7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

1/33

CUPRINS:

Cap1 Laboratorul de Microbiologie - Prof.dr.Braga Victoria1.1. Organizarea i funcionarea laboratorului de Microbiologie1.2. Principii de conduit i reguli de protecie a muncii1.3. descrierea aparaturii specifice, a modului de funcionare i de

ntreinereCap.2 - Bazele asepsiei si ale antisepsiei - S.l.dr.Botnarciuc Mihaela2.1.decontaminarea prin caldura: sterilizarea prin caldura umeda, caldurauscata, alte metode de sterlizare2.2. decontaminarea

Cap.3 - Recoltarea si transportul produselor patologice. - S.l.dr.Botnarciuc MihaelaCap.4 - Cultivarea microorganismelor: - S.l.dr.Stoicescu Ramona

4.1. medii de cultura: formule, metode de preparare si conservare;4.2.prezentarea mediilor de cultura: lichide, solide, semisolide, selective,diferentiale, de mbogatire, de conservare si transport, anaerobe, speciale4.3. cultivarea virusurilor: ou embrionat, culturi celulare, animale de

laborator Cap.5 - Tehnica examenului microscopic - S.l.dr.Botnarciuc Mihaela5.1.coloranti si coloratii microbiologice,5.2.examenul ntre lama si lamela,5.3.coloratii speciale: cili, capsula, spori5.4.examenul pe fond ntunecat.

Cap.6 - Tehnici specifice Microbiologiei - S.l.dr.Stoicescu Ramona6.1.nsamntarea pe medii de cultura6.2.aspecte ale culturilor,6.3.efectuarea de frotiuri din produse patologice si culturi-coloratie,6.4.examinarea frotiurilor

Cap.7 - Cercetarea sensibilitatii germenilor la antibiotice si chimioterapice -S.l.dr.Botnarciuc Mihaela

7.1.antibiograma germenilor aerobi,7.2.antibiograma germenilor anaerobi-tehnica si interpretare

Cap.8 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de coci Gram pozitivi -S.l.dr.Botnarciuc MihaelaCap.9 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de coci Gram negativi. - Asist.Dr.Voineagu LaviniaCap.10 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de parvobacterii - Asist.Dr.Voineagu LaviniaCap.11 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacili Gram pozitivi -S.l.dr.Stoicescu RamonaCap.12 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacili Gram negativ -S.l.dr.Stoicescu RamonaCap.13 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Pseudomonas -S.l.dr.Stoicescu RamonaCap.14 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Mycobacterii - Asist.Dr.Voineagu Lavinia

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

2/33

Cap.15 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacterii anaerobe - Asist.Dr.Voineagu LaviniaCap. 16 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Spirochete -S.l.dr.Botnarciuc MihaelaCap. 17 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Mycoplasma -S.l.dr.Botnarciuc Mihaela

Anexa................................................................................................Bibliografie........................................................................................

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

3/33

CAPITOLUL 1

ORGANIZAREA SPAIULUI DESTINAT LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE

Diagnosticul microbiologic constituie un act medical extrem de important pentrupacienii cu posibile infectii. Acurateea, meticulozitatea i, deloc de neglijat, intuiia mediculumicrobiolog pot salva viaa pacientului.

Pentru buna realizare a acestui obiectiv produsele biologice diverse trebuie supuse treptaunor etape importante de diagnostic (colorare, cultivare, identificare etc.).

Spaiul n care se desfoar aceste etape are obligatorie o anumit organizarei o anumit dotare. Acest spaiu trebuie amplasat la distan de zonele n care se

recolteaz probele patologice i de zonele n care se elibereaz rezultatele deoareceacestea sunt zone cu circulaie intens.Construcia trebuie prevzut cu instalaie electric inclus n perei care s su-

porte sarcini importante impuse de utilizarea aparatelor.Instalaia de ap i de canalizare sunt obligatorii, fiecare spaiu de lucru avnd

obligatoriu cuvet cu ap rece i cu ap cald pentru splarea pe mini a tehnicienilor.Iluminarea este foarte important deoarece o prim etap n diagnostic o

constituie examinarea macroscopic a produsului patologic iar etapa de interpretare aculturii microbiologice necesit de asemenea o lumin bun.

Camerele laboratorului de microbiologie, de preferin orientate spre nord, trebuies fie prevzute cu suprafee lavabile: pereii zugrvii cu vopsea lavabil, pardosealaacoperit cu rini epoxilice sau nveliuri de materiale plastice uor lavabile, fr crp-turi i cu marginile rotunjite.Astfel curarea si dezinfectarea suprafetelor se face uor.Mobilierul laboratorului de microbiologie trebuie s fie simplu, din materiale lavabile(inox, blat de mas din pal melaminat, suprafee de sticl etc.).

ORGANIZAREA SPAIULUI LABORATORULUI

Spaiul trebuie compartimentat n camere cu destinaie precis, complet decoman-date, dispuse n jurul unei arii centrale destinate recoltrii de produse biologice.

Destinaia camerelor trebuie gndit astfel nct circuitul produselor microbiologie,de la recoltare pn la nlturare (dup dezinfecie) s fie unidirecional.

Alturi camerelor de lucru propriu-zis trebuie s existe spaii pentru depozitareamaterialelor necesare lucrului microbiologic, spaiul pentru splarea materialelor ,vestiar,WC pentru personal.Calculul spaiului necesar este multiplicarea suprafeei de 11 m2 cu numrul de lucrtori.Compartimentele obligatorii laboratorului de microbiologie sunt: spaiul pentru primireai nregistrarea produselor biologice, spaiul pentru pregtirea materialelor de laborator,spaiul de lucru propriu-zis ( de nsmnare i de citire a culturilor microbiologice), depo-

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

4/33

zitul de materiale, spaiul necesar igienei personalului laboratorului.Circuitul n laborator trebuie s aib un sens unic cel mai bun mod de comunicare

ntre camere fiind un coridor n care s se deschid toate camerele.Fiecare zon cu o anumit i precis destinaie trebuie s fie organizat independentastfel nct s nu fie necesar circulaia ntre camere n timpul desfurrii activitii.

Aparatele i instrumente utilizate (de exemplu microscoape, centrifugi, etc.) trebu-

Ie s aparin unei singure zone i s nu fie deplasate dintr-o camer n alta.Rapoartele dintre diverse aparate trebuie gndite logic astfel nct acestea s nu i pericliteze funcionarea ( frigider lng termostat).

APARATURA I INSTRUMENTARUL NECESARELABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE

Instrumentarul i aparatura de laborator necesar, n ordinea activitilor care auloc n laboratorul de microbiologie sunt urmtoarele: Instrumentar pentru recoltare: seringi de unic folosin, vacuumteinere, tam-

poane sterile, urocultoare, coprocultoare; anse bacteriologice, pipete Pasteur, tampoane sterile, microscoape, stative,

set de colorani, centrifug i balane, bec Bunsen, termostate etc.; autoclav, dulap, vase de plastic,etc.; frigidere, bi de ap, distilatoare; congelatoare, tromp de aer; pupinel; distilator; instrumente variate:foarfeci, pense, sonde, etc.; cristalizoare cu materiale dezinfectante pentru lamele folosite; boxele de siguran antiepidemic.

Boxele de siguran antiepidemic, obligatorii n ultima perioad, controleaz ntr-un grad mai mare sau mai mic (n funcie de complexitatea construciei acestora)circulaia aerosolilor la locul de munc, aerosoli care pot constitui un factor importantinfecios.

NORME DE PROTECIA MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Date fiind riscurile infecioase i cele de ardere fizic sau chimic existente n la-boratorul de microbiologie personalul de laborator trebuie s respecte urmtoarele reguli:

folosirea obligatorie a echipamentului de protecie: halate, bonete,mnui, mti, oruri speciale;

aranjarea aparaturii i a materialelor de laborator astfel nct lucrul s se des-

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

5/33

foare cu economie maxim de micri i fr deplasri inutile; nu se pipeteaz cu gura ci cu pipete automate; nu se mnnc i nu se fumeaz n laborator ci doar n spaiul special amena-

jat; obiectele utilizate la nsmnare trebuie obligatoriu sterilizate, pe mesele de laborator nu se aaz haine, geni, cri, caiete; nu este permis intrarea n laborator a persoanelor strine, orice contact infectant pe suprafee umane neprotejate trebuie urmat obligato-

riu de antiseptizarea atent a zonei i curirea atent urmat de dezinfecie asuprafeelor neanimate contaminate (acoperirea cu sublimat 1% pentru 2.-3ore apoi curirea mecanic atent i, n final tergerea cu sublimat );

halatele i orurile contaminate se sterilizeaz la autoclav; pentru prevenirea arsurilor se acord atenie maxim micrilor n preajma

becului Bunsen i a soluiilor dezinfectante care pot determina arsuri chimice( amestec sulfocromic).

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

6/33

CAPITOLUL 2

BAZELE ASEPSIEI I ANTISEPSIEI STERILIZAREA I DEZINFECIA

Definiii:Prin sterilizare se nelege orice metod fizic sau chimic prin care sunt distruse

microorganismele, att formele vegetative ct i formele de rezisten (sporii) de lanivelul unui substrat. Rezultatul unei proceduri de sterilizare estestarea de sterilitate:un substrat steril, complet lipsit de microorganisme vii, att formele vegetative ct iformele de rezisten.

Obinerea strii de "sterilitate", precum i meninerea ei (pn n momentulutilizrii) confer siguran maxim, probabilitatea teoretic a existeneimicroorganismelor fiind 10 6.

Prin dezinfecie se nelege procesul prin care sunt distruse majoritateamicroorganismelor (n proporie de pn la 99 %) de pe obiectele din mediul inert, cuexcepia formelor de rezisten (sporilor bacterieni). Substanele utilizate n acest scopse numesc dezinfectante.

Dezinfecia se aplic n cazurile n care curenia nu elimin riscurile de rspndirea infeciei, iar sterilizarea nu este necesar. Reducerea numrului de microorganismede la nivelul pielii, mucoaselor i esuturilor vii se numeteantisepsie. Substanelefolosite n acest scop se numescantiseptice. Unele substane pot fi folosite att cadezinfectante, ct i ca antiseptice, n concentraii diferite.

Decontaminarease refer la procesul sau tratamentul care se aplic dispozitivelor medicale utilizate, avnd scopurile urmtoare: diminuarea populaiei demicroorganisme, prevenirea uscrii produselor biologice, protecia personalului care-lmanipuleaz, protecia mediului mpotriva contaminrii.

Metodele de sterilizarese clasific, dup agentul sterilizant, n:a. Sterilizare prin metode fizice:

Sterilizarea prin cldurSterilizarea prin filtrare

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

7/33

Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor b. Sterilizarea chimic

2.1 Sterilizarea prin cldur. Cldura este un agent relativ ieftin i foarte eficient.Se preteaz la sterilizarea prin cldur toate materialele termorezistente.

Sterilizarea prin cldur uscat:

STERILIZAREA PRIN ARDEREA N FLACR ( ARDEREA LA ROU)esteutilizat n bacteriologie, pentru ansa bacteriologic metalic. Ansa se ine cu vrful nflacra becului Bunsen, pn se nroete, apoi nc 5-10 secunde. La temperatura lacare metalul este incandescent, toate microorganismele sunt distruse prin carbonizare.

Atenie: flacra este mai fierbinte spre vrf. Dac ansa este ncrcat ( conineprodus biologic sau cultur bacterian), ea se introduce la nceput n poriunea inferioara flcrii, pn la ardereaprodusului, apoi se ridic uor spre vrful flcrii. n acest mod persoana care manipuleazansa evit

s se stropeasc cu materialul ce poate sri din ans.Instrumentele metalice tietoare sau neptoare din oel inoxidabil pot fideteriorate dac se sterilizeaz prin aceast metod, datorit declirii oelului.

STERILIZAREA LA PUPINEL, ETUV TERMOREGLABILSterilizatorul cu aer cald este un cuptor (cuptor Pasteur) cu perei dubli, ntre care

gsetesursa de cldur. Pereii interiori sunt perforai, pentru a permite circulaia aerului cSterilizatorulpoate fi cu sau fr ventilator. El are n mod obligatoriu un afiaj mecanic sau electronic pentrutemperatur i timp, care permite fixarea i urmrirea parametrilor de funcionare. (Fig. 1).

Agentul de sterilizare este aerul uscat i cald, la180 C, care acionea 1 or efectiv, dinmomentul atingerii temperaturii de sterilizare n interiorul ncrcturii.

Fig. 1.a. Pupinel; b. Principiul de funcionare al pupinelului

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

8/33

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

9/33

La sterilizatorul cu aer cald se sterilizeaz sticlria i instrumentarul care nu suportsterilizarea cu aburi sub presiune (oel ne-inoxidabil: cromat). Sterilizatorul cu aer cald estecontraindicat pentru materiale textile, lichide i cauciuc.

Obiectele de sterilizat sunt splate, uscate i ambalate n hrtie special (sticlria delaborator) sau cutii metalice (instrumentarul metalic).Cutiile metalice cu instrumentar se introduc nchise n incinta sterilizatorului cu aer cald.

Durata meninerii sterilitii materialelor ambalate n cutii metalice este de24 de ore dela sterilizare,cu condiia meninerii cutiilor metalice nchise.Durata meninerii sterilitii materialelor n ambalaje de hrtie sudate este de2 luni de

la sterilizare, cu condiia meninerii integritii lor i a manipulrii acestora numai prinintermediul coului.

La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu aer cald se folosesc mnui.Se lipete o etichet sau banderol pe capac pentru a identifica dispozitivele medicale

i materialele sterilizate. Se noteaz data i ora sterilizrii.Se noteaz n caietul de sterilizare: data, coninutul cutiilor (pachetelor), temperatura la

care s-a efectuat sterilizarea, durata, rezultatele indicatorilor chimici, semntura persoaneiresponsabilizate cu sterilizarea, observaii.

Sterilizarea prin cldur umed:

STERILIZAREA CU ABUR SUB PRESIUNE AUTOCLAVAREAPrincipiul sterilizrii cu abur sub presiune este de a expune fiecare la contactul cu aburul

la temperatura i presiunea pentru timpul specificat: 121C la 1,01 atmosfere timpde 30 minute, pn la 134C la 2 atmosfere, timp de 30 minute. Timpul de sterilzare semsoar din momentul atingerii temperaturii efective n interiorul ncrcturii.

Prin autoclavare se pot steriliza: instrumentar medical metalic, textile, sticlrie, cauciuc,plastic termostabil, ap i soluiilor apoase, medii de cultur.

Se pot utiliza 2 tipuri de autoclave:

1. Autoclave cu pre i post vacuumare.Realizeaz sterilizarea optim a instrumentarului chirurgical din oel inoxidabil i singurmetod posibil pentru sterilizarea materialului moale (textile), cauciucului, sticlriei.Este folosit i n decontaminarea deeurilor din laborator (deeuri infecioase).

2. Autoclave fr post vacuumare. Sunt folosite pentru sterilizarea mediilor delaborator i lichidelor n flacoane. Timpul de ptrundere al aburului este prelungit datoriteliminrii incomplete a aerului.

La ncheierea ciclului complet de sterilizare se ateapt s se rceasc, se evacueazaburul, apoi se deschide ua autoclavului. Nu se deschide niciodat sterilizatorul cu aur subpresiune nainte ca temperatura s fie sub 100C. La extragerea pachetelor din sterilizatorulcu abur sub presiune se folosesc mnui din bumbac.

Cutiile, casoletele, i pachetele sterilizate se depoziteaz temporar pe o suprafaspecial destinat materialului steril i se aranjez n dulapuri special destinate depozitriimaterialului steril.

Cutiile, casoletele, courile, navetele cu pachetele sterilizatese eticheteaz (banderoleaz) otndu-se data, ora, sterilizatorul cu abur sub presiune la care s-a efectuatsterilizarea, persoana care a efectuat sterilizarea.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

10/33

Fig.2 a. Autoclav vertical model clasic

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

11/33

b. Autoclav orizontal

Controlul sterilizriise poate face prin metode fizice, chimice i biologice.a). Verificarea temperaturii: Se citete temperatura termometrului sau temperatu

afiatpe monitor. Temperatura se noteaz n caietul de sterilizare.La autoclav: verificarea presiunila manometru i a temperaturii.

b). Verificarea indicatorilor fizico-chimici:- virarea culorii la benzile adezive cu indicator fizico-chimic.

- virarea culorii la indicatorii fizico-chimici integratori.Indicatorul integrator plasat n interiorul cutiilor metalice indic dac au fost ndeplincondiiile pentru o sterilizare eficient temperatura atins n interiorul pachetului i timpulexpunere. n situaia n care virajul nu s-a realizat, materialul se consider nesterilizat i nu utilizeaz.

O dat pe lun -se utilizeaz indicator biologic cu Bacillus subtillis pentrucontrolul eficacitii sterilizrii.

Pentru sterilizarea la pupinel pot fi utilizai indicatori biologici cu Bacillus supreparaiindustrial, comercializai, care conin 106 UFC sau preparai n laborator.

Acestea se plaseaz n mijlocul incintei sterilizatorului cu aer cald, odat cu celelapachete

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

12/33

pentru sterilizat. Se realizeaz ciclul complet de sterilizare.La sfritul ciclului, indicatorii biologici se extrag din cutie i se incubeaz 48 ore la

56C, lalaborator. Laboratorul va emite un buletin de analiz cu rezultatul constatat.

Pentru controlul sterilizrii la autoclav sunt admii indicatorii biologici cu formediferite de condiionare:

Indicatori biologici cu Bacillus stearothermophylus impregnai pe supori debumbac n concentraii de 106 UFC. Acetia se pun n interiorul unei cutii-test. Cutia-test se introduce n autoclav odat cu materialul de sterilizat i se realizeaz ciclulcomplet de sterilizare. La sfritul ciclului, indicatorul biologic este trimis la laborator,unde este extras, nsmnat i incubat; citirea se face la 7 zile.

Controlul bacteriologic al sterilizrii la autoclav cu indicator tipStearotest 120,pentru controlul sterilizrii la autoclav la temperatura de 120C cu o durat de 30minute.

Acest produs este o suspensie de spori de Bacillus stearothermophyllus n solunutritiv,cu indicator de pH. Coninutul fiolelor de Stearotest 120 este limpede de culoare violet.Fiolele de tipStearotest 120 se introduc n autoclav printre dispozitivele medicalmaterialelesupuse sterilizrii. Se efectueaz sterilizarea, la 120C, timp de 30 min; dup sterilizare fiolesuntaezate ntr-un incubator de 56C.

Citirea i interpretarea rezultatelor:-meninerea aspectului (culoare, transparen) nemodificat arat o sterilizare corect;-virajul la galben al indicatorului de pH i o uoar opalescen a coninutului indic

sterilizare sub parametrii de eficien optim (au rmas spori viabili s-au cultivat i au modiaspectul produsului).

La 6 luniSe efectueaz verificarea aparatului de ctre un tehnician autorizat.STERILIZAREA PRIN FILTRARESterilizarea prin filtrare reprezint trecerea unui lichid printr-un filtru cu porii avnd

dimensiuni mai mici dect ale bacteriilor sau ale virusurilor (ultrafiltrare).Filtrele bacteriologice sunt de mai multe tipuri:Filtre Seitz, din azbestFiltre Chamberland, din porelan porosFiltre din sticl Yena, etcFiltrele se sterilizeaz prin autoclavare. Lichidul de sterilizare este aspirat cu ajuto

uneipompe de vid. n situaiile n care n laboratoare este necesar lucrul n condiii aseptice (prelucrprodusece conin M.tubreculosis, tehnic PCR), se utilizeaz incintele aseptice cu protecsuplimentarhote cu flux laminar. Acestea au un spaiu de lucru, cu perei de sticl i un compartimsuperior metalic, care conine 2-3 filtre ( foltru din fibr poliamidic i 1-2 filtre HEPA).Circulaia aerului se face cu ajutorul unui ventilator.

STERILIZAREA CU AJUTORUL RADIAIILORRadiaiile ionizante ( , , ,X) au o bun capacitate sterilizant, dar sunt nocive pentr

organismul uman. De aceea se folosesc numai n activitatea industrial i nu sunt folosite n

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

13/33

activitatea medical.Radiaiile neionizante UV sunt folosite pentru sterilizarea suprafeelor i aerului n

laboratoare, sli de operaie, pentru sterilizarea apei n bazine. Lmpile de UV trebuie folo nlaboratorul de bacteriologie cte 10 minute, de mai multe ori pe zi, dup evacuarea prealabapersonalului din ncpere.

2.2 STERILIZAREA CHIMIC: STERILIZATOARE CU OXID DE ETILEN

Sterilizarea cu oxid de etilen se utilizeaz numai atunci cnd nu exist altmijloc de sterilizare adecvat pentru obiecte i echipamente termosensibile.Materialul medico-chirurgical care se sterilizeaz cu oxid de etilen:

Obiecte din material plastic i materiale compozite, termosensibile i pentrucare se cunoate perioada de timp necesar desorbiei; polielietilen, teflon, latex,silicon, acetatul de etilenvinil, poliuretan, polipropilen. Echipamentul medicalconstituit din pri de PVC (policlorura de vinil) sterilizat iniial cu radiaii ionizante sauraze gamma nu va fi resterilizat cu oxid de etilen, deoarece PVC elibereazcompui toxici - etilen clorhidrin.

Oxidul de etilen este un gaz inodor, toxic, a crui prezen nu este perceput n aer. n amestec cu aerul, este exploziv pornind de la concentraia de 3% V-V. Prininhalare: oxidul de etilen poate provoca iritaia cilor respiratorii i depresiasistemului nervos central, iar prin contact: reacii de iritaie a pieli i mucoaselor lapersonalul care efectueaz sterilizarea.

Materialul supus insuficient tratamentului de desorbie utilizat la bolnavi poatecauza fenomene hemolitice, stenoze traheale, colaps cardiovascular i fenomenealergice. De aceea, sterilizatoarele cu oxidul de etilen trebuie s aib inclus n ciclulde sterilizare desorbia la sfritul programului.

Sterilizarea cu oxid de etilen se va realiza n spaii ventilate, destinate numai pentruaceast activitate.

DEZINFECIA1.DEZINFECIA CHIMIC. SUBSTANE DEZINFECTANTE I ANTISEPTI

Eficiena unei proceduri de dezinfecie depinde de natura substanei dezinfectanfolositefiind direct proporional cu concentraia acesteia i timpul de aciune, n timp ce prezena

materiilor organice (snge, urin, materii fecale, culturi bacteriene) i a formelor sporureducefectul dezinfectant.

Spre deosebire de sterilizare, care este un termen cu semnificaie absolut (steril saunesteril), dezinfecia poate fi de diferite grade: dezinfecie nalt, medie i slab.

Dezinfecia nalt este orice procedur care reuete s inactiveze formele vegetativalebacteriilor, virusurile, paraziii i ciupercile microscopice.

Dezinfectante puternice:

Glutaraldehida: soluie apoas 2%Formaldehida: soluie apoas 8%

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

14/33

Amestecul sulfocromic: acid sulfuric+ bicromat de potasiu+ apPeroxidul de hidrogen 3-6%Acidul peracetic n diferite concentraiiHipocloritul de sodiu

Timpul de aciune necesar pentru ca aceste substane s realizeze o dezinfecie denivel nalt este de minim 20 minute. Este absolut necesar s se respecte instruciunile de folosialefiecrui preparat comercial, aa cum sunt specificate de productor.Dac dezinfectantele puternice acioneaz un timp suficient i pe substratul respectiv nu exispori bacterieni, se poate realizao sterilizare chimic.

Dezinfectante cu putere medie:

Realizeaz distrugerea Mycobacterium tuberculosis, a bacteriilor n formvegetativ, a celor mai multe virusuri i fungi, dar nu i a sporilor bacterieni.

Substanele chimice care realizeaz dezinfecia de nivel intermediar sunt:Iodofori (compui iodai): combinaii ale iodului cu o substan

stabilizatoare sau transportatoare. La diluarea n ap, din aceste complexe seelibereaz iodul liber, cu aciune antimicrobian 50-150 mg /1000ml ( 5-15%).Exemple de substane transportatoare: compui cuaternari de amoniu,polivinilpirolidon, detergeni.

Compui clorurai: elibereaz Cl liber i ClO2. Conin 0.5-5 g Cl /1000ml.Cloramina, hipocloritul

Alcooli: etilic, izopropilic 70% vol/vol.Compui fenolici: 0.5-3% n apDetergenii

Detergeni neutri folosii pentru: mobilier, pavimente, vesel i splareamanual a textilelor.

Detergeni alcalinisau decapani folosii pentru pavimente.Detergeni acizi sau detartrani utilizai pentru materiale cu depuneri de

piatr: ceramic, pavimente placate cu materiale care suport acizi, sticlrie delaborator, bazine, bazinete, urinare.

Detergeni-dezinfectanii sau detergenii cationicisunt produse a cror proprietate principal este cea de curare i secundar dezinfectant.

Timpul de contact necesar al substanei chimice cu substratul tratat este de10minute.

Dezinfectante slabe:

Pot distruge cele mai multe bacterii n forma vegetativ, unele virusuri, uniifungi, dar nu distrug microorganisme rezistente, ca Mycobacterium tuberculosis, sausporii bacterieni.

Compui cuaternari de amoniu.Dezinfectante care conin fenoli, iodofori i ageni de spumare;

Timpul de contact necesar al substanei chimice cu substratul tratat este desub 10 minute.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

15/33

n funcie de suportul tratat, se pot folosi urmtoarele metode de aplicare dezinfectantelor chimice. Imersie (recipiente pentru recoltarea produselor patologice, instrumente, pipete, lademicroscop), tergere (mese de lucru n laborator, aparate, pavimente), stropire, pulveriza

(ui,ferestre).

Pregtirea n vederea sterilizrii a materialului medico-chirurgical utilizatcuprinde mai multe etape:

Curarea / decontaminarea (predezinfecie) echipamentelor: realizatimediat dup utilizareaacestora, ct mai aproape de locul utilizrii.

- diminueaz populaia de microorganisme- previne uscarea produselor biologice- contribuie la protecia personalului care-l manipuleaz

- contribuie la protecia mediului mpotriva contaminrii

Se realizeaz n dou etape:

1. faza de pretratament, realizat prin imersia dispozitivelor utilizate, nsoluie de detergent - dezinfectant (cu aciune de detaare a murdrieigrosiere de pe substrat i aciune bactericid)

2. faza de curare manual sau mecanic

Clatireriguroas sub jet de ap potabil;Dezinfectie,utiliznd un dezinfectant adecvat, dintre cele cu putere nalt sau

medie;Cltirecu ap;Uscare cu prosop curat sau aer comprimat.

ANTISEPTICELEsunt preparate cu proprieti antimicrobiene, ele distrug, sauinactiveaz microorgnismele de la nivelul esuturilor vii. Ele reduc temporar de pepiele i mucoase numrul de microorganisme.

Utilizarea antisepticelor permite:- realizarea ngrijirilor aseptice,- reducerea transmiterii germenilor, de la bolnav la bolnav, prin intermediul

minilor,- tratarea infeciilor locale cutanate si mucoase.

Substane antiseptice

Alcooli: etanol, izopropanol 70% vol/vol 35% vol/volCompui iodai 1-2%: alcool iodat, tinctur de iod, betadina:povidone-

iodine 7,5-10%Compui clorurai: Clorhexidina ( 0,75-4%), Hexaclorofen (1-3%)H2O2 3%Compui colorai:Violet de geniana, albastru de metilen, fucsinaPermanganat de potasiuNitrat de argint 0,1%

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

16/33

Clorura de benzalkonium:soluie alcoolic 0,1-0,2% (piele), soluieapoas 0,1-0,2%(plgi) soluii oftalmice: 0,01%, instilaii vezic urinari uretr: 0,005%Spunuri i detergeni

2 DEZINFECIA PRIN MIJLOACE FIZICE

Dezinfecia prin cldurCldura uscat:flambarea.Flambarea const n trecerea unui obiect prin flacr. Este utilizat n

laborator, pentru eprubete de sticl, lame de microscop, etc. Nu se folosete pentruinstrumente medico-chirurgicale.

Cldura umed:fierberea i pasteurizareaFierberea n ap la temperatura de 100C timp de minim 20 minute realizeaz

distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor patogene. Fierberea apei ialimentelor reprezint o metod de prevenire a bolilor transmisibile cu poart deintrare digestiv.

Pasteurizarea: este o metod de dezinfecie a lichidelor, la temperaturicuprinse ntre 55 - 95C. Dup expunere, de durat variabil, sunt distruse 90 95%dintre formele vegetative ale microorganismele patogene.

Dezinfecia prin splare la temperatura de 60 - 95 C este un procescomplex la care, pe lng aciunea cldurii umede, se adaug i aciuneadetergenilor sau a altor substane, ct i aciunea mecanic de splare. Acestprocedeu se folosete la splarea i dezinfecia lenjeriei, veselei, sticlriei delaborator, instrumentarului.

Dezinfecia cu raze ultraviolete

Indicaii: dezinfecia suprafeelor netede i aerului n boxe de laborator, sli deoperaii, alte spaii nchise, pentrucompletarea msurilor de curenie i dezinfeciechimic.

Lmpile destinate dezinfeciei pot fi fixe sau mobile, cu tuburi de UV ntre 15 i30 W, prevzute s funcioneze n absena omului (cu radiaie direct) sau nprezena omului (cu radiaie indirect, ecranat i fr emisie de ozon).

Exemple de produse comerciale de detergeni dezinfectani i dezinfectaniVirkon(Antec international) detergent-dezinfectant; amestec de peroxizi, surfactant,

acizi organici i sruri anorganice. Poate fi folosit pentru suprafee dure (faian, pavimentelaboratoarele medicale pentru aparatura de laborator, cuve, centrifugi, pipete.

Biguacid S (Antiseptica ) dezinfectant-detergent, conine didecyl-dimethyl ammonium-chlorid i biguanin. Poate fi folosit pentru suprafee, pavimente, grupuri sanitare.

Combi-instruments(Antiseptica) dezinfectant - detergent lichid pentru instrumentachirurgical i din laboratoare (sticl, porelan, metal, cauciuc, mase plastice).Conine: glutaraldehid, clorur de benzalkonium, didecyl-dimethyl ammonium-chlorid.

Big Spray(Antiseptica) amestec de ethanol propanol poyhxanide.Spray dezinfectant, utilizat prin pulverizare, pentru dezinfecia suprafeelor din sli d

operaie, ambulane, mobilier, haine, saltele, perne.Mikrozid Liquid(Shulke &Meyer) - amestec de etanol i propanol.Dezinfectant pentru suprafee, grupuri sanitare.Lysetol AF(Shulke &Meyer) - conine: guanidinacetat, fenoxipropanol, clorur debenzalconiu. Dezinfectant pentru instrumentarul medico-chirurgical.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

17/33

Perform FF(Shulke &Meyer) - conine peroximonosulfat de potasiu, benzoat de sodiacid tartric, spun. Indicat n dezinfecia i curarea suprafeelor i obiectelor de invenlavabile.

Terralin(Shulke &Meyer) - amestec de clorur de benzalconiu i propanol.Poate fi folosit pentru curirea i dezinfecia pardoselilor, peteilor, grupurilor sanita

i obiectelor de inventar lavabile.Fig.3 Simboluri pentru modul de utilizare a dezinfectantelor

Exemple de produse comerciale de antiseptice

Desmanol(Shulke &Meyer) conine digluconat de clorhexidin i propanol.Utilizat pentru dezinfecia igienic i chirurgical a minilor.Desderman N(Shulke &Meyer) - conine etanol, bifenilol, polyvidone, isopropyl.

Indicat pentru dezinfecia igienic i chirurgical a minilor.

Primasept Med (Shulke &Meyer) conine bifenilol i propanol. Utilizat pedezinfeciaigienic a minilor.

Fig.4 Simbol pentru dezinfecia mainilor

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

18/33

CAPITOLUL 3

RECOLTAREA I TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE

Recoltarea produselor patologice n scopul examenului microbiologicreprezint o etap extrem de important, de corectitudinea creia depinde n maremsur exactitatea diagnosticului. Recoltarea produselor patologice adecvate, nmomentul corespunztor, cu respectarea regulilor de asepsie, transportul n condiiioptime i ct mai rapid spre laborator sunt absolut necesare.

Principii generaleRecoltarea probelor trebuie fcut de medic sau sub ndrumarea acestuia.Se utilizeaz numai recoltoare sterile, pe care vor fi menionate datele de

identificare: numele pacientului, secia, produsul i data recoltrii, nainte de a seface prelevarea.

Recoltarea unui produs biologic n vederea evidenierii florei microbienetrebuie efectuat, pe ct posibil, naintea administrrii tratamentului cu antibiotice.

Din produsul biologic se va recolta poriunea sau fragmentul cu aspectpatologic, caracteristic.

Prelevarea trebuie fcut n momentul optim, n sensul posibilitii prezeneiunui numr ct mai mare de microorganisme i n funcie de evoluia clinic a bolii.Cantitatea de produs trebuie s fie suficient pentru a permite efectuarea mai multor examen

Transportul probelor recoltate la laborator trebuie s fie fcut n timp ct maiscurt, pentru a evita modificrile cantitative i calitative ale florei, sub aciuneadeshidratrii, modificrilor de temperatur, pH, etc. n probele pstrate prea multtimp, microorganismele mor datorit deshidratrii, temperaturii prea sczute sau, dincontr, altele (urina) sunt medii favorabile multiplicrii excesive a florei iniiale.

n cazul n care transportul poate dura mai mult timp sau nu exist posibilitatea nsmnrii imediate a probelor, se folosesc recoltoare cu medii de conservare itransport.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

19/33

Transportul probelor se va face n containere speciale, inscripionate cumeniunea material infectant, manipulate de persoane instruite, evitndu-sersturnarea containerelor i vrsarea materialelor.

HEMOCULTURA

Prelevarea unei probe de snge pentru cultivarea pe medii adecvate hemocultura are indicaie n suspiciunea de bacteriemie, septicemie sau endocarditbacterian. De asemenea hemocultura este indicat n strile febrile prelungite fr ocauz decelabil.

Este foarte important ca puncia venoas s fie fcut n condiii de asepsie,folosind pentru dezinfectarea pielii la locul punciei venoase alcool 80-95% icompui iodai: tintur de iod sau betadin, ce vor fi lsai s acioneze pe pieleminim 1 minut. Persoana care recolteaz va purta mnui sterile.

Vor fi recoltate cel puin trei probe, fie ntr-un interval de 24 h, n suspiciuneade endocardit, fie la intervale de timp determinate de evoluia clinic, n general nplin puseu febril, timp de 2-3 zile consecutiv. O singur prob este insuficient pentrustabilirea unui diagnostic corect, indiferent de rezultatul acesteia.Volumul de snge indicat a se recolta pentru hemocultur este de 20 ml laadult i 1-5 ml la copii, n funcie de vrsta acestora. Sngele se recolteaz cuseringa i se descarc imediat n mediile de cultur lichide speciale. Se folosete deregul un set de dou medii de cultur: aerobe i anaerobe. Raportul optim snge:mediu de cultur este de 1: 10 (flacoanele cu medii pentru hemocultur au n general100 ml, pentru aduli i 20 ml pentru copii ). n cazul n care pacienii au primit dejaantibiotice, exist medii de cultur aerobe i anaerobe cu inhibitori de antibiotice.Totui este de preferat ca mcar primele prelevri s se fac naintea instituiriitratamentului antibacterian sau antifungic.

Incubarea hemoculturilor se face la 370 C, timp de 7 zile. n sistem clasic, sefac treceri pe medii solide la fiecare 24 h. Hemocultoarele automate efectueaz citiricu ajutorul unei fotocelule ce nregistreaz modificarea turbiditii mediului princreterea bacterian, la intervale de timp de 15-30 minute. Confirmarea pozitivriihemoculturii precum i identificarea tulpinii izolate se face tot prin trecere pe medii decultur solide. Dac dup 7 zile hemocultura nu s-a pozitivat, rezultatul definitiv va finegativ (hemocultur steril).

Catetere intravasculareMeninerea cateterelor intravasculare mai mult de 72h reprezint o surs

important de episoade de bacteriemie i de infecii la locul de inserie al cateterului.

Dup scoaterea cateterului, vrful de cateter segmentul distal, de 3-5 cm, secionataseptic i introdus ntr-un tub cu capac steril, este trimis la laboratorul debacteriologie. Aici, peste vrful de cateter se toarn 2-3 ml bulion steril, astfel nct sfie complet acoperit i va fi meninut astfel 24 h. Din bulion vor fi fcute treceri pemedii de cultur solide.

Lichidul cefalorahidian (L.C.R.)Examenul lichidului cefalorahidian este indicat n suspiciunea de meningit:

febr, cefalee, fotofobie, redoarea cefei, etc.Recoltarea L.C.R. se face prin puncie lombar, n condiii de asepsie strict,

dup dezinfecia pielii cu betadin sau ali compui iodai. Prelevarea se face nsering, fr a aspira, apoi se descarc n flacoane sterile cu dop, sau/i n medii decultur lichide pentru hemocultur.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

20/33

Este de preferat s existe flacoane diferite: pentru cultur, examenul biochimici examenul microscopic. Dac nu exist dect un singur flacon, atunci mai nti seefectueaz nsmnarea (cultura), apoi examenul biochimic i cel microscopic.

La examenul macroscopic LCR normal este incolor, limpede, transparent. nmeningitele bacteriene apare tulbure, glbui sau verzui. Culturile se fac pe mediisolide, dar pot fi fcute i n medii lichide de hemocultur, n special la analizorulautomat. Apoi, din L.C.R. se numr elementele (celulele), n camera de numratFuchs-Rosenthal. Valoarea normal a numrului de elemente celulare este mai micde 5 elemente la 1 ml, acestea fiind n special limfocite. Dac numrul de celuledepete limitele fiziologice, este necesar efectuarea unui frotiu colorat Giemsapentru aprecierea raportului dintre mononucleare i polinucleare. n meningitelebacteriene, numrul de celule crete la cteva sute sau chiar mii la 1ml,predominante fiind polinuclearele. n meningitele virale, fungice i n meningitatuberculoas, numrul de elemente este mai redus i chiar dac n primele ore existo predominen a polinuclearelor, ulterior raportul se inverseaz cu predominenamononuclearelor.

L.C.R. este apoi centrifugat la 1500 g timp de 15 minute. Supernatantul esteseparat i va fi folosit la examenul biochimic: dozarea proteinelor, glucozei, clorurilor.Din sediment se efectueaz 2-3 frotiuri, colorate A.M., Gram i la nevoie Ziehl-

Neelsen.Teste imunologice, de detectare a antigenelor bacteriene sau fungice n LCR

sunt recomandate atunci cnd exist modificri semnificative ale LCR: leucocite,glucoz sczut, proteine crescute, dar pe frotiu nu se observ flor sau pacientul afost tratat n prealabil. Pot fi detectate antigene de Streptococcus pneumoniae,Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus agalactiae sauCryptococcus neoformans. Alte lichide normal sterile: lichidul peritoneal, lichidul pleural, lichidul sinovial, lichidul pe

Aceste lichide se recolteaz de regul prin puncie transcutan, n condiii deasepsie riguroas, n cantitate de 5-20 ml. Fiind produse normal sterile, oricemicroorganism de pe piele care contamineaz proba duce la rezultate completeronate. Lichidul peritoneal se poate recolta i intraoperator, cu tamponul steril. Daclichidul este purulent, se poate efectua un frotiu colorat Gram direct din produsulpatologic. n caz contrar, se fac culturi aerobe i anaerobe.

BilaRecoltarea bilei se poate face prin tubaj duodenal sau, dup colecistectomie,

direct din vezica biliar cu tamponul steril sau n sering.Tubajul duodenal se

efectueaz dimineaa pe nemncate, cu sonda Einhorn introdus pe nas sau pegur, dup ce bolnavul a fcut gargar cu ser fiziologic. Se introduce sonda pn ladiviziune 45, apoi se culc bolnavul pe parte dreapt i se continu introducereasondei pn la diviziunea 60. Se aspir pe sond iniial bila A, bil amestecat cusuc duodenal. Se introduc pe sond 30 ml soluie de sulfat de magneziu sau sulfatde sodiu 40%, cu efect coleretic i colagog. Se aspir apoi bila B, de culoare verde nchis, vscoas (bila vezicular), apoi bila C, mai deschis la culoare i mai fluid(bila hepatic). Pentru examenul bacteriologic se folosete bila B, 10-20 ml.Din bilaB se fectueaz culturi aerobe i anaerobe.Din eantioane de bil A, B i C seefectueaz preparate ntre lam i lamel pentru examenul parazitologic.

Exudatul faringian i exudatul nazal

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

21/33

Exudatul faringian se recolteaz cu tamponul steril, de unic folosin.Recoltarea se face dimineaa pe nemncate, nainte ca pacientul s se spele pe dini,s-i fac toaleta bucal sau s bea ceva. De asemenea, recoltarea se face nainteaoricrui tratament cu antibiotice sau local (badijonri cu substane antiseptice,antifungice sau antibacteriene).

Pacientul este aezat cu faa spre lumin, i se indic s deschid gura ctpoate de mult i cu ajutorul unui apstor de limb se preseaz limba astfel nct sse evidenieze peretele posterior al oro-faringelui i tonsilele palatine. Seexamineaz macroscopic rapid oro-faringele i cu o micare rapid, blnd dar precis se terg cu tamponul peretele faringian i tonsilele. Nu se ating peretelesuperior al palatului i nici limba. (Secreia lingual este o investigaie aparte, cndse recolteaz tot cu tamponul strict de pe suprafaa limbii).

Exudatul nazal se recolteaz n mod similar, cu tampon steril, din fiecare fosnazal.

Exudatul faringian i cel nazal se transport la laborator i se nsmneaz ncel mai scurt timp posibil, evitndu-se uscarea tamponului i efectul temperaturiisczute, care duc la moartea florei bacteriene, n special a streptococilor ipneumococilor. Pentru a evita aceste neajunsuri se pot folosi tuburi cu medii deconservare i transport.

Secreiile conjunctivale, otice, secreiile de plagSecreia conjunctival se recolteaz cu tamponul steril, dimineaa, naintea

efecturii toaletei i naintea aplicrii de coliruri sau de creme oftalmice. Prelevarease va face din sacul conjunctival intern, eventual cu tamponul umezit n ser fiziologicsteril. Secreia otic se recolteaz cu tamponul steril din conductul auditiv, nainte deaplicarea oricrui tratament cu antibiotice sau antiseptice. Secreiile de plag se vor recolta cu tamponul steril, nainte de toaleta plgii. Dac plaga este profund isecreia abundent, se va recolta cu seringa steril i o prob pentru cultur nanaerobioz.

SputaSputa poate fi recoltat prin expectoraie ntr-un recipient steril (gradat, de

unic folosin). Pacientul este instruit ca dimineaa, dup un acces de tuse, sexpectoreze n recipientul steril, evitnd s amestece sputa cu saliva.

Acest lucru este dificil de realizat, principalul neajuns al metodei este cprodusele sunt frecvent contaminate cu flor din cavitatea bucal. Probele de sputrecoltate n cursul bronhoscopiei sunt ferite de acest inconvenient, contaminarea cuflor bucal fiind practic neglijabil. Aceast metod este cea mai recomandabil. La

copiii mici, care nu tiu s expectoreze i nghit sputa. Aceasta poate fi recoltat printubaj gastric urmat de introducerea a 10-20 ml ser fiziologic, urmat de aspiraie. nlichidul aspirat va fi i sputa nghiit, dar micobacteriile i fungii coninui pot fi deorigine gastric.

UrinaRecoltarea urinei pentru urocultur este indicat n suspiciunea de infecie

urinar. Recoltarea se poate face n mai multe moduri.n majoritatea cazurilor, urinase recolteaz n timpul primei miciuni de diminea, din mijlocul jetului.

Pacienii sunt instruii ca nainte de prima miciune s efectueze o toaletgenital riguroas, cu ap i spun, apoi s se tearg cu tifon steril, iar femeile care

au secreii genitale abundente s-i introduc un tampon intravaginal. Aceste msuri

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

22/33

sunt absolut necesare pentru a evita contaminarea probei de urin cu flor de lanivelul mucoasei genitale.

Recoltarea se face n flacoane steile, de unic folosin. Pacientul va ncepes urineze, pentru ca prima poriune a jetului s elimine flora existent la niveluluretrei terminale; apoi va ntrerupe voluntar miciunea; va deuruba flaconul steril i adoua parte a jetului (mijlocul jetului) o va urina direct n flacon 2-3 ml. Va astupaflaconul. Va termina miciunea normal, n toalet.

La bolnavii care nu-i pot controla miciunea (copii mici, aduli incontieni) ila cei la care oricum se efectueaz sondaj vezical evacuator (adenom de prostat,etc.) recoltarea urinii pentru urocultur se face pe sond. Aici exist ns pericolulintroducerii n vezica urinar a florei de la nivelul uretrei terminale sau chiar florexogen.

Puncia suprapubian transcutanat permite recoltarea unei probe de urindirect din vezica urinar.

Urina fiind un excelent mediu de cultur, ea va fi pstrat la temperaturacamerei maximum 2h pn la nsmnare, sau la frigider maxim cteva ore.

Materiile fecaleMateriile fecale se recolteaz n scopul efecturii coproculturii sau a

examenului coproparazitologic.Coprocultura este indicat n bolile diareice, n febra tifoid i paratifoid i

pentru depistarea portajului de enterobacterii obligat patogene. Recoltarea se face ncoprorecoltoare sterile, cu mediu de conservare i transport.

La bolnavii cu diaree, materiile fecale se recolteaz din scaunul emis spontan, ntr-un recipient steril, fr urme de detergeni sau dezinfectani. Cu linguria cu careeste prevzut coprorecoltorul special, pacientul va recolta o cantitate mic din prob,

n special cu snge sau mucus, dac exist. Proba va fi introdus n coprorecoltor, nmediul de conservare i transport Carry-Blair.Materiile fecale mai pot fi recoltate prin sondal rectal, cu sonda Nelaton,

introdus 10-12 cm la copil i 16-18 cm la adult, i aspirnd prin presare la captuldistal al sondei. Aceasta va fi apoi descrcat n ser fiziologic steril sau n mediulCarry-Blair din coprorecoltor.

Pentru suspecii de portaj de enterobacterii patogene, recoltarea materiilor fecale se va face dup administrarea unui purgativ salin (sulfat de sodiu i demagneziu).

Pentru examenul coproparazitologic, recoltarea se face n mod similar, probaintroducndu-se ntr-un coprorecoltor de unic utilizare fr mediu de conservare itransport.

Secreiile genitale: secreia vaginal i secreia uretral.Secreia vaginal se recolteaz pe masa ginecologic. Este de preferat ca

femeia s se afle n primele 5-10 zile dup menstruaie, pentru a evidenia mai bineparazitul Trichomonas vaginalis. Ca tamponul steril se recolteaz secreie din vagini din fundul de sac posterior, iar din secreia acumulat pe valv, se depun probe pe2-3 lame de microscop, pentru preparatul proaspt i pentru frotiuri. Pentrupreparatul proaspt lamele i serul fiziologic folosit trebuie inute la termostat la 37OC, iar examinarea microscopic s fie fcut n 10-15 minute de la recoltare.Frotiurile se coloreaz Albastru de metilen i Gram. Culturile se fac pe geloz-snge,geloz chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-Martin i AABTL.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

23/33

Secreia uretral la bolnavii cu uretrite acute este de obicei abundent. Labolnavii cu uretrite cronice este mult mai redus. Ea se recolteaz dimineaa, naintede miciune. Dup un masaj uor al uretrei anterioare, ca s se exprime ctevapicturi de secreie (pictura matinal). Cu un tampon steril se recolteaz pentrucultur, apoi se depune cte o pictur pe 2-3 lame de microscop, pentru examenuldirect i pentru frotiuri.

n vederea depistrii parazitului Trichomonas se poate examina sedimentulurinar al primului jet de urin recoltat de diminea.

Scuame cutanate, fire de pr Scuamele cutanate se recolteaz prin raclare uoar, cu o lam de bisturiu,

din regiunea periferic a leziunii, apoi se introduc ntr-o eprubet steril. Firele de pr modificate se recolteaz cu pensa prin smulgere, apoi se introduc ntr-o plac Petristeril. Unghiile parazitate se taie cu o foarfec dezinfectat i se introduc ntr-oplac petri steril.

Aceste produse vor fi supuse unor examene micologice i eventualbacteriologice.

CAPITOLUL 5

EXAMENUL MICROSCOPIC

Microscopul permite observarea corpurilor foarte mici, sub limita de vizibilitatochiuluiliber, ntre care i microorganismele.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

24/33

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

25/33

Microscopul cu fond ntunecat(ultramicroscopul) realizeaz luminarea dinlateral a preparatului; n obiectiv nu ptrund dect razele reflectate de marginilecelulelor (bacteriilor, de exemplu), care apar albe, strlucitoare, refringente, iar fonduleste negru ( ntunecat). Aceste microscoape pot fi realizate din microscoape optice,prin nlocuirea condensorului cu un condensor special, prevzut cu un disc opaccentral. Microscopul cu fond ntunecat permite examinarea preparatelor proaspete,necolorate (Treponeme, Leptospire) i permite studiul obiectelor transparente.Microscopul cu contrast de fazfolosete transformarea diferenei de faz aluminii care traverseaz un preparat n diferen de intensitate, sesizabil cu ochiulliber. Este folosit la studiul preparatelor cu celule vii, preparatelor proaspetenecolorate i al celor slab colorate: Ricketsii, Treponeme, Leptospire.

Microscopul cu fluorescen la care sursa de lumin folosete radiaii dindomeniul U.V. apropiat spectrului vizibil i vizibil. Se bazeaz pe fenomenul defluorescen - fenomenul de emitere a unor radiaii luminoase din spectrul vizibil dectre o celul sau substan, dac aceasta este supus aciunii unei radiaii excitanteexterne, cu durata mai mic de 107 sec. Fluorescena celulelor saumicroorganismelor poate fi:

- primar ( natural), proprie celulei respective- secundar, sau rezultat prin cuplarea celulei respective cu o substan

fluorescent numit fluorocrom.Cei mai importani fluorocromi sunt: Izotiocianatul de fluorescein,

Rhodamina, Auramina, Eozina. Un preparat colorat cu fluorocromi trebuie examinat ntotdeauna n paralel cu un preparat similar necolorat (martor), pentru a facediferena ntre fluorescena preparatului colorat de cea natural a unor celule.

Microscopul cu fluorescen este folosit n bacteriologie, virusologie,parazitologie i imunologie ( imunofluorescena).

Microscopul electronic folosete lentile electronice: cmpuri magnetice,electrice sau electromagnetice, care acioneaz asupra unui fascicul de electroniaccelerai, pe care l poate focaliza sau defocaliza. Un astfel de microscop are oputere de rezoluie de 100.000 ori mai mare dect a unui microscop optic.

Principalele tipuri de microscoape electronice sunt :- M.E. prin transmisie folosit pentru examinarea unor preparate

transparente la trecerea unui fascicul de electroni. Schematic, este formatdintr-o surs de electroni accelerai (tub electronic), sistem de lentilecondensor (cmpuri electrice sau magnetice), portobiect, lentil obiectiv,lentil proiector (tot electromagnetic) i ecran de observaie fluorescentsub aciunea electronilor.

- M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeelor obiectelor solide.

Este format dintr-o surs de electroni accelerai, un sistem de baleiere afasciculului de electroni pe suprafaa preparatului de examinat, un sistemde detecie a electronilor emii de pe suprafaa preparatului, un sistem deamplificare video i un tub cinescopic. Ambele tipuri de M. E. Sunt dotatecu un sistem ce asigur vid naintat pe tot traiectul parcurs de electroni,traiect ce se gsete ntr-o structur nchis numit coloana microscopuluielectronic. Preparatele microscopice pentru microscopia fotonic utilizate n microbiologie. n vederea examenului microbiologic, preparatelemicroscopice pot fi efectuate att din produsele patologice, ct i dinculturi.

Preparatele microscopice pot fi de dou feluri:- preparate proaspete (native), ntre lam i lamel- preparate uscate, fixate i colorate frotiurile

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

26/33

Preparatul proasptMateriale necesare : lame de microscop curate,degresate i uscate, lamele de

microscop,pipete, ans bacteriologic, bec Bunsen, ser fiziologic steril, soluie Lugol.

Tehnica de execuie: dac produsul patologic este lichid sau culturabacterian este n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o pictur din acestea i sedepune pe o lam de microscop. Se acoper cu o lamel. Se examineaz cuobiectivul 40 X.

- Dac produsul patologic este solid sau cultura bacterian este pe mediusolid, pe lama de microscop se depune o pictur de ser fiziologic steril,apoi ansa steril se ncarc cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene, seemulsioneaz n pictura de ser fiziologic, apoi se acoper cu lamel i seexamineaz cu obiectivul 40X.Este folosit pentru examinarea bacteriilor, paraziilor, fungilor Avantajele preparatului proaspt:

- este uor de executat i se efectueaz rapid- evideniaz forma i mobilitatea microorganismelor (viabilitatea celor mobile).- preparatul poate fi examinat i la microscopul cu cu cmp ntunecat sau la

microscopul cu contrast de faz.Dezavantaje:

- microorganismele sunt vii, deci exist posibilitatea contaminrii.- dac examinarea nu se face n 10-15 minute, preparatul se usuc i

examinarea devine imposibil.- nu poate fi pstrat.

FROTIULMateriale necesareLame de microscop curate,degresate i uscatePipete, ans bacteriologic, bec Bunsen, ser fiziologic sterilTehnica de execuie :

Etapele efecturii unui frotiu sunt:a. ntinderea frotiuluib. uscareac. fixaread. colorareaa. ntinderea frotiului: dac produsul patologic este lichid sau cultura

bacterian este n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o pictur dinacestea i se depune pe o lam de microscop. Dac produsul patologiceste solid sau cultura bacterian este pe mediu solid, pe lama demicroscop se depune o pictur de ser fiziologic steril, apoi ansa steril se ncarc cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene i se emulsioneaz npictura de ser fiziologic urmrind s se obin o suspensie omogen i nuprea dens . Apoi, cu ansa, prin micri concentrice, se ntinde pictura nstrat subire.

b. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. Uscarea brusc, latemperaturi ridicate, produce fierberea apei din frotiu , cu distrugereamorfologiei i structurii celulelor.

c. Fixarea se face la cald, prin trecerea lamei, cu frotiul n sus peste flacrabecului Bunsen de 3-4 ori. Fixarea realizeaz aderarea frotiului de lam ,

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

27/33

astfel nct nu se va desprinde cu ocazia procedurilor de splare din timpulcolorrii, asigur omorrea microorganismelor i crete susceptibilitateaacestora la colorani.

d. Colorarea este o etap esenial n executarea unui frotiu. Coloraiile celmai frecvent folosite n bacteriologie se clasific n :

- coloraii simple: coloraia cu albastru de metilen ( A.M.)- coloraii duble: coloraia Gram- coloraii speciale: coloraia Ziehl-Neelsen, Coloraia Del Vechio, coloraia

pentru capsul, coloraia pentru spori, coloraia pentru flageli, etc.

Coloraia cu albastru de metileneste o coloraie simpl, rapid, neagresivasupra bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare i recolorare, i care permite oorientare rapid asupra prezenei i morfologiei baceriilor. De asemenea, permitevizualizarea capsulei bacteriene sub forma unui halou clar n jurul acestora.

Tehnica coloraiei albastru de metilen:- frotiul bine uscat i fixat se acoper cu soluie albastru de metilen 1%, timp

de 2-3 minute- se scurge colorantul i se spal cu ap- se usuc n stativ, la temperatura camereiLa examenul microscopic bacteriile i levurile apar colorate albastru nchis, iar

celulele eucariote: leucocite, celule epiteliale, etc, n albastru deschis, cu nucleii mai nchii.

Coloraia Grameste cea mai utilizat coloraie n bacteriologie. Imaginat n1884 de danezul Hans Christian Gram, a suferit mici adaptri de-a lungul anilor, dar n esen a rmas neschimbat. Permite vizualizarea marii majoriti a bacteriilor, cu ncadrarea n categoriile morfologice: coci, bacili, etc. i diferenierea lor n cele doumari clase: bacterii Gram-pozitive i bacterii Gram-negative.

Timpii coloraiei Gram ( modificat de Hucker):- frotiul uscat i fixat se acoper cu soluie de Violet de geniana sau Cristal

violet , 1-3 minute- se scurge colorantul i se spal cu ap- se acoper frotiul cu soluie Lugol, 1 minut- se scurge Lugolul i se spal cu ap- decolorare cu alcool-aceton 25 secunde (strict)- se spal cu ap- se acoper frotiul cu soluie fuxin 10% diluat extemporaneu, 1 minut- se scurge colorantul i se spal cu ap- se usuc n stativ, la temperatura camereiLa examenul microscopic, unele bacterii apar colorate n violet Gram

pozitive, altele apar colorate n roz- Gram negative.Diferena de colorabilitate se datoreaz structurii diferete a peretelui celular la

cele dou categorii de bacterii: Unele au peretele format din mai multe straturi depeptidoglican, impenetrabil pentru alcool-aceton, astfel nct violetul nu este extrasdin celul.

Altele au peretele format din puine straturi de peptidoglican i bogate n lipide,care se solubilizeaz n alcool-aceton, permind decolorarea violetului i colorareacu fuxin.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

28/33

Coloraia Ziehl-Neelsenevideniaz bacterii acid-alcoolo rezistente, dingenurile Mycobacterium i Nocardia.

Reactivi necesari:-Fuxin fenicat Ziehl 1%-Soluie alcool-acid (alcool 96% i acid aclorhidric sau azotic)Timpii coloraiei Ziehl-Neelsen:- frotiul uscat i fixat se acoper cu fuxin Ziehl 1% i se nclzete dosul

lamei ( cu flacr de alcool) pn la emisia de vapori, de 3 ori cte 5minute. Nu se aduce la temperatura de fierbere a colorantului

- se las s se rceasc- se vars colorantul i se spal cu ap- de colorare cu acid-alcool timp de 2-3 minute- se spal cu ap- se acoper cu albastru de metilen pentru recolorare 1 minut- se spal, se usuc n stativ la temperatura camereiLa examinarea la microscop, bacilii acid-alcoolo-rezisteni apar colorai nrou. Celelalte bacterii, precum i celulele eucariote din frotiurole efectuate din

produsele patologice, apar colorate n albastru.Mecanismul coloraiei este ptrunderea fuxinei fenicate n bacterii la cald i

legarea acesteia de acizii micolici din peretele celular. La temperatura camerei,peretele celular al acestor bacterii este impenetrabil att la amestecul decolorant, cti la colorarea cu A.M.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

29/33

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

30/33

Prezena de colonii n interiorul zonei de inhibiie semnific dezvoltarea rezistesecundare,interpretarea fiind R indiferent de mrimea diametrului zonei respective.

Posibile surse de eroare: nerespectarea densitii inoculului, nerespectareapuritii culturii, excesul de umiditatea al mediului.

Metoda diluiilor

Antibiograma prin diluia antibioticului n mediu lichid

Metod cantitativ, ce permite determinarea concentraiei minime inhibitorii(CMI)iconcentraiei minime bactericide(CMB)a unui antibiotic fa de tulpina testat.Este o metod laborioas, rezervat cercetrii i situaiilor n care este necesar administrarede doze mari de antibiotice (endocardite, septicemii).

Tehnica de lucru:I: Se pregtete o serie de eprubete cu cantiti egale de mediu Muller-Hinton

lichid ce conin diluii crescnde dintr-un antibiotic. Se folosete un martor decretere eprubet cu mediu dar fr antibiotic. n eprubete se adaug cantiti egale din suspensia bacterian standard detestat.

Se incubeaz peste noapte la 37OC.

Citire i interpretare: n tubul martor, fr antibiotic trebuie s existe cretere bacterian )

(tulburarea mediului); eprubetele n care mediul este limpede semnific, prin lipsamultiplicrii bacteriene, sensibilitatea la antibioticul testat.

Ultima diluie care a inhibat creterea corespunde CMI.II: Din epubetele cu mediu clar se nsmneaz cte un sector de mediu Muller-Hin

solid,fr antibiotic. Dup incubare, se noteaz ultima diluie la care bacteriile nu au crescut

mediulsolid, aceasta corespunznd CMB.

Antibiograma prin diluia antibioticului n mediu solid

Se prepar soluiile stoc de antibiotic, cu concentraii de 5,120 g/ml, din care se vorfacediluii binare, apoi diluia final 1:10 n geloz topit Muller Hinton. Apoi geloza se toa

plciPetri n strat de 4 mm grosime, obinndu-se medii solide cu diferite concentraii de antibiotPentru testarea streptococilor, la geloza topit se adaug 5% snge defibrinat de cal sau dberbec.

nsmnarea mediului se va face cu ansa calibrat de 0,001 ml, care se ncarc cususpensie dun cultura de testat cu densitatea de 0.5 McFarland.

Se nsmneaz i un mediu fr antibiotic, pentru controlul creterii.CMI este dat de cea mai mic concentraie de antibiotic la care nu se observ colonii

bacteriene pe suprafaa de inoculare.

Metoda miniaturizat API de diluii n mediu lichidfolosete galerii detestare a sensibilitii, ce conin antibiotice n stare deshidratat.Exist diferite tipuri de teste

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

31/33

antibiograme convenionale, cu dou concentraii limit i incubare de18-24h. antibiograme rapide, Rapid ATB, cu incubare de 4h, pentru stafilococi ienterobacterii.

Principiul metodeiTestele se bazeaz pe determinarea ratei de cretere a bacteriilor n prezenaantibioticului.Galeriile sunt confecionate din material plastic transparent i conin 32

godeuri.Primele dou godeuri nu conin antibiotic i servesc drept martor de cretere.Lipsa creterii sau creterea insuficient n acestea invalideaz rezultatele.

Celelalte godeuri conin antibiotice n form deshidratat, n diferiteconcentraii. n funcie de tipul de antibiogram, tulpina izolat poate fi testat la unasau mai multe concentraii ale unui antibiotic. Godeurile trebuie inoculate cu osuspensie bacterian n mediu special ATB medium sau NaCl 0,85%.

Galeriile sunt apoi incubate un interval de timp corespunztor - 4h sau 24h la37OC.

Citirea automat a galeriilor Msurarea creterii se face turbidimetric. Cititorul face msurtorile i le transfer

apoi n computer, care stabilete profilul corespunztor (Rezistent, Sensibil, Intermedsensibil).

Interpretarea rezultatelor n general sunt testate dou concentraii limit, stabilite pe baze

bacteriologice, farmacocinetice i terapeutice. Aceste concentraii permit apreciereasensibilitii unei tulpini astfel:

Sensibil - creterea bacterian este inhibat la ambele concentraii;Intermediar - creterea bacterian este inhibat numai de concentraia mai

mare.Rezistent - creterea bacterian nu este inhibat de nici una din concentraii.Cnd antibioticele sunt testate la o singur concentraie, rezultatul se exprim

n Sensibilsau Rezistent.

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

32/33

7/27/2019 65275193-CARTE-LP1

33/33

Exemplu: Testarea stafilococilor la Vancomicin prin metoda E-Test nconformitate cu normele NCCLS:

Mediul: Muller-HintonInoculul: suspensie bacterian cu densitatea de 1 McF

Interpretare:

S I R 4 g/ml 8-16 g/ml 32 g/ml

Figura 7: Determinarea CMI prin E-test