Aspectele cresterii bacteriene in vitro

Bacteriile sunt niste fiinte vii si, astfel, ele cresc, se inmultesc si mor. Acest proces complex nu se refera numai la indivizi, ci si la populatia bacteriana in totalitate. In primul caz biologia cresterii si dezvoltarii este dirijata ereditar, in cel de al doilea aceste fenomene depind cu precadere de conditiile de mediu. Multiplicarea bacteriilor inseamna cresterea numarului de indivizi intr-un mediu de viata favorabil si se realizeaza prin diviziune. Populatia care rezulta prin diviziunea bacteriilor creste in progresie geometrica cu ratia 2, timpul necesar  pentru dublarea populaţiei numindu-se timp de dublare sau timp de generatie

La bacteriile cu diviziune rapida (majoritatea )timpul de generatie este de 20 minute pana la 3 ore.

La bacteriile cu diviziune lenta(genul Mycobacterium) timpul de generatie este de 20 de ore.

In raport cu specia bacteriana, multiplicarea atinge un maximum de populatie care se poate mentine o perioada oarecare dupa care incepe declinul ei. Multiplicarea se petrece in faze succesive. Acestea sunt:1.faza de lag sau faza de ajustare, ce se caracterizeaza prin diminuarea numarului de indivizi care constituie inoculul, prin cresterea dimensiunilor germenilor viabili.2.faza logaritmica (exponentiala) de multiplicare este o faza de crestere rapida, in progresie geometrica, a bacteriilor si se caracterizeaza printr-o serie de manifestari cunoscute sub numele de“tinerete fiziologica" ; microorganismele sunt mai permeabile si mai sensibile la factorii de mediu.3.faza stationara caracterizata prin faptul ca raportul dintre germenii care se divid si cei care mor ramane relativ constant, astfel incat numarul bacteriilor se stabilizeaza. Faza de stationare este denumita si faza de concentratie “M”,deoarece in aceasta etapă populaia bacteriană atinge un maximum in cultură.4.faza de declin (faza de moarte logaritmica)este etapa in care numarul germenilor morti intrece numarul germenilor vii, deoarece consumarea substratului nutritiv si acumularea de metaboliti toxici duc la moartea majoritatii bacteriilor, iar timpul de generatie creste la cateve zile; celulele vii imbatranesc, nu-si mai pastreaza caracteristicile, speciile patogene isi pierd patogenitatea si virulenta. In aceasta faza apar tendintele de sporulare.

Culturile continue se fac in scopuri productive si prezintă o deosebita importanta industriala,și biotehnologica in domenii de activitate de mare importanta economica si sociala.In fapt, cultura bacteriana este rezultatul inmultirii, cresterii numarului de germeni, intr-un mediu favorabil formandu-se o populatie avand caractere asemanatoare. Aspectul culturii bacteriene depinde de specia, varsta indivizilor precum si de mediul de cultura.Mediile de cultura bacteriana pot fi:artificiale,create in scopul asigurarii tuturor conditiilor pentru dezvoltarea si multiplicarea indivizilor si naturale

(vii), avand provenienta animala (ou embrionat, animale de experienta, tesuturi animale, culturi celulare, sange etc.) si vegetala (culturicelulare, meristeme, parti din plante s.a.). Culturile bacteriene pot fi studiate in vitro – pe medii de cultura artificiale sau in vivo – direct pe mediile naturale, mai ales pentru germenii patogeni.Culturile bacteriene se dezvolta pe medii: artificiale lichide si solide. Primele determina aparitia dupa o perioada de 18-20 ore a unei turbiditati (tulbureli) ce poate fi omogena, datorata germenilor de varsta tanara, cu vigoare ridicata caredisperseaza uniform si rapid in mediu, denumita culturi S ( smooth – netede) sau neomogena, cu grade de turbiditate diferite si uneori chiar limpezi dar cu depuneri pe vasele de cultura sau valuri de suprafata, purtand denumirea de culturi R(rough – rugoase).Culturile de medii solide sunt obtinute prin insamantarea germenilor bacterieni rezultati din multiplicarea unei singure celule bacteriene si se numesc colonii de culturi pure sau culturi clonare. Colonia bacteriana reprezintă cultura pură apărută după un timp de multiplicare de 2 - 6 ore, în care, din punct devedere genetic, indivizii sunt identici.Dupa aspect, coloniile pot avea o forma geometrica regulata sau neregulata, conturate sau difuze, colorate sau necolorate, lucioase sau rugoase,limpezi, opace sau semimate, cu sau fara caracteristici specifice specie .Coloniile - S au aspect lucios, cu margini conturate, forma rotunda sau ovoidala, diametru 1-2 mm, consistenta onctuoasa.reprezintă forma normală pentru majoritatea bacteriilor patogene, fiind dotată cu calităţi optime de structură antigenică şi de patogenitate. Coloniile – R au suprafata aspra, forme cu margini neregulate, crenelate,uneori difuze in mediul de cultura, in general colorate si mate. forma R reprezintă o formă de degradare, însoţită de modificări structural profunde, de modificări antigenice şi de scăderea virulenţei ,este caracteristică, în general, bacteriilor nepatogene ,există şi 3 excepţii la care forma R caracterizează specii patogene:Bacillusanthracis,Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheria Coloniile - M sunt variante ale tipului S dar contin germeni cu capsula si au o consistenta gelatinoasa sau mucilaginoasa, prezentand tendinta de a difuza in mediu sau de jonctiune intre ele.caracteristice bacteriilor care posedă capsulă (de ex. Klebsiella) Coloniile - G sunt colonii pitice obtinute din germeni normali dar afectati de interventii exterioare (ex. antibiotice, antiseptice, carente nutritionale, etc.). Colonii untoase -colonii mari rotunde ,suprafaţă mată,aspect untos Colonii pufoase caracteristice mucegaiurilor Fenomen de căţărare Speciile Proteus: pe medii simple (fără substanţe inhibitoare) creşte sub forma unui văl care acoperă toată suprafaţa mediului,dacă tulpinile însămânţate pe acelaşi mediu de cultură sunt diferite atunci peliculele formate nu se intersectează, apare un spaţiu de demarcare, fenomen numit DIENEŞ.dacă tulpinile de Proteus sunt la fel atunci cele două pelicule se vor contopi Coloniile bacteriene se deosebesc intre ele prin anumite caracteristici de cultura, care, singure sau impreuna, constituie criterii de departajare. Astfel,diametrul coloniei bacteriene imparte coloniile in mari – cele care au diametrul mai mare de 2 mm, mijlocii si mici – coloniile cu diametrul sub 1 mm. O alta caracteristica este transparenta coloniilor . Sub acest aspect exista colonii translucide, ca cele date de streptococi si opace, caracteristice, in general,coloniilor de stafilococi. In functie de proprietatea de a produce pigmenti, bacteriile pot fi pigmentogene (cromogene), daca produc pigmenti, caz

in care: a)se coloreaza doar colonia (cazul bacteriilor cromofore si paracromofore) – de exemplu coloniile stafilococice colorate in alb, galben, auriu b) se coloreaza si mediul, fiind cazul bacteriilor cromopare la care pigmentul este eliberat in exteriorul celulei – ca de exemplu bacilul piocianic care sintetizeaza si elibereaza in exterior doi pigmenti: piocanina – albastra si pioverina – verde. Alte caracteristici ce pot constitui criterii de identificare a coloniilor bacteriene, prezentate si anterior sunt: forma coloniei, rugozitatea coloniei, consistenta, forma conturului marginal, etc. . Clasificarea mediilor de cultură

După consistenţă: lichide (repartizate în eprubete) solide (geloza dreaptă, înclinată, în placă) semisolide (în eprubete)

După conţinutul de substanţe nutritive: A. Medii naturale: conţin substanţe nutritive în forma lor naturală, fără a fi prelucrate în prealabil:

mediul cu bilă, mediul cu lapte, mediul cu ouă (Dorset), ser coagulat de bou (Löffler)

B. Medii artificiale:a. Medii de bază – pentru germeni nepretenţioşi

bulion simplu – macerat de carne, peptonă, NaCl 0,5% apa peptonată – peptonă şi NaCl 0,5% geloza simplă – bulion + agar-agar (un extract de alge care

asigură consistenţa solidă, nu are proprietăţi nutritive)b. Medii compuse 1) Medii complexe: mediu de bază + substanţe organice (sânge, ser, glucoză), sunt folosite pentru cultivarea germenilor pretenţioşi

geloza sânge, geloza ser bulion sânge, bulion ser, bulion glucozat

2) Medii de îmbogăţire: conţin agenţi selectivi, care inhibă dezvoltarea unor bacterii dar permit creşterea altora

mediul Pike pentru îmbogăţirea streptococilor: bulion glucozat cu cristal violet(inhibă dezvoltarea stafilococilor), azid de Na (inhibă Gram negativii), +/- sânge

mediul hiperclorurat pentru îmbogăţirea stafilococilor: bulion + NaCl 7,5% mediul OCST pentru bacilul difteric: ou, cistină, ser, telurit de potasiu

3) Medii speciale: au compoziţie specială, permit cultivarea unor bacterii pretenţioase

mediul Löwenstein-Jensen – pt. cultivarea micobacteriilor – ou, cartofi, verdemalachit, asparagină, glicerină

mediul Sabouraud – pt. cultivarea levurilor: geloză + maltoză/glucoză +antibiotice

mediul Schaedler – pt. anaerobi – geloză sânge + glucoză mediul chocolat – neisserii, hemofili: geloză sânge, sângele se adaugă la geloza

topită şi răcită la 60-70C

4) Medii selective şi diferenţiale: substanţe selective (inhibă creşterea unor bacterii) +zaharuri/polialcooli + indicator; sunt folosite pentru izolare şi identificare

mediul Leifson (ADCL – agar dezoxicholat citrat, lactoză) - pt. enterobacterii:săruri biliare + lactoză + roşu neutru;

mediul Levine (EMB – eosine – methyl blau) - pt. enterobacterii, E. coli: eozină +albastru de metilen + lactoză;

mediul SS – Salmonella-Shigella: săruri biliare + verde briliant + lactoză + roşuneutru + săruri de fier

mediul MacConkey – pt. enterobacterii: săruri biliare +roşu neutru + cristal violet+ lactoză

mediul Chapman - pt. stafilococi: NaCl 7,5% + manitol + roşu fenol

mediul ABE – pentru enterococi Agar + Bilă + Esculină 5) Medii diferenţiale: permit identificarea bacteriilor pe baza unor procese biochimice

geloza lactozată: lactoză + albastru de bromtimol – se studiază fermentarealactozei

mediul lichid cu indicator Andrade: un zahăr + indicator Andrade – se studiazăfermentarea zaharurilor

mediul SIM (hidrogen sulfurat, indol, mobilitate): conţine agar semisolid pentrustudiul mobilităţii, bogat în triptofan pentru studiul producerii de indol şi conţinutde săruri de fier pentru detectarea producerii de H2S

mediul TSI (triple sugar iron) conţine glucoză, lactoză, zaharoză pentru studiulfermentării acestora, sulfat de Fe pentru detectarea producerii de H2S

mediul Simmons – mediu cu citrat pentru studiul folosirii citratului ca unica sursăde carbon

mediul cu uree – uree + roşu fenol pentru detectarea ureazei

Metode de însămânţare

Pe medii solide o însămânţare prin epuizare (se obţin colonii izolate) o însămânţare în sector (se obţin colonii confluen o însămânţare prin înţepare

Pe medii lichide o omogenizarea unei colonii în mediu lichid

Însămânţarea prin epuizare

Obţinerea culturii pure

· Se replică o singură colonie din cultura primară pe un mediu de cultură proaspăt, fie prin epuizare, fie prin însămânţare în sector

Însămânţarea în sector

Pe o placă pot fi însămânţate mai multe specii bacterienePrin însămânţare în sector nu se obţin colonii izolate !

Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic Se descarcă ansa pe mediu de cultură sub forma unui sector de cerc

Însămânţarea pe medii în coloană înclinată Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs Se descarcă ansa pe partea înclinată a mediului de cultură sub forma unui striu

NU se obţin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele

Însămânţarea prin înţepareSe practică pentru însămânţarea mediilor solide turnate în coloană dreaptă

Se încarcă acul de inoculare cu produs Se înţeapă mediul în direcţie verticală pe o distanţă de ¾ din înălţimea coloanei

Însămânţarea în mediu lichid Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs Se omogenizează produsul recoltat în mediul de cultură lichid

Caractere de cultură

a. În medii lichide:

tulburarea uniformă a mediului: Staphylococcus, Salmonella etc. depozit grunjos sau nisipos la fundul tubului, mediul rămâne clar: Streptococcus

spp. depozit floconos, mediul rămâne clar: B. anthracis mediul prezintă văl subţire la suprafaţă: Corynebacterium diphtheriae membrană groasă rugoasă, plisată la suprafaţă, restul lichidului limpede:

Mycobacterium tuberculosis inel aderent pe pereţii tubului: Escherichia coli peliculă la suprafaţă, sub aceasta mediul este colorat verde-albastru: Pseudomonas

spp. b. Pe medii solideÎn cazul germenilor cu creştere rapidă (timp de generaţie 20-30 minute) după 18 ore deincubare la 35-37C, dintr-o singură bacterie ia naştere colonia.La colonii notăm:

1. mărimea2. forma: rotunde, stelate etc.3. aspectul marginilor: regulate, neregulate, cu prelungiri în cap de meduză.4. suprafaţa coloniei: bombată, granulată, plată, cu depresiune centrală, cu

ridicăturăcentrală, sau marginală etc.

5. aspectul: lucios, mat, mucoid, aspect curgător uleios, vitros etc.6. consistenţa: vâscoasă, filantă7. dacă se emulsionează uşor sau nu în ser fiziologic8. transparenţa sau opacitatea coloniei9. pigmentarea coloniei10. apariţia unei zone colorate sau incolore în jurul coloniei11. eventual lichefierea mediului

.I.Studierea metabolismului glucidic

A. PE MEDII SELECTIV-DIFERENŢIALE

a. Fermentarea manitei pe mediul Chapman fermentarea manitei se face cu producere de acid,culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben,se diferenţiază stafilococii

patogeni - manitopozitivi nepatogeni – manitonegativi

b.Fermentarea lactozei pe mediul Leifson / MacConkey fermentarea lactozei se face cu producere de acid ,culoarea indicatorului (roşu neutru) virează în roşu,se diferenţiază enterobacteriile patogene de nepatogene

B. PE MEDII DIFERENŢIALE

a. Fermentarea lactozei pe geloză lactozată fermentarea lactozei se face cu producere de acid,culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în galbenb. Fermentarea zaharurilor pe mediul lichid cu indicator Andrade in mediul lichid se introduce un glucid,fermentarea lui duce la formare de acid,culoarea indicatorului (iniţial albastru) virează în roşu,evidenţierea producerii de gaz se face cu tub Durhamc. Fermentarea zaharurilor pe mediul TSI,fermentarea glucozei se studiază pe porţiunea dreaptăfermentarea glucozei se face cu producere de acid,culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben,fermentarea lactozei, zaharozei se studiază pe porţiunea înclinată,fermentarea glucozei se face cu producere de acid,culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben II. Studierea metabolismului proteic

A. Producerea de indolDegradarea proteinelor (triptofanul) se face cu producere de indol,indolul în contact cu reactivul Erlich (galben) formează de nitrozoindol ( roşu). Metode de evidenţiere:Extragerea indolului cu eter

în apă peptonată însămânţată + eter + reactiv Kovacs inel roşu – indol pozitiv inel galben – indol negativ

Benzi pentru reacţia indolului,benzi de hârtie de filtru impregnate cu reactiv Kovacs (galbene)se ataşează la dopul eprubetei cu apă peptonată sau mediul SIM

banda devine roşie – indol pozitiv banda rămâne galbenă – indol negativ

B. Producerea de H2S.Descompunerea proteinelor se poate face cu producere de H2S,H2S în contact cu săruri de fier sau plumb formează sulfuri de culoare neagră. Metode de evidenţiere: Benzi pentru H2S,benzi de hârtie de filtru impregnate cu acetat de plumb (albe)se ataşează la dopul eprubetei cu apă peptonată însămânţată

banda devine neagră – H2S pozitiv banda rămâne albă – H2S negativ

Pe mediul TSI,mediul conţine săruri de fier şi protein,se însămânţează prin înţepareapariţia unui inel negru între porţiunea dreaptă şi cea înclinată - H2S pozitiv Pe mediul SIM,mediul conţine săruri de fier,se însămânţează prin înţepare.apariţia unui zone negre în jurul înţepăturii - H2S pozitiv Pe mediul PISU cu cistină,mediul conţine cistină şi acetat de plumb,se însămânţează prin înţepare,apariţia unui halou cafeniu în jurul înţepăturii - H2S pozitiv

C. Testul ureazei.,se studiază pe mediul cu uree,scindarea ureei se face cu producere de amoniac,mediul devine alcalin, culoarea indicatorul (roşu fenol) virează în roşu.

III. Evidenţierea altor enzime bacteriene

A. Evidenţierea catalazeiCatalaza descompune apa oxigenată în apă şi oxygen,oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz,metoda: cultura de cercetat se suspendă pe o lamă într-o pic. de H2O2,apariţia bulelor – catalază pozitiv

B. Evidenţierea oxidazeiEnzimele oxidative acţionează asupra unor substanţe producând compuşi coloraţi,metode de evidenţiere: cu tetrametil parafenilen diamină,benzi impregnate cu reactivPe benzile umezite cu apă distilată se depune o parte din colonie,culoarea virează în mov închis – oxidază pozitiv,reactivul se picură direct pe coloniile suspecte

C. Evidenţierea hemolizei se face pe geloză sânge Tipuri de hemoliză: Hemoliza α, incomplete,hemoglobina este descompusă doar până la

methemoglobină,apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei. Hemoliza β, completă,sângele este descompus total,în jurul coloniei este o zonă

clară, transparentă

D. Evidenţierea coagulazeiCoagulaza este o enzimă bacteriană extracelulară şi determină coagularea plasmei,metode de evidenţiere

pe lamăo cantitate mică din colonie se depune într-o picătură de plasma,apariţia de coaguli mici - coagulază pozitiv

în tuburi,în eprubete cu plasmă citratată se adaugă cultura în bulion,se incubează la termostat 24 de ore,apariţia de coaguli – coagulază pozitiv

IV. Alte teste biochimice

A. Mobilitatea germenilor se studiază pe mediul SIMînsămânţare prin înţepare:

mobilitate negativ - mediul rămâne clar mobilitate pozitiv – mediul se tulbură

B. Folosirea citratului ca sursă de carbonse studiază pe mediul Simmons.dacă germenii folosesc citratul în metabolism, cresc şi alcalinizează mediul,culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în albastru.

C. Producerea de pigment. Pigmenţi intracelulari – nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia

(stafilococul) Pigmenţi extracelulari – difuzează în mediu, colorează şi mediul (Pseudomonas).

D. Mirosul unii germeni au miros caracteristic: Proteus – fetid Candida – drojdie Esherichia coli – varză acră Pseudomonas – miros aromat Shigella – miros de spermă