analiza plantelor
DESCRIPTION
analiza plantelorTRANSCRIPT
Extracţia asistată de ultrasunete
Din punct de vedere fizic, sunetul este vibraţie
mecanică care se transmite printr-un mediu sub
formă de undă
In funcţie de frecvenţă se clasifică astfel: infrasunet, frecvenţe mai mici de 20 Hz, acustic, frecvenţe în domeniul 20 Hz şi 20 kHz
ultrasunet, frecvenţe mai mari de 20 kHz
Efectul ultrasunetelor asupra unui fluid continuu îl reprezintă presiunea excercitată:
Pa=Pa, maxsin(2ft)
Pa,max - presiunea maximă, f – frecvenţa undei, t- durata
Consecinţe:
determină scăderea distanţei dintre moleculele acestuia
pentru anumite valori ale acestei presiuni, moleculele se vor apropia la distanţe mai mici decât distanţa critică pentru menţinerea lichidului în stare intactă şi va apărea fenomenul de cavitaţie
cavitaţia - proces dinamic de formare, dezvoltare şi implozie a unor bule sau cavităţi umplute cu gaze şi vapori, numite bule cavitaţionale
Dimensiunea bulei este invers proporţională cu
frecvenţa undei:
ultrasunetele de frecvenţă joasă (16 – 100 kHz)
generează bule cavitaţionale mari
Ultrasunetele de frecvenţă mare nu produc
fenomenul de cavitaţie
Apariţia şi dezvoltarea bulelor cavitaţionale necesită prezenţa
unor factori favorizanţi, numiţi germeni cavitaţionali
Impurităţile aflate în lichid precum şi imperfecţiunile de formă ale
corpurilor solide care mărginesc sau vin în contact cu fluidul în
mişcare, favorizează reţinerea unor volume microscopice de gaz
nedizolvat în lichid care constituie nucleele sau germenii de
cavitaţie
Bulele cavitaţionale sunt de două tipuri:
stabile tranziente
Bulele cavitaţionale stabile au aproximativ dimensiunea de echilibru şi pot exista ca atare pe parcursul a mai multe cicluri
Bulele cavitaţionale tranziente pot avea raze până la de două ori mai mari decât raza iniţială înainte
şi suferă implozia
Photograph of a transient cloud of cavitation
bubbles generated acoustically
Temperatura şi presiunea la care are loc implozia bulelor
cavitaţionale sunt exprimate:
P
)(PTT max
max
10
11
P
)(PPP max
max
unde: T0 – temperatura camerei, - este raportul căldurilor specifice ale gazului şi amestecului gaz-vapori, P – presiunea în bula cavitaţională corespunzătoare dimensiunii maxime a acesteia; această presiune este presupusă a fi egală cu presiunea de vapori a lichidului, P. Pentru gaze monoatomice, are valoarea 1.67 iar pentru gaze biatomice, are valoarea 1.40
Temperaturile şi
presiunile locale pot
atinge valori de mii
de K şi respectiv,
sute de atmosfere
cavitation bubble implosion
Efectele de tip mecanic care apar ca urmare a propagării ultrasunetelor sunt:
formarea de microfluxuri - care constă într-o circulaţie independentă de timp a lichidului, care se produce în imediata vecinătate a bulelor aflate în mişcare, sub acţiunea presiunii oscilante exercitate de ultrasunet
formarea de microjeturi – bulele cavitaţionale odată formate în zonele de presiune scăzută sunt preluate de către curentul de lichid şi transportate în regiuni cu presiuni mai ridicate unde are loc implozia bulelor cu apariţia unui microjet de lichid care circulă cu viteză foarte mare 100 - 1000 m/s
A water vapor bubble reveals a water jet toward the surface during the collapse, which produces an intensive acoustic signal
Extracţia speciilor din probele de plante se
produce datoritã
valorilor extrem de mari ale presiunii şi vitezelor generate în lichidul înconjurător bulei în timpul imploziei
undelor de şoc emise în urma imploziei
impactului microjeturilor lichide care străbat interiorul bulei
Cavitation bubble collapse and plant material releasing: example of extraction of essential oil from basil
Optimizarea condiţiilor de extracţie asistată deultrasunete:
raportul probă-solvent tip solventfrecvenţa undei durata extracţiei
Metode de extracţie asistată de ultrasunete cuplate cu alte metode
On-line coupled dynamic ultrasound-assisted extraction (DUAE)
Cuplare on-line cu HPLC
ultrasound-assisted liquid-phase microextraction (ULPME)
ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction
(UDLLME)
ultrasound-assisted headspace liquid-phase microextraction (UAHS-LPME)
Extracţia asistată de microunde
Microunde:
unde electromagnetice cu frecvenţe
în domeniul 300MHz-300GHz,
poziţionate între razele X şi cele
infraroşii în spectrul electromagnetic
Microundele sunt utilizate în două
direcţii: comunicaţii sursă de energie
Spre deosebire de procesul de încălzire convenţional care este dependent de fenomenul de conducţie-convecţie şi care este însoţit de pierderea unei părţi din căldură spre mediul ambient, în cazul încălzirii sub acţiunea microundelor, procesul este direcţionat şi selectiv şi nu este însoţit de pierdere de căldură
permite reducerea timpului de extracţie în comparaţie cu metodele convenţionale de încălzire (mai puţin de 30 min)
Principiul încălzirii cu microunde are la bază
impactul direct al microundei cu materialele
polare/ solvent şi este guvernat de două fenomene:
conducţia ionică rotaţia dipolilor
fenomene care de obicei se produc simultan
Conducţia ionică se referă la migrarea ionilor sub acţiunea câmpului electric variabil, componentă a oricărei radiaţii electromagnetice; soluţia se se opune migrării ionilor ceea ce generează frecări, care, în ultimă instanţă încălzesc soluţia
Rotaţia dipolilor se referă la realinierea dipolilor moleculari în câmpul electric variabil, care se petrece cu absorbţie de energie
Incălzirea se produce numai la frecvenţa de 2450MHz
Componenta electrică a undei variază de 4.9x104 ori/s
In aceste condiţii, dipolii moleculelor nu se vor putea alinia cu câmpul electric şi vor căpăta o mişcare de vibraţie care generează căldură
Numai un material polar sau cu dipol moment permanent se va încălzi sub acţiunea
microundelor
Eficienţa încălzirii este dependentă de factorul de disipare (tan δ)→măsură a capacităţii solventului de a absorbi energia microundelor şi de a o transmite sub formă de căldură soluţiei:
tg=’’/’
unde: ε”- pierderea dielectrică - măsură a conversiei energiei microundelor în căldură ε’- constanta dielectrică - măsură a polarizabilităţii unui solvent în câmp electric
Mecanismul extracţiei din probe de plante
sub acţiunea microundelor, microumiditatea din celulele plantei
se evaporă →presiune enormă asupra pereţilor celulei→rupere→
constituienţii celulei “curg” în solvent
Dispozitive:
cu vas închis (closed- vessel) cu vas deschis (open- vessel)
Componente:
generator de microunde - magnetronsistem de focalizare al undei aplicator – locul unde se plasează probasistem de direcţionare al undei- asigură propagarea undei numai în direcţia înainte
Parametrii care influenţează extracţa:
tipul solventului
durata extracţiei
volumul solventului
temperatura – energia undei
matricea probei
Avantaje:
o durata: 15-30 min
o volume mici de extractant: 10 – 30 mL
DETERMINAREA CONTINUTULUI DE MATERIE
USCATA
Metoda gravimetrică→ determinarea procentului de materie uscată din plante pe baza pierderii apei libere prin incălzire la 1050C, timp de 2 ore
Conţinutul de materie uscată este folosit pentru corecţia conţinutului celorlalte elemente prin raportare la masă uscată absolută
Metoda nu permite îndepărtarea apei legate chimic
Reproductibilitate: 7%
ObservaţiePrin uscarea probelor la 1050C, o parte din compuşii C, N şi S se pot pierde prin volatilizare
DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL:
AZOT KJEHLDAL-MICROKJEHLDAL Metoda Kjeldahl→ determinarea cantitativă a amoniului din plante pe
baza oxidării pe cale umedă a materiei organice şi folosirea unui catalizator pentru dizolvare
Determinare: distilare în acid boric şi titrare spectrofotometrie de absorbţie moleculară în UV-Vis potenţiometrie cu electrod ion selectiv conductivitate
Metoda nu permite recuperarea cantitativă a N din compuşi organici heterociclici ( acid nicotinic) sau din forme oxidate
Metoda se foloseşte atât pentru determinarea continutului de azot în plante cât şi pentru estimarea necesarului de fertilizator
Limită de detecţie: 0.05%N
Reproductibilitate: 4%
AZOTATUL EXTRACTIBIL
METODA CU ELECTROD ION SELECTIV Metodă semicantitativă →determinarea concentraţiei de azotat-
azot din plante, bazată pe extracţia în soluţie de sulfat de aluminiu urmată de determinare potenţiometrică cu electrod azotat selectiv
Determinare:
potenţiometrie directă
Determinarea este sensibilă la variaţii ale forţei ionice
Interferenţi: Cl-, sulfat
Limită de detecţie: 200mg/kg (probă uscată)
Reproductibilitate: 18%.
DETERMINAREA SULFULUI TOTAL
Metoda implică: descompunerea compuşilor organici şi conversia
sulfului anorganic în sulfat determinarea sulfatului
Determinarea) cromatografie ionică b) indirect prin ICP-AESc) reducere cu acid iodhidric urmată de determinare
spectrofotometrică cu o soluţie de Bi(NO3)25H2O în gelatină d) determinare pe bază de precipitare ca sulfat de bariu
KITURI SI PROCEDEE PENTRU TESTARE
CONTINUTULUI IN NUTRIENTI Kiturile sunt destinate utilizării în analiza pe teren şi furnizează
rezultatul în timp real
Kiturile pot fi folosite pentru următoarele elemente: N, P, K sau pentru testarea acelor parametrii pentru care detecţia şi determinarea necesită doar un singur reactiv sau o combinaţie de reactivi
Detecţie: colorimetric: comparaţie vizuală sau fotometrie titrimetric: pe bază de numărarea picăturilor de reactiv
titrant necesare atingerii punctului de echivalenţă sau folosind un dispozitiv calibrat: biuretă, seringă
potenţiometrie, conductibilitate bazate pe reacţii enzimatice
Determinarea B, Mo şi Se Micronutrienţii B şi Mo şi elementul Se, sunt mai greu de determinat din
probe plante datorită conţinutului redus al acestora: <0.1 mg/kg pentru Mo şi Se şi >10mg/kg B.
Determinarea B titrimetrie spectrofotometrie de absorbţie moleculară în UV-Vis
folosind unul dintre următorii reactivi: cucurmină, quinalizarină, azomethină-H
ICP-AES
Observaţii: Metoda spectrofotometrică cu azomethină-H este superioară
celorlalte metode spectrofotometrice deoarece nu necesită utilizarea de acizi concentraţi. Complexul colorat este stabil timp de 4 ore.
ICP-AES prezintă sensibilitate şi precizie foarte bune pentru determinarea B la nivelul de concentraţie din plante, într-un interval care acoperă deficienţa până la intoxicaţia cu B.
Determinarea Mo
Concentraţia Mo în plante este de regulă 1mg/kg
Determinare: 1. colorimetrie: cu ditiol, foloseşte un compusul
toluen-3,4-zinc ditiol cu care Mo formează un complex colorat a cărui absorbanţă se măsoară 680nm. Metoda este adecvată determinării Mo din plante într-un interval larg de concentraţii. Metoda este adecvată determinării atât a concentraţiilor joase (<0.1mg/kg), cât a celor corespunzătoare intoxicării plantei cu Mo.
2. GF-AAS, se utilizează pentru deteminarea Mo în domeniul 0-1mg
3. FAAS
Determinarea Se
Deficienţa în Se este mai frecvent întâlnită decât intoxicarea cu Se→limita de detecţie în domeniul microcantităţilor
Determinare: cromatografie de gazespectrofotometriegenerare de hidrură urmată de AAS cu atomizare electrotermică
Metoda cu generare de hidrură de seleniu (H2Se) este poate cea mai mult utilizată datorită preciziei, rapidităţii şi sensibilităţii
Limită de determinare: 0.02mg/kg
DETERMINAREA ARSENULUI SI MERCURULUI
Determinarea As
As in plante: 0.02-7 mgAs/kg Metode pentru distrugerea materiei organice: dizolvare cu amestec HNO3-HClO4 dezagragare cu fondant alcalin extracţie asistată de microunde
Determinare: HG-AAS cu generare de arsină (AsH3) colorimetrie cu: dietilditiocarbamatul de argint sau albastrul
de molibden GF-AAS - afectată de interferenţi ICP-AES
Limita de detecţie As: 1-2 mgAs/kg
Determinarea Hg
Hg în plante: 30-700μgHg/kg
Preparea probei:
conversia Hg din probă în Hg(II) prin oxidare în mediu acid cu un amestec HNO3-H2SO4-V2O5
reducerea Hg(II) la vapori de Hg0 cu SnCl2 sau SnSO4 sau NaBH4
Determinare: FAAS
Limita de detecţie: 0.2-0.3 ng/ml
DETERMINAREA Cd, Cr, Co, Pb, Ni
Cd, Co, Cr, Pb şi Ni se găsesc în concentraţii relativ joase: <10 mg/kg
Preparare probã: combustia la temperatură înaltă este preferată
datorită volumului final mic al soluţiei care se supune analizei
extracţia asistată de microunde
Determinare: FAAS ICP-AES
DETERMINAREA COMPUSILOR CU POTENTIAL
TERAPEUTIC SI A ANTIOXIDANTILOR
Compuşi cu potenţial terapeutic:
flavonoide fitoestrogeni fitosteroli carotenoide
Antioxidanţii: molecule care pot reacţiona cu radicalii liberi şi sunt capabile să inhibe sau să termine reacţiile care conduc la radicali liberi
Radicalii liberi sunt atomi sau grupuri de atomi cu reactivitate înaltă care au un electron neîmperecheat pe ultimul nivel electronic; ei au tendinţa de accepta electroni de la molecule stabile
Corpul uman nu produce antioxidanţi
Preparare probă
extracţie la rece
extracţie cu refluxare folosind sisteme de solvenţi la cald
extracţia asistată de ultrasunete sau microunde
extracţia cu fluide supercritice
Separare şi identificare
Metode cromatografice: TLC, HPLC, GC, LC Spectrofotometrie de absorbţie moleculară în UV-Vis pe baza spectrelor de absorbţie ale plantelor în soluţii diluate
Spectrometrie IR MS
RMN
Tehnici cuplate
Evaluarea activităţii antioxidante – teste in vitro
ORACun generator de radical liber de tip peroxil este adãugat fluoresceineise înregistreazã variaţia fluorescenţei în funcţie de timpse calculeazã aria de sub curbele obţinute în prezenţa, şi respectiv în absenţa antioxidantului şi sunt comparate cu curbe standard generate folosind antioxidantul, un derivat de vitamina E solubil în apã, cunoscut sub denumirea de TROLOX
TRAP- metoda se bazeazã pe mãsurarea scãderii fluorescenţei R-ficoeritrinei în reacţie controlatã de peroxidare. Valorile TRAP sunt calculate din mãrimea deplasãrii de fazã datorate anitoxidantului prin comparaţie cu TROLOX.
TEAC- se bazeazã pe mãsurarea scãderii intensitãţii culorii la adaugarea unui antioxidant, cromoforului albastru-verde ABTS•+ ( radical liber care nu se gãseşte în organismul omului). Antioxidantul reduce radicalul la ABTS, determinnd decolorarea soluţiei acestuia.
DPPH – se bazeazã pe mãsurarea spectrofotometricã a abilitãţii antioxidantului de a reduce radicalul DPPH, care de asemenea, nu segãseşte în organismul uman
PSC – se bazeazã pe mãsurarea inhibãrii oxidãrii diclorofluoresceinei de cãtre antioxidanţi care reacţionezã cu radicalii peroxil generaţi prin degradarea termicã a 2,2’- azobis(amidinopropan)-ului
TOSC- se bazeazã pe reacţia dintre radicalii peroxil şi acidul α-keto-γ-metiolbutiric din care rezultã etilenã care este mãsuratã prin cromatografie de gaze
FRAP- se bazeazã pe mãsurarea spectrofotometricã a abilitãţii antioxidanţilor de a reduce ionul feric din complexul pe care acesta îl formeazã în mediu acid cu TPTZ ( clorurã de 2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniacuclopenta-1,4-dienã). Reducerea este monitorizatã la 593 nm
Testul Folin Ciocâlteu pentru compuşii fenolici – se bazeazã pe mãsurarea modificãrii culorii în urma reducerii unor oxizi metalici de cãtre antioxidanţii fenolici: acidul galic şi catechinã, cu formarea unei soluţii albastre care are un maxim de absorbţie la 764 nm. Se traseazã o curbã de etalonare folosind soluţii cu concentraţie cunoscutã de acid galic, concentraţia de compuşi fenolici fiind exprimatã în echivalent de acid galic
Alte metode utilizate pentru evaluarea activitãţii antioxidante totale
sunt:
voltametria biamperometria biosenzorii amperometrici RES metoda bazatã pe cultura de celule, consideratã mult mai
relevantã din punct de vedere biologic decât testele chimice