FIZIOLOGIA

ORGANITELOR CELULARE

reticulul endoplasmic &

semnalele citosolice de calciu

citoscheletul &

aparatul contractil actina-miozina

Reticulul endoplasmic (RE)

este un ansamblu tubulo-vezicular cu rol in: - transport intracelular - stocarea si eliberarea Ca, - sinteza fosfolipidelor, acizilor grasi si steroizilor. - sinteza proteinelor eliberate direct in RE rugos

RE se prezinta ca un sistem inchis de membrane plin cu lichid, raspandit in citosol, care se continua cu membrana nucleara.

RETICULUL ENDOPLASMIC

Există două aspecte ale RE:

- reticulul endoplasmic neted (REN) sub forma unei

reţele de tuburi interconectate;

- reticulul endoplasmic rugos (RER) care comunică cu

reticulul endoplasmic neted ce se prezintă sub forma

unor stive de saci aplatizaţi a căror faţă externă este

presărată de particule de dimensiuni mici dense

electronomicroscopic numite ribozomi.

SEMNALE DE CALCIU• Eliberarea din RE → cresteri de Cac,

– integrabile in cresteri globale;

– uniforme spatial

(fata de gradientele mari ce insotesc influxul).

• Fiziologic sunt activate ambele surse;

- CICR recruteaza rezervele

cand semnalul primar este influxul;

- eliberarea nu este izolata, datorita SOC.

• Ideea de semnal de Ca++ local a aparut in studii privind

eliberarea neuromediatorilor si influenta Cas asupra canalelor.

SEMNALE DE CALCIU• Semnalul de Ca (SC) → autoregenerativ;

raspunsurile gradate indica natura cuantala.

• Sensibilitatea variabila fata de Cac a canalelor

reticulare permite gradarea prin recrutare.

• Semnalul elementar (SE) = evidentiat in diverse celule

(sparks, puffs, bumps, quantal emission domains).

• Exista si aspecte subquantale numite semnale unitare

(quarks, blips).

• In general SE dureaza ~0,5 ms

si ajung la concentratii de 0,1-200 M.

SEMNALE DE CALCIU• Frecventa globala si amplitudinea medie a SE contribuie la

nivelul de repaus al Cac global, conditionand distanta pana

la pragul de cuplare excitatie-raspuns. • SE participa la controlul unor activitati zonale:

- canale ionice membranare,

- metabolismul mitocondrial,

- eliberarea neuromediatorilor. • Tranziente globale (spikes, waves); CICR asigura

- amplificarea in avalansa

- sincronizarea SC in citosolul profund,

pentru raspuns sinergic.

• SE contribuie (direct / CICR) la cresterile globale ale Cac

SEMNALE DE CALCIU• SE submembranare;

activarea simultana a unui mic grup de RyR

duce la crestere locala (~20 nm) a Cac (10-100 M).

• Un efect al SE: curentii cationici tranzitorii spontani

(STOC) → in neuroni, MN vascular si visceral.

• Efluxul de K+ se realizeaza prin BKCa,

cu sensibilitate mica pentru Ca++ si conductanta mare;

hiperpolarizare de ~20 mV/SE.

SEMNALE DE CALCIU• SE produc curenti inhibitori (STIC)

prin activarea unor canale de Cl-

• Alte tinte ( CaM-dependente) raspund la

cresteri mai mici (0,1-1 M), dar globale ale Cac.

• Disocierea STOC de Cac global → Cas,

cu cresteri locale mari separate de cele globale.

• Imagistica 3D bazata pe MC → distributia superficiala spiralata a

formatiunilor reticulare (6% v/v)

• MF (fluo 4) → situs profund de initiere a undelor de Ca++ propagate,

alte focare fiind superficiale, dispersate si putin active.

SEMNALE DE CALCIU• In MS deschiderea CaL poate sa nu fie insotita de SE (pot

aparea si dupa inchidere), iar CICR depinde de influxul net, nu

de curentul unitar si poate fi complet eliminat in prin tamponare

citosolica (au fost studiate caveolele ca zona preferentiala de

generare a SE).

• Spre deosebire de MS (CaL ca senzor de voltaj cuplat direct cu

RyR din cisternele terminale) si de miocard (influxul prin CaL

declanseaza CICR bazat pe RyR), in MN cuplarea influx-

eliberare este laxa.

• implicarea mitocondriei (preia din Ca++ eliberat în vecinatate, cu

efect de tampon temporar).

FIZIOLOGIA

ORGANITELOR CELULARE

reticulul endoplasmic &

semnalele citosolice de calciu

citoscheletul &

aparatul contractil actina-miozina

Citoscheletul:- forma & mărimea celulei;- mişcarea unor constituienţi

în interiorul celulei.

Se prezintă sub aspect:

microtubular,

microfilamentar,

intermediar,

microtrabecular.

Structurile citoscheletului nu sunt fixe; ele suferă modificări

reversibile, asigurând redistribuirea şi reorientarea organitelor.

Semnale de la nivelul citoscheletului intervin în procesele

de control a creşterii şi diviziunii normale a celulelor.

Citoschelet = ansamblu de filamente proteice,

cu diferentieri regionale de compozitie si arhitectura

ce servesc diverse roluri functionale.

Se descriu trei clase de filamente:

- microfilamente (implicate in mentinerea arhitecturii celulare),

- microtubuli (implicati in motilitate),

- filamente intermediare (ancorarea unor proteine membranare).

Microtubulii (tubulina) au rol în:

- menţinerea formei neregulate a unor celule, - transportul unor vezicule,- mişcările cililor şi flagelilor,

- realizarea fusului mitotic.

Microfilamentele = cele mai mari - alcătuite din actină (şi miozină în celulele musculare- reprezintă sistemul contractil al celulei

- contractilitatea musculară- mişcările amiboide ale leucocitelor,

• Filamentele intermediare

- dimensiuni între ale microtubulilor şi microfilamentelor;

- mai ales în celulele care suportă compresiuni

• Reţeaua microtrabeculară

– alcătuită din filamente foarte subţiri interconectate care

traversează întreaga citoplasmă ancorându-se de faţa

internă a plasmalemei

– organitele, microtubulii şi microfilamentele par a fi

suspendate de reţeaua microtrabeculară

– realizează scheletul celulei, conferind în acest mod unitate

funcţională tuturor constituienţilor citoplasmatici.

The cytoskeleton is a cytoplasmic network of filamentous, non-covalent protein polymers found in eukaryotic cells. The cytoskeleton allows cells to reproduce and move; it is critical for cell growth and for the cell to be able to respond to the environment. The cytoskeleton is rigid, yet flexible, and it is dynamic.

The cytoskeleton functions to control cell shape and provide for a variety of different morphologies (e.g., neurons, epithelia, muscle). Cytoskeletal proteins also allow the cell to change its shape. The cytoskeleton contributes to the organization of cytoplasm, and allows for motility, both of whole cells (and animals) as well as of structures within the cell.

F-actina: contractie, modificari de forma, miscare amiboidala, citokinezaMicrotubuli: arhitectura, modificari de forma, mitoza, cili si flageli, miscari intracelulareFilamente intermediare: rigiditate

Filament F-Actin (MICROFILAMENTS)

INTERMEDIATE FILAMENTS (IFs)

MICROTUBULES (MTs)

Diameter 8 nm 10 nm 24 nm

Subunit monomer  G-actin 42kD

many types of subunits dimer a/b tubulin monomer: 55kD dimer: 110kD

Nucleotide bound one ATP / monomer NO 2 GTP / dimer only one hydrolyzed

Polar? YES NO YES

Drugs Favor depolym

       

Stabilize

cytochalasins          

phalloidin

  ?

     

?

colchicine colcemide nocodazole

  taxol¡¡

ACTIN POLYMERIZATION

You can assess actin polymerization by measuring solution viscosity or turbidity or by

sedimenting F-actin polymer. G-actin can be induced to polymerize by addition of salt.

Actin polymerization occurs in three steps: (1) the lag phase, during which actin

assembly is nucleated. Nucleation involves the formation of a large enough cluster of

actin monomers (currently thought to be three) that will then support further growth; (2)

rapid assembly, and (3) steady state. During the rapid assembly phase, the filament is

growing at both ends. At steady state, the filament is not at equilibrium. It is still growing

and shrinking in a process called treadmilling, which is discussed in detail below.

Actin assembly is strongly influenced by a property known as the critical concentration

(Cc). This is a property that is also seen for other self-assembling molecules (e.g.,

tubulin). Filaments assemble only in solutions that are above the Cc. Solutions of actin

polymer contain both F-actin and G-actin, and G-actin is maintained at the Cc. Solutions

of actin polymer that are diluted to below the Cc will depolymerize.

• Celula musculara = aparat contractil specific, cu organizare sarcomerica

• Discul clar = miofilamente de actina; 2 semidiscuri, de o parte si de alta a membranei Z; lungime de 2 m. Aceasta reprezinta lungimea maxima, caracteristica muschiului intins in repaus (miofilamentele de actina nu patrund in interiorul discului intunecat).

Miofilamentele de actina: doua extremitati: - una patrunde printre miofilamentele de miozina, - una este fixata prin impletire pe membrana Z.

Miofilamentele de miozina: discul intunecat (1,5 m); agregate moleculare cilindrice, cu proiectii laterale. Exceptie face o zona neteda centrala, de 0,2 m, si o portiune mijlocie a

acestei zone ingrosata, reprezentand stria M.

Sarcomerul

- portiunea cuprinsa intre 2 membrane Z succesive;

- contine un disc intunecat central si doua semidiscuri

clare la extremitati

- reprezinta unitatea morfo-functionala a miofibrilei

- lungimea depinde de starea functionala a muschiului:

- in repaus sarcomerul are lungimea de 2,2 m; filamentele de

actina patrund partial printre cele de miozina, pana la limita

zonei centrale, unde lipsesc proiectiile laterale (zona clara H,

lungime de 0,2 m).

- intinderea prin tractionare a muschiului are ca efect iesirea

filamentelor de actina inafara discului intunecat si alungirea

discului clar; zona H se mareste.

In timpul contractiei musculare - filamentele de actina patrund printre cele de miozina,

in interiorul discului intunecat, - se micsoreaza discul clar, - stria H dispare,- stria M devine evidenta

(la nivelul ei filamentele de actina se suprapun).

Miofilamentele sunt alcatuite din:- proteine contractile fundamentale

actina si miozina - proteine reglatoare

troponina, tropomiozina, si actinina

• FILAMENTUL DE MIOZINA este un polimer;

200 de monomeri alcatuiti din 6 lanturi polipeptidice,

2 grele (200 kDa) si 4 usoare (20 kDa),

configuratie de “crosa de golf”.

• Cele doua lanturi grele longitudinale rasucite in dublu

helix formeaza manerul sau corpul.

• Extremitatile au forma de dublu cap polar cu structura

globulara (legat de corpul moleculei printr-un scurt lant

polipeptidic helicoidal) + atasate 2 lanturi usoare.

• Fiecare dintre cele doua capete polare are

activitate ATP-azica si afinitate pentru actina.

• Partea longitudinala a moleculei este meromiozina

usoara (LMM), iar capetele polare si lantul peptidic de

legatura formeaza meromiozina grea (HMM).

• Pe lantul peptidic care leaga capul polar de corpul

moleculei exista 1-2 zone de flexibilitate moleculara,

numite “balama”, capul polar putand avea inclinatii

diferite fata de corpul moleculei.

• Structura supramoleculara ordonata a filamentului

gros este conferita de subunitatile LMM alaturate

longitudinal, alcatuind un cilindru gros, cu extremitatile

libere ale moleculei orientate spre mijlocul filamentului

si capetele polare proeminând din aceasta structura

pe un traiect spiralat = aspect de ‘fascie romana’

FILAMENTUL DE ACTINA

• Actina fibrilara (F), = polimer (dublu helix) format din

subunitati de actina globulara (G), cu GM de 47 kDa.

• Actina G (41,7 kDa, ~5,5 nm diametru) se dispune în

număr de 2x14 molecule pentru fiecare tură a lanţului

spiralat de actină F.

• Actina prezintă aşa-numitele situsuri active pentru

legarea miozinei.

• Filamentele subţiri mai conţin şi proteinele accesorii,

reglatoare; complexul troponină-tropomiozină.

TROPOMIOZINA• dublu helix, rezulta din polimerizarea longitudinala a unor

molecule de tropomiozina; legata de actina, situata in santurile

dintre cele doua spirale ale filamentului subtire. • ~5 kDa, ~38,5 nm = jumatate de tura a spiralei de actina• in repaus tropomiozina acopera fizic zonele active ale actinei,

impiedicand interactiunea cu miozina.

TROPONINA- situata la intervale de 40 nm din lungimea filamentului de actina- 3 subunitati globulare

- troponina T cu afinitate pentru tropomiozina, - troponina I intermediara cu afinitate pentru actina- troponina C cu afinitate pentru ionii de calciu.

• Fixarea Ca++ pe troponina C

→ descoperirea zonelor active de pe actina

→ fixarea capului polar al miozinei

→ prin activarea ATP-azei miozinice se modifica incarcarea

capului polar care, atras de corpul filamentului de miozina,

determina flexia puntii transversale spre interiorul discului

intunecat.

• Actina aluneca spre mijlocul sarcomerului,

care astfel se va scurta = mecanism glisant

• Desfacerea puntii transversale duce la revenirea in pozitie

perpendiculara pe directia filamentului de miozina, refacand o

noua legatura cu locusul urmator de pe actina.

• Procesul inceteaza si are loc relaxarea fibrei musculare cand

scade concentratia calciului citosolic liber la nivelul de repaus.

• Ca++ citosolic ↑ indeparteaza efectul inhibitor

exercitat de complexul troponina-tropomiozina

asupra interactiunii actina-miozina. • Forta dezvoltata de muschi

este proportionala cu rata ciclarii puntilor transversale.

• Lipsa ATP-ului este o situatie anormala, când ciclul se

opreste si se formeaza un complex permanent actina -

miozina / acumularea ionului de calciu in sarcoplasma

datorita ineficientei pompei de Ca++

- rigiditatea cadaverica

- contractura fiziologica din oboseala musculara

• Relaxarea se datoreaza

revenirii Ca++ citosolic la valorile de repaus,

deoarece repolarizarea sarcolemei

intrerupe influxul de calciu,

permitand expulzarea din citosol a calciului suplimentar,

prin activitatea pompei de calciu (sarcolemala / reticulara),

la care se adauga antiportul sodiu / calciu sarcolemal

(3:1, transport activ secundar bazat pe gradientul de Na menţinut de pompa de Na).

• Inhibarea pompei de sodiu de către agenţi cardiotonici din

clasa digitalice duce la creşterea nivelelelor de calciu

activator, cu efect inotrop pozitiv.

• Scurtarea muşchiului striat

este rezultatul scurtării sarcomerelor (~1 m),

cu menţinerea constantă a lungimii benzilor A, fapt

datorat alunecării reciproce

a filamentelor de actină şi miozină.

• Aceasta este rezultatul

ataşării şi detaşării ciclice a punţilor transversale,

prin legarea reversibilă a capetelor miozinei

pe situsuri active succesive de pe filamentul de actină.

Thick filaments are made up of 200 molecules of myosin, each with a molecular weight of ~500 kDa and comprising two heavy chains and four light chains (fig. 4.1).The heavy chains are organised in light meromyosin that forms the common tail and heavy meromyosin with regions S2 (common neck, flexible) and S1 (2 heads per myosin molecule, each with one binding site for actin and one for ATP). From the two light chains per myosin head one is essential and one is regulatory.The myosin filament is a bundle of parallel tails with the heads projecting from it every 14.4 nm, at 60o one from another (corresponding to the three surrounding actin filaments). They look like bundles of golf clubs, with no heads in the length midportion.

By definition the sarcomere is a longitudinal fragment of a myofibril delimited by two successive Z membranes, placed in the middle of light bands I (isotropic), and to which actin filaments are anchored. The midportion of the sarcomere is the dark band A (anisotropic), made up of actin and myosin filaments, except the central H zone, with no actin (at normal lengths). In transverse section each myosin filament appears surrounded by six actin ones and each actin filament by three myosin ones.

Phases of crossbridge cycling- ATP binding to the polar myosin head,- hydrolysis of ATP, with an increase in the tail to head angle,- formation of the actin-myosin crossbridge,- flexion of the myosin head, with traction of the actin filament (~10 nm),- detachment of the crossbridge (simultaneous / subsequent with the next step),- release of ADP and binding of another ATP molecule, hence a new cycle.