120896883 metode de detectie a plantelor transgenice

Maria DUCA, Angela LOZAN, Angela PORT, Aliona GLIJIN, Victor LUPACU

Aspecte metodologice n testareaplantelor modificate genetic

Chiinu 2008

Fondul Global Programul Naiunilor Ministerul Ecologiei i Universitatea de Stat de Mediu Unite pentru Mediu Resurselor Naturale din Moldova


ASPECTE METODOLOGICE N TESTAREA PLANTELOR MODIFICATE GENETIC

Chiinu - 2008




Chiinu - 2008




Chiinu - 2008




Chiinu - 2008

Universitatea de Statdin Moldova

Fondul Globalde Mediu

Programul Naiunilor Unite pentru Mediu

Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale

CZU 581.151A 88

Aceast lucrare a fost elaborat i editat n cadrul proiectului UNEP-GEF nr. GFL/2328-2716-4933 Suport pentru implementarea Cadrului Naional de Biosecuritate n Republica Mol-dova, implementat de Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale i susinut financiar de Fon-

dul Global de Mediu.

Grupul de autori:

Maria DUCA Doctor habilitat n biologie, profesor universitar, membru corespon-dent al AM, decan al Facultii de Biologie i Pedologie, Universi-tatea de Stat din Moldova

Angela LOZAN Doctor n biologie, manager de proiect, proiectul UNEP-GEF Su-port pentru Implementarea Cadrului Naional de Biosecuritate n Republica Moldova

Angela PORT Doctor n biologie, confereniar universitar, ef de laborator Securi-tate Biologic, Universitatea de Stat din Moldova

Aliona GLIJIN Doctor n biologie, lector superior, prodecan al Facultii de Biolo-gie i Pedologie, Universitatea de Stat din Moldova

Victor LUPACU Doctor n biologie, lector, Universitatea de Stat din Moldova

Copyright Maria Duca, Angela Lozan, Angela Port, Aliona Glijin, Victor LupacuCopyright Ministerul Ecologiei i Resurselor NaturaleCopyright Universitatea de Stat din Moldova

ISBN 978-9975-78-613-3

Descrierea CIP a Camerei Naionale a Crii

Aspecte metodologice n testarea plantelor modificate genetic / Maria DUCA, Angela LOZAN, Angela PORT, Aliona GLIJIN, Victor LUPACU; Fondul Global de Mediu. Programul Naiunilor Unite pen-tru Mediu. Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale. Universitatea de Stat din Moldova Chiinu: .S.FE-P. Tipografia Central, 2008, 168 pag.

ISBN 978-9975-78-613-3 1000 ex.

CUPRINSIntroducere ............................................................................................................................. 41. NoIUNI GeNerALe PrIVIND TrANSForMAreA GeNeTIC ..................... 7

1.1. Etape de obinere a OMG ....................................................................................... 81.2. Strategii de identificare, izolare i clonare a genelor de interes .......................... 91.3. Transferul genelor la plante .................................................................................... 261.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor modificate genetic ................................ 321.5. Gene de interes .................................................................................................... 36

2. STANDArDIzAreA I VALIDAreA INTerNAIoNAL .................................... 472.1. Culturi agricole modificate genetic ......................................................................... 482.2. Strategii de nregistrare i stocare a informaiei privind PMG n bazele de date ... 512.3. Laboratoare acreditate pentru testarea OMG .......................................................... 612.4. Norme i legi ce reglementeaz testarea OMG ...................................................... 652.5. Metode validate aprobate pentru testarea OMG ..................................................... 66

3. PreLeVAreA I oBINereA ProBeLor PeNTrU ANALIze GeNeTICe .......... 713.1. Principii i norme de selectare a materialului experimental pentru testare ............ 723.2. Izolarea i purificarea proteinelor i ADN-ului vegetal .......................................... 733.3. Electroforeza proteinelor i a acizilor nucleici ....................................................... 793.4. Estimarea coninutului de proteine i de ADN ....................................................... 863.5. Exemple de protocoale .......................................................................................... 89

4. DeTeCIA PMG LA NIVeL De exPreSIe FeNoTIPIC A TrANSGeNeLor ........................................................................................................ 93

4.1. Genele-marker i raportoare utilizate n selecia PMG .......................................... 944.2. Biotestul fenotipic al PMG ..................................................................................... 974.3. Exemple de protocoale ........................................................................................... 101

5. ANALIzA MoDIFICrILor GeNeTICe LA NIVeL De ProTeINe ................ 1035.1. Analiza proteinelor prin metoda ELISA ................................................................. 1045.2. Analiza proteinelor prin testul Lateral Flow Sticks ............................................. 1085.3. Exemple de protocoale .......................................................................................... 109

6. IDeNTIFICAreA oMG LA NIVeL De ADN ANALIzA CALITATIV .............. 1136.1. Analiza PCR ............................................................................................................ 1146.2. Screening-ul general al PMG .................................................................................. 1186.3. Exemple de protocoale ........................................................................................... 124

7. MeToDe PCr De CUANTIFICAre A PMG ............................................................. 1297.1. Real-time PCR ........................................................................................................ 1307.2. RCR-ul cantitativ competitiv (QC-PCR) ................................................................ 1337.3. Exemple de protocoale ........................................................................................... 135

8. CAPACITI NAIoNALe PeNTrU TeSTAreA PMG ......................................... 1398.1. Structura i potenialul tehnico-tiinific al laboratorului Securitate Biologic...... 1408.2. Detecia PMG la nivel de expresie fenotipic a transgenelor ................................. 1448.3. Identificarea unor transgene la nivel de proteine .................................................... 1478.4. Screening-ul PMG prin PCR .................................................................................. 148

Glosar de termeni ................................................................................................................... 151Bibliografie.............................................................................................................................. 161Abrevieri ................................................................................................................................. 168

4INTroDUCere

n decursul ultimelor decenii, biotehnologia a cunoscut progrese impor-tante datorit descoperirilor ce in de mecanismul funcionrii acizilor nucleici (ADN-ului i ARN-ului) i investigaiilor desfurate apoi n domeniul geneticii moleculare. Relevarea particularitilor materialului genetic la animale, plante i microorganisme, precum i posibilitatea de modificare a unitilor lor com-ponente au lrgit considerabil domeniile aplicrii biotehnologiei, genernd ns n societate o profund nelinite fa de gradul de securitate i caracterul etic al unor asemenea cercetri.

Biotehnologia modern include aplicarea tehnicilor de recombinare a acizi-lor nucleici i a tehnicilor de fuziune celular.in.vitro, nlturnd barierele natu-rale de reproducere sau recombinare genetic. Astfel, prin metode de inginerie genetic, metode care reprezint un sistem de tehnici contemporane de manipu-lare a genomului, a fost posibil inserarea unui spectru larg de gene de interes.(transgene) n mai mult de 120 de specii de plante care aparin la 35 de familii.

O importan practic deosebit o au numeroasele varieti de plante.mo-dificate genetic (PMG), rezistente la diferite erbicide (, 1998; Van Eerd i al., 2003), insecte duntoare (Sharma i al., 2004), boli (Jauhar, 2006), patogeni fungali (Sahrawat, Becker, Lutticke i al. 2003), bacteriali (Datta, Baisakh, Thet i al. 2002) i virali (Gonsalves, 2003). Un rol aparte va reveni n viitorul apro-piat plantelor modificate genetic, ce conin gene ale rezistenei la stresul abiotic, inclusiv la secet (Abebe, Guenzi, Martin i al., 2003) i la salinitatea solurilor (Flowers, 2004), care astzi cauzeaz pn la 50% din pierderile de produc-ie agricol mondial (Bray, Bailey-Serres i Weretilnyk, 2000). Biofortificarea plantelor de cultur prin introducerea genelor implicate n mbuntirea caliti-lor nutritive ale produselor alimentare, precum coninutul de proteine, vitamine i minerale este o direcie relativ nou, n continu dezvoltare (Ducreux, Morris, Hedley i al., 2004).

Produsele alimentare derivate din PMG sunt prezente n magazinele i mar-keturile Uniunii Europene (UE) din anul 1996. Acest fapt a condiionat apariia unei serii de directive i legi emise de Comunitatea European, menite s supun unui control strict comercializarea i cultivarea organismelor modificate genetic (OMG). Conform cerinelor, produsele alimentare care conin cel puin 0,9 - 1% OMG trebuie supuse analizelor i etichetrii.

Necesitatea monitorizrii prezenei PMG i cantitii acestora n culturile agricole i n produsele alimentare derivate din acestea a impus cutarea meto-

5delor analitice eficiente n detectarea, identificarea i cuantificarea alogenelor i a produselor de expresie, care reprezint constituenii genetici de baz. Labora-toarele UE au elaborat i dezvoltat metode de testare a PMG la nivel de ADN prin metoda PCR i/sau proteine, prin analize imunoenzimatice.

n Republica Moldova, cercetrile n domeniul biotehnologiei i problema biosecuritii sunt la nceput de cale. Pn la momentul de fa nu exist centre tiinifice n care s-ar obine PMG, ns produsele modificate genetic pot ajunge la consumatori prin importul de produse alimentare, fructe, legume etc., iar pe cmpurile agricole prin procurarea din strintate a materialului semincer.

Pentru reglementarea activitilor de obinere a PMG, testarea lor, eliberarea n mediul nconjurtor, importul, exportul, transportul acestora etc., Guvernul Republicii.Moldova.a adoptat.Legea.nr.755-XV.din.21.12.2001.privind.securita-tea biologic, precum i Legea pentru ratificarea Protocolului de la Cartagena privind biosecuritatea la Convenia privind diversitatea biologic nr. 1381-XV din. 11. octombrie. 2002. Introducerea pe pia a OMG i/sau a produselor re-zultate din astfel de organisme se face numai n baza autorizaiei eliberate de Comisia Naional pentru Securitatea Biologic n conformitate cu prevederile reglementate de lege.

Implementarea i crearea unui sistem naional n domeniul securitii biolo-gice n Republica Moldova s-a realizat graie proiectelor finanate de programul Naiunilor Unite pentru Mediu/Fondul Global pentru Mediu (UNEP/GEF) n comun acord cu Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale. Pe site-ul oficial www.biosafety.md sunt abordate diferite aspecte legate de problema biosecurit-ii, inclusiv testarea i efectuarea cercetrilor biotehnologice.

n cadrul Universitii de Stat din Moldova, n baza Ordinului comun (nr. 19 din 10.02.2004) al Ministerului Ecologiei i Resurselor Naturale i Ministerului Educaiei i n baza deciziei Senatului USM (proces-verbal nr. 8 din 27.01.2004) a fost organizat Laboratorul Securitatea Biologic (LSB), laborator care are drept scop testarea PMG.

Pe parcursul ultimilor cinci ani n cadrul LSB au fost realizate proiectele nr. 619 (2004)) i nr. 1156 (2006), finanate de Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale; COBASE, 001028-001 (2004), finanat de NSF (SUA), MTFP-04-08 (2005), MTFP-015-05 (2006), prin care au fost procurai reageni specifici pen-tru testarea PMG i efectuat training-ul privind tehnicile de obinere i testare a PMG; MERL-1300 (2007-2008) finanate de CRDF/MRDA (SUA), care au permis nzestrarea laboratorului cu echipament modern. Actualmente, laborato-rul servete drept baz de cercetare i de instruire a studenilor, masteranzilor,

doctoranzilor, contribuind la dezvoltarea unor deprinderi practice de lucru, la nsuirea diferitor metode analitice i tehnici de biologie molecular. Colecti-vul laboratorului realizeaz activiti de implementare i optimizare a diferitor metode, bazate pe PCR i ELISA de detecie a PMG, ce vor permite efectuarea unor analize mult mai ample activiti care au sugerat ideea scrierii acestui manual.

Lucrarea de fa reprezint un ndrumar practic privind aspecte strategice i metodologice de testare a PMG i include principalele noiuni, etape i tehnici referitoare la efectuarea testrii plantelor transgenice i la reglementarea poli-tico-legal a acestora. Fiind contieni de faptul c n literatura de specialitate exist mult mai multe tehnici i metode dect cele expuse n acest manual, iar dinamica progresiv a cercetrilor n domeniu implic o revizuire continu a acestora, am ncercat s v conducem pas cu pas spre paginile WEB respective, care sunt accesibile publicului larg.

Cartea este adresat tuturor celor care sunt interesai de problema securitii biologice i monitoringului PMG, dar poate fi cu succes utilizat i de studenii facultilor de biologie i agronomie, avnd astfel o menire dubl de a contri-bui la pregtirea cadrelor universitare i de a constitui un suport metodologic pentru cercettorii din acest domeniu.

Autorii

Capitolul

Metoda biolistic sau bombardarecu particule

esut vegetal

Microproiectilecu ADN

Macroproiectil

Plac de protecie

Microproiectile

Biolistic PDS-1000/He Schema procesului de transformare

Corp

Pompa de propulsare

Meanism de observare

Selecia i regenerarea transformanilor

Material-int Selecia i regenerarea

Creterea i dezvoltarea nrdcinarea

METODELE TRANSGENEZEI

1.1. Etape de obinere a OMG 1.2. Strategii de identificare, izolare i clonare

a genelor de interes 1.3. Transferul alogenelor la plante1.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor

modificate genetic 1.5. Gene de interes

CAPITOLUL1NOIUNI GENERALE PRIVIND TRANSFORMAREA GENETIC

Suportul informaional

8

1NOIUNI GENERALE PRIVIND TRANSFORMAREA GENETIC

1.1. Etape de obinere a OMG

1.2. Strategii de identificare, izolare i clonare a genelor de interes

1.3. Transferul genelor la plante

1.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor modificate genetic

1.5. Gene de interes

MeToDeLe TrANSGeNezeI

Metoda biolistic sau bombardarecu particule

esut vegetal

Microproiectilecu ADN

Macroproiectil

Plac de protecie

Microproiectile

Biolistic PDS-1000/He Schema procesului de transformare

Corp

Pompa de propulsare

Meanism de observare

Selecia i regenerarea transformanilor

Material-int Selecia i regenerarea

Creterea i dezvoltarea nrdcinarea

METODELE TRANSGENEZEI

1.1. Etape de obinere a OMG 1.2. Strategii de identificare, izolare i clonare

a genelor de interes 1.3. Transferul alogenelor la plante1.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor

modificate genetic 1.5. Gene de interes

CAPITOLUL1NOIUNI GENERALE PRIVIND TRANSFORMAREA GENETIC

Suportul informaional

8

8Capitolul 1. NoIUNI GeNerALe PrIVIND TrANSForMAreA GeNeTIC

Ingineria genetic a plantelor reprezint un instrument relativ nou, eficient n realizarea multiplelor valorificri de prim importan pentru ameliorarea standar-dului de via al omenirii. n acelai timp, introducerea n mediu a organismelor obinute prin tehnicile biotehnologiilor contemporane este un subiect discutabil i larg mediatizat, generat att de beneficiile considerabile pentru societate, ct i de efectele neprevzute, care pot fi evidente dup un timp oarecare.

Abilitatea de a ne orienta i a ne forma o opinie proprie vizavi de introducerea n agricultur i pe pia a PMG i a produselor derivate este determinat de un anu-mit nivel de informare i nelegere a acestor probleme, care este inevitabil fr o descriere a tehnologiilor i instrumentelor de baz utilizate n obinerea plantelor cu nsuiri noi prin transformare genetic.

1.1. etape de obinere a oMG

Transformarea genetic reprezint modificarea genomului unui organism prin tehnicile biotehnologiilor contemporane, care permit introducerea genelor noi, de in-teres, sau modificarea expresiei unei/ unor gene prezente deja n celul. Organismele astfel obinute, sunt denumite organisme modificate genetic (OMG) sau transgenice.

Evoluarea tehnico-experimental a ingineriei genetice, n special a metodelor de transfer al genelor peste barierele de sex i la distane taxonomice mari, a per-mis transgeneza unui numr impuntor de plante cu importan economic: cereale, leguminoase, specii pomicole sau forestiere etc. Obinerea autorizrii unei varie-ti modificate genetic (MG) n conformitate cu reglementrile de rigoare impune respectarea urmtoarelor cerine: stabilitate n expresia i motenirea transgenelor n generaiile succesive; segregare mendelian a fenotipului transgenic, reglarea or-gan-specific a expresiei alogenelor i exploatarea produsului su n scop agrono-mic, alimentar, medical, farmaceutic etc. n afara aplicaiilor practice, manipulrile genetice permit analiza structurii i funciei genelor, oferind posibiliti de a cunoa-te i a interveni n mecanismele de dezvoltare a plantelor.

Literatura de specialitate nsumeaz o serie de date referitoare la transgeneza culturilor agricole, relevnd faptul c elaborarea strategiei i selectarea metodei de transformare depind de interesele economice, de echipamentul accesibil i de anu-mite particulariti genetice ale speciei (Kaeppler i al., 1992; Van der Graaff i al., 1996; Sambrook i Russell, 2001).

Obinerea organismelor modificate genetic include cteva etape, care pot fi rezumate astfel:

I. Identificarea, izolarea i clonarea genelor de interes.II. Transferul genelor la plante. III. regenerarea, selecia i testarea plantelor MG.

9Aceste etape includ o serie de procese intermediare urmate de verificri care decurg ntr-o anumit succesiune (fig. 1.1.).

Figura 1.1. etapele transformrii genetice http://www.mun.ca/biology/scarr/Gr13-16b.htm

1,2 Identificarea i izolarea genei de interes, obinerea ADN-ului recombinat (integrarea

transgenei n vector);

3 Transferul genei himere n celula vegetal prin metode directe sau indirecte;

4 Selectarea celulelor modificate genetic;

5 Regenerarea plantelor din celulele transformate genetic;

6 Reproducerea sexuat/ asexuat a plantelor modificate genetic.


Strategia utilizat ntr-un proiect de identificare, izolare i clonare a secvenelor nucleotidice utilizate n obinerea ADN-ului recombinat apeleaz la o gam larg de metode optimizate n funcie de tipul celulei (procariote, eucariote), esutului, orga-nului, fazei de vegetaie, speciei. Cea mai simpl metod de izolare a fragmentelor ce conin gena de interes se bazeaz pe utilizarea unor enzime endonucleaze de restricie implicate n scindarea hidrolitic a legturilor fosfodiesterice din ADN. Acestea recunosc secvene specifice de 4, 6, 8 nucleotide cu structur de palindrom (secvene repetate invers), avnd simetrie rotaional de tip doi numite situsuri.i la nivelul acestora cliveaz ambele catene ale moleculei. n raport cu axul de simetrie, unele enzime taie ADN-ul asimetric genernd extremiti complementare sau coezi-

L RRspcRkan

nos

10

ve, altele taie ambele catene n centrul de simetrie al situsului de restricie, rezultnd fragmente cu capete drepte. Cnd enzimele taie asimetric la distane ntmpltoare, atunci se obin fragmente cu extremiti monocatenare cu secvene nespecifice:

Enzimele de restricie recunosc secvena de nucleotide specific, indiferent de originea ADN-ului. Prin aciunea mai multor restrictaze asupra unui genom, se re-alizeaz aa-numite hri de restricie, care indic plasarea succesiv a locusurilor de recunoatere a diferitor enzime. Astfel de hri permit analiza comparativ a unei i aceleiai regiuni ale ADN-urilor de diferit origine. Dintre restrictazele cel mai des utilizate n tehnicile ingineriei genetice, pot fi menionate: Hae III, Eco RV, Eco RI, TagI, NotI etc. (Sambrook i Russell, 2001).

Fragmentele de restricie obinute prin digestia enzimatic a ADN-ului au lun-gime variat n funcie de numrul situsurilor de restricie, i anume ele reprezint materialul iniial n izolarea, clonarea genelor i n obinerea constructului genetic utilizat n transformare (fig. 1.2.).

Figura 1.2. Diferite ci de izolare a fragmentelor de ADN utilizat n tehnologia ADN-ului recombinant

IZOLAREA FRAGMENTELOR DE ADN UTILIZAT N TEHNOLOGIA ADN-ULUI

RECOMBINANT

Sinteza enzimatic a ADN-ului complementar

ARNm

ADNc

PCR

Revers trancripie

Fragmente de ADNde interes

Sinteza chimic imultiplicarea

fragmentelor de ADN prin tehnologia PCR

Tag-polimerazadNTPADN

primeri

ADN

Denaturare

Aliniereaprimerilor

Elongare

Electroforeza

Izolarea fragmentelor de ADN prin digestie cu restrictaze

Fragmente de ADN de interes

Fragmente de ADN de interes

Figura 1.2. Diferite ci de izolare a fragmentelor de ADN utilizat n tehnologiaADN-lui recombinant

O alt metod de izolare i multiplicare a genelor inlude reacia de polimerizare n lan

(Polymerase Chain Reaction PCR), prin care are loc amplificarea in vitro a diferitor fragmente de

ADN, utiliznd secvene nucleotidice specifice numite primeri. Existena ADN polimerazelor,

purificate i termostabile (de la Thermus aquaticus Taq-polimeraza i de la Pyrococcus furiosus

12

Secvene de ADN tiate drept


Strategia utilizat ntr-un proiect de identificare, izolare i clonare a secvenelor nucleotidice

utilizate n obinerea ADN-ului recombinat apeleaz la o gam larg de metode optimizate n funcie

de tipul celulei (procariote, eucariote), esutului, organului, fazei de vegetaie, speciei. Cea mai

simpl metod de izolare a fragmentelor ce conin gena de interes se bazeaz pe utilizarea unor

enzime endonucleaze de restricie implicate n scindarea hidrolitic a legturilor fosfodiesterice

din ADN. Acestea recunosc secvene specifice de 4, 6, 8 nucleotide cu structur de palindrom

(secvene repetate invers), avnd simetrie rotaional de tip doi, numite situsuri i la nivelul acestora

cliveaz ambele catene ale moleculei. n raport cu axul de simetrie, unele enzime taie ADN-ul

asimetric genernd extremiti complementare sau coezive, altele taie ambele catene n centrul de

simetrie al situsului de restricie, rezultnd fragmente cu capete drepte. Cnd enzimele taie asimetric

la distane ntmpltoare, atunci se obin fragmente cu extremiti monocatenare cu secvene

nespecifice:

5'-GTT AAC-3'

3'-CAA TTG-5'

Secvene ADN tiate drept

5'-G GATCC-3'

3'-CCTAG G-5'

Secvene ADN tiate decalat

5'-GACGC(N5) -3'

3'-CTGCG(N10) -5'

Secvene ADN tiatedecalat la distane

diferite

Enzimele de restricie recunosc secvena de nucleotide specific indiferent de originea ADN -

lui. Prin aciunea mai multor restrictaze asupra unui genom se realizeaz aa-numite hri de

restricie care indic plasarea succesiv a locusurilor de recunoatere a diferitor enzime. Astfel de

hri permit analiza comparativ a unei i aceleiai regiuni ale ADN-urilor de diferit origine. Dintre

restrictazele cel mai des utilizate n tehnicile ingineriei genetice pot fi menionate: Hae III, Eco RV,

Eco RI, TagI, NotI etc (Sambrook i Russell, 2001).

Fragmentele de restricie obinute prin digestia enzimatic a ADN-ului au lungime variat n

funcie de numrul situsurilor de restricie, i anume ele reprezint materialul iniial n izolarea,

clonarea genelor i n obinerea constructului genetic utilizat n transformare (fig. 1.2.).

11

Secvene de ADN tiate decalat

Secvene de ADN tiate decalat la distane diferite

11

O alt metod de izolare i multiplicare a genelor include reacia de polimerizare n lan (Polymerase Chain Reaction PCR), prin care are loc amplificarea in.vitro a diferitor fragmente de ADN, utiliznd secvene nucleotidice specifice numite primeri. Existena ADN polimerazelor, purificate i termostabile (de la Thermus.aquaticus. Taq-polimera-za i de la Pyrococcus furiosus Pfu-polimeraza) i a oligonucleotidelor ADN sintetizate chimic (dNTP) face posibil clonarea unor secvene specifice de ADN in.vitro. Tehnica PCR permite amplificarea de miliarde de ori a unui fragment de ADN dintr-o anumit regiune a genomului doar n cteva ore, n comparaie cu tehnica de clonare standard, cu ajutorul bncilor de gene, pentru care sunt necesare mai multe zile (vezi cap. 6).

Procesul de izolare i ulterior clonare poate ncepe i prin extragerea ARNm din esuturi i organe n faza de dezvoltare a plantei, n care gena de interes este expresat, urmat de sinteza ADNc, prin transcripie invers realizat de revers-transcriptaza.

Fragmentele de ADN izolate prin diferite metode, pot fi ataate unor molecule de ADN capabile de autoreplicare vectori de clonare, astfel obinndu-se ADN recombinat. Moleculele de ADN recombinat sunt multiplicate prin introducerea vec-torilor de clonare n celule bacteriene, care se vor nmuli pe medii de cultur adecvate i vor forma colonii, fcnd posibil obinerea unei mari cantiti a genei de interes. Aceast colecie de fragmente de ADN constituie o bibliotec de gene (fig. 1.3.).

Figura 1.3. Prezentare schematic a clonrii fragmentelor de ADN de interes n bacterii

Situsuri de restricie a enzimei

ADN donorFragmente restrictate

Vector recombinant cu inserturile 1 i 2

Transformare

Replicare, amplificare i dividere celular

Clone ce conininsertul de ADN nr. 1

Clone celularece conin fragmentul nr. 2

Genom bacterian

12

n funcie de surs se pot construi 2 tipuri de biblioteci: genomice i ADNc. Astfel, se poate realiza i izolarea n form pur a unui anumit segment de ADN dintr-o populaie mare i heterogen de molecule.

Pentru obinerea moleculelor de ADN recombinat se recurge la: Utilizarea aceleiai enzime de restricie pentru tierea (izolarea) ADN-ului ge-

nomic i a vectorului de clonare. Capetele fragmentelor de ADN astfel obinute vor fi complementare i la amestecarea lor n prezena unei ADN-ligaze se va realiza legarea covalent a acestora obinndu-se molecule recombinate circulare (fig. 1.4.). Forma-rea unui plasmid recombinant circular capabil de transformare a bacteriei Escherichia.coli (E..coli) are loc printr-o reacie intermolecular ntre plasmida liniarizat i frag-mentele de ADN cu capete coezive complementare vectorului, rezultnd un hibrid molecular i o a doua reacie intramolecular, prin care capetele coezive ale hibridului liniar se leag formnd o molecul recombinat circular legat necovalent.

Figura 1.4. Formarea unei plasmide recombinate circulare atunci cnd se utilizeaz aceeai restrictaz pentru ADN-ul exogen i pentru vector

Ataarea la fragmentele de ADN cu capete drepte (obinute atunci cnd sunt utilizate anumite enzime de restricie, sau cnd este clonat ADNc) a unei secvene linker (de legtur) sau a unor secvene homopolimere poliA/poliC la nivelul unei singure catene. n acelai fel se modific i ADN-ul vectorului, ns prin ataarea unei secvene de nudeotide complementare poliT/poliG. Secvenele linker sunt secvene de sintez, mici, de 8-16 nucleotide, autocomplementare, care conin situsuri de recu-noatere pentru enzime de restricie necesare unei clonri ulterioare (fig. 1.5.).

Vectorii utilizai n tehnologia ADN-ului recombinat trebuie s corespund ur-mtoarelor cerine:

5 ' P

5 ' P

G

G

C T T A A

A A T T C

G

A A T T C

C T T A A G

EcoRI

vector insert

vector insert

reacie intermolecular

reacie intramolecular

3 ' O H

3 ' O H 5 ' P

5 ' P 5 ' O H

5 ' P3 ' O H

3 ' O H

3 ' O H5 ' P

capete 5` terminale

vector

insert

s fie izolat i purificat cu uurin; s poat fi introdus ntr-o celul-gazd; s posede o origine a replicrii (ori) i astfel s se poat multiplica n celula-gazd; s posede un marker genetic stabil, care s permit identificarea i izolarea celulelor care

conin vectori; s conin mai multe situsuri de restricie pentru o gam variat de enzime asociate ntr-

un polilinker (situsuri multiple pentru restrictaze) pentru inseria fragmentelor de ADN.

13

n calitate de vectori cel mai des se utilizeaz plasmidele bacteriei E..coli, de-rivai ai bacteriofagilor i M13, cosmide, cromozomi artificiali de drojdie etc. Varietatea de vectori este determinat de dimensiunea fragmentelor strine de ADN care pot fi inserate.

Plasmidele (uniti genetice extracromozomale) reprezint molecule de ADN dublu catenare, circulare, capabile de replicare independent, care se ntlnesc prac-tic la toate speciile de bacterii. Macromolecula de ADN are dimensiuni de 100-200 kb i constituie 1-3% din cantitatea total de material genetic bacterian (cromozom circular alctuit dintr-o molecul de ADN dublu catenar). Prezena lor nu este obli-gatorie, ele pot fi dobndite sau pierdute fr a afecta viabilitatea celulelor purt-toare. Plasmidele sunt dependente de celula-gazd, cu excepia autoreplicrii i a controlului numrului de copii per celul. Cu ct este mai mare plasmidul, cu att mai mic este numrul de copii per celul. Plasmidele posed o regiune notat ori, format din cteva sute de perechi de nucleotide, unde este iniiat replicarea i ali determinani genetici (secvene de inserie, gene de reglare, structurale etc.). Genele structurale atribuie caracteristici fenotipice noii celule-gazde: rezisten la antibio-tice, metale grele, UV, sintez de antibiotice, toxine, producerea de bacteriocine i enzime de restricie etc.

n natur, transferul plasmidelor ntre diferite celule-gazd are loc printr-un proces similar cu conjugarea bacteriilor. n laborator, plasmidele sunt transferate n

Figura 1.5. Clonarea prin adugarea unei secvene linker la ADN-ul de interes cu capete drepte (Sambrook i Russell, 2001)

C CG G C T T A A G G C

G A A T T C G

C CG G C T T A

A A T T C GG C C

G

A G C CG A A T T C

C T T A A GG A A T T C

C T T A A GG

GC

CG G G

C C CG

GC

GC

GC A A T T C

C T T A A GG A A T T C

CG

CGGG

GC

GC

G5 ' P 5 ' OH

5 ' P5 ' OH

5 ' P

3 ' OH

C

G

C G

CG T T A A 5 ' P

5 ' OH

Linkerul EcoRI

Digestia cu EcoRI

Capetele drepte ale ADN-int



Adugarea lincherilor la ADN-intutiliznd o concentraie mare de ADN-ligaz T4

Includerea ADN-int n plasmidulrestrictat cu ajutorul enzimei EcoRI

ADN-int

vector

14

bacterii printr-un proces artificial numit transformare care include incubarea plas-midelor cu bacterii competente (permeabilitate tranzitorie pentru ADN-ul exogen). Astfel, bacteria-gazd capt un nou caracter fenotipic, de exemplu, rezistena la un anumit antibiotic, particularitate important n selectarea bacteriilor transformate.

Pentru ca plasmida s fie utilizat n calitate de vector, ea trebuie s fie de di-mensiuni mici, replicarea s se afle sub un control redus din partea cromozomului bacterian i s conin situsuri unice pentru una sau mai multe enzime de restricie, aflate n regiuni neeseniale pentru replicare. Situsurile de inserie a ADN-ului pot fi n cadrul genelor care codific markeri. n acest caz, va avea loc inactivarea genei respective oferind o posibilitate de selecie. De obicei, se recurge la astfel de inserii n plasmidele care manifest rezisten la dou tipuri de antibiotice (fig.1.6.). Un exem-plu de acest fel l reprezint utilizarea plasmidei cu genele rezistenei la ampicilin i tetraciclin n scopul clonrii. Pentru nceput, se realizeaz clivarea ADN-plasmidial cu restrictazele Hind.III.i Bam.II n situsurile corespunztoare aflate la nivelul genei rezistenei la tetraciclin i izolarea fragmentului mare al ADN-ului plasmidic (rezul-tat al digestiei enzimatice) prin electroforez. Acesta, fiind incubat cu ADN exogen restricionat tot cu aceste enzime, n prezena unei ligaze se combin cu fragmentul ADN de interes datorit extremitilor coezive complementare vectorului.

Figura 1.6. Prezentare schematic a clonrii fragmentelor ntr-un situs de inserare la nivelul unei gene, care determin rezistena la tetraciclin n

plasmida-vector ( i al., 1984)

Notaii: Amprrezisten la ampicilin; Tetr rezisten la tetraciclin; HindIII i BamII enzime de restricie, respectiv fiind notate i fragmentele clivate.

Ampr Amp r

Amp HH

H B B H

H

B

B

Br

Ampr

Ampr Ampr

Hind III Hind III

Bom HI + Hind III Bom HI + Hind III

Bom HI + Hind III

Bom HI

Tet

Ter r

r

15

Recombinantul circular obinut este utilizat n transformarea E. coli, transfor-mnd-o ntr-o su bacterian rezistent la ampicilin. Deoarece capetele mono-catenare, numite conform enzimelor care le cliveaz, nu sunt complementare unul altuia, fragmentul mare care reprezint ADN-ul vectorului nu se poate circulariza, manifestnd astfel o capacitate de transformare foarte joas. De aceea, selecia clo-nelor pe baza rezistenei la ampicilin va arta c majoritatea celulelor bacteriene conin plasmida recombinat. n funcie de fragmentul exogen i localizarea situsu-rilor se pot obine combinaii variate.

Pentru a majora numrul de situsuri de inserie, n plasmide se introduc anumi-te segmente de ADN, care conin mai multe situsuri aranjate succesiv pentru o gam larg de restrictaze (fig. 1.7.).

Figura 1.7. Schema unei plasmide care conine polilinker, plink322, derivat de la plasmidul pBr322 ( i al., 1984)

Ampr marker selectiv; situsuri unice: ClaI, HindIII, XbaI, Bg III, BamHI.)

Pe baza plasmidelor naturale care se ntlnesc la bacterii se obin plasmide ar-tificiale, care se utilizeaz n clonarea genelor, n formarea bibliotecilor genomice i n transformarea genetic. Cel mai utilizat vector plasmidial derivat de la plasmide naturale este pBR322 plasmid cu control slab al replicrii care conine genele rezistenei la ampicilin i tetraciclin i cteva situsuri de restricie. O alt plasmi-d din acest grup este pBR325 (codific rezistena la cloramfenicol, ampicilin i tetraciclin). De la aceast plasmid au fost derivate alte plasmide cu caracteristici mbuntite. De exemplu, pAT153, care a fost obinut n urma deleiei regiunii implicate n controlul numrului de copii/celul. Aceasta se replic formnd de 3

EcoRI CloI Hind III XboI P

siI Bom

HI co

RI

Ava I

Bal I

2.0

1.0

3.0

4.0

GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTCTAGAGATCTTCCATACCTACC

AGTTCTCCGCCTGCAGCAATGGCAACGTTGCCCGGATCCGGTCGCGCGAATTC

EcoRI

Hinc II/Sol I

Psi I

Am

pr

Ori

Pvu I

Hind II

Pst I Bam HI Eco RI

Cla I Hind III

Xba IBg III

BamHI

16

ori mai multe copii per celul n comparaie cu plasmida de la care a derivat. Ali vectori derivai artificial de la plasmide naturale utilizai n tehnologia ADN-ului recombinat sunt cele din grupa pHV, pUC, pACYC etc. (Vlaic, 1997; Moldoveanu i al., 2000).

Vectorii de clonare derivai din plasmidele bacteriene nu tolereaz secvene de ADN mai mari de 6-8 kb, deoarece viteza lor de multiplicare i eficiena lor de transformare scade pe msur ce dimensiunile inseriilor cresc. Pentru clonarea fragmentelor de ADN mai mari de 10 kb au fost construii vectori derivai din fagul .

Bacteriofagul este un fag lizogen cu genomul sub forma unei molecule de ADN dublu catenar, de aproximativ 47500 pb i include cel puin 30 gene. nain-te de integrare n cromozomul bacterian (E..coli), genomul fagic se circularizeaz prin mperecherea bazelor de la nivelul extremitilor monocatenare complemen-tare, numite extremiti coezive, sau situsuri cos (12 nucleotide). Moleculele de ADN circulare se integreaz n situsuri specifice n cromozomul bacterian printr-un crossingover, rezultnd un profag liniar, inert genetic, pn cnd, n anumite condi-ii, se separ i iniiaz ciclul litic. Sutele de copii ADN fagic nou rezultat n urma replicrii formeaz lanuri (concatameri) prin intermediul situsurilor cos. Enzimele de asamblare taie acest concatamer, deoarece recunosc cele dou situsuri cos, aflate la o distan de aproximativ 45 kb unul de altul, n uniti care se asambleaz n fagi. Astfel, pentru maturarea fagului, ADN-ul cromozomal trebuie s fie de aproximativ 45 kb i s posede situsurile cos.(Raicu, 1997).

Construcia vectorilor derivai de la fagul s-a bazat pe o serie de particulariti: regiunea central nu este necesar pentru replicare, ceea ce a fcut posibil

eliminarea i nlocuirea acesteia cu fragmentul de ADN care trebuie clonat; prezena unor situsuri de restricie pentru o serie de restrictaze importante n

clonare. Astfel, de la fagul de tip slbatic au fost construite mai multe tipuri de vectori:

Utilizarea vectorilor derivai de la fagul prezint avantajul ncorporrii unui seg-ment mare de ADN strin, iar infecia bacteriilor i selecia clonelor recombinate sunt uor de realizat.

de inserie ( gt i ZAP), care posed un singur situs de restricie la nivelul cruia se taie i se insereaz ADN-ul strin, i permit inserarea fragmentelor de 6-7 kb;

de nlocuire, care posed dou situsuri de restricie, ce flancheaz fragmen-tul central, care este nlocuit cu ADN strin, i permit inserarea fragmentelor de 9-22 kb. Vectorii din noua generaie posed situsuri de clonare multiple, care flancheaz fragmentul central ce poate fi nlocuit: EMBL, DASH, Charon 34, 35 etc. (fig. 1.8.).

17

Figura 1.8. Prezentare schematic a clonrii genelor de interes n vectorul fagic EMBL3A cu secvene polilinker

(Sambrook i Russell, 2001)

Pentru clonarea unor fragmente de ADN ale cror dimensiuni variaz ntre 32 i 47 kb au fost construii vectori numii cosmide hibrizi derivai din fagul (si-tusurile cos) i plasmide (originea replicrii, o gen de rezisten la un antibiotic i situs unic pentru o enzim de restricie). Pentru clonare, ADN-ul genomic este dige-rat parial cu o enzim de restricie, care genereaz fragmente cu extremiti coezive complementare vectorului (liniarizat cu aceeai enzim de restricie). Fragmentele de ADN, lungi de 32-47 kb, sunt izolate i ataate la vector. Rezult concatameri, care conin fragmente de ADN genomic i ADN aparinnd vectorului, n tandem. Un extract de fag, care conine -terminaza determin tierea acestor fragmente re-combinate de ADN ce pot fi asamblate n particule virale i introduse prin infecie n E..coli, unde sunt replicate n bacterie ca plasmide rezistente la antibiotice.

Captul stng

Captul stng

Captul stng

Captul stng

Captul drept

ADN genomic

Secvene parial digerate cu Sau3AI

Fragmente de restricie de diferite dimensiuni

In vitro mpachetarea ADN-ului recombinantn particula viral

Capete coezive Sau3AI, compatibile cu capetele coezive BamH1

Captul drept

Captul drept

Captul drept

Digestie cu BamH1 i EcoRI

Sal I

Sal I

Bam

HI

Bam

HI

Eco R

I

Eco RI

Captul coezivBam HI

insertde 15-20 Kb

Legarea fragmentelor cu ajutorul ligazei T4

15-20 Kb insert

Polilinker

Precipitarea fragmentelor depoliliker prin centrifugare

difereniat

Polilinker

ADN intercalatntre situsurile

de restricie

Eco R

I

Eco RI

18

Cosmidele sunt primii vectori, care au fost utilizai n analiza genomurilor com-plexe. Ali vectori cu capacitate nalt utilizai n clonare sunt: cromozomi artificiali de drojdie sau YAC (Yeast Artificial Chromosome), care permit inserarea fragmen-telor de ADN de 250-400 kb, cromozomi artificiali bacterieni BAC (Bacterial Artificial Chromosome), care pot insera segmente de nucleotide de 120-300 kb.

Astfel, fragmentele de ADN de interes izolate prin diverse metode i clonate n bacterii sau cell free reprezint materialul genetic, care poate fi utilizat n construcia unor gene himere funcionale ce urmeaz a fi introduse n plante prin transformare ge-netic. Aceste gene sunt secvene hibride alctuite din promotorul unei gene, regiunea codificatoare a unei alte gene i secvena de terminare de la o a treia gen.

Cunoaterea exact a secvenei de nucleotide, a principalelor pri ale genei: promotorul (5), cu rol de reglare n transcripie i expresie (activator, represor, sec-vene implicate n expresia esut-specific sau inductibil); secvena codificatoare cu codonul ATG, pentru iniierea translaiei; regiunea terminal (3), n care se afl semnalele ce marcheaz sfritul translaiei, transcripiei i poliadenilrii, face posibil separarea n componente distincte cu recombinarea ulterioar a acestora n scopul obinerii genelor himere de interes. De exemplu, dac o gen cunoscut este expresat la un nivel foarte ridicat (se afl sub controlul unui promotor puternic, care permite formarea frecvent a complexului de iniiere a transcripiei) n orga-nismul de origine, promotorul poate fi ataat la orice alt gen pentru a-i asigura acesteia o rat de transcripie nalt.

Secvena codificatoare este aleas n funcie de scopul cercetrii. Pentru nceput, ea este identificat, izolat i secveniat. Exist gene ai cror produi ARNm sau proteine sunt cunoscui i foarte multe gene despre care nu se cunosc dect modul de transmitere i fenotipul. Pentru ambele categorii, ntr-o anumit etap, se utilizeaz o variant a tehnicii de hibridare in.situ hibridarea coloniilor. Procedeul permite detectarea prezenei oricrei gene pentru care exist o sond de ADN sau ARN marcat radioactiv sau chimic. Coloniile bacteriene sunt transferate de pe mediul solid pe filtru de nitroceluloz printr-o uoar ap-sare pe suprafaa culturii. O parte din colonii rmne pe mediu i constituie placa

de referin. Prile care ader, numite replici, vor fi, dup denaturarea ADN-ului, incubate cu sonda. Dup nltura-rea surplusului de sond, locul de pe replic n care sonda s-a ataat pe baz de complementaritate va fi identificat prin autoradiografie (fig. 1.9.).

Modul n care se obine sonda un segment de ADN sau ARN marcat, uti-lizat pentru a realiza selecia n banc a coloniilor, care conin secvene omoloage depinde de informaiile disponibile re-feritoare la gena care trebuie s fie izolat (Raicu, 1997).

Figura 1.9. Izolarea genelor prin tehnica hibridrii in situ

Membrana Proba radioactiv

Coloniile selectate Hibridizare

Expoziia sub razele X

19

n multe cazuri, proteina de interes este identificat, purificat i secveniat (cel puin 30 aminoacizi). Pe baza codului genetic, utilizndu-se anumite soft-uri de translaie, se deduce secvena nucleotidelor. Se sintetizeaz artificial oligonu-cleotide, marcate radioactiv sau chimic, cu care se sondeaz bibliotecile genomi-ce transferate (replicile). Pentru confirmarea faptului c celulele care urmeaz a fi transformate vor sintetiza proteina codificat de gena clonat se apeleaz la vectori de expresie n care se insereaz ADNc, adiacent unui promotor pentru a asigura sin-teza proteinei date n cantitate mare n bacterii. Identificarea n bncile de expresie se face cu anticorpi obinui pentru proteina respectiv. Poziia anticorpului legat de protein pe filtru este evideniat dup incubarea cu un al doilea anticorp marcat. Proteina sintetizat este astfel din nou caracterizat, confirmndu-se faptul c a fost clonat gena de interes.

Pentru foarte multe gene, proteina codificat nu este cunoscut, sau nu poate fi purificat n cantiti suficiente pentru a determina secvena aminoacizilor ori pre-pararea anticorpilor. n acest caz, pentru elucidarea funciei unei gene se poate uti-liza strategia ARN antisens. Construciile antisens se realizeaz prin clonarea unui ADNc provenit de la gena de interes, ataat unui promotor foarte puternic, ampla-sat ntr-o orientare care face posibil transcrierea ARN-ului de pe catena opus (an-tisens) celei de pe care are loc transcripia ARNm natural. Mecanismul interaciunii ARNm-endogen cu ARN antisens codificat de transgen nu este bine cunoscut. Se consider c n celul s-ar forma un duplex ntre cele dou tipuri de ARN, care este rapid degradat i, ca urmare, se blocheaz sau se reduce sinteza proteinei respective. Prin strategia antisens se creeaz mutaii specifice (fig. 1.10.).

Acest mecanism de represie, descoperit pentru prima dat la bacterii, exist i la animale. ARN antisens sunt definii ca transcripi de mici dimensiuni, difuzibili, fr capacitate de codificare, care se ataeaz prin mperecherea bazelor de o regiune com-

Secvena de ADN a genei native

Transcripie

ARNm

ARN duplex

Translaie

ARNm

ARNm naitiv

ARN antisens

Proteina (enzima)Degradarea ARN-uluide interferen (ARNi)

Secvena de ADN a genei antisens

5

5

A T TG GC

3

3

3 5

A A G TC C

A A T GC C3 5

5 3 A G GT TC

5 3 A G GU UC

5

5

3

3

A G GU UC

A A GUC C

A A G UC C

Figura 1. 10. Inhibarea expresiei unor gene de interes prin strategia antisens

20

plementar specific a unui ARN-int, actionnd ca un represor al funciei normale i ca un inhibitor de nalt specificitate al expresiei genei. La plante ns nu a fost nc demonstrat existena unui asemenea mecanism natural de reglare (Raicu, 1997).

Plantele transgenice obinute cu construcia antisens au fost folosite pentru a identifica funciile mai multor gene. n transgenez se recurge foarte des la aceast strategie pentru a modula expresia unor gene de interes agricol. Un exemplu de acest fel l reprezint modificarea expresiei genelor implicate n ntrzierea coacerii fructului de tomate apelndu-se la patru modaliti:

inhibarea activitii poligalacturonazei (PG); inhibarea activitii acid-aminociclopropan-1-carboxilic (ACC) sintazei; inhibarea activitii ACC oxidazei; intensificarea activitii ACC dezaminazei.

Plantele de tomate transformate cu gene antisens pentru poligalacturonaza enzima, care determin degradarea peretelui celular n fructele coapte au produs tomate cu durat mai ndelungat de pstrare. n plus, aceleai fructe au prezentat i caracteristici importante pentru industrializare, i rezisten la o serie de patogeni care atac dup recoltare.

Pectinesteraza (PE), o alt enzim care metabolizeaz peretele celular, i po-ligalacturonaza nu sunt factori majori asociai cu nmuierea fructelor. ns fructele plantelor care conin PE antisens prezint o viscozitate sporit a sucului, care ameli-oreaz extractul i crete valoarea pentru prelucrarea sub form de paste i sosuri.

Biosinteza etilenei n plante implic conversia S-adenosil metioninei n acid-aminociclopropan-1-carboxilic (ACC), catalizat de ACC-sintetaz i transforma-rea ACC n etilen de ctre ACC-oxidaz. Fructele care conin ACC-oxidaz anti-sens au un fenotip al coacerii modificat. Acumularea licopenului, cu rol n nroirea fructului copt, a fost redus. De asemenea, au fost reduse i fenomenele de zbrcire asociate cu supracoacerea. Unele dintre aceste modificri fenotipice au valori co-merciale determinate de posibiliti de transportare la distane mari.

Strategia de design a constructului genetic ce urmeaz a fi transferat la plante prin transformare genetic este elaborat n funcie de interesele economice. Pentru genele de importan agronomic se utilizeaz frecvent ADNc. n vederea obinerii unui nivel de expresie suficient de nalt, n unele situaii se impune modificarea sec-venei nucleotidelor genei fr modificarea secvenei de aminoacizi. Deoarece codul genetic este universal, secvenele codificatoare de origine procariot sau de origine animal pot fi uor exprimate n plante.

Modul de expresie al genelor este reglat de promotor, care poate fi constitutiv (tab. 1.1.), asigurnd exprimarea genei n toate esuturile plantei, tisular-specific, ceea ce determin expresia ntr-un anumit tip de esut/organ, sau expresia inductibi-l prin rnire, stres termic ori atacul unor patogeni (Raicu, 1997).

21

Tabelul 1.1.Gene cu expresie tisular-specific i inductibile

Gena Planta Gazda transgenic

Factorul inductibil i localizare

inductorul organ/esut

RbcSRbcSRbcSCabCabST-LS1PatatinaLeghemoglobinap-FazeolinaLectinaGlutenineHordeinaZeina

MazreMazreMazreMazreGruCartofCartofSoiaFasoleSoiaGruOrzPorumb

Tutun TutunPetuniaTutunTutunTutunCartofLotusTutunTutunTutun TutunTutun

Lumin

Lumin

VerdeVerdeVerde

Verde

TuberculNodul

SemineSemine Semine SemineSemine

Promotorii genelor himere utilizate n transgenez la plante pot proveni chiar de la speciile aceluiai grup, de exemplu, pentru monocotiledonate: de la alcool dehidrogenaza din porumb Adh-1, sau de la actina din orez Act-1, care posed un intron n secvena-lider, sau de la specii i organisme diferite, aa cum este promo-torul 35S de la virusul fitopatogen Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) sau deriva-ii acestuia (Wilminkand, 1993)..Majoritatea plantelor transgenice conin o copie sau mai multe ale promotorului 35S CaMV (P-35S), graie faptului c este un promotor puternic i constitutiv (cu expresie n toate esuturile). n acelai timp, s-a constatat c activitatea acestui promotor nu este tot att de nalt i la plantele monocotiledonate, ceea ce a i determinat utilizarea promotorilor de la speciile aceleiai grupe. De aceea, n transformarea genetic a plantelor sunt utilizai mai muli promotori n conformitate cu planta-recipient i cu scopul de cercetare sau agroindustrial (tab. 1.2.).

Conform unui raport de analiz a PMG aprobate (Genetically Modified [GM] Crops: molecular and regulatory details, 2003) prezentat de Centrul pentru biose-curitate i durabilitate din Elveia (Centre for biosafety and sustainability BATS) secvenele promotorului 35S CaMV (fig. 1.11.) sunt prezente n majoritatea plante-lor transgenice (http://www.bats.ch/bats/en/index.php)..

22

Tabelul 1.2.

exemple de promotori utilizai n obinerea PMG

Promotorul Abrevierea organismul donorGazda

transgenic

Promotor derivat de la Cauliflower Mosaic.Virus P-35s

Cauliflower Mosaic.Virus.

porumb, bumbac, rapi, papaia, cartof, tomate

Promotor ALS1 prezent n tutun P-AlS Nicotiana tabacum bumbac

Promotor derivat de la gena kinazei calciu-dependent (CDPK) expresat exclusiv n polen

P-PCDK Zea.mays. cereale

Promotorul genei cu expresie inductibil determinat de etilen P-e8

Lycoperiscon.esculentum. tomate

Promotor derivat de la Figwort.Mosaic.Virus (FMV) P-FMV

Figworth.Mosaic.Virus.

tomate, bumbac, rapi

Promotor RuBisCo SSU (ribulozo-1,5-bisfosfat carboxilaza, subunitatea mic 1A) de la Helianthus.annuus

P-HelSsu Helianthus.annuus. tutun

Regiunea promotor a genei mannopin sintaza a pTiA6 P-mas

Agrobacterium tumefaciens tomate

Regiunea promotor a genei nopalin sintaza P-nos


Promotorul fosfoenolpiruvat carboxilazei, (PEPC) specific esuturilor verzi P-PePC Zea.mays. cereale

Promotorul ribulozei-1,5-bisfosfat carboxilaza, subunitatea mic 1A P-SsuAra

Arabidopsis thaliana.

cicoare, rapi, cartof

Regiunea promotor a genei anter-specific TA29 P-TA29

Nicotiana tabacum.

cicoare, cereale, rapi

Figura 1.11. rezultatele analizei a 66 culturi transgenice aprobate privind promotorii inserai http://www.bats.ch/bats/en/index.php

Not: Numrul de varieti MG exprimat n % care conin inserii genetice cu promotorii respectivi; grupa P-35s include i derivaii P-35s, P-E35s i dP-35s.

41%

16%

8%

6%

7%

4%

18% P-35S

de origine bacterian

P-nos

P-FMV

P-Ssu

P-TA29

ali promotori

23

O alt secven de reglare n sinteza i expresia genelor terminatorul re-prezint o secven de nucleotide inversate, plasat la sfritul unitii transcripio-nale. Cea mai rspndit secven-terminator este NOS (T-nos), izolat de la gena nopalinsintasa a Agrobacterium tumefaciens, fiind constatat n 37 culturi MG, http://www.bats.ch/bats/en/index.php (fig.1.12.). Unele secvene-terminator utiliza-te n transgenez sunt prezentate n tabelul 1.3.

Tabelul 1.3.Secvene-terminator utilizate n transgenez

Secvena-terminator Abrevierea organismul donororaganismul

receptorRegiunea 3 non-translabil a genei ribulozo-1,5-bisfosfat carboxilaza, subunitatea mic E9

T-E9 Pisum sativum bumbac, rapi, cartof, tomate

Regiunea de poliadenilare a genei mannopin sintaza pTiA6 T-mas


Regiunea 3 non-translabil a geneinopalin sintaza T-nos

Agrobacterium tumefaciens

cicoare, cereale, bumbac, rapi,

cartof, soia, tutun

Secvena-terminator a genei octopin sintaza T-ocs


cicoare, rapi, tomate

Regiunea 3 non-translabil a geneiribulozo-1,5-bisfosfat carboxilaza, subunitatea mic

T-SSU Glycine.max. soia

Regiunea de poliadenilare a genei pTiA6 T-tml


bumbac, rapi, tomate

Regiunea 3 a genei transcriptului ADN 7 T-Tr7


cicoare, cereale, rapi

Figura 1.12. Secvenele terminator utilizate cel mai des n transgenez http://www.bats.ch/bats/en/index.php

Not: Numrul de varieti exprimat n % care conin inseri genetici cu terminatorii respectivi.

32%

19%14%

10%

4%

3%

18%T-nos

de origine bacterian

T-35s

T-E9

T-ocs

T-tml

ali terminatori

24

Alte secvene care pot fi prezente n inserii genetice sunt secvenele de desti-naie ce provin de la gene codificatoare de proteine, cu localizare celular bine cu-noscut. De exemplu, secvena peptidei-tranzit utilizat pentru destinaia cloroplast provine de la gena subunitii mici a enzimei Rubisco.

Astfel, inseriile cu ADN recombinat efectuate n scop de transformare gene-tic a plantelor includ trei componente de baz: promotorul, gena de interes i terminatorul. n linii generale, combinaia promotor-gen-terminator reprezint o caset a genei de interes (fig. 1.13. a). Constructul genetic poate conine dou sau mai multe casete ale alogenei (fig. 1.13. b) i suplimentar alte elemente cu rol de control i facilitare a activitii genelor strine.

Figura 1.13. Schema insertului genetic (construct genetic)

a) Un insert cu componentele de baz necesare integrrii i expresiei alogenei (P: promotor, T: terminator).

b) Insert genetic cu dou casete ale genei.

Cunoaterea elementelor insertului genetic este esenial n detecia, identifica-rea i cuantificarea materialului transformat genetic. Dosarele de notificare a PMG naintate pentru autorizare n scopul introducerii pe pia includ astfel de informaii. De exemplu, linia de porumb GA21, Roundup Ready (toleran la glifosat ingre-dient activ al erbicidului Roundup Ready), a fost obinut n urma transferului unui fragment de restricie NotI cu lungimea de 3,4 kb de la plasmida pDPG434 prin metoda biolistic (fig. 1.14.).

Vectorul plasmidial pDPG434 conine caseta cu gena EPSPS modificat prin mutagenez de la porumb. Produsul de expresie a acestei gene reprezint o enzim insensibil la glifosat, conferind astfel toleran fa de acest compus. Alte secvene coninute n vector sunt gena-marker selectabil bla. (codific rezistena la ampi-cilin n bacterii i permite selecia bacteriilor care conin plasmide), o origine a replicrii (ori) necesar pentru replicarea plasmidei n E..coli.i o secven parial lacZ (fig. l.14.).

GenaP T

P1 Gena 1 T1 P2 Gena 2 T2

Caset genetic

Caseta 1 Caseta 2

a

b

25

Figura 1.14. Harta plasmidului PDPG434 (Compania Monsanto, dosar de notificare, 1998)

Fragmentul de restricie NotI utilizat pentru transformarea liniei de porumb GA21 Roundup Ready conine o caset de expresie cu gena EPSPS modificat care include: promotorul r-act - (1,37 kb) i intronul de la gena actinei de la orez; gena - 5-enolpiruvil i kimat-3-fosfat sintaza de la Zea.mays - mEPSPS (1,34 kb) fuzionat cu o secven N- terminal a peptidei tranzit n cloroplast derivat de la genele RuBisCo de la Helianthus.annuus.i Zea.mays pentru a direciona proteina mEPSPS spre cloroplast, unde are loc sinteza acizilor aromatici; secvena N-terminal a peptidei tranzit n cloroplast (CTP) derivat de la secvenele CTP de la Helianthus.annuus i genele RuBisCo (sssu CTP and mssu CTP) de la Zea.mays OTP (0,37 kb) si NOS 3 secvena de terminare provenit de la plasmida Ti din Agrobacterium (fig. 1.14. i 1.15.).

NosIacZ

bla

ColE1

r-act

pDPG4346128 bp

OTPmssu(CTP)

mEPSP

Notl 6122AfIII 5977

AfIII 5712

BgIII 4557Pstl 4545

Sacl 4138EcoRI 4128

Pstl 4128BgIII 3990

BgIII 3848Sacl 3622

EcoRI 3114

HindIII 5862Xbal 5857

sssu(CTP)

SacI 2679 NotI 2692 Xbal 2699 Sphl 2729 Pstl 2735

Fragment de ADN-T (NotI fragment) utilizat n transformarea genetic

26

Figura 1.15. Harta liniar a fragmentului de restricie NotI a constructului pDPG434

(Compania Monsanto, US-Patent-N: 6,040,497) http://www.bats.ch/bats/en/index.php

Informaii privind secvenele de reglare utilizate n obinerea PMG, originea acestora i culturile care le conin sunt accesibile n bncile internaionale de date privind OMG (AGBIOS, COMPASS etc.).

1.3. Transferul genelor la plante

Transferul genelor n celulele plantelor se realizeaz printr-o gam variat de metode care dup modul de realizare se divid n dou grupe: indirecte, mediate de bacterii i virusuri, i directe, care fac apel la o serie de procedee fizice i chimice.

Tehnicile de transfer mediate de Agrobacterium i cele de transfer direct, n-cepnd de la primele succese ale aplicrii acestora nregistrate n anii 1983 la unele specii de tutun, au evoluat n paralel, ns pn n prezent, cel mai larg utilizat ra-mne a fi sistemul biologic determinat de simplitatea n realizare i de eficien la multe specii de plante. n condiii naturale, Agrobacterium infecteaz doar speciile erbacee dicotiledonate, ceea ce limiteaz utilizarea acestor bacterii n transforma-rea genetic a speciilor monocotiledonate. Totui, conform unor cercetri, limitrile impuse de gazdele naturale sunt esenial diminuate prin optimizarea condiiilor de cultur a materialului surs i procedurii de cocultivare a esutului-int cu aceste microorganisme (Ishida i al., 1996).

Transformarea mediat de Agrobacterium. Bacteriile din acest gen, Agro-bacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes (familia Rhizobiaceae) sunt.lo-calizate n sol i.infecteaz plantele dicotiledonate susceptibile la nivelul leziunilor de divers natur, determinnd apariia unor tumori la nivelul coletului i, respectiv, a unor rdcini firoase.

Agrobacteriile conin n copii unice megaplasmidele Ti (tumor inducing) i Ri (root inducing) cu dimensiuni mai mari de 200 kb. O regiune din ADN-ul plasmidic ADN-T (transferred) este transferat i integrat stabil n genomul plantei. Anu-me aceast regiune conine un set de gene cu caracter tumoral. Aciunea oncogen

P-ract

Promotor:

Gena:

Terminator:

OTP mEPSPS T-nos

27

este cauzat de introducerea n celula-gazd a informaiei necesare pentru sinteza constitutiv a auxinelor i citochininelor prin ci metabolice complet diferite de cele folosite de plant (Van Haaren i al., 1988; Van der Graaff, i al., 1996). Astfel, sinteza n exces a acestor doi hormoni determin diviziunea necontrolat a celulelor determinnd formarea tumorilor. La inducerea tumorilor particip:

regiunea ADN-T, care include genele responsabile de sinteza unor amino-acizi mai puin obinuii, numii opine i folosii ca surs de azot i carbon de ctre bacterie i genele care codific enzimele implicate n sinteza auxinelor i citochi-ninelor. Aceast regiune este flancat de dou fragmente a cte 25 pb n lungime, reprezentnd repetri directe, care acioneaz ca elemente semnal cis n transferul ADN-T.

regiunea vir (virulen) cu dimensiunea de 30 kb, plasat n afara regiunii ADN-T, conine cel puin 22 gene, organizate n 6 operoane: vir A, vir B, vir D i.vir.G eseniale pentru excizia i transferul ADN-T i vir C i.E.pentru sporirea efi-cienei de transfer. Transferul ADN-T este mediat de aciunea cooperant a genelor din aceast regiune i a unor gene de pe cromozomul bacterian responsabile pentru ataarea celulelor bacteriene la plante.

Deoarece genele transferate n plant se afl sub controlul unui promotor cu secvene de reglare de tip eucariot, se expreseaz n celul, modificndu-i fenotipul. Analiza transferului mediat de aceste bacterii a pus n eviden trei factori eseniali, care au permis utilizarea n practic a acestui mijloc de transformare prin construirea unor factori i sisteme bacteriene:

Elaborarea unui sistem Agrobacterium ca vector pentru gene a impus eli-minarea oncogenelor din ADN-T pentru a obine celule transformate capabile s regenereze plante normale i nu proliferarea lor. Aceast eliminare face ns im-posibil selecia celulelor transformate capabile s creasc n absena hormonilor. n scopul seleciei genelor transformate au fost construite gene himere cu secvene ce confer rezisten la un antibiotic (de ex., kanamicin) ataat unui promotor adecvat (de ex., promotorul genei nopalin-sintazei [nos] sau promotorul genei VI de la virusul mozaicului conopidei (Wang, 1984, 1990; Waters i Guiney, 1993).

Au fost construii numeroi vectori nononcogeni cu diferite caracteristici, cla-sificai n dou categorii: cis i trans. Vectorii cis conin att extremitile n lungime de 25 de pb, ct i regiunea vir, pe acelai replicon. Vectorii trans sunt formai din doi repliconi, unul purtnd extremitile i ADN-ul exogen ce va fi transferat n

Apariia tumorilor este rezultatul transformrii genetice a celulelor vegetale prin inte-grarea n genom a ADN-T i al expresiei genelor din aceast regiune.

Genele ADN-T sunt transcrise numai n celulele vegetale i nu au nici un rol n pro-cesul de transfer.

ADN-ul exogen inserat ntre cele dou capete ale ADN-T poate fi transferat n celu-lele vegetale.

28

celula vegetal, iar cellalt (plasmida ajuttoare) posednd funcia vir, care este pla-sat n poziia trans.(sistem vector binar). Avantajul vectorilor trans const n faptul c sunt mai mici dect plasmidele Ti i Ri, astfel fiind mai adecvai unei manipulri genetice. n cazul ambelor tipuri de vectori, genele strine sunt inserate n ADN-T, clonate mai nti n E..coli i apoi transferate n Agrobacterium prin conjugare ori electroporare.

Plasmidul pCambia 1300 (fig. 1.16.) prezint un exemplu de vector utilizat n transformarea genetic ce include promotorul 35S, secvenele marginale de 25 kb derivate de la ADN-T, situsuri unice de restricie i grupate n polilinkeri, gena raportoare Lac-Z-alfa, gena marker NPT pentru selecionarea celulelor i plantelor transformate.

Figura 1.16. Schema plasmidului pCambia 1300

Metodologia folosit n mod curent pentru agroinfecie const n cocultiva-rea bacteriei cu fragmente de esut vegetal (frunze, rdcini, hipocotili, peioluri, cotiledoane etc.) i cultivarea in.vitro.pe medii de inducere a regenerrii, adiionate cu antibiotic pentru eliminarea bacteriei.

La plante, vectorii virali sunt utilizai mai puin dect la bacterii i mamifere. n special, virusurile sunt utilizate ca vector pentru transferul genelor, n vederea elucidrii unor probleme teoretice, expresia genelor fr variaii determinate de lo-calizarea pe cromozom: caracterizarea expresiei genelor n esuturi difereniate fr s fie necesar cultivarea in.vitro.(Raicu, 1997).

Capacitatea virusurilor de a se rspndi n ntreaga plant asigur niveluri foar-te ridicate de expresie a transgenelor. Aceast nsuire a vectorilor virali este exploa-

Sac II (6317)

Ecg 0109I (5904) PpuMI (5905)

Bsp HI 5863

Blp I (5713)

SspII (5367)

Ppu 10I (5325) pBR322 ori

pBR322 bom

Bsi 11071

Bsg I 3795

Ecg NI 3705

pSV1

Bsp DI, Cla 1 (3742)

Nhe I (3392)

Bsi WI

Psp14061(2317)

pVS1 sta

Bsg BI (1716)

Sph I (389)

Captul T drept Lac Z alfa

Site-ul unde a fost introdus gena Basta

Aat II (7875)

Bsi XI (8716)Promotorul 35 S CaMV

Rst II (7487)

Gena marker NPT

Captul T stng

NOS terminator pCAMBIA 1300 8958 pb

Kas I (4177) Nat I (4178) Ehe I (4179)

Fig. 1.16. Prezentarea schematic a plasmidului pCAMBIA 1300

29

tat pentru a produce proteine virale n plante. Au fost construii vectori virali por-nindu-se de la virusul mozaicului tutunului, virusul X al cartofului i virusul piticirii tomatelor. Vectorii virali artificiali nu produc simptomele bolii, dar se rspndesc sistemic i conin o gen strin. Se consider c pe viitor transferul prin intermediul virusurilor derivate va fi aplicat pe scar larg.

Metodele de transfer direct al genelor se realizeaz prin procedee fizice, elec-trice i chimice. n ce privete transferul genelor, n comparaie cu sistemul biologic, acestea nu sunt dependente de genotip, ns efeciena lor variaz n funcie de tipul celulei-int, de capacitatea lor de regenerare, ntruct majoritatea transformrilor se efectueaz pe celule cultivate in.vitro.

Cele mai simple metode de transfer direct ar putea consta n aplicarea exo-gen a materialului genetic urmat de ptrunderea acestuia n celule i respectiv n nucleu. Exist unele lucrri efectuate n anii 80 ai secolului trecut, care indic asupra unui transfer de ADN prin aplicare exogen conjugat cu polinizarea. Prin funcia sa de a transmite ADN-ul, polenul a generat un interes continuu n transfor-marea mediat de gametofit (De Wet i al., 1986), ns n lipsa unor gene markeri i a tehnicii moleculare de analiz adecvat a fost dificil de a atesta transformarea genetic, ntruct markerii genetici clasici puteau fi interpretai drept un rezultat al contaminrii polenului i nu al transformrii. Totui cercetrile de acest fel au conti-nuat prin obinerea n anii 1986-88 a speciilor de porumb, orez i gru transformate genetic prin polenizare cu polen i extract de ADN strin. n aceste experimente ADN-ul plasmidial incluznd gena nptII. inserat a fost aplicat asupra florilor n perioada polenizrii. Fenomenul de transformare a fost confirmat prin screening la rezistena fa de antibiotic i analize Southern blot. Autorii au explicat datele obi-nute prin ptrunderea ADN-ului plasmidial mpreun cu tubul polinic n germinare spre ovule, sugerndu-se c acestea n faza de fecundare sunt sensibile i pot permi-te ncorporarea ADN-ului strin (Luo i Wu, 1988; Picard i al., 1988). Simplitatea n efectuare, lipsa unui echipament special i costisitor a determinat continuarea acestor experiene i n anii90 ai secolului trecut de ctre ali cercettori (Langridge i al., 1992; Zeng i al., 1994), care au demonstrat succesul transferului de gene me-diat de tubul polinic. Cu toate acestea, nu exist dovezi suficiente care ar demonstra c prin aceast metod se poate asigura o integrare i o transmitere n descenden a genelor inserate.

Transferul genelor n protoplati (celule lipsite de perete celular) reprezint prima metod de transfer direct al ADN-ului n plante a crei eficien a fost demons-trat (Krens i al., 1982). Tehnicile utilizate se bazeaz pe proprietile ADN-ului de a traversa membrana plasmatic i pe totipotenialitatea protoplatilor. Primele cercetri care au indicat asupra unei transformri stabile a protoplatilor s-au ba-zat pe permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice pentru ADN-ul strin cu polietilenglicol.(PEG, solubil n ap, greutatea molecular variaz ntre 200-15000 daltoni) cu formula chimic:

HOH2C-(CH2-O-CH2)n-CH2OH

30

n general, se utilizeaz polimeri cu greuti moleculare de aproximativ 1500-6000 daltoni, cu o capacitate ridicat de adiie a ionilor de calciu n mediul de cul-tur. Polietilenglicolul aplicat n concentraii de 25-40% i la o agitare circular continu, timp de 30 minute, provoac, la nceput, deshidratarea i aglutinarea pro-toplatilor cu formarea de puni de hidrogen cu radicalii pozitivi ai proteinelor, fosfoli-pidelor i glucidelor, proces stimulat de concentraii ridicate de ioni de Ca++ i valori superioare ale pH-lui.

Deoarece PEG prezint un anumit grad de toxicitate, iar n unele cazuri determin formarea celulelor multinucleate, prin fuziuni ale mai multor protoplati, ca o metod alternativ de transfer al ADN-ului n protoplati a fost propus electroporarea. O con-centraie mare de ADN plasmidial care conine gena clonat este adugat la o suspensie de protoplati cruia i se aplic un oc electric de 200-600 V/cm timp de 30-100 milise-cunde. Ca rezultat, n membranele plasmatice se formeaz pori care permit ptrunderea ADN-ului exogen n citoplasm (Milic, 1999; Sambrook i Russell, 2001).

Eficiena transformrii prin aceste procedee este influenat de o serie de parametri: greutatea molecular i concentraia PEG, tensiunea, tipul i durata impulsului electric, dimensiunile i configuraia plasmidei (superrsucit sau liniarizat), starea fiziologic i stadiul din ciclul celular n care se afl protoplatii-recipient, protocolul de regenerare pentru fiecare specie de interes. Al doilea dezavantaj al transferului de gene n proto-plati este probabilitatea mare de a integra mai multe copii ale transgenei.

Microinjecia este o metod fizic direct de introducere a ADN-ului n nucle-ul celulei vegetale, sub control optic, aplicat cu succes pentru prima dat n a doua jumtate a anilor90 ai secolului trecut la tutun i lucern (Crossway i al., 1986). Este una dintre cele mai laborioase i complexe metode. Prezena peretelui celular reprezint nu numai o barier fizic, prezentnd dificulti n penetrarea peretelui de ctre microcapilare, ci i o vizibilitate redus a nucleului. Prezena vacuolei mari, de asemenea, reprezint o problem, deoarece exist riscul distrugerii tonoplastului n procesul penetrrii spre nucleu. Exist i o serie de avantaje: permite controlul numrului moleculelor transferate, face posibil cotransferul de ADN, ARN, protei-ne sau chiar mitocondrii. Transferul moleculelor poate fi efectuat n celule izolate, structuri multicelulare cu mare competen pentru regenerarea plantelor.

Transferul direct al ADN-ului plasmidial cu fibre de carbid-silicon reprezin-t o metod relativ nou, primele succese fiind nregistrate n anii 90 ai secolului trecut la porumb (Kaeppler i al., 1992). Aceast metod ofer o alternativ micro-injeciei, fiind extrem de simpl i ieftin pentru producerea plantelor transgenice fertile. Tuburile Eppendorff cu suspensii de agregate celulare sunt iniial inversate i apoi vortexate mpreun cu ADN-ul plasmidial i fibrele ncrcate negativ ntr-un mediu hipertonic cu un coninut de sorbitol 0,25 M i manitol 0,25 M. Ca urmare a coliziunilor ntre agregatele celulare i fibrele ascuite ca nite ace, peretele celular este penetrat i ADN-ul ptrunde n citoplasm. Principalii factori care pot afecta transferul sunt modalitatea i intensitatea agitrii. Pn n prezent metoda a fost folosit cu succes la porumb i tutun.

31

Un dezavantaj al acestei metode este determinat de tipul de esut-int utilizat. Pn n prezent s-a reuit utilizarea doar a suspensiilor cu agregate celulare mici cu perete celular subire. O alt cauz care limiteaz aceast metod o reprezint faptul c fibrele de carbid-silicon pot fi cancerigene din cauza proprietilor similare cu fibrele de azbest.

Transferul direct al genelor prin metoda biolistic, elaborat n 1987 (Sanford i al., 1987), se consider a fi un progres esenial n manipularea genetic, ntruct realizeaz transferul genelor n plantele pentru care nu sunt eficiente transferul me-diat de Agrobacterium sau metodele bazate pe protoplati. Principiul acestei metode constituie utilizarea microproiectilelor lansate cu vitez mare pentru introducerea ADN-ului n celulele vii.

ADN-ul este precipitat cu clorur de calciu la suprafaa unor particule de aur sau tungsten, cu diametrul mai mic de 1 micron. Particulele sunt amplasate ntr-un glon din plastic (macroproiectil), introdus n eava unui dispozitiv special construit n acest scop. esutul vegetal int este plasat n apropierea unui mic orificiu de la captul evii. Macroproiectilul este propulsat spre esut cu ajutorul unei ncrc-turi explozive i cnd se izbete de placa de protecie, particulele pe care le poart trec prin orificiu i lovesc celulele. eava pistolului i camera cu esutul trebuie s fie vidate. n caz contrar, rezistena aerului reduce viteza macroproiectilului. Dup bombardare, celulele sunt transferate n cultur pentru regenerarea plantelor.

Spre deosebire de mecanismele de bombardare cu macroproiectile, o alt varian-tmicrointirea genereaz mai nti aerosoli printr-un scurt oc de presiune, dup care accelereaz picturile, conform legii lui Bernoulli ntr-un capilar foarte ngust. Prin intermediul acestui sistem, 80% din totalul particulelor ajung ntr-o regiune cu diametrul de numai 150 microni: meristemul. Aceast metod balistic ameliorat este folosit pentru transformarea inflorescenei i meristemelor florale (Raicu, 1997).

Principalii factori limitativi sunt: masa i materiile prime ale particulelor care tre-buie s reprezinte metale inerte din punct de vedere chimic, natura, forma i concentraia ADN-ului. Pentru nvelirea particulelor metalice cu ADN, se poate recurge la aditivi (spermidina, clorura de calciu). Ali parametri cu inciden asupra fiziologiei esutului sunt: condiiile de temperatur, fotoperioada i umiditatea n care sunt meninute plan-tele-donor, explantele i esuturile transformate. Avantajele acestei tehnici constau n transformarea esuturilor organizate potenial regenerabile, permit transferul unor gene strine n germoplasma-elit, tehnica putnd fi aplicat teoretic la orice specie.

Alte tehnici de transfer direct al genelor fac apel la: microfascicule laser, lipo-somi, sonicare, macroinjecie etc. Aceast gam de tehnici de transfer care difer prin complexitatea tehnic i eficien se afl n dezvoltare, n cutarea noilor meto-de cu condiii tehnice simple, reproductibile n diverse laboratoare fr un echipa-ment specializat i costisitor.

La momentul actual, conform datelor nregistrate n bazele de date (AGBIOS i COMPASS) privind PMG aprobate, majoritatea plantelor au fost obinute prin transferul genelor indirect mediat de Agrobacterium i direct prin metoda biolistic.

32

1.4. regenerarea, selecia i testarea plantelor modificate genetic

Regenerarea, selecia i testarea PMG reprezint componente eseniale ale unui protocol de transformare. Datorit totipotenei caracteristice organismului vegetal, celulele transformate pot regenera prin cultura in.vitro.plante transgenice, care fiind supuse unor etape intermediare de selecie sunt cultivate n cmp pentru o testare a stabilitii expresiei transgenei n condiii naturale.

Sistemele de cultur in.vitro includ att cultura explantelor care i pstreaz integritatea: embrioni zigotici, meristeme, ct i a celor pentru care condiiile in.vitro determin o dediferiniere celular mai mult sau mai puin pronunat. De-diferenierea este procesul prin care celulele unui organ pierd capacitatea de a-i regla dezvoltarea, devenind apte de a se divide cu formarea unei mase de celule parenchimatice numit calus (Raicu, 1997). n calitate de explante pentru inducerea calusului pot fi folosite diferite pri ale organelor plantei. Excizia explantului indu-ce un rspuns de rnire la nivelul seciunilor care, cultivate n prezena hormonilor din mediu, formeaz calus. Prin modificarea raportului de substane reglatoare de cretere n mediul de cultivare este indus organogeneza, asigurat de meristemele care apar n calusurile cultivate in.vitro..Prin organogenez se formeaz lstari care, transferai pe un mediu lipsit de hormoni sau cu un coninut sczut de auxin, vor nrdcina. Plantele, astfel obinute, vor fi transferate n ser i, ulterior, n cmp.

Lstarii pot fi indui s se formeze i direct pe explantele difereniate: frunze, tulpini, hipocotile, inflorescene, rdcini. n acest caz, ei i au originea n zone r-mase n stare meristematic sau pot rezulta din diferenierea anumitor celule.

Obinerea plantelor din celule cultivate in.vitro.se poate realiza prin regenerare att direct, ct i indirect prin calus urmat de organogenez (fig. 1.17.).

Dei etapa de regenerare de.novo prin calus nu este o cerin obligatorie pentru a genera plante transgenice, aceasta reprezint o etap de baz n majoritatea proto-coalelor de transformare. Procedura de regenerare trebuie s corespund anumitor condiii. De exemplu, n cazul transformrii mediate de Agrobacterium, pentru a fi accesibile bacteriei, celulelor care urmeaz s fie regenerate li se aplic diferite for-me de rnire, iar acestea trebuie s fie competente pentru a primi i integra ADN-T (Sangwan i al., 1992; Ishida i al., 1996).

Regenerarea plantelor poate fi influenat negativ de concentraii nalte ale bac-teriei i perioada lung de cocultivare factori eseniali n eficiena transformrii. De aceea, este necesar de a gsi un echilibru ntre frecvena de transformare i vi-abilitatea esutului. S-a constatat c modul n care materialul vegetal este cultivat nainte i dup infectare cu bacterii, i n special prezena n mediu a hormonilor, reglatorilor de cretere i a diferitor substane: antioxidani sau antibiotice pot influ-ena profund att competena pentru transformare, ct i capacitatea de regenerare (Joersbo i Okkels, 1996; Perl i al., 1996; Nauerby i al., 1997).

Frecvena regenerrii variaz i este influenat de genotip i de metoda de transfer. Depirea acestor dificulti este posibil prin elaborarea unor metode de transformare direct a unor structuri cu potenial natural de regenerare, cum sunt embrionii i meristemele. Dezvoltarea transformanilor din.astfel de explani este

33

asociat cu un numr mai mic de manipulri ale tehnicii culturii in.vitro. De aseme-nea, se consider c plantele obinute din cultura meristemelor apicale sau auxiliare nu prezint variaia somaclonal. Cu ct este mai redus gradul de organizare a esu-tului i cu ct este mai lung timpul petrecut n aceast stare, cu att este mai mare amplitudinea fenomenului de variaie somaclonal (variabilitate genetic generat n timpul culturii de esuturi).

Figura 1.17. regenerarea plantelor prin organogenez direct (1) i indirect (2) (Raicu, 1997)

Not: A explante: fragmente de organe,.esuturi, celule izolate (polen, protoplati); B este indus for-marea mugurilor direct din celulele explantului pe un mediu de cultur adecvat; C dezvoltarea lstari-lor din muguri pe acelai mediu sau pe un mediu de alungire; D celulele explantului iniial sunt induse s se divid, dediferenieze cu formarea calusului primar; E calusul este subcultivat pe un mediu de cretere; F este indus organogeneza prin transferul calusului pe un mediu de regenerare; G lstari.

Indiferent de metoda de transfer utilizat, frecvena de integrare a genelor n genomul celulei este redus. Din aceast cauz, genei de interes, i este asociat o gen-marker, care permite selecia celulelor vegetale transformate. Cele mai folosite gene-marker selectabile confer rezisten la un antiobiotic sau un erbicid. Produsul unei asemenea gene este de obicei o enzim, care inactiveaz o substan toxic i astfel permite celulelor transformate s supravieuiasc pe un mediu de cultur adi-ionat cu antibioticul sau erbicidul respectiv i s regenereze.

Alegerea agentului de selecie n concentraie i durat optim de aplicare este important att pentru un nivel nalt de selectare a celulelor transformate, ct i pentru o regenerare calitativ. Exist o varietate mare de gene-marker (tab. 1.4.), care favorizeaz optimizarea factorilor cu inciden n transformare (Wilminkand i Dons, 1993).

A

B

C

G

E

F

1 2

34

Tabelul 1.4. Gene-marker utilizate n transformarea genetic a plantelor

(Wilmink i Dons, 1993)

Agentul de selecie/

substratul

Gena-marker

Produsul de expresie

efectulPrincipiul

mecanismului de rezisten

AntibioticeKanamicinaC418 Higromicin

aphA2aphA2 hpt=aphIV

APH(3)II (NPTII) APH(3)II (NPTII) APH(4)

Sinteza proteinelor

Fosforilarea agentului selectiv

erbicideBasta, PPT

Glifosat

Sulfoniluree Bromoxinil

Atrazin

bar, pat

aroA,Epsps

csr1-1bxn

psbA

PAT

EPSPS

ALS Nitrilasa

Qb

Sinteza aminoacizilor

Fotosintez

acetilarea agentului de seleciemodificarea/ amplificarea enzimei-intdegradarea agentului de seleciemodificarea enzimei-int

Ali ageni de selecieMetotrexat 2,4-D

Dhfr

tfdA

DHFR

DPAM

Sinteza nucleotidelorMetabolismulauxinelor

modificarea enzimei-int degradarea agentului de selecie

Cea mai des utilizat transgen n calitate de marker de selecie este gena neo-micin fosfotransferazei aminoglicozidice (3) de tip II (nptII), derivat de la trans-posonul Tn5 al E. coli, care mai este denumit i gena rezistenei la kanamicin. Aceast gen confer rezisten fa de antibioticele aminoglicozide. Gena nptII poate fi pus sub controlul elementelor reglatoare de origine bacterian, astfel nu va fi expresat n plante sau poate fi controlat de un promotor eucariot care va deter-mina expresia ei n planta-receptor.

O alt categorie de gene care permit analiza eficienei transformrii genetice sunt genele raportoare (3epea i Poao, 2000). Expresia acestor gene nu se re-flect asupra metabolismului sau rezistenei plantelor transgenice n condiii norma-le sau selective. Scopul utilizrii lor const n identificarea cu uurin a produselor lor de expresie (enzime, care pot fi detectate cu substraturi cromogene, fluorigene, care emit fotoni sau radioactive) pentru a concluziona despre prezena i expresia genelor de interes (vezi cap. 4).

35

Domeniul de utilizare a genelor raportoare este mult mai larg dect transge-neza. Un aspect al utilizrii lor este cel de a analiza expresia temporal-spaial a genelor n general, proprie organismului dat, sau a transgenei. n funcie de scopul cercetrii, secvena codificatoare a genelor raportoare pot nlocui anumite secvene n construct. De exemplu, ataarea genei la regiunea promotor permite de a cer-ceta rolul acestuia n expresia genei respective la nivel de transcripie. nlocuirea secvenei codificatoare a genei de interes cu cea a genei raportoare cu pstrarea regiunilor care codific secvena de la captul 5` netranslabil al ARNm permite de a aprecia rolul acestei succesiuni nucleotidice n procesul transportului ARNm din nucleu n citoplasm i iniierea translrii. Prin combinarea secvenelor codifica-toare ale genei de interes i raportoare se poate determina, n unele cazuri direct, cantitatea proteinei active n celule, interaciunea cu alte proteine, polipeptide, acizi nucleici, membrane etc.

n ultimii ani au fost propuse o serie de gene utilizate n monitorizarea celule-lor vegetale transformate genetic: genele octopinsintetazei OCS, nopalinsintetazei NOS, cloramfenicol acetiltransferazei CAT, -galactozidazei LacZ, -glucoro-nidazei GUS, luciferazei LUC, proteinei fluorescente verzi GFP (Sambrook i Russell, 2001).

Apelarea la genele raportoare este n funcie de avantajele i limitrile acesto-ra. Nu exist gene cu utilizare universal, de aceea selectarea unui marker adecvat se ncepe cu informaia cunoscut. De exemplu, metodele enzimatice de elucidare a activitii proteinelor raportoare GUS, LUC i CAT sunt mai sensibile dect de-tectarea fluorescent a GFP, iar stabilitatea nalt a proteinelor GFP, GUS i CAT in.vivo nu permite de a elucida pe baza lor modificrile rapide n expresia genelor. Pentru acest scop este mai eficient LUC, ntruct timpul de degradare a proteinei n celulele vii este de 2-3 ore (3epea i Poao, 2000).

n primii ani ai practicii de transformare genetic a plantelor, s-a apelat la gena -glucoronidazei, ns din cauza interveniei distructive a celulelor utilizarea aces-teia n testarea transgenelor este limitat (vezi cap. 4). n calitate de markeri vizuali alternativi s-a recurs la luceferaz i la genele antocianinelor, n special n trans-formarea gramineelor. Dar i n acest caz, simplitatea n vizualizare la microscop a acumulrilor de pigmeni antociani este contrastat de faptul c acetia afecteaz dezvoltarea celulelor transformate. ns utilizarea pe larg a luciferazei, care nu ma-nifest activitate toxic asupra celulelor, este limitat de echipamentul costisitor pentru vizualizarea produselor reaciei enzimatice.

Proteinele GFP sunt unele din cele mai recent utilizate n calitate de markeri n transformarea genetic. Acetia permit detecia vizual nedistructiv a celulelor transgenice prin microscopie fluorescent. Sistemul dat este independent de genotip i de esutul analizat i prezint un nivel jos de toxicitate.

Reieind din avantajele i dezavantajele fiecrui sistem reporter, se consider c cel mai des utilizate n tennologia ADN-recombinant sunt genele GUS i GFP, i mai puin LUC i CAT (vezi cap. 4)..

36

Diferite strategii aplicate n scop de selecie (antibiotice, erbicide, gene rapor-toare) vizeaz asigurarea celulelor cu un component final, esenial pentru regene-rare. De exemplu, benziladenina glucoronidul inactiv este convertit n citochini-na benziadenina activ n celulele care expreseaz gena gus (Joersbo i Okkels, 1996). Un alt sistem este bazat pe expresia unei gene isopentiltransferaza (ipt), care determin producerea unui precursor al citochininei (Ebinuma i al., 1997). Aceast strategie determin producerea unui fenotip transgenic aberant, ns problema n cauz a fost nlturat prin clonarea genei ipt ntr-un element transpozabil, fcnd posibil eliminarea genei prin selecia transgenei.

Ultima verificare a plantelor transgenice n cazul speciilor de interes economic se face n teste de cmp. Aceste teste au drept scop determinarea stabilitii genetice a caracterului transferat i evaluarea altor nsuiri cu inciden asupra produciei i calitii. Pentru tehnologia de transfer al genelor, cea mai important confirmare a reuitei transformrii const n acceptarea produselor plantelor astfel manipulate de ctre fermieri i consumatori.

1.5. Gene de interes

Obiectivele transformrii genetice a plantelor evolueaz odat cu cerinele so-cietii. Dac n primii ani de utilizare a tehnicilor ADN-ului recombinant erau im-plicate doar centre tiinifice a cror activitate de cercetare era axat preponderent pe eficientizarea metodelor de transfer al alogenelor i obinerea PMG cu un caracter de valoare, acum exist laboratoare comerciale care produc sute de linii transgenice, cu gene de importan agroindustrial. Realizrile ingineriei genetice vegetale i gsesc, din ce n ce mai mult, implementare n diverse domenii ale vieii contem-porane fiind stimulate de imposibilitatea rezolvrii unor imperative ale timpului, cum ar fi ameliorarea capacitii i calitii produciei, rezistena plantelor la diferii patogeni i factori abiotici, conservarea biodiversitii, poluarea chimic a mediului ambiant, farmaceutic, profilaxia i tratamentul multor maladii etc.

Tra

120896883 metode de detectie a plantelor transgenice

Documents