senzori si biosenzori

7/29/2019 Senzori si Biosenzori

1/49

Senzori si Biosenzori


2/49

BIOSENZORI

recunoastere moleculara

ingineria proteinelor

tehnologia receptorilor

CHIMIArecunosteremolecularasinteza

polimerimembraneimobilizare

FIZICAoptica

semiconductori

ELECTRONICAoptoelectronica

tehnologia siliciuluiprocesarea si

controlul datelor

OPORTUNITATI

DE PIATA

in flux

in vivo

implantabile

ELECTRONICA

MOLECULARA-bioelectronica

-retele neuronale

INSTRUMENTATIE

-

portabila

-discreta

-prezentarea datelor

microinstrumentatie

BIOLOGIA

SENZORI


3/49

Principiul recunoasterii moleculare

++

semnalsemnal

analitanalit complexcomplexreceptorreceptor


4/49

DEFINIREA BIOSENZORILOR Un biosenzor este prindefinitie un instrument

(sistem) analitic careincorporeaza o componentabiologic activa numita(biobio))receptorreceptor, integrata sau incontact cu un traductortraductorfizico-chimic care transformasemnalul biologic intr-unsemnal electric digital

continuu sau semicontinuu.Semnalul analitic inregistrateste proportional cucompusul sau clasa decompusi, care prezintainteres analitic.

In comparatie cu tehnicile de

analiza clasice (cromatografiaspectroscopia) biosenzoriisunt instrumente analiticecare prezinta o serie deavantaje precum detectiarapida, sensibila si selectivaa analitului.

Reprezentarea schematica siprincipiul de functionare al

unui biosenzor.

vvv

v

vANALIT

TRADUCTOR

BIORECEPTOR

AMPLIFICATOR

DE SEMNAL


5/49

BIOSENZORII

BIOSENZORI CATALITICI

Functionarea lor are la baza oreactie catalizata de biomolecule

(enzime)

BIOSENZORI DE AFINITATE

Principiul de functionare are labaza interactia analitului de

interes cu componente biologice

printro reactie de tip afin (AG-AC)

BIOSENZORI METABOLICI

Functionarea lor foloseste transformarea

unui substrat, mediu,compus printro

reactie metabolica (celule,

microorganisme)


6/49

ANALITI SI REACTII CONTROLATE

Biosenzorii pot fi clasificati dupa analiti, sau dupareactiile pe care le controleaza:

Monitorizarea directa a substratului reprezinta aplicatiaprincipala a biosenzorilor si se refera atat la detectiasubstratului, cat si a compusilor care intervin sau se formeaza

in timpul procesului biocatalitic.Un astfel de biosenzor poate fi aplicat cu succes pentrumonitorizarea directa a activitatii enzimatice prin masurareacontinua sau secventiala a produceri sau consumari unuianumit compus.

Monitorizarea indirecta biosenzori bazati pe monitorizarea

directa a compusilor organici sau anorganici (metale grele,fluor, cianuri etc.) si a altor substante ce inhiba sauinfluenteaza proprietatile biocatalitice aleelementului/receptorului biologic al biosenzorului.


7/49

Principiul de functionare

probaproba receptorreceptor electronicaelectronicatraductortraductor

semnalsemnal


8/49

Evolutia constructiva

aa douadoua

generatiegeneratie

aa treiatreia

generatiegeneratie(biochip)(biochip)

primaprima

generatiegeneratie


9/49

Componentele principale

Receptori: enzime, celule, microrganisme,anticorpi, ADN, chemo-receptori etc.

Traductori: electrochimici (ISE,O2, H2O2),optici, tranzistori (ENFET), termistori,piezoelectrici etc.

Semnale: substante chimice, lumina, pH,temperatura etc.

tehniciletehnicile chimicechimice sisi bioanaliticebioanalitice

senzorisenzori chimicichimici biosenzoribiosenzori bioanalizabioanaliza


10/49

Biosenzorii enzimatici

Biosenzori enzimatici/metabolici pot fi reprezentati in mod schematicca fiind alcatuiti din doua parti principale si anume: biocomponentacare asigura transformarea chimica a analitului si traductorul caretransforma semnalul chimic intr-un semnal fizic, de obicei electric.Analitul difuzeaza din masa solutiei in stratul biocatalitic, unde are loctransformarea enzimatica.

Biosenzori enzimatici reprezinta cel mai mare grup mult mai mare debiosenzori cu aplicatii practice.

Realizari:

dezvoltarea unui senzor electrochimic continuu pentru detectiafenolilor din matricele complexe;

detectia dioxidului de sulf din curenti de gaz folosind electroziserigrafiati;

dezvoltarea unui biosenzor optic bazat pe reductaza in scopulmonitorizari cu o limita de detectie a nitritilor de numai 0,93M,valoare sub limita admisa a concentratiei impuse de normeleComunitatii Europene, care este de 2,2 M.


11/49

Tipuri de biosenzori enzimatici

E

traductortraductorreciclare

reciclare

substrat

substrat

traductortraductor

E

E

secventialsecvential

E1

traductortraductor

E2

competitivcompetitiv

E1

traductortraductor

E2

reciclarereciclare dubladubla

E

traductortraductor

direct

direct

k1 kcatE + S E-S E + P

k2


12/49

Enzimele

Caracteristici:

Structura:

Catalizatori biologici (conditii de lucru:37C, pH 6,5 - 7,5)

Vmax > 106 to 1012 x Vmax al reactiilor fara enzime

Turnover: 107 substrat de molecule / minut

Specificitate ridicata

Independente din punct de vedere al modului de detectie

Mari, macromolecule complexe, constand din proteine mari

De obicei contin un group prostetic (unul sau mai multi atomi

metalici)


13/49

+Cinetica enzimatica

vmax/2

vmax

v

Reprezentare clasica Reprezentare Lineweaver-Burke

Km [S] -1/Km

1/vmax

1/v

1/[S]

1

1

catk k

kE S ES E P

max

m

S

K S

max max

1 1 1m

K

s


14/49

Enzime

Clasificare:++

Oxidoreductaze

Transferaze

Hidrolaze

Liaze

Isomeraze

Ligaze

Transfer de electroni

Transfer de grupari functionale

Transfer de grupari functionale in apa

Transfer de grupari la sau de la duble legaturi

Transfer de grupari in molecule

Transfer de grupari de legatura

1

1

catk k

kE S ES E P


15/49

Imobilizarea enzimelor

De ce? Atentie la:

Pentru a asigura un contact si un

raspuns maxim

Reutilizarea biosenzorului

Garanteaza stabilitatea enzimei

Mai putin sensibile la interferente

Denaturarea enzimei

Pierderea activitatii

enzimatice

Sensibilitatea semnalului

electrochimic


16/49

Immobilizarea enzimelor

Entrapare Adsorbtie

EE

EE

EE

E E

E E

EE

E

E

E

Legare

covalenta

E

E

E

Micro-incapsulareReticulare

E

E

E

E E

EE


17/49


Entrapare

E E

E E

EE

E

E E

E

E

E

Un gel polimeric este adaugat la o solutie ce

contine enzime.

- Gel poliacrilamida

- PEG-Agaroza

Avantaje: Dezavantaje:

Usor, simplu si rapid Bariere difuzionale mari

Poate fi aplicat oricarei enzime Pierderea continua a

activitatii enzimei

Stabilitate: 3-4 sa tamani


18/49

Micro-incapsularea

E

E

E

O membrana inerta este folosita pentru a prinde enzima in

traductor

- Strans legata de traductor

- Se adapteaza usor

- Este sigura

- Stabilitatea si eficienta enzimei ramanneschimbate

(Acetat de celuloza, policarbonat, colagen, PTFE)

Stabilitate 1 saptamana



19/49

Adsorbtia

E

E

E

- Cea mai simpla cale, pregatire minima

- Adsorbtie fizica, legaturi slabe

(legaturi Van der Walls, ionice sau polare)

- Depinde de substrat

Adsorbtia depinde foarte mult de: pH, temperatura solventului, taria ionica!Stabilitate: 1 zi



20/49

Reticularea

E E

EE

- Foarte utila pentru stabilitatea enzimelor

adsorbite

- Agenti bifunctionali folositi: Glutaraldehida

CH2CHO-CH2-CH2CHO

!-Poate duce la distrugerea enzimei

-Bariere difuzionale



21/49

Legaturi covalente cu membrana sau cu traductorul

E

E

E

- Legatura dintre o grupare functionala a enzimei si suport

(i.e., traductorul)

- Conditii pentru realizarea legaturii: temperatura scazuta,

pH neutru

Stabilitate: 4-14 luni



22/49



Cu bromura de cianogen

Cu carbodiimida

Prin grupari acil prin tratarea

hidrazidelor cu acid azotos


23/49



Cu clorura de cianuril

Prin diazotare si cuplarePrin grupari tiol


24/49

Electrod pasta de carbune: Enzima este adaugata in matrice

Electrod polimer: Polimeri cu conductivitate electrica

Poliacetilena, polipirol, polianilina...KCl: 0.1 M oxidatrea polipirolului la 0.8V vs SCE

Polimeri schimbatori de ioni

Electrozi modificati

(Hsu, W.Y.; Gierke, T.D. J. Membr. Sci. 1983, 13, 307)Canal de interconexiune Micele inverse

SO3-

SO3 -

SO3 -

SO3 - SO3 -

SO3 - SO3-

SO3 -

SO3 -

5 nm

SO3 -SO3 -

SO3 -

SO3 - -SO3 - SO3

SO3 -

SO3-

4 nm

SO3 -

SO3 -1 nm



25/49

Datorita imobilizarii, eficienta enzimatica

este diferita fata de cea din solutie

Interiorul membranei prezinta un pH

aparent

Accesibilitate

Actiune inhibitoare a speciilor acumulate in spatiul limitat

Schimbari ale valorilor Km

Caracteristici ale enzimelor imobilizate

Membrana incarcata negativpH mai mic decat in solution



26/49

Part IV: Examples of enzyme electrodes (2/7)Exemple de electrozi enzimatici

L.C. Clark Jr and C. Lyons (1962) Ann. N. Y. Acad. Sci., 102, 29

Electrod de oxigen

Glucozoxidaza in gel

poliacrilamidic

Electrolit

Anod de argint

Catod de platina

Membrana de celofan

Catre inregistrator

Membrana de teflon

- Prima generatie

- Scaderea concentratiei de oxigen

- Reducerea oxigenului: -0,7V

xGO2 2 2 2Glucoza+O +H O Acid Gluconic+H O


27/49

Example de electrozi enzimatici

Trei tipuri diferite de reactii:

Reducerea oxigenului-in reactii de oxidare catalitica

Consum de oxigen prin oxigenare

Oxidarea NADH si NADPH

Electrod de oxigen

xGO

2 2 2 2Glucoza+O +H O Acid Gluconic+H O

tirozinaza2 2Fenol + O chinona+H O

salicilat hidroxilaza2 2NADP + salicilat + O catecol+H O+NADP


28/49

Part IV: Examples of enzyme electrodes (3/7)Exemple de electrozi enzimatici

Membrana GOX Acetat de

policarbonat reticulat celuloza

Oxidarea H2O2: 0,7 V

Electrod cu apa oxigenata

apa

oxigen igen

apaH2O2

apaoxigen

H2O2

H2O2 e e e e

H2O2

xGO2 2 2 2Glucoza+O +H O Acid Gluconic+H O

Example de electrozi enzimatici


29/49

Se obtine un curent in platou proportional cu cantitatea de glucoza

Electrod cu apa oxigenata

Current (nA)

Time (s)

Rata de formare a apei oxigenate = Ratade oxidare a apei oxigenate

Factorul de limitare a

curentului este dat de difuzia

glucozei , limitarile nu sunt

legate de enzima

!

Exemple de electrozi enzimatici


30/49


Utilizarea mediatorilor

Electrod de referinta

tiparitGox imobilizata

in membrana

Electrod de lucru tiparit

Contacte catre potentiostat


31/49

analitanalitindicatorindicator

coloratcolorat

produsprodus dede

reactiereactie

ER

SiO2

Si

ENFET / IMFETENFET / IMFET

Al2O3

membranamembrana selectivaselectiva

OPTRODEOPTRODE


32/49


Reactia globala de oxidare a glucozei:


De fapt are loc:

FAD: flavin adenin dinucleotidul, grupare prostetica ce asigura transferul de electroni din

substrat

Dependenta de oxigen este depasita prin folosirea unui mediator:

2 2 2 2GOxGlucoza O H O Acid Gluconic+H O

2( ) ( )GOx FAD GOx FADH Glucoza Acid Gluconic+

2 2 2 2( ) ( )GOx FADH O GOx FAD H O

2( ) ( ) 2ox red GOx FADH M GOx FAD M H

anod

red oxM e M

si

si


33/49



HO

OH

OHO

CH2OH

O + H2O2

CH2OH

OH2O +

OH

HO

OH OH

Gox(FAD Gox(FADH2)

Enzima

2 Fe(cp) Mediator 2 Fe(cp)+

Electrode 2 e-

Mediatori:Ferocenul si derivatii sai

Tetracianochinodimetan (TCNQ)

Tetratiafulvalena (TTF)

O gama larga de

oxidoreductaze

Electrodzi utilizati:Electrodul modificat de pasta de

carbon

Electrod din carbon imprimat


34/49

AplicatiiAplicatii

senzorsenzor electrochimicelectrochimic biosenzorbiosenzor enzimaticenzimatic

Sensor


35/49

Biosenzori pe baza de anticorpi si receptori

Elementele de biorecunoastere bazate pe molecule de anticorpi sireceptori au arii de aplicatie si functionalitate similare.

Analitii vizati in ultimi ani acopera un domeniu larg de aplicati de laantibioticele din lapte, monitorizarea generala a mediului pana lametalele grele.

O arie de aplicati traditionala a imunosenzorilor o reprezintadetectia pesticidelor din probele de mediu si matrici alimentare.

Realizari: dezvoltarea unui senzor potentiometric pentru simazina si aplicat

in analiza alimentelor precum extractele din carne , lapte, rosi sicastraveti.

alti poluanti ai mediului incluzand si PCB-urile sunt detectatifolosind electrozi serigrafiati.

utilizarea unor imonosenzori dezvoltati special pentru analize

patogenice, dar numai uni dintre acestia au demonstrat ca aulimite de detectie excelente intr-un timp de analiza relativ scurt.

Principalele directii in utilizarea acestui tip de biosenzori seindreapta spre obtinerea unor limite de detectie din ce in ce maimici.


36/49

Biosenzorii cu celule Biosenzorii cu celule sunt

instrumente analitice careutilizeaza celulele cabiocomponenta imobilizatapentru a detecta sau araspunde la interacti specificecu substantele din mediu.

Biosenzorii cu celule pot fiinclusi in clasa senzorilormetabolici - recunoasterea

substratului de catre receptorulimobilizat (enzime in diferitegrade de integrare, organele,microorganisme sau tesuturi)este urmata imediat de oconversie chimica la un produscorespondent care estedetectabil.

Intr-o ierarhie abiocomponentelor utilizate larealizarea biosenzorilor,celulele se afla la polul opusenzimelor, reprezentand gradulcel mai inalt de complexitate.

drojdii

bacterii

cooperativesecvential

competitive

cuamplificare

Sectiuni de tesut(animal, vegetal,

ciuperci)

Celule bacteriene

intacte

Organite celulare(mitocondri,

microzomi, peretecelular)

Sisteme de enzimecuplate

Enzime izolate


37/49

Biosenzori celulari/microbieni

analitanalit

oxigenoxigen

componentacomponenta

biologicabiologica

NHNH33 HH22S COS CO22 HH++

OO22

luminalumina

calduracaldura

traductortraductor

semnalsemnal

amperometricamperometric

potentiometricpotentiometric

opticoptic

termistortermistor

amoniac, uree, nitriti, sulfati,fosfati, fenol, naftalina, metan,clorofenol, acid formic, benzoat, Fe,Al, Hg, SO2

NHNH33

COCO22

HH++OO22

HH22OO

substrat

substrat


38/49

Biosenzori bazati pe tesuturi si organisme intregi

(superioare) Plante si tesuturi dar si organisme superioare intregi au fost utilizate in

constructia biosenzorilor.

Numarul aplicatilor cu acest tip de biosenzori este minuscul incomparatie cu alte elemente de biorecunoastere, dar cu toate acesteasunt aplicabili pe aproape orice tip de sistem biologic ca element debiorecunoastere in biosenzori.

Realizari : folosirea boabelor de soia si a raspunsului lor electropsihologic la ploaia

acida si alte conditi de stress din mediu ca un potential sistem debiosenzori

tesutul de cartof dulce a fost imobilizat intr-un electrod de grafit ca sursade peroxidaza si utilizat pentru detectia hidrazinei din apa folosita lafierberea alimentelor

chemoreceptori insectelor au fost inglobati cu tranzistori de silicon pentrudeterminarea compusilor organici din aer

microalga Chlorella vulgaris a fost folosita pentru detectia metalelor greleprin imobilizarea celulelor pe un fascicul de fibre optice si pentrudetectia acivitati fosfatazei alcaline.


39/49

Datorita utilizari lor ca senzori pentru determinareatoxicitati si a genotoxicitati, biosenzori bazati pe celuleintregi ca elemente de recunoastere au ca subiect deanaliza produselor farmaceutice si contaminantii dinalimente.

Realizari:- dezvoltarea unui senzor bacterian prevazut cu un

mecanism de corectie interna a raspunsului analitic prinintroducerea unei gene aditionale raportoare;

- folosirea biosenzorilor bazati pe detectia respiratorica pebaza de microbi si celule din plante pentru detectia CO2,NH2

- folosirea Pseudomonas sp. pentru detectia influenteimicrobiologice in unele procese metabolice.


40/49

structura ADN

tranductortranductor piezoelectricpiezoelectric


41/49

Recunoastere moleculara

spatiala

imobilizareimobilizare orientataorientata


42/49

Producatorii comerciali

Life Scan

(Milpitas, CA, USA)

Glucoza din snge Enzim GOD/POD

MediSense Inc.

(Waltham, MA, USA)

Glucoza din snge

(ExacTech

Compania

productoare

Analitul Tehnologia de realizare

YSI (Yellow Springs, OH,

USA)

Glucoz, alcooli, amidon Electrod enzimatic

Numeroi biosenzori au fost dezvoltati de laboratoarele de cercetare insa putine

sisteme practice s-au bucurat de un succes comercial


43/49

Prezinta avantaje analitice Specificitate mare

Sensibilitate

Ofer posibilitatea determinarii nu numai a compusilor chimicidar si a efectelor biologice

Pot furniza atat concentratia totala cat si cea biodisponibila asubstantei

Portabilitate, miniaturizare, lucrul on-site, capacitatea de amasura substante direct din matricii complexa cu minim deprelucrari, raspuns rapid etc.

Aspecte practice la aplicarea biosenzorilor

Matricea probei poate afecta dramatic aplicarea

biosenzorilor in medii reale Nivelul variat de carbon organic

Alegerea solventilor organici

Stabilitatea compusilor biologici


44/49

Tendinte actuale si perspective viitoare

Monitorizarea continua Determinarea multi-analit

Nanotehnologii

Miniaturizarea

Elemente biosenzitive noi

- biosenzorii cu SPR (rezonanta suprafetei plasmei) constituie tipul cel mai de

succes al instrumentelor comerciale

Ingrijorarea la nivel global privind impactul pe care contaminarea mediuluio poate avea asupra sanatatii publice si a mediului va conduce la:

- cresterea cererii pentru biosenzori cu detectie rapida

- aparitia de aplicatii noi ale sistemelor de biosenzori bazati pe noi tehnologii

Validarea. Biosenzorii trebuie comparati cu sistemele analiticeconventionale in termenii sigurantei, sensibilitatii, selectivitatii, specificitatii

determinarilor. Validarea poate implica unele dificultati: aspecte legate de

stabilitatea elementului biologic sau a elementului imobilizat in/pe traductor.


45/49

0,60,6--0,8 mm0,8 mm

anodanod

catodcatod

membranamembrana

enzimaticaenzimaticamembranamembrana

filtrantafiltranta

senzor implantabil

teflonteflonpotentiostatpotentiostatpotentiostat

EL

ER

EA

AA

sistemsistem analiticanalitic

detectiedetectieamperometricaamperometrica

miniaturizare


46/49

Microbiosenzori

Nanobiosenzori Micro si nanobiosenzori reprezinta in mod cert una

din directiile viitoare in cercetarea din domeniul

biosenzorilor. Posibilitatile par nelimitate atunci cand combinam

aceste ari diferite si sperantele rezolvariiproblemelor curente: prepararea probelor,portabilitate, detectia moleculelor, pana la vitezeanalitice veritabile si fiabilitate.

Multe obstacole tipice pentru subsisteme si pentrusenzori bioanalitici vor trebui depasite pentru a

indeplini toate aceste sperante.

Realizari recente:

dezvoltarea unui sistem complet automat depreparare a probelor pentru detectia organismelorpatogene.

dezvoltarea unei biosenzor bazat pe fibre opticefolosind bacteri recombinate pentru detectiatoxicitati mediului.

dezvoltarea unui microsenzor in care anticorpii aufost discret imobilizati pe o varietate de suprafete,prin aceasta asigurandu-se o separare aelementelor de biorecunoastere.

BIOCHIPUL

-lab on a chip-


47/49

Biosenzorul identificaprezenta sau absenta a

33 de specii animale

diferite in orice produs

alimentar prin detectiasecventelor AND specifice.

Aplicare:

Sanatate, Economie, Legalitate, Religie


48/49

Electrozii

Detectie

multipla

Biozenzori

Eliberareacontrolata

Bazati pe

chipuri/arrays

anticorpi,probe bazate pe

activitate, suprafeteactivate chimic


49/49

UtilizareaUtilizarea biochipurilorbiochipurilorcu ADNcu ADN

DetectiaDetectia polimorfismuluipolimorfismului apoapo--lipoproteineilipoproteinei E dinE din sangelesangele umanuman

DetectiaDetectia genelorgenelorspecificespecifice legate delegate de speciilespeciile dede MycrocystisMycrocystis

DenaturareaDenaturarea oxidativaoxidativa a ADNa ADN

DetectiaDetectia hibridizariihibridizarii ADN legate deADN legate de virusulvirusul hepatiteihepatitei BB

InteractiaInteractia intreintre ADNADN cucu echinomicinaechinomicina,, mitomicinamitomicina,, tiotepatiotepa,, complexulcomplexul Cu(II)Cu(II)--mitoxantronamitoxantrona

DeterminareaDeterminarea originiioriginii unorunorboliboli

IN ANALIZA CLINICA:IN ANALIZA CLINICA:

IN ANALIZA MEDIULUI:IN ANALIZA MEDIULUI:

DetectiaDetectia amineloramineloraromaticearomatice toxicetoxice dindin apeleapele rezidualereziduale

DetectiaDetectia aducturiloraducturilorformateformate intreintre benzo[benzo[

senzori si biosenzori

Documents