biotehnologii

7/21/2019 biotehnologii

http://slidepdf.com/reader/full/biotehnologii-56d9f0c687d2e 1/7

Pg 63

Măsurarea digestiei şi.....

Introducere

Endonucleotidele sunt enzime care recunosc secvenţe de nucelotide specifice din AD du!lucatenar şi sunt un instrument ma"or al !iote#nologiştilor.Pentru celulele procariote$ acesteafuncţionează %n natură ca sisteme de restricţie şi modificare şi se va lipi de AD&uri străine careintră %n celula !acteriană$ dar nu se va lipi de AD&ul gazdă care a fost prote"at sau modificat prin metilare. Ma"oritatea endonucleotidelor se vor lipi reproductiv de AD la un anumit punct%ntr&o secvenţă de recunoaştere. 'n general$ diferite enzime vor recunoaşte diferite secvenţe careau lungimea de la ( la 6 nucleotide. Această precizie este esenţială pentru te#nicile de clonaremoleculară$ cum ar fi izolarea genelor din AD&ul genomic sau inserarea unui AD străin %ntr&o plasmidă. Multe enzime produc secvenţe %n zig&zag faţă de a)a de simetrie a secvenţei lor de

recunoaştere. *liva"ele de acest tip vor aduce un !eneficiu de 3+ şi ,+ fragmente de AD& prelungiri sau -capetele lipicioase care pot forma perec#e cu fragmente de AD generate deaceeaşi enzimă şi totuşi care să formeze molecule recom!inate.

Pg 6(

Alte enzime vor readuce adresa de recunaştere la a)a de simetrie pentru a producerezultate direct finisate. Acestea pot fi legate altor secvente direct finisate sauterminate$ indiferent de enzima de restricţie utilizată. A dua te#nică introdusă %n

acest e)erciţiu este gelul de agarpză electroforeză. Când agaroza este topită şiapoi răcită într-o soluţie apoasă, aceasta formează un gel prin legături dehidrogen. Populaţia fragmentelor de AD generate de restricţia enzimelor !atrece printr-un mediu agarizat su" influenţa unui câmp electric, undemoleculele de AD încărcate negati! !or fi atrase la anod. #ata lor de mişcarese "azează aproape în întregime pe mărime, moleculele cele mai mari a!ândmo"ilitatea cea mai mică. Concentraţia de agaroză în gel determină mărimea

porilor iar fragmentul de AD care are o anumie mărime !a migra la ratediferite prin geluri de concentraţii !ariate.

$%istă o relaţie lineară între registrul de mo"ilitate şi concentraţia gelului peste un anumit inter!al de mărimi ale fragmentului, astfel că concentraţia gelului tre"uie să fie aleasă astfel încât să poată efecti! separa moleculele de AD din populaţia de AD. &elul de agaroză ',() este potri!it pentru a separamoleculele de AD-ul linear, de mărime ',*-+' ".



/reutăţile moleculare ale fragmentelor cunoscute$ cum ar fi p#age cut$ curestricţia nucleotidei 0indill$ poate să fie un punct de măsurare %mpotrivamo!ilităţii. *ur!a de etalonare care rezultă poate fi folosită pentru a determinagreutăţile moleculare ale fragmentelor de AD necunoscute. *a o măsură rapidă$greutatea moleculară a unui fragment poate fi estimată prin comparaţie directăvizuală la poziţia de 1 fragmente pe gel. 2enzile sunt vizualizate cu iluminaţieultravioletă după colorarea cu o vopsea fluorescentă$ !romură de etidiu. *antitatea

potrivită de AD prezentă %n !andă poate fi estimată la fel de !ine şi princompararea intensităţilor fluorescenţei$ la fel ca %n E)erciţiul ,$ partea *4.

Puritatea sau orice degradare a ADN-ului poate fi de asemenea determinată pe gel de agaroză.

Contaminarea cu ARN poate fi detectată ca un larg frotiu care rulează la o greutate moleculară

mică. ARN-ul poate fi îndepărtat prin adiţia de ribonucleotide la digestia restrictivă.

Contaminarea cu proteine poate rezulta prin inibarea parţială a activităţii enzimelor restrictive

sau a degradării ADN-ului. Contaminanţii proteiformi pot fi eliminaţi prin e!tracţia de fenocloroform "i ulterior# prin precipitaţii de etanol. $!cesul de sare într-un preparat plasmidă

va iniba de obicei activitatea enzematică

pg 6,

de asemenea. 5area poate fi eliminată prin precipitaţii de etanol urmată despălarea AD&ului cu 78 etanol. /elul de agaroză va arăta dacă plasmida digeratădă randamentul aşteptat de la cunoscutele adrese de restricţie din #arta plasmidei.

Dacă AD&ul a fost degradat$ de e)emplu$ prin contaminarea D&ului$ Adn&ulva apărea ca un frotiu %n gelul colorat.

'n acest e)erciţiu vom folosi enzime restrictive şi mini&geluri de agaroză ca uninstrument de diagnostic rapid pentru a determina mărimea şi puritatea at9t a ma)i

preparatelor4 c9t şi a mini&preparatelor4. 'n plus$ cantitatea apro)imativă de plasmidăAD din mostre poate fi determinată prin compararea cu :!andele luminoase vezie)erciţiul ,$ partea *4.

5uccesul de amplificare P*; a unei gene fragment lac<$ aşa cum s&a %ncercat %ne)erciţiul $ va fi de asemenea evaluat %n acest e)erciţiu.

;eactivi=materiale necesare>



Agaroză 5ea?em$ @M* *orporation4

Al!umina serică !ovină 25A$ 7mg=ml4

Ditiot#reitol$ B7) DCD$ B7mm4

2aloane Erlenmezer B,7ml4

2romură de etidiu 7mg=ml$ vezi e)erciţiul ,4

Mănuşi

/#eaţă

a!oratorul de !andă

Marcatori de mărime 0indill$ de concerntrare furnizate de fa!ricant17$,=1g=ml4

Cu!uri de microcentrifugă 7$,ml4

Micropipetor şi sfaturi

Pipeta pasteur

Pro!e de reacţie P*; de la e)erciţiul 4

@olie de plastic

@ilm polaroid tip 664

p;B plasmidă de AD de la ma)i&prep de la E)erciţiul 64

p;B plasmidă de AD de la mini&prep de la E)erciţiul (4.

Pg 66

;estricţie tampoane reacţie enzimă$ 7) a se vedea nota instructorului demai "os4



;estricţii ale enzimelor> 0indill$ Pstl$ 2am0I$ Eco;I %n glicerol$ disponi!ilede la diverşi producători$ a se vedea apendicele B74

Campon stop> B77 mM EDCA p0 F$74

CEA tampon$ B,)> Cris M$ , mM EDCA$ B, mm acetat de sodiu$ p0 $F

a ,7 ml de 0BG distilată de adaugă B g de !ază Cris$ 7$B g de acetat desodiu$ F$6 g de EDCA. A"ustează P0&ul la $F cu acid acetic glacial şi aduvolumul la litru. Păstrează la ( grade.

Hrmărire vopsea$ 6) a se vedea nota instructorului$ mai "os4

*ontainere Cupperare sau ec#ivalent4 pentru colorare.

Ec#ipament

2loc de căldură la 6, de grade

Aparate orizontale de electroforare %n&cu gel a se vedea nota instructoruluide mai "os4

@iltru Jratten KodaK BBA

Microcentrifugă

*uptor cu microunde sau arzător 2unsen

*ameră Polaroid MP&(

Putere capa!ilă să transporte cel puţin 77 de volţi de aprovizionare

Cransiluminator ultraviolete HL4

2aie de apă la 3 de grade

2aie de apă la (, de grade.



otele instructorului

. . Pregătirea de urmărire a soluţiei colorate> Pentru 77 ml de stoc 6) soluţie$

se adaugă (7 g de za#aroză la 67 ml apă distilată. Adaugă B,7mg de al!astru de !romfenol. 5e amestecă prin agitare pentru ,B7 de minute. A se păstra la ( grade*. Această soluţie colorată 6) se adaugă la ă şesime din volumul final al soluţiei deAD pentru a fi supus electroporezei.

B. B. Atunci c9nd ac#iziţionaţi un aparat de electroforeză orizontală gel$instructorul ar tre!ui să ia %n considerare numărul de pro!e sau mostre careurmează să fie prelucrate.

Pagina 6

'n acest e)erciţiu. Mulţi producători v9nd aparate sufie a se vedea Appendi) B74

Procedura>

. Hrmătoarele orientări sunt folosite pentru a pregăti AD&ul plasmidic pentru restricţia digestiei>

a. Determină cantitatea de AD pentru a fi digerată de e)emplu$1g4.

!. Pe !aza de concentrare a stocului unităţi pe microlitri4 deendonucleaze de restricţie$ calculează micrilotrii de enzimă necesari

pentru a atinge digestia din cantitatea dorită de AD. Pentru aceste)periment$ B unităţi de enzimă sunt suficiente pentru a digera =.1g de plasmidă AD. otă> 6 unităţi == g1 este regula - -degetuluimare pentru digestia de AD cromozomial4. Pentru ca folosirea

e)cesului de enzNme să asigure digestia completă$ stocul de producţieeste adăugat ca furnizor şi fără diluare.

c. Determinaţi volumul total de reacţie de digestiv pentru a atingeun volum adecvat$ %n care conţinutul de glicerol %n reacţie va fi maimic sau egal cu ,78 v=v4glicerol$ astfel %nc9t A>7 diluarea enzimeidin amestecul reacţiei finale să fie suficient.



d. Pe !aza acestui volum total de reacţie$ calculează c9t de multtampon 7) şi B7) DDC dacă este necesar4 este necesar pentru ao!ţine ) o concentraţie finală a acestor reactivi %n amestecul reacţiei.Camponul folosit este dependent de concentraţia de sare la careenzima este activă optim. Camponul corespunzător scăzut$ mediu sauridicat4 este furnizat de către producător.

e. Pentru unele enzNme de al!umin serică !ovină 25A4 estenecesară ca un sta!ilizator pentru o digestive optimă. 25A estedeseori furnizat ca o soluţie 77) stoc la 7mg= ml şi ar tre!ui să fieadăugate reacţiilor pentru o concentraţie finală de 7$mg=ml. Esteconvena!il să fie pregătit o soluţie de lucru 7) pentru acest PH;

din pagia anterioara&ultima propozitie4

a. Este convena!il să fie pregătita o soluţie de lucru 7) pentruacest scop.

Este prudent să se verifice dacă o enzimă necesită 25A sau nu %nainte de digestie.'n cazul %n care se adaugă 25A$ o cantitate compara!ilă de 0BG distilat tre!uie săfie reţinută de reacţia amestecului.

*alculaţi volumul de 0BG distilat necesar pentru adaptarea volumului de reacţie lavolumul final dorit. A se vedea eşantionul %nta!ulat Ca!elul F.4 pentru un

e)emplu de cum o astfel de reacţie poate fi pregătită şi corespunzător %ntregistrată%ntr&un caiet.

Cu!&

*oncentraţia de AD& 7$, ug=ul

5olutie de AD pentru a da ug deAD> B ul 77

Enzime si concentratie de enzime

Enzime si concentratie de enzime> E*G ;I O6B> 7H=ul 5olutie enzime dau Bu de AD per microgram> ul din >, diluare 7) tampoane concentratia sarii4> Bul mediu4 7 )25A> B ul Apa distilata> 3 ul Lolum total> B7ul.



(!!! Nota de la mine, Delia: u= miu, stii tu semnul acela! in

loc de u-urile puse de mine in bold, pune tu acel simbol!

Plus ca eu nu am mai facut tabel, asa cum era in text, ci am

enumerat, asa cum vezi mai sus!)B. *alculeaza sumele de ingrediente pentru a fi utilizate in fiecare dintreurmatoarele restrictii digestive>

4p;B mini&prep7 tiat cu 2am0I$ B4p;B ma)i&prep4 taiat cu 0indill$34p;B ma)i&prep4 taiat cu Eco;I$ (4p;B ma)i&prep4 taiat cu Pstl si,4p;B ma)i&prep4$ taiat cu 2am0I.

ota instructorului>

Producatorii vor furniza un tampon recomandat cu enzima. Alternativ$ acesteatampoane 7) denumit in cintinuare sare scazuta$ medie sau mare4 pot fi pregatitein conformitate cu specificatiile producatorului si stocate in parti alicote de $,mlla B7 de grade. Hntampon universal potrivit pentruQ.. pana aici am tradusRAdica pana la sfarsitul paginii 6F4

biotehnologii

Documents