5 tehnici bio molec

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara

Biologie Celulara si Histologie

Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara si inginerie geneticasi inginerie genetica


CuprinsCuprins

⇨ The Human Genome project

⇨ Tehnici de genetica moleculara

Secventierea acizilor nucleici

PCR

Clonarea unor gene

Vectori

Transfectii

Animale transgenice; linii knock-out

⇨ Aplicatii ale ingineriei genetice


The human genome projectThe human genome project


The human genome projectThe human genome project

⇨ Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 – 2003

⇨ Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health

Partener major: Wellcome Trust (UK)

Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc


The Human Genome ProjectThe Human Genome ProjectObiectiveObiective

⇨ Identificarea tuturor genelorgenelor din ADN-ul uman (in total 20-25000)

⇨ Determinarea intregii secvente de nucleotidesecvente de nucleotide din ADN-ul uman (aprox. 3 miliarde)

⇨ Crearea unor baze de datebaze de date cu aceste informatii

⇨ Perfectionarea de instrumenteinstrumente pentru analiza and

⇨ Transferul tehnologiilorTransferul tehnologiilor catre sectorul privat

⇨ Identificarea problemelor legale si eticeproblemelor legale si etice care pot aparea si propunerea de solutii


Continutul informational al genomului umanContinutul informational al genomului uman


Probleme speciale legate de identificarea si localizarea Probleme speciale legate de identificarea si localizarea genelorgenelor

⇨ CentromeriiCentromerii – contin secvente cu grad inalt de repetitivitate, dificil de mapat cu tehnicile actuale

⇨ TelomereleTelomerele – contin la randul lor secvente repetitive, de multe ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului

⇨ Existenta multigenelormultigenelor – locusuri cromozomiale care contin gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat individual

⇨ Aprox. 93%93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent; studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia actuala


http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml


Cromozomul 1Cromozomul 1

⇨ Cel mai mare dintre cromozomii umani; contine aprox. 8% din informatia genetica

⇨ Boli genetice:

▶ Parkinson

▶ Alzheimer

▶ Charcot-Marie Tooth (neuropatie ereditara)

⇨ In cancer apar frecvent modificari ale regiunilor sale terminale


Cromozomii 2 si 4Cromozomii 2 si 4

⇨ Au cea mai mica rata de recombinare dintre cromozomii umani

⇨ Cromozomul 2 – unic prin provenienta (fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)

⇨ Cromozomul 4:

▶ Boala Huntington

▶ Boala polichistica


Cromozomii 3, 5, 6Cromozomii 3, 5, 6

⇨ Cromozomul 3

▶ Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala

▶ Zone implicate in diferite cancere

⇨ Cromozomul 5

▶ Redundanta informationala mare, continut genetic scazut

▶ Implicat in atrofia musculara spinala

⇨ Cromozomul 6

▶ Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t (activitate transcriptionala)

▶ Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate


Cromozomii 7, 8, 9Cromozomii 7, 8, 9

⇨ Cromozomul 7

▶ Gena CFTR - implicata in fibroza chistica

⇨ Cromozomul 8

▶ Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii creierului la primatele mari

⇨ Cromozomul 9

▶ Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie de sex mascul → femela)

▶ Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc


Cromozomii 10, 11, 12, 13Cromozomii 10, 11, 12, 13

⇨ Cromozomul 10

▶ Tumori, boli neurologice

⇨ Cromozomul 11

▶ Unul dintre cei mai bogati in gene

▶ Numarul cel mai mare de gene ptr receptori olfactivi

⇨ Cromozomul 12

▶ Leucemii, limfoame, alte cancere

▶ 2 gene asociate diabetului

▶ Gene implicate in tulburari psihiatrice

⇨ Cromozomul 13

▶ Contine gena cancerului de san (de tip II)

▶ Contine gena asociata retinoblastomului



⇨ Cromozomul 14

▶ Gene pentru ARNr in bratul scurt

⇨ Cromozomul 15

▶ Unul din cromozomii cu rata mare de duplicare segmentala

⇨ Cromozomul 16

▶ Duplicare segmentala mare

▶ Gene implicate in boala polichistica renala, leucemii acute

⇨ Cromozomul 17

▶ Cea mai mare diferenta de structura dintre un cromozom uman si cromozomi similari mamalieni



⇨ Cromozomul 18

▶ Translocarea 14-18 este una din cele mai comune cauze genetice de cancer la oameni

⇨ Cromozomul 19

▶ Gene implicate in hipercolesterolemia familiala si diabetul insulino-rezistent

⇨ Cromozomul 20

▶ Contine gene prionice (boala Creutzfeld-Jacob)

▶ Implicat in diabetul zaharat de tip II, obezitate, cataracta, boala Graves

⇨ Cromozomul 21

▶ Cel mai mic cromozom

▶ O copie suplimentara (trisomie) determina sindromul Down


Cromozomii 22, X, YCromozomii 22, X, Y

⇨ Cromozomul 22

▶ Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice

⇨ Cromozomul X

▶ Cromozomul sexual feminin

⇨ Cromozomul Y

▶ Cromozomul sexual masculin


Exemplu – cromozomul 21Exemplu – cromozomul 21

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml


Baze de dateBaze de date

⇨ NCBI Human Genome Sequencing Progress

▶ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

⇨ University of California (Santa Cruz)

▶ http://genome.ucsc.edu/

⇨ Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBL-European Bioinformatics Institute

▶ http://www.ensembl.org/

⇨ EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide Sequence Database)

▶ http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

http://genome.ucsc.edu/

http://www.ensembl.org/

http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html


Aplicatii, beneficii din urma HGPAplicatii, beneficii din urma HGP

⇨ Medicina moleculara:

Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala

Design rational de medicamente

Terapie genica

Farmacogenomica

⇨ Aplicatii energetice si de ingineria mediului

Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili, sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului

⇨ Bioarheologie si antropologie

⇨ Medicina legala

⇨ Agricultura

Genetically modified foods (GMF)


Patentarea genelor, secventelor geneticePatentarea genelor, secventelor genetice

⇨ Se poate face atunci cand:

Este identificata o noua secventa genetica

Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective

Este specificata functia produsului respectiv

Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care poate fi utilizata de specialisti din domeniu

⇨ Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani

⇨ Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii referitoare la produsul patentat

⇨ Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in USA etc):http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml


Tehnici de genetica molecularaTehnici de genetica moleculara


Secventierea ADNSecventierea ADN

⇨ Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea secventei de nucleotide intr-un lant de and

⇨ Metode de baza:

▶ Secventierea chimicaSecventierea chimica (Maxam – Gilbert)

Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea lantului la nivelula cestor modificari

Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADN-proteine etc)

▶ Metoda de terminare a lantului Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent

Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV


Alte metode de secventiereAlte metode de secventiere

Electroforeza capilara

Dye-termination method Clonare in vectori bacterieni


Secventierea ADN Secventierea ADN Metoda shotgunMetoda shotgun

⇨ Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici

⇨ Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa ulterioara)

⇨ Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel

⇨ Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul aceleiasi benzi de migrare in gel

⇨ Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment – se recreaza astfel secventa originala de A – T – C – G pentru fiecare fragment

⇨ Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate

⇨ Dupa “citirea” bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.


Exemplu (principiu de baza)


PCR = polymerase chain reactionPCR = polymerase chain reaction

⇨ Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN

⇨ Necesita: Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat

Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale lantului de ADN

ADN-polimeraza

Nucleotide

Buffer, ioni divalenti

⇨ Utilizare: Secventializarea ADN-ului (“citirea” informatiei genetice)

Clonari

Scopuri diagnostice

Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica

Scopuri criminalistice


PCRPCR


http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf



Clonari de geneClonari de gene


Clonari de geneClonari de gene

⇨ Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si realizarea de copii multiple ale acesteia




Vectori Vectori

⇨Sunt molecule de ADN utilizate pentru transferarea de material genetic strain intr-o celula

⇨Tipuri de vectori: Plasmide Bacteriofagi, alte virusuri Cromozomi artificiali

⇨Transferul de material genetic intr-o celula = Transfectie


PlasmidePlasmide

⇨ Fragmente de ADN dublu spiralat, de obicei circulare

⇨ Capabile de autoreplicare

⇨ Se pot integra sau nu in genomul celulei gazda

⇨ Origine bacteriana / sinteza in vitro

⇨ Utilizare in transfectii, terapie genica

Wikimedia Commons

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Plasmid_replication_(english).svg


http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf


⇨ Bacteriofagi – virusuri care infecteaza bacterii

⇨ Retrovirusuri – se integreaza in genom, se replica o data cu celula gazda

⇨ Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)

⇨ Adenovirusuri – nu se integreaza in genom, nu se replica o data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns imun puternic → utilizare in crearea de vaccinuri)

CONDITII DE UTILIZARE:CONDITII DE UTILIZARE:

● NepatogeneNepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene● Toxicitate redusaToxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza pentru celulele pe care le infecteaza● StabilitateStabilitate – sa nu prezinte mutatii frecvente – sa nu prezinte mutatii frecvente● SpecificitateSpecificitate pentru o anumita linie celulara pentru o anumita linie celulara

Vectori viraliVectori virali


Vectori viraliVectori virali

Wikimedia Commons

Wikimedia Commons

Bacteriofag

Vector lentiviral

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/95/Lentiviral_vector.png

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Phage.png


Cromozomi artificialiCromozomi artificiali

⇨Cromozomi de drojdie (YAC – yeast artificial chromosome)

⇨Cromozomi bacterieni (BAC)

⇨Cromozomi umani (HAC) – functioneaza ca un cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea in celula de gene noi


TransfectiiTransfectii

⇨ Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu ajutorul unui vector

⇨ Metode:

✗ Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula

➔ Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!)

➔ Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele celulare

➔ Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in celule prin endocitoza

➔ Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.

✗ Utilizarea de vectori virali:

➔ Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule


Animale transgeniceAnimale transgenice

⇨ Crearea, in scopuri de cercetare, a unor linii de animale de laborator (soareci, sobolani etc), ce prezinta o anumita mutatie a unei gene

⇨ Utilitate:➔ Modele pentru anumite boli

➔ Studierea implicarii anumitor gene in anumite lanturi de control, in aparitia anumitor maladii Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003

Generation of YAC-transgenic miceKenneth R. Peterson


Linii knock-outLinii knock-out

⇨ Linii de organisme modificate genetic (de obicei soareci), la care una sau mai multe gene au fost blocate de la expresie

⇨ Utilizate in studiul patogeniei unor boli

Wikimedia Commons Wikimedia Commons

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Knockout_mouse_production_2.svg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f3/Knockout_mouse_breeding_scheme.svg


Aplicatii ale ingineriei geneticeAplicatii ale ingineriei genetice


Aplicatii ale ingineriei geneticeAplicatii ale ingineriei genetice

⇨ Screening genetic

⇨ Vaccinuri

⇨ Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)

⇨ Terapie genica

⇨ GMF/O


Screening geneticScreening genetic

⇨ Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane

⇨ Aplicatii:

Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)

Diagnostic prenatal

Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)

Medicina legala


Terapie genicaTerapie genica

⇨ Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice

⇨ Cum se introduce gena?

Vectori: Retrovirusuri Adenovirusuri Virusuri herpes simplex


Terapia genicaTerapia genica

⇨ Probleme actuale de rezolvat:

Durata scurta a efectului – in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie

Controlul raspunsului imun – declansat de prima sedinta de terapie, accentuat la repetarea sedintei

Probleme speciale legate de vectorii virali – efecte adverse nedorite (raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei)

Bolile multigenice – dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate


Terapia genicaTerapia genica

⇨ Rezultate semnificative in prezent:▶ 2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical

Research Centre – ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitatececitate

▶ 2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonaretumori pulmonare

▶ 2006: National Cancer Institute (NCI) – au obtinut limfocite modificate genetic care ataca cu succes celule tumorale de melanom malignmelanom malign

▶ 2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame sindroame mieloidemieloide

▶ 2005: tratata cu succes surditateasurditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare

▶ Alte rezultate promitatoare – deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc


FarmacogenomicaFarmacogenomica

⇨ Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza raspunsul organismului la medicamente

⇨ Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm

5 tehnici bio molec

Documents