acidul ascorbic
Post on 19-Jan-2016
820 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
UNIVERSITATEA ”OVIDIUS”, CONSTANȚA
FACULTATEA DE FARMACIE
SPECIALIZAREA: FARMACIE
ACIDUL ASCORBIC
Studenți: Carabaș Virginia, Hristu Elena
Anul:II, grupa:9
1
CUPRINS
Cuprins...............................................................................................................................................2
I.Introducere.......................................................................................................................................3
II.Formule chimice.............................................................................................................................3
III.Structura chimică..........................................................................................................................3
IV.Proprietăți fizice............................................................................................................................4
V.Surse naturale..................................................................................................................................4
VI.Acțiune fiziologică........................................................................................................................7
VII.Metode de obţinere.......................................................................................................................9
VIII.Metode de analiză.....................................................................................................................12
IX.Utilizarea acidului ascorbic..........................................................................................................16
X.Forme farmaceutice......................................................................................................................17
Bibliografie......................................................................................................................................18
2
I.Introducere
L-acid ascorbic (vitamina C), reprezintă un antioxidant de exceptie ce contribuie activ la
frânarea proceselor degenerative din organism. Facând parte din grupa vitaminelor hidrosolubile
(solubile in apa),acidul ascorbic se elimina ȋn cantitati mari din organism. L-enantiomerul acidului
ascorbic se mai numeşte şi vitamina C (numele de "ascorbic"vine de la proprietatea sa de a preveni şi
vindeca scorbutul).
Vitamina C, cu denumirea IUPAC (R)-3,4-dihidroxi-5((S)-1,2-dihidroxietil)furan-2 ona, este
de fapt γ-lactona acidului 2,3-dienol-L-gulonic și conține in molecula 6 atomi de carbon, două grupări
alcoolice și două grupări enolice. Vitamina C se poate prezenta sub forma de izomeri optici(R,S),
datorita faptului că are în structură un atom de carbon asimetric. Forma activa biologic a acidului
ascorbic face parte din seria L. Enantiomerul D este lipsit de semnificație fiziologică.
Activitatea vitaminică a acidului ascorbic este determinată de prezența grupării en-dolice
specifice, forma biologic activă fiind cea în care grupările en-dolice sunt libere pentru a trece reversibil
în grupe cetonice.
II.Formule chimice de structura ale celor doi compusi sunt :
Acid L-ascorbic ( Acidum Ascorbicum)
Acid dehidroascorbic: este forma reversibil oxidata a acidului
ascorbic și este biologic activ . Se prepară prin acțiunea
benzochinonei asupra acidului ascorbic.
III.Structura chimică
3
IV.Proprietăți fizice
Acidul ascorbic este un compus nesaturat, cu caracter acid datorită prezenţei celor doi hidroxili enolici
capabili de a se disocia cu formarea de ioni de hidrogen.
Vitamina C este o pulbere albă,cristalină,fără miros, este ușor solubilă în apă, solubilă în alcool și
metanol, practic insolubilă în benzen,cloroform,eter, eter de petrol și uleiuri grase. Stabilă în aer,în
stare uscată. În preparatele impure și în multi produși naturali, vitamina se oxideaza când este expusa la
aer și lumină.
Punctul de topire: 188-192ºC.
V.Surse naturale
Acidul ascorbic se găseşte în stare naturală în toate plantele şi animalele, preponderent în fructele
proaspete (în special citrice) şi în multe legume.
1.Plante
Cantitatea de vitamina C din alimente provenite din plante depinde de:
varietatea exactă a plantei
condițiile solului
climatul în care s-a dezvoltat
perioada de timp dintre recoltare și consumare
condițiile de păstrare
metoda de preparare. Gătitul în general, se presupune, distruge vitamina C.
4
Următorul tabel arată abundența relativă a vitaminei C în plante crude. Cantitatea este
exprimată în mgla 100 grame de fruct sau legumă:
Concentrația de acid ascorbic variază în funcție de temperatură și de perioada de stocare. Prin urmare,
apar modificări ale cantității de vitamina C la anumite legume și fructe în timpul congelării la diferite
condiții( depozitare 2 luni la diferite temperaturi). S-a observat faptul că temperatura de depozitare
constituie un factor major al scăderii lente a cantității de acid ascorbic. De asemenea, fieberea la
temperatură ridicată cât și prăjirea reduc drastic cantitatea de vitamina C.
2. Animale
Majoritatea speciilor de animale și plante iși sintetizează singure vitamina C. Prin urmare, nu este o
vitamină pentru ele. Sinteza este obținută printr-o secvență de pași,bazați pe enzime, care convertesc
glucoza în acid ascorbic. Acest lucru are loc fie în rinichi,la reptile și păsări, sau în ficat, la mamifere.
Ultima enzimă din proces, l-gulonolactonă oxidează, nu poate fi fabricată de organismele umane
deoarece gena care aparține enzimei nu funcționeză.
5
Toate organismele vii au nevoie de Vitamina C pe care fie o produc, fie o obţin din alimentaţie, în caz
contrar putând surveni chiar moartea din cauza scorbutului.
Abia în anii 1920 s-a realizat că și unele bucăți de carne sunt, de asemenea, o sursă de vitamina C.
Mușchiul și grăsimea, care reprezintă baza alimentației occidentale moderne, sunt surse slabe. Ca și în
cazul fructelor și legumelor, gătitul micșorează cantitatea de vitamina C conținută.
Conținutul de vitamina C al unor produse de origine animală
6
Funcția biologica a acidului ascorbic
VI.Acțiune fiziologică
Acidul ascorbic efectuează numeroase funcţii fiziologice în corpul uman,acesta avănd o importanță
capitală pentru organism.
Organismul uman este capabil sa depoziteze în rezerve o parte din cantitatea ingerata, în organe cum
sunt : suprarenalele, cristalinul, corpul vitros, umoarea apoasa, leucocite .
Vitamina C, acidul ascorbic, este un acid organic cu proprietăţi antioxidante, implicat într-o serie de
procese care se desfăşoară în celulele vii. În organismul uman vitamina C deţine un rol complex şi
7
important; protejează compuşii biologici activi de degradări oxidative, întăreşte sistemul imunitar,
stimulează procesele de biosinteză a colagenului, hormonilor steroidici şi a unor neurotransmiţători.
Doza de 10 mg/zi previne avitaminoza C, însă raţia zilnică recomandată pentru un adult este de 60 mg.
Lipsa vitaminei C din organism conduce la scorbut, denumită şi boala marinarilor, caracterizată prin
gingivite (gingii cavernoase şi inflamate), paradontoze, pierderea dinţilor, vase de sânge fragile,
neelastice, inflamarea articulaţiilor şi anemie.
Vitamina C este o substanţă usor oxidabilă, degradarea sa fiind accelerată de căldură, lumină și
de prezența cationilor metalelor grele. Pierderile de acid ascorbic ce au loc în decursul procedeelor
tehnologice ce sunt parte a procesării sucurilor de fructe, pot depăși 50%. Din acest motiv, adeseori,
fabricanții adaugă vitamina C pentru a îmbunătăţi valoarea nutritivă şi de a prelungi timpul de viaţă al
produselor.
Principalele ei proprietãți sunt urmãtoarele:
intervine in fenomenele de oxido-reducere, fiind cel mai puternic antioxidant;
este antiinfecțioasã, tonifiantã, antitoxica;
participã la asimilarea de cãtre organism a fierului ;
previne și vindecã scorbutul;
mãrește rezistența vaselor sanguine;
contribuie la formarea globulelor roșii,a dinților si oaselor;
8
are rol de reglare a nivelului glicemiei și al colesterolului, de distrugere a toxinelor acumulate
in organism;
intervine în buna funcționare a țesuturilor, precum și a diferitelor organe;
participã la transformãrile chimice ale proteinelor, lipidelor și glucidelor, la formarea
substanțelor intercelulare ;
diminueazã perioadele de convalescențã;
este eficientã în reducerea ritmului de opacifiere a cristalinului (îndeosebi la persoanele
vârstnice);
întârzie apariția cataractei și-i reduce gravitatea cu cca 50%;
împiedicã depunerea grãsimilor la nivelul ficatului asigurã funcționarea normalã a celulei
hepatice;
intervine în metabolismul carotenilor ;
protejeazã acidul folic ;
are acțiune antialergica ;
ca laxativ natural;
scade incidența apariției de cheaguri in vasele sanguine;
mãreste gradul de absorbție a fierului organic;
reduce efectele unui numãr mare de alergeni;
asigurã coeziunea celulelor proteice, mărind astfel durata vietii.
VII.Metode de obţinere
La nivel industrial, sunt aplicate două procedee, şi anume: biosinteza cuplată cu transformarea chimică
(procedeul Reichstein) şi fermentaţia, în două stadii.
Procedeul Reichstein este utilizat de firmele BASF, Takeda, La Roche şi constă în transformarea
sorbitolului, obţinut din glucoză, în sorboză, cu ajutorul unor bacterii (Acetobacter suboxidans,
Bacterium xylinum, Erwinia sp., Corynebacterium sp.), urmată de sinteza chimică a acidului diaceton-
gluconic şi, în final, a acidului 2-ceto-gluconic. Acesta este transformat în vitamina C, în mediu acid.
Obţinerea vitaminei C prin fermentaţie: prin acest procedeu, glucoza este transformată direct în
acid 2,5-diceto-gluconic, cu ajutorul unor tulpini mutante de Erwinia sp. Din acidul 2,5-diceto-
9
gluconic este biosintetizat, apoi acidul 2-ceto-gluconic, sub acţiunea tulpinilor de Corynebacterium sp.
În 1989, în SUA, a fost elaborat procedeul de obţinere a acidului 2-ceto-gluconic prin fermentaţie într-
un singur stadiu, utilizându-se culturi mutante de Erwinia herbicola pe substrat de glucoză, dar cu o
productivitate inferioară procedeelor prezentate anterior. Acidul 2-ceto-gluconic, obţinut prin
fermentaţia într-una sau două stadii, este transformat chimic, în final, în vitamina C, similar
procedeului Reichstein. Însă, indiferent de procedeul utilizat, separarea şi purificarea vitaminei C
necesită o succesiune de etape laborioase, cu consumuri importante de energie şi materiale.
Deoarece în etapa de transformare chimică, inclusă în procedeul Reichstein, sau în a doua etapă
de fermentaţie, conform procedeului de fermentaţie în două stadii, se foloseşte lichidul de fermentaţie
rezultat în etapa anterioară, soluţia finală va conţine numeroşi compuşi secundari, totuşi, acidul 2-ceto-
gluconic aflându-se în proporţia cea mai mare. În plus, chiar în condiţiile în care randamentele fiecărei
etape sunt de circa 90 %, conversiautilă a glucozei nu depăşeşte 60%, ca randament total (datorită
numeroaselor etape implicate).
În următoarea schemă este prezentată sinteza industrială a acidului ascorbic de la glucoză prin
procesul Reichstein:
10
Acidul ascorbic se obţine prin extracţie din diferite materii prime vegetale, prin sinteză chimică,
prin biosinteză sau prin procedee combinate de sinteză chimică şi biosinteză. Indiferent de metoda de
obţinere, separarea şi purificarea necesită numeroase etape, care implică consumuri ridicate de
materiale şi energie. Soluţia finală din care trebuie extras acidul ascorbic conţine numeroase produse
secundare, cel mai important dintre acestea fiind acidul 2-cetogluconic. În ciuda faptului că fiecare
etapă a procesului decurge cu randamente de 90%, conversia globală glucozei în acid ascorbic nu
depăşeşte 60% .
Datorită caracterului labil al acidului ascorbic, procedurile de extracţie sunt proiectate pentru a
o stabiliza. Soluţiile de extract ar trebui să menţină un mediu acid, să inactiveze oxidaza acidului
ascorbic, să limiteze oxigenul şi să precipite amidonul şi proteinele. Alegerea depinde de soluţia de
extract și de proba matrice determinând procedura. Acidul metafosforic inhibă oxidaza acidului L-
11
ascorbic, inhibă cataliza din metal, şi precipită proteinele.
Amidonul este problematic în sensul ca interferează cu titrarea colorimetrică şi teste fluorometrice.
Adaosul de etanol sau acetonă pentru a extrage precipitate metafosforic solubilizeaza amidonul. Acest
pas este necesar pentru a analiza prin metode spectroscopice multe legume, inclusiv cartofi, legume,
porumb. Acetona este de asemenea utilă pentru a elimina metabisulfitul şi dioxidul de sulf din fructele
deshidratate și din sucuri de fructe.
Acidul ascorbic se extrage din celule prin ruperea ţesutului într-un mediu potrivit pentru
extracţie. Varza, la fel ca multe ţesuturi de plante superioare, poate fi uşor omogenizată prin măcinarea
într-un mojar şi cu un pic de nisip curat (pentru a face procesul mai uşor).Pentru o măsurare exactă a
conţinutului de acid ascorbic, extracţia de acid ascorbic trebuie să fie completă, acidul ascorbic poate fi
pierdut prin degradare. Multe plante conţin oxidaza acid ascorbic, care catalizează oxidarea acidului
ascorbic la acid dehidroascorbic. Atunci când celulele sunt pregatite pentru extracție, componentele din
celule, care sunt de obicei separate prin membrane, se amestecă împreună. În aceste cazuri, oxidaza
acidului ascorbic poate cataliza oxidarea acid ascorbic iniţial prezent în ţesut.
VIII.Metode de analiză
Pentru determinarea acidului ascorbic din diferite tipuri de probe, au fost sugerate multe tehnici
analitice,toate bazându-se pe caracterul reducător al analitului. Cromatografia lichidă de înaltă
performanță(HPLC), metode spectrofotometrice, instrumente de electroforeză capilară,metode
titrimetrice bazate pe titrare cu soluție oxidată(diclorofenol indofenol, iodat de potasiu sau bromat de
potasiu) , metode biologice,electrochimice,fluorimetrice sau amperometrice, bazate pe biosenzori, toate
utilizate pentru determinarea vitaminei C.
Cu toate acestea, majoritatea prezintă limitări în utilizare (unele sunt costisitoare, unele necesită o
pregătire specială sau nu sunt suficient de sensibile și selective). Este dificil să alegi o singură metodă
pentru a determina conținutul total al vitaminei C din produse alimentare, probe biologice și
12
farmaceutice,deoarece fiecare probă are propriile ei caracteristici și proprietăți specifice. Anumite
metode sunt disponibile pentru a determina acidul ascoribic, dar foarte puține din acestea sunt folosite
pentru determinarea ambelor forme: acid ascorbic și acid dehidroascorbic. Acest lucru se datorează
faptului că cele formlele vitaminei C ,acidul ascorbic și forma sa oxidată ( acidul dehidroascorbic)
posedă proprietăți chimice, optice și electrochimice diferite. Cea mai cunoscută metodă pentru
determinarea conținutului total de vitamina C din probele de alimente, este 2,4- dinitrofenil hidrazina
(DNPH) (Riemschneider și colab., 1976). Aceasta este o metodă simplificată pentru determinarea
simultană a acidului ascorbic si a acidului dehiroascorbic; reacția de cuplare a colorantului 2,4-
dinitrofenil hidrazina cu vitamina C, urmată apoi de determinarea spectrofotometrică.
Detecția electrochimică reprezintă o metodă alternativă atractivă pentru detecția speciilor
electroactive, datorita faptului că prezintă o serie de avantaje, cum ar fi: usurință în manipulare,
miniaturizare, prezintă o sensibilitate ridicată si un cost scăzut. Detecția electrochimică poate fi cuplată
cu cromatografia lichidă de înaltă performanță pentru a asigura o sensibilitate mare a speciilor
electroactive.
Determinarea vitaminei C din sucurile de fructe prin cromatografia lichidă de înaltă
performanță ( HPLC ):
În special, metodele cromatografice sunt foarte eficiente în determinarea acidului ascorbic prin
analiza cantitativă a materialelor complexe,cum ar fi sucurile de fructe, legume și băuturile. Prin
această metodă se pot separa,identifica și cuantifica majoritatea acizilor organici din sucurile naturale
de fructe folosind HPLC ,care va identifica compușii, nu doar cu timpii lor de retenție, ci și cu spectrele
lor individuale.
Materiale și metode
Sucul de citrice se centrifughează la 3000 de rotații timp de 10 minute ,iar supernantantul se
diluează în raport 1:50 pentru determinarea acidului citric și în raport 1:5 pentru alți acizi. Diluțiile sunt
filtrate printr-o membrană înainte de injectare. Se analizează 2 eșantioane în duplicat. Se prepară o
soluție standard mixtă ce conține 1000mg/l acid citric, 2000mg/l acid malic, 300mg/l acid oxalic si
acid ascorbic, 700mg/l acid tartric și 400mg/l acid lactic. Soluția standard si diluțiile corespunzatoare
sunt preparate cu apă distilată și sunt păstrate în locuri întunecoase , la temperatură joasă (+4oC).
13
Analiza HPLC
Acizii organici din probe sunt separați prin cromatografie cu fază inversă ,și determinați cu
ajutorul absorbanței,apoi cuantificați cu graficele de calibrare externe.Pentru detectarea simultană a 6
probe,detectorul este setat la lungimea de undă λ=254
Timpii de retenție, gradul de concentrație si limita de detecție pentru acizi organici standard:
Determinările se fac la 10ºC folosind o fază mobilă formată din soluție de fosfat (se dizolvă
6,8g dihidrogenofosfat de potasiu în 900ml apă; pH-ul se ajustează cu acid fosforic până la pH=2,8
apoi se completează cu apă până la 1000 ml),ce se filtrează printr-o membrană de poliamidă și este
introdusă la vid. Rata de curgere a fazei mobile este de 0,7ml/min pentru toate separările
cromatografice. Coloana de separare este echilibrată cu faza mobilă înainte ca linia de bază să se
stabilizeze. La acest nivel se fac pipetări cu volume de 5 μl pentru fiecare probă preparată sau soluție
standard.
Valorile abaterilor standard relative variază de la 0,154 la 3,18% indicând că această metodă
este precisă ,cu un grad mare de repetabilitate ,în special pentru acidul citric, ascorbic, lactic și
oxalic .Recuperarea acizilor organici din sucurile de citrice variază între 95,8 si 102,1% confirmând
precizia de separare si condițiile de analiză.
Această metodă contribuie la dezvoltarea procedurii HPLC, fiind rapidă și precisă, pentru
determinarea cantitativă a acizilor organici din sucurile de fructe, în condițiile de fază inversă. Acizii
oxalic,tartric,malic,lactic,citric și ascorbic sunt determinați simultan și luate din coloană în timp de 20
14
de minute. Având în vedere ușurința și concizia de pregătire a probei,această metodă poate fi
considerată eficientă,precisă și rapidă pentru determinarea acizilor organici.Se mai pot folosi și alte
metode de determinare a vitaminei C, însă au anumite dezavantaje,consumă mult timp și au
reproductibilitate mai mică.
Determinarea vitaminei C prin metoda spectrofotometrică UV
Acidul ascorbic mai poate fi analizat prin metoda spectrofotometrică UV. Spre deosebire de metoda
HPCL ( care are avantajul unei specificități avansate, dar implică operații relativ laborioase),
spectrofotometria UV, prezintă avantajul unei execuții simple,directe și extrem de sensibile. Ca orice
metoda, aceasta prezintă și dezavantaje cum ar fi interferența ingredienților.
Instrumente-spectrofotometru Shimadzu(model UV-1601)+o pereche de celule de cuarț de 1 cm
Reacticvi:
acid acetic 5%
metafosforic 10%
soluție de tiouree 10%
soluție2,4-dinitrohidrazină
acid sulfuric 85%
soluție standard vitamina C ( acid ascorbic)
Pregătirea probei:
10g probă este omogenizată cu aproximativ 50ml de solutie de acid metafosforic 5% și acid
acetic 10%, apoi este transferată într-un balon de sticlă de 100 ml, se agită ușor până la
omogenizare.
Se diluează până la semn cu soluție de acid acetic 10% si acid metafosforic 5%
Soluția se filtrează și filtratul obținut se colectează pentru determinarea vitaminei C din această
probă.
Estimarea vitaminei C- procedură:
15
Peste filtratul cu proba se adaugă apă de brom pentru a oxida acidul ascorbic in acid
dehidroascorbic
Se adaugă cateva picături de tiouree pentru a elimina excesul de brom, obținându-se astfel o
soluție limpede.
Se introduce soluția standard de acid ascorbic și apoi 1 ml de 2,4- DNPH
Amestecul obținut este menținut timp de 3 ore la o temperatură de 37 º C într-o baie de apă.
După incubare ,amestecul este răcit într-o baie de gheață și este tratat cu 5 ml H2SO4 85 % și
se agită constant.
Se obține o soluție colorată.
Reacții:
Acidul ascorbic este oxidat la acid dehidroascorbic prin acțiunea apei de brom
Acidul L-dihidroascorbic reacționează cu 2,4-difenilhidrazina și produce o osazonă care,
tratată cu H2SO4 formează o soluție de culoare roșie.
Curba de calibrare:
-este construită prin reprezentarea grafică a concentrației față de absorbția corespunzătoare
IX.Utilizarea acidului ascorbic
Antioxidantii reprezinta un grup de aditivi care se utilizeaza pentru pastrarea calitatii
grasimilor, impiedicand procesul de deagrdare a grasimilor pirn autooxidae (rancezire aldehidica). In
16
cazul alimentelor, degradarea grasimilor, pe langa faptul ca face alimentele improprii consumului
(modificand gustul si mirosul), reduce si valoarea lor nutritive. Grasimile degradate oxidative au effect
daunator asupra organismului prin actiune distructiva aspura vitaminelro A,EC,B2,B6 din alimente
(avitaminoze secundare), prin lezarea mucoasei gastrice şi intestinale, în care caz se ajunge la scăderea
coeficientului de utilizare digestivă aalimentelor şi prin acţiunea peroxizilor şi radicalilor din grăsimile
autooxidate asupramembranelor celulare, asupra unor vitamine din organismul uman .Antioxidanţii pot
fi clasificaţi în antioxidanţi propriu-zişi şi antioxidanţi secundari. Substanţelecare întăresc acţiunea
antioxidanţilor se numesc sinergetice. După originea lor antioxidanţii pot finaturali şi de sinteză.
Acidul ascorbic este utilizat ca un antioxidant în industria berii, mărind timpul de depozitare a
berii pe raft si prevenind tulburarea ei. E300 este folosit ca şi conservant în industria cărnii pentru a-i
păstra culoarea, ca agent de coacere în panificaţie, dar şi pentru a inhiba decolorarea fructelor tăiate, a
pulpei şi a sucurilor de fructe. Soluţiile pentru developarea fotografiilor conţin şi ele acid ascorbic.
Acidul ascorbic se mai găseşte în unt, produse cu ouă congelate, lapte praf, lapte condensat,
cartofi congelaţi, mâncare pentru sugari în conservă, vinuri. Se mai poate adăuga şi produselor care îşi
pierd Vitamina C prin prelucrare – fulgii de cartofi.
Acidul ascorbic şi sărurile sale de sodiu, de potasiu şi de calciu sunt utilizate în mod obişnuit ca
aditivi alimentari. Aceşti compuşi sunt solubili în apă şi astfel nu pot preveni oxidarea grăsimilor.
Pentru acest scop se folosesc esterii solubili în grăsime ai acidului ascorbic cu acizi graşi cu lanţ lung
(ascorbyl palmitat sau ascorbyl stearat).
Numerele E relevante sunt: E300 acid ascorbic, E301 ascorbat de sodiu, E302 ascorbat de
calciu, E303 ascorbat de potasiu, E304 esteri glicerici ai acidului ascorbic: ascorbyl palmitat şi ascorbyl
stearat.
X.Forme farmaceutice
Exista o gama foarte mare si variata de produse farmaceutice
care contin vitamina C. Acesta se găsește atât singură în
preparatele farmaceutice, cât și în combinație cu alte vitamine
sau/și minerale.
17
În produsele farmaceutice, acidul ascorbic se găsește sub urmatoarele forme:
comprimate, drajeuri, capsule gelatinoase
comprimate efervescente sau pulberi efervescente
comprimate masticabile: in general, aceste produse sunt destinate copiilor, contin diferite
arome si au culori și forme usor acceptate de acestia;
solutii injectabile.
Bibliografie
1. http://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_ascorbic
2. Constantin Banu “Manualul inginerului din industra alimentara”. Ed. Tehnica,Bucuresti,1998
3. http://www.scribd.com/doc/168821926/Determinarea-Vit-C
4. http://www.banglajol.info/index.php/BJSIR/article/viewFile/749/789
5. http://www.scritube.com/stiinta/chimie/Lucrare-de-disertaie-Dozarea-a2338722.php
6. http://euri.ro/2009/07/e300-acidul-ascorbic-vitamina-c/
7. http://www.mdpi.com/1424-8220/8/11/7097/pdf
18
top related