analiza plantelor

60
ANALIZA CHIMICÃ A PLANTELOR

Upload: diana-dunca

Post on 15-Dec-2015

170 views

Category:

Documents


8 download

DESCRIPTION

analiza plantelor

TRANSCRIPT

ANALIZA CHIMICÃ A PLANTELOR

Extracţia asistată de ultrasunete

Din punct de vedere fizic, sunetul este vibraţie

mecanică care se transmite printr-un mediu sub

formă de undă

In funcţie de frecvenţă se clasifică astfel: infrasunet, frecvenţe mai mici de 20 Hz, acustic, frecvenţe în domeniul 20 Hz şi 20 kHz

ultrasunet, frecvenţe mai mari de 20 kHz

Efectul ultrasunetelor asupra unui fluid continuu îl reprezintă presiunea excercitată:

Pa=Pa, maxsin(2ft)

Pa,max - presiunea maximă, f – frecvenţa undei, t- durata

Consecinţe:

determină scăderea distanţei dintre moleculele acestuia

pentru anumite valori ale acestei presiuni, moleculele se vor apropia la distanţe mai mici decât distanţa critică pentru menţinerea lichidului în stare intactă şi va apărea fenomenul de cavitaţie

cavitaţia - proces dinamic de formare, dezvoltare şi implozie a unor bule sau cavităţi umplute cu gaze şi vapori, numite bule cavitaţionale

Dimensiunea bulei este invers proporţională cu

frecvenţa undei:

ultrasunetele de frecvenţă joasă (16 – 100 kHz)

generează bule cavitaţionale mari

Ultrasunetele de frecvenţă mare nu produc

fenomenul de cavitaţie

Apariţia şi dezvoltarea bulelor cavitaţionale necesită prezenţa

unor factori favorizanţi, numiţi germeni cavitaţionali

Impurităţile aflate în lichid precum şi imperfecţiunile de formă ale

corpurilor solide care mărginesc sau vin în contact cu fluidul în

mişcare, favorizează reţinerea unor volume microscopice de gaz

nedizolvat în lichid care constituie nucleele sau germenii de

cavitaţie

Bulele cavitaţionale sunt de două tipuri:

stabile tranziente

Bulele cavitaţionale stabile au aproximativ dimensiunea de echilibru şi pot exista ca atare pe parcursul a mai multe cicluri

Bulele cavitaţionale tranziente pot avea raze până la de două ori mai mari decât raza iniţială înainte

şi suferă implozia

Photograph of a transient cloud of cavitation

bubbles generated acoustically

Temperatura şi presiunea la care are loc implozia bulelor

cavitaţionale sunt exprimate:

P

)(PTT max

max

10

11

P

)(PPP max

max

unde: T0 – temperatura camerei, - este raportul căldurilor specifice ale gazului şi amestecului gaz-vapori, P – presiunea în bula cavitaţională corespunzătoare dimensiunii maxime a acesteia; această presiune este presupusă a fi egală cu presiunea de vapori a lichidului, P. Pentru gaze monoatomice, are valoarea 1.67 iar pentru gaze biatomice, are valoarea 1.40

Temperaturile şi

presiunile locale pot

atinge valori de mii

de K şi respectiv,

sute de atmosfere

cavitation bubble implosion

Efectele de tip mecanic care apar ca urmare a propagării ultrasunetelor sunt:

formarea de microfluxuri - care constă într-o circulaţie independentă de timp a lichidului, care se produce în imediata vecinătate a bulelor aflate în mişcare, sub acţiunea presiunii oscilante exercitate de ultrasunet

formarea de microjeturi – bulele cavitaţionale odată formate în zonele de presiune scăzută sunt preluate de către curentul de lichid şi transportate în regiuni cu presiuni mai ridicate unde are loc implozia bulelor cu apariţia unui microjet de lichid care circulă cu viteză foarte mare 100 - 1000 m/s

A water vapor bubble reveals a water jet toward the surface during the collapse, which produces an intensive acoustic signal

Extracţia speciilor din probele de plante se

produce datoritã

valorilor extrem de mari ale presiunii şi vitezelor generate în lichidul înconjurător bulei în timpul imploziei

undelor de şoc emise în urma imploziei

impactului microjeturilor lichide care străbat interiorul bulei

Cavitation bubble collapse and plant material releasing: example of extraction of essential oil from basil

Optimizarea condiţiilor de extracţie asistată deultrasunete:

raportul probă-solvent tip solventfrecvenţa undei durata extracţiei

Metode de extracţie asistată de ultrasunete cuplate cu alte metode

On-line coupled dynamic ultrasound-assisted extraction (DUAE)

Cuplare on-line cu HPLC

ultrasound-assisted liquid-phase microextraction (ULPME)

ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction

(UDLLME)

ultrasound-assisted headspace liquid-phase microextraction (UAHS-LPME)

Extracţia asistată de microunde

Microunde:

unde electromagnetice cu frecvenţe

în domeniul 300MHz-300GHz,

poziţionate între razele X şi cele

infraroşii în spectrul electromagnetic

Microundele sunt utilizate în două

direcţii: comunicaţii sursă de energie

Spre deosebire de procesul de încălzire convenţional care este dependent de fenomenul de conducţie-convecţie şi care este însoţit de pierderea unei părţi din căldură spre mediul ambient, în cazul încălzirii sub acţiunea microundelor, procesul este direcţionat şi selectiv şi nu este însoţit de pierdere de căldură

permite reducerea timpului de extracţie în comparaţie cu metodele convenţionale de încălzire (mai puţin de 30 min)

Principiul încălzirii cu microunde are la bază

impactul direct al microundei cu materialele

polare/ solvent şi este guvernat de două fenomene:

conducţia ionică rotaţia dipolilor

fenomene care de obicei se produc simultan

Conducţia ionică se referă la migrarea ionilor sub acţiunea câmpului electric variabil, componentă a oricărei radiaţii electromagnetice; soluţia se se opune migrării ionilor ceea ce generează frecări, care, în ultimă instanţă încălzesc soluţia

Rotaţia dipolilor se referă la realinierea dipolilor moleculari în câmpul electric variabil, care se petrece cu absorbţie de energie

Incălzirea se produce numai la frecvenţa de 2450MHz

Componenta electrică a undei variază de 4.9x104 ori/s

In aceste condiţii, dipolii moleculelor nu se vor putea alinia cu câmpul electric şi vor căpăta o mişcare de vibraţie care generează căldură

Numai un material polar sau cu dipol moment permanent se va încălzi sub acţiunea

microundelor

Eficienţa încălzirii este dependentă de factorul de disipare (tan δ)→măsură a capacităţii solventului de a absorbi energia microundelor şi de a o transmite sub formă de căldură soluţiei:

tg=’’/’

unde: ε”- pierderea dielectrică - măsură a conversiei energiei microundelor în căldură ε’- constanta dielectrică - măsură a polarizabilităţii unui solvent în câmp electric

Mecanismul extracţiei din probe de plante

sub acţiunea microundelor, microumiditatea din celulele plantei

se evaporă →presiune enormă asupra pereţilor celulei→rupere→

constituienţii celulei “curg” în solvent

Dispozitive:

cu vas închis (closed- vessel) cu vas deschis (open- vessel)

Componente:

generator de microunde - magnetronsistem de focalizare al undei aplicator – locul unde se plasează probasistem de direcţionare al undei- asigură propagarea undei numai în direcţia înainte

Parametrii care influenţează extracţa:

tipul solventului

durata extracţiei

volumul solventului

temperatura – energia undei

matricea probei

Avantaje:

o durata: 15-30 min

o volume mici de extractant: 10 – 30 mL

Metode de analiză

Metode standardizate

DETERMINAREA CONTINUTULUI DE MATERIE

USCATA

Metoda gravimetrică→ determinarea procentului de materie uscată din plante pe baza pierderii apei libere prin incălzire la 1050C, timp de 2 ore

Conţinutul de materie uscată este folosit pentru corecţia conţinutului celorlalte elemente prin raportare la masă uscată absolută

Metoda nu permite îndepărtarea apei legate chimic

Reproductibilitate: 7%

ObservaţiePrin uscarea probelor la 1050C, o parte din compuşii C, N şi S se pot pierde prin volatilizare

DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL:

AZOT KJEHLDAL-MICROKJEHLDAL Metoda Kjeldahl→ determinarea cantitativă a amoniului din plante pe

baza oxidării pe cale umedă a materiei organice şi folosirea unui catalizator pentru dizolvare

Determinare: distilare în acid boric şi titrare spectrofotometrie de absorbţie moleculară în UV-Vis potenţiometrie cu electrod ion selectiv conductivitate

Metoda nu permite recuperarea cantitativă a N din compuşi organici heterociclici ( acid nicotinic) sau din forme oxidate

Metoda se foloseşte atât pentru determinarea continutului de azot în plante cât şi pentru estimarea necesarului de fertilizator

Limită de detecţie: 0.05%N

Reproductibilitate: 4%

AZOTATUL EXTRACTIBIL

METODA CU ELECTROD ION SELECTIV Metodă semicantitativă →determinarea concentraţiei de azotat-

azot din plante, bazată pe extracţia în soluţie de sulfat de aluminiu urmată de determinare potenţiometrică cu electrod azotat selectiv

Determinare:

potenţiometrie directă

Determinarea este sensibilă la variaţii ale forţei ionice

Interferenţi: Cl-, sulfat

Limită de detecţie: 200mg/kg (probă uscată)

Reproductibilitate: 18%.

DETERMINAREA SULFULUI TOTAL

Metoda implică: descompunerea compuşilor organici şi conversia

sulfului anorganic în sulfat determinarea sulfatului

Determinarea) cromatografie ionică b) indirect prin ICP-AESc) reducere cu acid iodhidric urmată de determinare

spectrofotometrică cu o soluţie de Bi(NO3)25H2O în gelatină d) determinare pe bază de precipitare ca sulfat de bariu

KITURI SI PROCEDEE PENTRU TESTARE

CONTINUTULUI IN NUTRIENTI Kiturile sunt destinate utilizării în analiza pe teren şi furnizează

rezultatul în timp real

Kiturile pot fi folosite pentru următoarele elemente: N, P, K sau pentru testarea acelor parametrii pentru care detecţia şi determinarea necesită doar un singur reactiv sau o combinaţie de reactivi

Detecţie: colorimetric: comparaţie vizuală sau fotometrie titrimetric: pe bază de numărarea picăturilor de reactiv

titrant necesare atingerii punctului de echivalenţă sau folosind un dispozitiv calibrat: biuretă, seringă

potenţiometrie, conductibilitate bazate pe reacţii enzimatice

Determinarea B, Mo şi Se Micronutrienţii B şi Mo şi elementul Se, sunt mai greu de determinat din

probe plante datorită conţinutului redus al acestora: <0.1 mg/kg pentru Mo şi Se şi >10mg/kg B.

Determinarea B titrimetrie spectrofotometrie de absorbţie moleculară în UV-Vis

folosind unul dintre următorii reactivi: cucurmină, quinalizarină, azomethină-H

ICP-AES

Observaţii: Metoda spectrofotometrică cu azomethină-H este superioară

celorlalte metode spectrofotometrice deoarece nu necesită utilizarea de acizi concentraţi. Complexul colorat este stabil timp de 4 ore.

ICP-AES prezintă sensibilitate şi precizie foarte bune pentru determinarea B la nivelul de concentraţie din plante, într-un interval care acoperă deficienţa până la intoxicaţia cu B.

Determinarea Mo

Concentraţia Mo în plante este de regulă 1mg/kg

Determinare: 1. colorimetrie: cu ditiol, foloseşte un compusul

toluen-3,4-zinc ditiol cu care Mo formează un complex colorat a cărui absorbanţă se măsoară 680nm. Metoda este adecvată determinării Mo din plante într-un interval larg de concentraţii. Metoda este adecvată determinării atât a concentraţiilor joase (<0.1mg/kg), cât a celor corespunzătoare intoxicării plantei cu Mo.

2. GF-AAS, se utilizează pentru deteminarea Mo în domeniul 0-1mg

3. FAAS

Determinarea Se

Deficienţa în Se este mai frecvent întâlnită decât intoxicarea cu Se→limita de detecţie în domeniul microcantităţilor

Determinare: cromatografie de gazespectrofotometriegenerare de hidrură urmată de AAS cu atomizare electrotermică

Metoda cu generare de hidrură de seleniu (H2Se) este poate cea mai mult utilizată datorită preciziei, rapidităţii şi sensibilităţii

Limită de determinare: 0.02mg/kg

DETERMINAREA ARSENULUI SI MERCURULUI

Determinarea As

As in plante: 0.02-7 mgAs/kg Metode pentru distrugerea materiei organice: dizolvare cu amestec HNO3-HClO4 dezagragare cu fondant alcalin extracţie asistată de microunde

Determinare: HG-AAS cu generare de arsină (AsH3) colorimetrie cu: dietilditiocarbamatul de argint sau albastrul

de molibden GF-AAS - afectată de interferenţi ICP-AES

Limita de detecţie As: 1-2 mgAs/kg

Determinarea Hg

Hg în plante: 30-700μgHg/kg

Preparea probei:

conversia Hg din probă în Hg(II) prin oxidare în mediu acid cu un amestec HNO3-H2SO4-V2O5

reducerea Hg(II) la vapori de Hg0 cu SnCl2 sau SnSO4 sau NaBH4

Determinare: FAAS

Limita de detecţie: 0.2-0.3 ng/ml

DETERMINAREA Cd, Cr, Co, Pb, Ni

Cd, Co, Cr, Pb şi Ni se găsesc în concentraţii relativ joase: <10 mg/kg

Preparare probã: combustia la temperatură înaltă este preferată

datorită volumului final mic al soluţiei care se supune analizei

extracţia asistată de microunde

Determinare: FAAS ICP-AES

DETERMINAREA COMPUSILOR CU POTENTIAL

TERAPEUTIC SI A ANTIOXIDANTILOR

Compuşi cu potenţial terapeutic:

flavonoide fitoestrogeni fitosteroli carotenoide

Antioxidanţii: molecule care pot reacţiona cu radicalii liberi şi sunt capabile să inhibe sau să termine reacţiile care conduc la radicali liberi

Radicalii liberi sunt atomi sau grupuri de atomi cu reactivitate înaltă care au un electron neîmperecheat pe ultimul nivel electronic; ei au tendinţa de accepta electroni de la molecule stabile

Corpul uman nu produce antioxidanţi

Antioxidanţi din plante

Preparare probă

extracţie la rece

extracţie cu refluxare folosind sisteme de solvenţi la cald

extracţia asistată de ultrasunete sau microunde

extracţia cu fluide supercritice

Separare şi identificare

Metode cromatografice: TLC, HPLC, GC, LC Spectrofotometrie de absorbţie moleculară în UV-Vis pe baza spectrelor de absorbţie ale plantelor în soluţii diluate

Spectrometrie IR MS

RMN

Tehnici cuplate

HPLC

GC-MS

RMN

Vis-RMN-FTIR

Evaluarea activităţii antioxidante – teste in vitro

ORACun generator de radical liber de tip peroxil este adãugat fluoresceineise înregistreazã variaţia fluorescenţei în funcţie de timpse calculeazã aria de sub curbele obţinute în prezenţa, şi respectiv în absenţa antioxidantului şi sunt comparate cu curbe standard generate folosind antioxidantul, un derivat de vitamina E solubil în apã, cunoscut sub denumirea de TROLOX

TRAP- metoda se bazeazã pe mãsurarea scãderii fluorescenţei R-ficoeritrinei în reacţie controlatã de peroxidare. Valorile TRAP sunt calculate din mãrimea deplasãrii de fazã datorate anitoxidantului prin comparaţie cu TROLOX.

TEAC- se bazeazã pe mãsurarea scãderii intensitãţii culorii la adaugarea unui antioxidant, cromoforului albastru-verde ABTS•+ ( radical liber care nu se gãseşte în organismul omului). Antioxidantul reduce radicalul la ABTS, determinnd decolorarea soluţiei acestuia.

DPPH – se bazeazã pe mãsurarea spectrofotometricã a abilitãţii antioxidantului de a reduce radicalul DPPH, care de asemenea, nu segãseşte în organismul uman

PSC – se bazeazã pe mãsurarea inhibãrii oxidãrii diclorofluoresceinei de cãtre antioxidanţi care reacţionezã cu radicalii peroxil generaţi prin degradarea termicã a 2,2’- azobis(amidinopropan)-ului

TOSC- se bazeazã pe reacţia dintre radicalii peroxil şi acidul α-keto-γ-metiolbutiric din care rezultã etilenã care este mãsuratã prin cromatografie de gaze

FRAP- se bazeazã pe mãsurarea spectrofotometricã a abilitãţii antioxidanţilor de a reduce ionul feric din complexul pe care acesta îl formeazã în mediu acid cu TPTZ ( clorurã de 2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniacuclopenta-1,4-dienã). Reducerea este monitorizatã la 593 nm

Testul Folin Ciocâlteu pentru compuşii fenolici – se bazeazã pe mãsurarea modificãrii culorii în urma reducerii unor oxizi metalici de cãtre antioxidanţii fenolici: acidul galic şi catechinã, cu formarea unei soluţii albastre care are un maxim de absorbţie la 764 nm. Se traseazã o curbã de etalonare folosind soluţii cu concentraţie cunoscutã de acid galic, concentraţia de compuşi fenolici fiind exprimatã în echivalent de acid galic

Alte metode utilizate pentru evaluarea activitãţii antioxidante totale

sunt:

voltametria biamperometria biosenzorii amperometrici RES metoda bazatã pe cultura de celule, consideratã mult mai

relevantã din punct de vedere biologic decât testele chimice

DPPH

TPC-total phenolic compounds-Folin Ciocâlteu

Voltametrie ciclicã

TEAC-trolox equivalent antioxidant capacity

Amperometrie

Biosenzori amperometrici