei oxigenate.
Alte tipuri de materiale de electrod pe bază de carbon (grafit, pastă de cărbune sunt
folosite pentru oxidarea anodică a apei oxigenate şi a mediatorilor redox. Aceste tipuri de
electrozi îndeplinesc condiţiile necesare pentru obţinerea unui electrod de lucru cu
performanţe foarte bune [20], conductibilitate, prezintă curenţi de bază mici, iar suprafaţa lor
4
poate fi uşor modificată chimic sau electrochimic, un avantaj este cel al preţului de cost
scăzut.Introducerea materialelor paladiu, platina, ruteniu şi cobalt sub formă de nanoparticule
în pulberea de grafit oferă o activitate electrocatalitică mai eficientă (timp de răspuns mai
scurt, potenţial aplicat mai mic) în comparaţie cu pastele convenţionale de grafit [21]. Alte
materiale solide folosite în realizarea electrozilor sunt semiconductori de tipul oxizilor
metalici TiO2, SiO2 etc. [22-23].
I.2.2. Modificarea materialului de electrod
Prin modificarea electrozilor utilizaţi în tehnicile de analiză electrochimică devine
posibilă lărgirea domeniului de aplicabilitate al acestor metode, cât şi ameliorarea
performanţelor acestora. Un electrod modificat chimic prezintă un modificator, legat direct de
suprafaţa acestuia fie printr-o legătură chimică, fie printr-o interacţie de natură fizică.
Modificatorii depuşi pe electrozi sunt folosiţi pentru a da un înalt grad de selectivitate
sensibilitate şi răspuns rapid traductorilor electrochimici.
Modificarea unui electrod implică imobilizarea pe suprafaţa acestuia a reactivului,
care schimbă caracteristicile electrochimice ale suprafeţei acestuia. Există numeroase metode
de imobilizare, capabile să reţină materialul biologic activ pe suprafaţa traductorului fizic
[24]. În acest context, este esenţială alegerea materialului de electrod, care trebuie să fie
biocompatibil cu materialul suport şi să răspundă sensibil la produsul rezultat din reacţia
enzimatică. Suprafaţa materialului de electrod în starea naturală, poate servi ca matrice suport
pentru ataşarea biomoleculelor, prin procedeul de adsorbţie fizică. Acest proces implică doar
legături de tip van der Waals şi interacţii hidrofobe [25-26]. Prin urmare, aceşti biosenzori
sunt caracterizaţi de parametri analitici cu valori neperformante, în special cu privire la
stabilitatea operaţională şi de lungă durată. În plus, materialului biologic adsorbit este direct
expus şi influenţat de variaţiile de pH, temperatură. În majoritatea cazurilor, atunci când un
material în starea lui naturală nu îndeplineşte condiţiile necesare pentru imobilizarea stabilă a
componentei biologice [27] sau nu prezintă proprietăţi electrocatalitice satisfăcătoare pentru
analitul de detectat, sunt necesare etape suplimentare de modificare.
Astfel, selecţia corectă a materialului de electrod, precum şi funcţionalizarea acestuia,
sunt impuse de o serie de parametri cum sunt: natura componentei biologice, metoda de
detecţie utilizată şi aplicaţia finală a biosenzorului obţinut.
I.2.3. Metode de imobilizare a enzimei
O etapă deosebit de importantă pentru performanţele finale ale biosenzorului o
constituie imobilizarea bioreceptorului (enzimei) pe traductorul amperometric. Două aspecte
sunt considerate esenţiale pentru succesul acestui proces:
imobilizarea trebuie să asigure un contact cât mai strâns între enzimă şi
traductor
procesul de imobilizare nu trebuie să afecteze în nici un fel activitatea
enzimatică a bioreceptorului, ba mai mult, să-i asigure stabilitate în timp.
5
Începând cu simpla adsorbţie a enzimei pe electrod şi terminând cu înglobarea
enzimei în materialul de electrod (electrozi cu materiale nanocompozite), actualmente este
cunoscută o mare varietate de metode de imobilizare a enzimei pe suprafaţa electrodului
(Fig.I.2).
Fig.I.2. Reprezentarea schematică a diferitelor metode de imobilizare a enzimelor pe suprafaţa unui
electrod [28]
Din larga varietate de metode de imobilizare existente în literatura de specialitate, în
această teză au fost folosite patru proceduri diferite şi anume:
adsorbţia fizică
electropolimerizarea
legarea covalentă
includerea în membrane de nafion
I.2.3.1. Adsorbţia fizică
Unul din procedele simple şi rapide de imobilizare a enzimelor este adsorbţia fizică.
Metoda constă în simpla depunere a enzimei pe suprafaţa electrodului, legarea fiind făcută
prin interacţii electrostatice sau de tip van der Waals.
Obţinerea unui electrod modificat prin adsorbţie fizică se realizează prin simpla
acoperire a suprafeţei sale cu soluţia apoasă sau neapoasă de modificator, urmată de
evaporarea solventului. Pentru astfel de modificări se folosesc electrozi cu suprafeţe de
carbon grafit, carbon vitros, grafit pirolitic iar ca element modificator adsorbit se utilizează
complecşi organici şi organometalici. Un material mult studiat şi dezvoltat în ultima vreme
este frecvent utilizat pentru modificarea electrozilor de cărbune vitros sau grafit prin simpla
depunere din soluţii de acetonă, dimetilformamidă folosite pentru determinarea unui număr
mare de analiţi [29-31].
6
Acest procedeu nu implică funcţionalizarea electrodului sau legături covalente, şi din
acest motiv este cel mai nedistructiv pentru enzimă. Dezavantajul este că biosenzorii cu
enzimă adsorbită prezintă o stabilitate operaţională şi de stocare scăzută.
I.2.3.2. Electropolimerizarea
Enzimele pot fi imobilizate în polimeri conductori de tipul politiofen, poliacetilenă,
polianilină, polipirol aceştia formând un mediu optim pentru imobilizarea acestora pe
suprafaţa electrozilor, cu rol semiconductor de electricitate.
Două metode de imobilizare sunt utilizate, şi anume:
depunerea prin electropolimerizare directă a polimerului şi a componentei
biologice
imobilizarea materialului bioactiv după polimerizare.
Polimerizarea electrochimică a monomerilor în prezenţa enzimei conduce la formarea
unui strat în care inclusă este enzima [32].
I.2.3.3. Legarea covalentă
Modificarea covalentă a suprafeţei electrodului reprezintă o metodă utilizată în
prepararea materialelor modificate, cu aplicaţii în construcţia biosenzorilor. Există două
modalităţi de realizare a acestui proces:
prima modalitate implică legarea directă a biomoleculei sau a compusului modificator
dorit, pe suprafaţa materialului de electrod care conţine în prealabil grupări
funcţionale (carboxil, carbonil, hidroxil). Un exemplu des întâlnit sunt grupările
funcţionale >C=O şi >C-O- (formate prin aplicarea unui potenţial controlat oxido-
reducător, într-un mediu adecvat, pe suprafaţa electrozilor de cărbune vitros) şi
grupările -OH de pe suprafaţa oxizilor metalici, utilizate în legarea covalentă a
diferiţilor compuşi [33-34].
a doua modalitate implică derivatizarea suprafeţei de electrod cu un agent de
reticulare, compus bi- sau polifuncţional (glutaraldehida, carbodiimida, succinimida
sau avidin biotina, care printr-o grupare funcţională se leagă de suprafaţa electrodului,
iar prin cealaltă grupare leagă enzima sau un alt compus modificator.
Suprafeţele de carbon sunt cele mai des şi mai eficient modificate prin legarea
covalentă, datorită grupărilor lor funcţionale ajustabile [35]. Compuşii conţinând grupările
amino (-NH2) [36], diazoniu R-N2+
[37-38] şi aril-acetat [39] sunt cei mai utilizaţi în
modificarea covalentă a suprafeţelor de carbon.
Biosenzorii realizaţi prin modificarea covalentă a materialului de electrod sunt
caracterizaţi de o bună stabilitate şi un răspuns rapid, însă procedura de modificare covalentă
este complexă, necesită condiţii experimentale speciale este slab reproductibilă şi prezintă
costuri relativ mare.
I.2.3.4. Includerea în membrane
Procedura de formare a membranelor presupune simpla acoperire/imersare a
electrodului cu/în soluţia de polielectrolit de natura urmată de evaporarea solventului.
Membranele astfel formate prezintă adeziune crescută faţă de suprafaţa electrodului şi
deformare minimă (datorită hidratării) atunci când sunt introduse în medii apoase [40-43].
7
În plus, membrana de polielectrolit poate stabiliza existentă la suprafaţa electrodului, lucru
esenţial pentru aplicaţiile biosenzorilor. Un electrolit mult utilizat în imobilizarea enzimelor
este Nafionul. Acest polimer (Fig.I.3) este disponibil comercial sub formă de soluţie, într-un
amestec de 80-90% alcool şi 20-10% apă. Nafionul formează o membrană schimbătoare de
cationi, care triază moleculele după sarcină şi mărime, şi este preferat în multe aplicaţii
datorită proprietăţilor mecanice bune [44].
Fig.I.3. Structura ionomerului perfluorinat Nafion® (tetrafloroetilensulfonat) [45]
Ca tehnică de imobilizare, Nafionul prezintă o serie de avantaje:
previne inactivarea electrodului şi creşte domeniul dinamic de răspuns al
biosenzorului [46-47].
fiind o matrice încărcată negativ, Nafionul prezintă permeabilitate redusă pentru
substanţele cu sarcină negativă, îmbunătăţind astfel selectivitatea senzorului [48-50]
şi eliminând parţial influenţa interferenţilor gen ascorbat [51] şi acetaminofen
[52-53] asupra răspunsului biosenzorului;
asigură stabilitate operaţională bună compuşilor redox cu sarcină pozitivă imobilizaţi
pe suprafaţa electrodului cu rol de mediatori [54-55].
I.2.3.5. Mediatori electrochimici
În principiu, toate substanţele pot fi oxidate/reduse dacă este aplicat un potenţial de
electrod suficient de mare. Din punct de vedere electroanalitic, un potenţial ridicat implică
însă interferenţe, produse de componentele electrochimic active prezente în matricea probei,
care vor fi oxidate/reduse împreună cu analitul. Mediatorii sunt substanţe care intermediază
transferul de electroni între electrodul de lucru şi analit sau o componentă biologică activă.
Aceştia sunt substanţe care au o comportare (cvasi) reversibilă electrochimic şi care
îndeplinesc două funcţii fundamentale.
reducerea suprapotenţialului necesar oxidării/reducerii analitului, în scopul
creşterii sensibilităţii determinărilor.
creşterea ratei transferului de electroni, pentru o mai bună sensibilitate.
8
În Fig. I.4 este redată schema mediatorului electrochimic care generează starea de oxidare şi
situl redox al enzimei.
Fig.I.4. Mediator electrochimic care regenerează starea de oxidare şi situl redox al enzimei
[56]
Caracteristicile unui mediator ideal sunt:
capacitatea de a reacţiona rapid cu analitul sau centrul redox al enzimei, în cazul
biosenzorilor enzimatici;
potenţialul redox al mediatorului (comparat cu potenţialul redox al analitului)
trebuie să fie redus;
trebuie să prezinte o cinetică reversibilă heterogenă;
suprapotenţialul pentru regenerarea mediatorului trebuie să fie scăzut, mai mic
decât al altor interferenţi, activ electrochimic, prezenţi în probă;
să nu participe la reacţii cu alte specii chimice în afara analitului, pentru a evita
interferenţele;
să fie independent de variaţia pH - ului (pentru mediatorii care nu schimbă
valoarea H+);
trebuie să fie stabil în formele oxidată şi redusă;
forma redusă a acestuia nu trebuie să reacţioneze cu oxigenul [55].
Avantajele utilizării mediatorilor sunt:
măsurătorile sunt puţin dependente de concentraţia de oxigen;
potenţialul de lucru al electrodului enzimatic este determinat de potenţialul de oxidare
al mediatorului;
utilizarea mediatorilor la potenţiale de oxidare scăzute implică eliminarea
interferenţilor [56].
Un exemplu de transfer de electroni către centrul activ al enzimei este cel al
biosenzorului bazat pe GOD (glucozoxidaza) pentru analiza glucozei, care utilizează electrozi
din oţel inoxidabil modificaţi cu un film conductiv de polipirol. În acest caz, mediatorul
reacţionează în primul rând cu enzima redusă şi apoi este oxidat la suprafaţa electrodului,
unde are loc un transfer rapid de electroni.
Există numeroase substanţe care pot fi utilizate drept mediatori electrochimici, din
diferite clase, cum ar fi: coloranţii organici (albastru de metil, Meldola Blue etc.), compuşi
anorganici (fericianurile, albastru de Prusia etc.) [57-60].
9
I.3. Nanomateriale folosite în realizarea biosenzorilor
Materialele folosite în mod curent la realizarea biosenzorilor electrochimici sunt
stabile termodinamic şi constau în polimeri, metale şi aliaje, materiale ceramice,
semiconductori organici, cristale, membrane şi materiale compozite pulberi etc. [61].
Descoperirea nanotuburilor de carbon [62] şi a fulerenelor [63] a deschis posibilitatea
utilizării unei noi clase de materiale, cu dimensiuni de ordinul nano, în construcţia senzorilor
şi biosenzorilor după cum urmează :
Carbonul element cu configuraţia electronică He 2s2 2p
2, prezintă diverse forme
alotropice: diamant, grafit, negru de fum, cărbune activ, fibre de carbon, cărbune vitros,
fluerene şi nanotuburi. Dintre toate aceste forme alotropice doar diamantul şi grafitul sunt
forme stabile din punct de vedere termodinamic.
Diamantul prezintă o structură cristalină tridimensională, descrisă de o reţea cubică şi
dotată cu proprietăţi fizice şi chimice excepţionale: duritate, rigiditate, conductibilitate
electrică redusă, indice de refracţie mare şi chimic inert.
Grafitul este un material solid cu proprietăţi metalice, caracterizat de o structură
stratificată, formată prin suprapoziţionarea reţelelor hexagonale ale planurilor de grafit.
Nanotuburile de carbon sunt structuri tridimensionale constituite din planuri grafitice
rulate în forme tubulare. În funcţie de numărul tuburilor concentrice şi de dispunerea
acestora, există trei tipuri de materiale din această categorie şi anume: nanotuburi de carbon
cu un singur perete (single-wall carbon nanotubes, SWNT), cu mai mulţi pereţi (multi Wall
carbon nanotubes, MWNT) şi nanofibre de carbon (carbon nanofibres CNF) [64-65]. În
Fig.I.5 sunt prezentate materiale carbonice dupa dimensiune (0, 1, 2, și 3 D).
Fig.I.5. Materiale carbonice după dimensiune (0, 1, 2, si 3 D) [66-67]
I.3.1. Materiale (nano) compozite
Un material compozit este o combinaţie heterogenă a două sau mai multe materiale
diferite ca formă şi compoziţie. Un amestec dintr-o fază conductoare şi una izolatoare devine
conductor atunci când fracţia de volum a fazei conductoare excede un prag de percolare de
16%, care reprezintă cantitatea minimă pentru a obţine o traversare continuă prin întregul
amestec.
Acest prag este independent de mărimea şi forma fazei conductoare atât timp cât
particulele sale sunt echidistante. Când faza conductoare este alcătuită din particule subţiri şi
lungi, şansele de contact cresc, reducând astfel pragul de percolare. În aceste cazuri,
10
conductibilitatea amestecului se realizează şi pentru procente mai mici de 16% ale fazei
conductoare în volumul final.
Materialele compozite folosite în construcţia biosenzorilor sunt, în general, alcătuite
din carbon (pulbere de grafit) şi o matrice de legare ulei mineral, hidroxietilceluloză răşini,
sol-gel, rezultând binecunoscuţii electrozi pastă de cărbune. Proprietăţile excelente ale
nanotuburilor de carbon şi nanofibrelor de carbon şi, în special, conductibilitatea electrică
mare, fac aceste materiale ideale pentru obţinerea de amestecuri nanocompozite conductoare
[67]. Mai multe studii demonstrează că introducerea CNT într-o matrice polimerică creşte
conductibilitatea electrică şi proprietăţile mecanice ale matricii originale [68].
I.3.2. Polimeri conductori
Polimerii conductori care conţin electroni responsabili pentru proprietăţile electrice
neobişnuite, cum ar fi conductivitate electrică mare, tranziţii optice cu energie joasă,
potenţialul mic de ionizare. Care se aplică şi sistemelor conjugate ale polimerilor conductori,
care au una sau două legături duble ce alternează cu lanţul polimeric. Mecanismul conductor
al acestor polimeri este foarte complex. Prin dopare, aceste materiale prezintă o modificare
importantă a conductivităţii, ce implică diferite mecanisme, cu regimuri diferite [69].
Numeroase metode sunt disponibile pentru sinteza polimerilor conductori. Cea mai
utilizată tehnică este cuplarea oxidativă, ce implică oxidarea monomerilor pentru formarea
radicalilor cationici, urmată de cuplarea pentru formarea dicationilor. Altă metodă
reproductibilă şi simplă este sinteza electrochimică, care prezintă avantajul faptului că
reacţiile pot avea loc la temperatura camerei. În plus, grosimea filmului poate fi controlată
prin varierea potenţialului sau curentului şi a timpului de depunere.
Polimerizarea electrochimică poate avea loc la:
a) curent constant
b) potenţial constant
c) prin balierea potenţialului de scanare [70]
Aceste materiale conductoare au atras atenţia datorită utilizării lor în obţinerea de
senzori şi biosenzori. Polimerii conductori sunt utilizaţi în obţinerea de biosenzori enzimatici
pentru analiza glucozei, fructozei, lactatului, etanolului, colesterolului, ureei precum şi în
obţinerea imunosenzorilor [71]. Pasul esenţial în construcţia de biosenzori bazaţi pe polimeri
conductori este imobilizarea eficientă a componentei biologice pe suprafaţa electrodului.
Două metode de imobilizare sunt frecvent utilizate în construcţia biosenzorilor bazaţi
pe polimeri conductori:
- electropolimerizarea directă
- depunerea pentru includerea componentei biologice imobilizarea materialului
bioactiv, urmată de electropolimerizare [72]
Construcţia unui biosenzor prin electrodepunerea unui polimer conductor este un
proces simplu ce implică un singur pas. Electropolimerizarea are loc în soluţia ce conţine
monomerul şi specia biologic activă. Acest model a fost utilizat pentru încorporarea
enzimelor [73], anticorpilor [74] şi chiar a celulelor vii [75].
Imobilizarea enzimelor în filme electropolimerizate permite un control electrochimic
al diferiţilor parametri de depunere, cum ar fi grosimea stratului polimeric, cantitatea de
enzimă şi localizarea enzimei. Imobilizarea enzimelor prin încapsulare în filme polimerice
conductoare implică concentraţii mari de monomeri şi enzimă în timpul procesului de
electropolimerizare. De altfel, cantitatea de enzimă imobilizată în reţeaua polimerică nu poate
fi estimată prin simpla diferenţă dintre concentraţiile biologice iniţiale şi cele de după etapa
de electropolimerizare. Prin electropolimerizarea albastrului de metil pe electrozi serigrafiaţi,
11
al căror electrod de lucru este acoperit cu un strat subţire de aur, se obţin straturi conductoare
[75]. Avantajul acestui procedeu de imobilizare a enzimei este acela că oferă posibilitatea de
a controla şi îmbunătăţi compoziţia stratului polimer-enzimă.
I.4. Aspecte generale privind biosenzorii amperometrici
La biosenzorii enzimatici funcţia enzimei este aceea de a cataliza reacţia la care
participă specia de determinat. Pe parcursul desfăşurării acestei reacţii biochimice, fie se
produce (de exemplu apa oxigenată şi gluconolactonă), fie se consumă oxigenul, fie este
implicată în mod deliberat o specie electrochimic activă (mediator), a cărei concentraţie este
monitorizată pe cale electrochimică, prin intermediul unei reacţii de electrod, a cărei
intensitate constituie semnalul analitic se prezintă în Fig.I.6. Caracteristicile cineticii reacţiilor
enzimatice care se desfăşoară în sisteme eterogene au, fără îndoială, o influenţă hotărâtoare
asupra performanţelor biosenzorilor amperometrici.
Fig.I.6. Reacţia reprezentativă a GOD [76].
222 OHtonaGluconolacOGlucozaD azaGlucozoxid (I.1)
Majoritatea senzorilor de acest tip operează datorită fie consumului de oxigen din
timpul reacţiei biocatalitice măsurat prin controlarea reduceri catodului de O2 pe electrod la
un potenţial de -0.7V, sau prin generarea biocatalitică a peroxidului de hidrogen evaluat prin
monitorizarea oxidării anodului de H2O2 pe electrod la un potenţial de +0.65V [77].
I.4.1. CINETICA ENZIMATICĂ
Reacțiile enzimatice care implică un singur substrat pot fi exprimate într-un
mod general ca:
PEEPESSE (I.2)
unde,
E – enzima;
S – substratul;
P – produsul reacției.
Reacția de legare a substratului este considerată a fi reversibilă, în timp ce formarea
produsului este considerată ireversibilă. Reacția E + P este lentă și deci poate fi neglijată. La
o concentraţie de enzimă fixă, rata de reacţie (V) a enzimei catalizate este dată de ecuaţia
Michaelis-Menten.
12
(I.3)
În acest mecanism, se presupune că enzima (E) și substratul (S) se combină reversibil
pentru a forma complexul enzimă-substrat (ES), care ulterior se descompune într-un pas mai
lent și ireversibil, pentru a produce enzima liberă (E) și produsul de reacție (P). În cinetica
enzimatică, condițiile cele mai importante sunt [S], V0, Vmax, și constanta Michaelis Menten,
Km.
Termenul Km corespunde concentraţiei de substrat pentru care rata este egală cu
jumătate din Vm. În construcţia electrozilor, enzima este de dorit să obţină cel mai mare Vm şi
cel mai mic Km.
- [S] – concentrația de substrat;
- V0 – viteza inițială (rata);
- Vmax – viteza maximă; este observată când efectiv întreaga enzimă e prezentă ca şi
complex ES şi [E] este foarte mic;
- Km – concentraţia substratului necesară pentru o enzimă (la o concentraţie fixă) pentru a
atinge jumătate din viteza sa maximă, denumită constanta Michaelis [78-79].
Fig.I.7. Cinetica enzimatică [13]
Rata de reacție (v) poate fi exprimată prin ecuația lui Michaelis–Menten:
SK
SVv
m max
(I.3)
În amperometrie, rata reacţiei (v) este exprimată ca şi intensitate a curentului (I):
SK
SII
max
max
(I.4)
Ecuaţia Michaelis–Menten poate fi simplificată la două etape:
- prima are loc la concentraţii mici ale substratului [S] << Km, apoi Km + [S] ≈ Km. În aceste
condiţii, o curbă de calibrare lineară poate fi obţinută, şi v devine:
mK
SVv max
(I.5)
Rata iniţială a reacţiei este, prin urmare, direct proporţională cu concentraţia iniţială a
substratului la [S] scăzut, şi poate fi folosită pentru cuantificarea substratului. Acest lucru este
arătat în Fig.I.7. în regiunea lineară iniţială a ratei zonei de reacţie, în contrast cu concentraţia
substratului, unde panta din această regiune este egală cu Vmax/Km [14].
În practică, gama lineară poate trece de concentraţia corespunzătoare lui Km, deoarece
concentraţia substratului local din apropierea electrodului este deseori mai mică decât
PESESE catk
k
k
1
2
13
concentraţia brută, fapt datorat, de exemplu, membranelor limitatoare de difuziune ce
învelesc electrodul.
- a doua simplificare are loc la o concentraţie mare a substratului, unde [S]>> Km, apoi:
1 SK
S
m (I.6)
şi v devine: EkVv 2max
(I.7)
Rata reacţiei iniţiale este acum independentă de [S], după cum se vede în regiunea de
platou din Fig.I.7. Rata depinde acum linar de concentraţia enzimei, şi o schemă a ratei
iniţiale, în comparaţie cu concentraţia totală a enzimei, va avea o pantă de k2. Astfel, la
concentraţii mari ale substratului, ratele reacţiei iniţiale pot fi utilizate pentru a determina
concentrația enzimei [13].
I.4.2. Calibrarea şi performanţă biosenzorilor enzimatici
La reacţia enzimatică, implicată în operarea biosenzorului, pot participa unul sau mai
mulţi analiţi, S şi S', care în prezenţa enzimei formează produşii de reacţie P şi P'.
S+P — PP’ (I.8)
Pentru a monitoriza transformarea substratului S în produsul P, se pot utiliza
următoarele strategii [80].
monitorizarea scăderii concentraţiei co-substratului S';
reciclarea unuia dintre produşii de reacţie;
detecţia stării centrului redox activ al enzimei, sau evoluţia cofactorului în
prezenţa substratului, folosind un mediator imobilizat, care să reacţioneze
suficient de repede cu biocatalizatorul şi să fie uşor detectabil de către
traductor;
detecţia transferului de electroni dintre centrul activ al enzimei redox şi
traductorul electrochimic.
Calibrarea senzorilor se realizează prin adaosul de soluţii standard de analit, măsurând
şi reprezentând grafic răspunsul corespunzător stării staţionare (Rss), corectat cu semnalul
soluţiei martor (linia de bază R0), în funcţie de concentraţia analitului (c) sau logaritmul
acesteia (log c/c0) (în general c
0-1
mol/L).
Sensibilitatea biosenzorului se determină din curbele de calibrare (Rss – Ro), în funcţie
de c sau de log c/0 şi este dată de panta dreptei.
Domeniul de variaţie liniară a răspunsului biosenzorului se determină tot din curbele
de calibrare şi reprezintă intervalul de concentraţii în care fiecărei variaţii de concentraţie îi
corespunde o variaţie proporţională a semnalului analitic. Dependenţa semnalului analitic de
concentraţie este reprezentată de ecuaţia:
R = Scx (I.9)
Domeniul dinamic de concentraţii este intervalul de concentraţii pentru care x ±.
Domeniul de variaţie liniară este acea parte a intervalului dinamic de concentraţii pentru care
x = 1. În general, domeniul de liniaritate se exprimă prin număr de decade cuprinse între
limita inferioară şi cea superioară, şi depinde de proprietăţile biocatalitice şi biocomplexante
ale receptorului biologic.
Acest domeniu poate fi considerabil mărit prin intermediul unei bariere de difuzie
externă (membrana), cu diminuarea consecutivă a sensibilităţii biosenzorului. Sensibilitatea
biosenzorului se determină în domeniul de liniaritate. Limita de detecţie şi limita de
cuantificare depind de zgomotul de fond al măsurătorii [80].
14
Selectivitatea este parametrul care cuantifică gradul de interferenţă a altor specii decât
analitul în cauză, asupra măsurătorii efectuate. Selectivitatea biosenzorilor depinde atât de
traductorul ales, cât şi de componenta biologică. Majoritatea enzimelor utilizate în construcţia
biosenzorilor prezintă specificitate pentru un singur substrat, însă există şi enzime cu
specificitate de clasă (alcooloxidaza, peroxidaza, lactaza, tirozinaza, ascorbat oxidaza,
glucozoxidaza etc.). Cea mai simplă modalitate de eliminarea interferenţilor este utilizarea
unei membrane protective, externă sau internă. O metodă de determinare a interferenţilor
constă în utilizarea de senzori compensatori fără enzimă [80].
Reproductibilitatea este o măsură a variaţiei rezultatelor obţinute într-o perioadă de
timp stabilită, pentru un anumit tip de biosenzor şi o anumită concentraţie a probei de
analizat.
Timpul de răspuns reprezintă timpul necesar unui senzor/biosenzor pentru a ajunge la
90% din semnalul analitic corespunzător stării staţionare [14]. Atunci când biosenzorii sunt
utilizaţi pentru măsurători secvenţiale (în flux) reprezintă numărul de probe analizate în
unitatea de timp, fără să existe interferenţe din partea probelor analizate anterior. Acest
parametru depinde de timpul de răspuns, dar şi de timpul de recuperare necesar biosenzorului
să revină la faza staţionară iniţială.
Timpul de viaţă al unui biosenzor este definit ca timpul de stocare necesar până când
sensibilitatea scade cu 10% sau 50% comparativ cu valoarea iniţială. Pentru determinarea
timpului de stocare pe termen lung, se compară sensibilitatea unor biosenzori diferiţi,
proveniţi din acelaşi lot de producţie, după timpi diferiţi de păstrare, dar în condiţii identice.
I.5. Metode electrochimice folosite la caracterizarea comportării biosenzorilor
Metode electrochimice sunt utilizate pentru studiul proprietăţilor unor specii redox şi
se bazează pe schimbul de electroni dintre electrod şi molecula de interes. Grupările
electrocatalitice ale unei molecule sunt capabile să primească sau să cedeze electroni,
producând astfel un curent pe durata acestei reacţii. Abilitatea unei molecule de a fi oxidată
sau redusă depinde de numărul de grupări electroactive, de poziţia acestora, de tipul şi pH-ul
soluţiei de electrolit şi de temperatură.
Măsurătorile electrochimice implică folosirea unor reacţii redox, ce pot fi realizate pe
suprafaţa electrodului de lucru cu ajutorul electricităţii, pe seama substanţelor de analizat.
Astfel, metodele electrochimice măsoară una dintre mărimile:
- potenţialul de electrod (E);
- intensitatea curentului electric prin celulă, I;
- rezistenţa (R) – sau conductanţa (I/R) - soluţiei din celulă;
- timpul de desfăşurare a procesului de electrod.
Oricare ar fi parametrul măsurat, acesta poate fi controlat cu concentraţia speciei
chimice din proba supusă analizei.
Studiul acestor corelaţii a condus la clasificarea metodelor de analiză electrochimică în:
metode potentiometrice – măsoară potențialul electrodului;
metode amperometrice – măsoară intensitatea curentului (Q = i·t);
metode conductometrice – măsoară rezistenţa (R) respectiv conductanța (I/R).
Unele dintre metode care măsoară curentul, însă în condiţii de tensiune variabilă se
numesc voltamperometrice, iar un caz particular al acestora care măsoară simultan curentul şi
modificarea ciclică a potenţialului în timp se numeşte voltametrie ciclică. Din categoria
15
tehnicilor electrochimice utilizate pe parcursul acestei lucrări fac parte: voltametria ciclică,
cronoamperometria şi amperometria.
I.5.1. Voltametria ciclică
Este una dintre metodele electroanalitice în care curentul electrodului de lucru este
măsurat ca funcţie de potenţialul aplicat electrodului. Reacţiile redox care au loc la electrod
sunt heterogene şi se desfăşoară în interfaţa dintre electrod şi soluţie.Voltamograma ciclică
este, cel mai adesea, primul experiment realizat într-un studiu analitic, deoarece oferă o
localizare rapidă a potenţialului redox al speciei electroactive analizate [81-83].
Voltamograma ciclică presupune o creştere liniară a potenţialului în timp la o anumită
valoare, după care variaţia se face în sens descrescător către valoarea iniţială. Reprezentarea
curentului generat în funcţie de potenţialul aplicat (voltamograma) este utilizată pentru a
identifica potenţialul redox format al comportamentului electroactiv. Această tehnică ajută la
înţelegerea comportamentului unei specii analizate şi la selectarea tipului de traductor potrivit
pentru compusul de determinat. Odată stabilit, potenţialul redox al unei specii poate fi folosit
pentru studiile următoare ale aceleiași specii, folosind tehnici la potenţial fix
(amperometrice).
I.5.2. Amperometria
Amperometria este una din tehnicile electroanalitice în care electrodului de lucru i se
aplică un potenţial fix, iar intensitatea curentului măsurat este corelată direct cu reacţia
electrochimică desfăşurată la electrodul de lucru. Electrodul acţionează ca o sursă de
electroni transferaţi către, sau de la o moleculă la nivelul interfaţei. În stare staţionară,
curentul care străbate electrodul este limitat de difuzia compusului electroactiv prin stratul de
difuzie, către suprafaţa electrodului.
Acest curent este descris de prima lege a lui Fick.
i = n F D A (I.10)
unde,
- n - numărul de electroni transferaţi;
- F - constanta Faraday (F = 96487 C/mol);
- D - coeficient de difuzie al compusului redox activ;
- A - suprafaţa electrodului;
- - grosimea startului de difuzie;
- C - concentraţia compusului în volumul soluţiei.
În măsurătorile amperometrice se folosesc de obicei trei electrozi. Pentru realizarea
electrodului de lucru se pot utiliza o serie de materiale cum sunt: carbonul, grafitul, cărbunele
sticlos sau metale inerte ca Au şi Pt. Pentru anumite aplicaţii specifice se pot folosi şi alte
metale precum Ni, Cu şi Rh. Ca electrod de referinţă care furnizează un potenţial stabil şi
reproductibil, faţă de care este comparat şi definit potenţialul electrodului de lucru, se
folosesc frecvent în amperometrie Ag/AgCl şi electrodul saturat de calomel (SCE). Ca
electrod auxiliar (contraelectrodul) se foloseşte un material inert conducător, cum este firul de
platină.
Amperometria este considerată ca fiind cea mai utilizată tehnică electrochimică şi are
numeroase aplicaţii în tehnologia biosenzorilor, deoarece permite determinări cu sensibilitate
16
ridicată, putând fi detectate concentraţii de 10-8
, chiar 10-9
[84]. Semnalul acestor biosenzori
este generat de schimbul de electroni dintre sistemul biologic din stratul bioreceptor şi
electrod. Înregistrarea intensităţii curentului se face în funcţie de timp, aplicând electrodului
un potenţial constant.
În Fig.I.8. este prezentat (A) răspunsul analitic al unui biosenzor amperometric şi
anume, variaţia intensităţii curentului la adiţia analitului și (B) analiza potențiometrică.
(A) (B)
Fig.I.8. Curba de răspuns obţinută cu un biosenzor amperometric și analiza potențiometrică [11]
Odată cu introducerea procesului de miniaturizare s-au înregistrat numeroase progrese
în electroanaliză [85]. Aceasta a condus la dezvoltarea de biosenzori portabili, utilizând
electrozi serigrafiaţi şi potenţiostate portabile cu baterie. Electrozii serigrafiaţi prezintă
dimensiuni reduse (o unitate poate măsura 5× 2 cm) şi pot fi obţinuţi în masă, cu un cost
moderat.
O atenţie deosebită se acordă naturii materialului de electrod, dat fiind faptul că
structura şi proprietăţile acestuia determină proprietăţile traductorului, precum şi ale interfaţei
traductor/detector. Dezvoltarea rapidă a tehnologiei materialelor de electrod a permis
extinderea domeniului de compuşi detectabili. Prin urmare, sunt necesare materiale noi, care
să îmbunătăţească stabilitatea mecanică şi chimică a biosenzorilor pentru aplicaţii practice în
condiţii variate, şi totodată să simplifice metodologia de imobilizarea biomoleculelor,
asigurând controlul spaţial al acestora. Cele mai importante materiale folosite pentru
construcţia senzorilor chimici biosenzorilor constau în: polimeri organici, materialele sol-gel,
materiale semiconductoare şi composite, oxizi metalici.
I.5.3. Analiza prin injectare în flux (FIA)
FIA se bazează pe inserarea / injectarea unei probe lichide într-un flux purtător
continuu nesegmentat constituit dintr-un lichid adecvat. Proba injectată formează o zonă care
este transportată de către purtător printr-un tub spiralat (sau nu) către detector. Detectorul
măsoară un anumit parametru fizic al probei (absorbanța, potențialul unui electrod, pH-ul
etc.) ce se modifică continuu în timp ce zona de probă trece prin celula în flux, cu alte
cuvinte, concentrația speciei de determinat se modifică continuu în timp. Astfel, răspunsul
detectorului în FIA este rezultatul a două procese, ambele de natură cinetică, și anume: un
proces fizic de dispersie al zonei de probă în fluxul purător; un proces chimic de formare a
speciilor chimice.
17
Schema celui mai simplu sistem FIA este prezentată în Fig. I.9 și constă din:
Fig. I.9. Schema unui sistem FIA
- o pompă (P) care este folosită pentru a propulsa fluxul purtător printr-un tub îngust;
- un dispozitiv de injectare (V) care introduce un volum bine definit de proba (S) în fluxul
purtător într-o manieră reproductibila; D- display; W- rezidii
- un tub spiralat denumit și tub de reacție (RC) în care zona de probă se dispersează și reacționează cu componentele purtătorului, formînd specii chimice ce sunt măsurate de un
detector prevazut cu celula în flux;
- un înregistrator.
Un înregistrator tipic pune în evidență un semnal care are forma unui pic a carui înălțime
este direct propoțională cu concentrația analitului.Timpul scurs între momentul injectarii S și apariția maximului picului, care reprezintă răspunsul analitic, corespunde timpului de
rezidență T, perioada în care are loc reacția chimică. Un volum de 100 L de probă de este
injectat în fluxul purtător prin intermediul valvei de injectare. Acest lucru face ca FIA sa fie o
tehnică microanalitică automată capabilă sa efectueze cel puțin 100 de determinări pe oră, cu
un consum foarte mic de probă și reactivi [86]. Înainte de începerea determinărilor, pompa
peristaltică se lasă să funcționeze 10 minute pentru a intra în regimul optim de lucru.
Schema unei pompe peristaltice este prezentată în Fig.I.10.
Fig.I.10. Schema unei pompe peristaltice. 1 – tub flexibil din plastic rezistent; 2 – rotor; 3 – role; 4 –
opritoare. Săgetile indică sensul de circulție al lichidului prin tubul pompei.
18
I.6. Metode de caracterizare a materialelor suport pentru biosenzori
I.6.1. Studiul prin spectroscopie FT- IR
Spectroscopia în infraroşu este o tehnică de investigare folosită în studierea atât a
materialelor organice, cât şi a celor anorganice. În principiu, se bazează pe măsurarea
absorbţiei undelor electromagnetice (IR) într-un anumit interval de frecvenţe. Undele
electromagnetice folosite în spectroscopia IR au frecvenţe cuprinse în intervalul 1.9 × 1013
-
1.2 × 1014
Hz, corespunzând unor energii a fotonilor situate în intervalul 0.078 - 0.5 eV, unde
h este constanta lui Planck, iar v frecvenţa.
Acest nivel de energie nu poate excita electronii, dar poate induce excitarea vibraţională
sau rotaţională a legăturilor covalente dintre atomi sau grupări funcţionale. Frecvenţele pentru
care are loc absorbţia sunt în directă legătură cu structura moleculelor sau a speciilor de
atomi, cu tipul legăturii şi cu modurile posibile de vibraţie. Pentru obţinerea unui spectru IR
tipic, proba de studiat este expusă la un fascicul de lumină în infraroşu, iar fasciculul transmis
sau reflectat este colectat şi analizat. Folosind frecvenţele de absorbţie caracteristice, diferite
grupări funcţionale pot fi identificate rapid [86-87].
Fenomenul de absorbţie în infraroşu rezultă din interacţiunea între componenta
electrică a radiaţiei incidente cu vectorii moment dipolari ai grupărilor chimice prezente în
moleculă. Spectrul în infraroşu al unei substanţe este determinat de natura, numărul şi
poziţiile relative ale atomilor componenţi, adică de structura moleculelor care o constituie.
Problemele identificate în spectroscopia IR tradiţională se rezumă la durata obţinerii
unui spectru complet pentru un domeniu larg şi cu o rezoluţie dată şi la coborârea domeniului
spectral măsurabil sub o anumită valoare, de ordinul a 400-500 cm-1
.
Principiul spectroscopiei IR
Un spectru în IR oferă două tipuri de informaţii: energia (sau frecvenţa) tranziţiilor
cuantice vibraţionale sau roto-vibraţionale şi măsura în care proba absoarbe sau emite
radiaţie (intensitatea acestui efect).
În raport cu spectrometrele dispersive, spectrometrele cu transformata Fourier prezintă
trei avantaje principale:
timpul de achiziţie a unui spectru infraroşu este redus considerabil;
obţinerea unor spectre cu eşantioane foarte absorbante, la care se adaptează accesorii
de eşantionare inutilizabile la un aparat dispersiv;
reproductibilitatea crescută a lungimii de undă, şi astfel ameliorarea raportului
semnal/zgomot.
Teoretic, se pot înregistra spectre în domeniul (0 - 4000) cm-1
(domeniul spectral
liber), cu o creştere a raportului semnal/zgomot de 2000x faţă de cazul lucrului cu un aparat
dispersiv obişnuit [88-89].
1.6.2. Studiul prin spectrometrie Raman
Spectroscopia Raman constituie principala sursă de informaţii asupra stărilor
vibraţionale ale materiei, alături de spectroscopia IR. Efectul Raman este un efect de
împrăştiere neelastică a radiaţiei electromagnetice la interacţia acesteia cu substanţa, când pot
avea loc următoarele fenomene:
19
emisie de radiaţie, datorită oscilaţiilor electronilor cauzate de unda electromagnetică
molecula devine polarizată la frecvenţa radiaţiei incidente;
au loc trei tipuri de împrăştiere
Tyndall - interacţia luminii preponderent cu particule coloidale, decât cu molecule
mici
Rayleigh - împrăştierea elastică a luminii, fără modificarea lungimii de undă. Este
proporţională cu inversul puterii a patra a lungimii de undă
Raman - împrăştierea inelastică, cu modificarea frecvenţei. Este mult mai slabă în
ceea ce priveşte intensitatea decât împrăştierea de tip Rayleigh şi reprezintă una
dintre principalele metode de analiză chimică nedistructivă.
Spectrometria Raman are multe avantaje faţă de spectrometria de absorbţie în IR. În
primul rând, spectrometria Raman poate fi utilizată pentru a identifica şi analiza molecule
care nu absorb în IR, ca de exemplu molecule diatomice homonucleare. Un alt avantaj îl
constituie faptul că spectrele Raman pot fi obţinute pentru soluţii, spectrul Raman al apei
fiind puţin intens. În IR însă, apa absoarbe puternic, mascând numeroase benzi de absorbţie
ale compuşilor studiaţi [90-91].
Difuzia Raman are câteva proprietăţi semnificative:
este o emisie spontană, incorectă;
intensitatea Raman este proporţională cu numărul moleculelor excitate;
pentru stările cristaline, intensitatea şi polarizarea emisiei Raman este dependentă
de proprietăţile de simetrie ale materialului [92-93].
I.6.3. Studiul prin microscopie de forță atomică
Prima descriere a unui microscop de forţe atomice a fost publicată în 1986 de Benning
(laureat al Premiului Nobel pentru Fizică în 1986), Quate şi Gerber [94-98]. Cu ajutorul
microscopului de forţe atomice se pot măsura forţe extrem de mici (<1 nN), prezente pe
suprafaţa vârfului şi pe suprafaţa probei de măsurat, forţe determinate prin contravaloarea
scării cantileverului (dispozitiv mecanic flexibil având o masă foarte mică). Forţele relevante
în microscopia de forţe atomice sunt: forţele electrostatice, legăturile dipol-dipol, forţele van
der waals, legăturile de H.
Microscopul de forţă atomică poate opera în două moduri: modul contact şi modul
noncontact. Când se lucrează în modul contact, suprafaţa probei este scanată de un vârf
ascuţit montat pe cantilever, iar proba este poziţionată pe un suport piezoelectric, care
controlează mişcarea de scanare. Caracteristicile suprafeţei probei cauzează o deviaţie a
cantileverului. Interacţia dintre suprafaţa probei şi vârf este determinată de interacţia dintre
moleculele sau atomii de pe suprafaţa probei şi vârf.
În timpul contactului iniţial, atomii de la vârf produc o forţă de repulsie foarte slabă,
datorită orbitalilor electronici suprapuşi cu atomii din suprafaţa probei. Dacă această tehnică
se utilizează la obţinerea informaţiilor topografice pe probe sensibile (de exemplu,
biostraturi), forţa laterală exercitată de vârf poate conduce la deviaţii, datorită scindării
suprafeţei.
I.6.4. Studiul prin microscopie electronică de baleiaj (Scanning Electron Microscopy)-
SEM
Un microscop electronic cu baleiaj permite obţinerea unor imagini ale topografiei şi
compoziţiei caracteristice suprafeţei unor probe netransparente la fascicule electronice.
Formarea imaginii se realizează cu ajutorul unui fascicul electronic incident primar (cu
20
energii de 1-5 KeV) foarte îngust, care baleiază suprafaţa unei probe de studiat. Baleierea se
poate realiza prin două metode:
deviaţia fasciculului de electroni cu ajutorul unor câmpuri electrostatice sau
electromagnetice variabile pe două direcţii reciproc perpendiculare;
deplasarea mecanică a probei în fasciculul electronic menţinut fix.
Prin interacţiunea electronilor primari cu suprafaţa, o parte dintre ei sunt
retroîmprăştiaţi prin reflexie elastică pe atomii probei, iar altă parte determină generarea de
electroni secundari din probă. Imaginea se realizează cu ajutorul acestor electroni fie
secundari, fie retroîmprăştiaţi care creează un contrast dependent de unghiul de incidenţă al
fascicului (adică dependent de înclinarea faţă de fascicul a unei zone sau alta din suprafaţă) şi
de compoziţia probei. Imaginile sunt construite punct cu punct pe ecranul unui tub catodic.
Rezoluţia unui microscop electronic cu baleiaj, de ordinul a 20-50 A, este un ordin mărime
inferioară microscoapelor electronice prin transmisie [99-100].
21
Capitolul II. Logistica de laborator folosită în cercetare
În cadrul studiilor efectuate s-au utilizat următorii reactivi:
- peroxid de hidrogen 30% (Sigma);
- Na2HPO4· 2H2O (Riedel-de Haën);
- KH2PO4 (Riedel-de Haën);
- KCl (Sigma);
- HCl 37% (Riedel de Haën);
- FeCl3 (Sigma);
- K3[Fe(CN)6] (Sigma);
- AOT (Dioctyl sulfo-succinate sodium salt) (Carlo Erba)
- Apă bidistilată
- 2-(4-aminofenil)-etilaminei (AP-EA), Sigma
- dihidroxinaftalină (2,6-DHN), Sigma
- Glucozoxidază, glutaraldehidă (2,5 % v/v diluata în apă) Sigma.
- soluţie Nafion 5% Dupon,
- TiO2 bioxid de titan (nanoparticule 50 nm)
Toţi reactivii chimici sunt de puritate analitică şi utilizaţi ca atare. S-au folosit
electrozii serigrafiaţi de carbon, model DRP-110, au fost achiziţionaţi de la Dropsens
(Spania). Acesti electrozi, serigrafiaţi pe un suport ceramic, sunt formaţi dintr-un electrod de
lucru de carbon cu o suprafaţă de S=0,4cm-2, un electrod de referinţă de Ag şi un
contraelectrod de carbon Fig. II.1.
Fig.II.1. Modul electrozi grafit de carbon, model DRP 110 (Dropsens, Spania)
Studiile de voltametrie ciclică, amperometrie, cronoamperometrie au fost realizate cu
ajutorul unui analizor electrochimic type III Autolab (EcoChemie, Olanda) conectat la un PC
pentru setarea parametrilor şi conectarea datelor, precum şi un potentiostat / galvanostat
portabil PalmSens (PalmSens, Olanda) controlat prin intermediul software-ului PalmSensPC.
22
Fig.II.2. Potentiostat type III (EcoChemie, Olanda)
Pentru caracterizarea senzorului SPCE/PB/copolim într-un sistem de analiză în flux cu
detecţie amperometrică s-a utilizat un montaj monocanal format din: dintr-o pompă
peristaltică Minipuls 3 (Gilson), un sistem de injectare bazat pe o valvă cu 6 canale
(Rheodyne, model 7725i), şi celula de analiză în flux tip jet pe perete prevazută cu electrod
de referință Ag/AgCl şi contraelectrod de aur. Bucla valvei de injectare este de 100µL.
Detectorul utilizat este un potentiostat/galvanostat – Autolab. Au mai fost utilizate două
agitatoare magnetice (Elma) şi o baie cu ultrasunete (Velp Scinetifica).
Fig.II.3. Sistem de analiză în flux
Toate experimentele au fost realizate la temperatura camerei, folosind tampon fosfat 50
mM cu un conţinut de 0.1 M KCl, pH 6,5. Determinările amperometrice au fost realizate în
soluții agitate cât şi în picătură, prin aplicarea potenţialului corespunzător. Când linia de bază
s-a stabilizat, se adaugă volumul potrivit de analit pentru a obţine o anumită concentraţie
finală, urmată de înregistrarea curentului staţionar corespunzător. Agitarea soluţiei s-a facut
cu ajutorul unui agitator magnetic, care asigură transportul convectiv pe toata durata
măsurătorii amperometrice.
23
Senzorul serigrafiat de grafit a fost curaţat înainte de folosire prin voltametrie ciclică în
soluţie de H2SO4 0.5 M (între -0,2-0,12V, timp de 50 de cicluri, la o viteza de scanare de 50
mV/s).
Măsurătorile SEM au fost efectuate folosind un microscop de înaltă rezoluţie, FEI
Quanta model 2D si 3D FEG, la o tensiune de accelerare de 5kV, în modul vid înalt cu
Everhart-Thornley secundar de electroni (SE) detector şi SEM Tescan Vega II LMU iar cel
AFM au fost efectuate în modul non-contact cu un XE-100 (< 7 nm tip radius; PPP-NCLR tip
de la Nanosensors TM) cu lungime de 225 µm, 38 µm laţime si 48 N/m spring constant și ~
190 KHz frecvenţa de rezonanţă.
Fig.II.4. Microscop Vega II LMU Tescan
Studiile AFM au fost realizate cu ajutorul unui microscop XE-100 Park System cu un
sistem non-contact. Spectrele Raman au fost obţinute cu un Spectrometru RM 100 Renishau
RAMAN echipat cu CCD. Înregistrarea spectrelor FT-IR s-a realizat cu ajutorul
spectrometrul FTIR model Nicolet iS10 (Thermo Scientific). Măsurătorile electrochimice au
fost realizate cu ajutorul unui potențiostat/galvanostat PARSTAT 4000 cu analizor de
frecvență (FRA), controlat prin intermediul unui software VersaStudio.
Fig.II.5. Potentiostat/ galvanostat PARSTAT 4000 cu analizor de frecvența (FRA)
24
Determinările amperometrice au fost realizate în soluţii agitate cât şi în picatură, prin
aplicarea potenţialului corespunzător.Agitarea soluţiei s-a facut cu ajutorul unui agitator
magnetic, care asigură transportul convectiv pe toata durata măsuratorii amperometrice.
Celula electrochimică a fost asamblată dupa modelul convenţional cu 3 electrozi: electrodul
serigrafiat DRP 110 a fost folosit ca electrod de lucru, Ag/AgCl ca electrod de referință şi
contraelectrod.
Fig.II.6. Sistem de conectare a senzorului cu electrozi de grafit (serigrafiaţi)
Măsurătorile de voltametrie ciclică (CV) şi amperometrie au fost realizate folosind un
sistem electrochimic 302 N Autolab (Eco Chimie, Utrecht, Oland) conectat la un PC pentru
controlul parametrilor și colectarea datelor și un software GPES. Rezultatele au fost
prelucrate cu ajutorul softwerul Origin 8.1.
Matricea oxidică pentru imobilizarea enzimei GOD s-a realizat pe suport de carbon
folosind pentru studiu două sisteme, carbon vitros (electrod GC) şi grafit serigrafiat (electrod
SCPE). Suprafața celor doi electrozi folosiţi a fost curăţată înainte de folosire ca suport.
25