utilizarea celulelor stem pluripotente … doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru...

40
1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “Grigore T. Popa” Iaşi FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE INDUSE (iPSC) DIN FIBROBLASTE/STEM MEZENCHIMALE ÎN PATOLOGIA OFTALMOLOGICĂ REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Îndrumător ştiinţific, Prof. Dr. Marcel Costuleanu Doctorand, Dr. Oana Cristina Răducanu -- IAŞI, 2016

Upload: ngodiep

Post on 17-Feb-2018

226 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

Page 1: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

1

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

“Grigore T. Popa” Iaşi

FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ

UTILIZAREA CELULELOR STEM

PLURIPOTENTE INDUSE (iPSC) DIN

FIBROBLASTE/STEM MEZENCHIMALE

ÎN PATOLOGIA OFTALMOLOGICĂ

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Îndrumător ştiinţific,

Prof. Dr. Marcel Costuleanu Doctorand,

Dr. Oana Cristina Răducanu

-- IAŞI, 2016 –

Page 2: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

2

CUPRINS

1.STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII………..........…...................................…..1

1.1. Celulele stem iPSC şi derivatele acestora în oftalmologie...................................................................……...1

1.2. Factorii de creştere celulară şi proliferarea celulelor progenitoare/stem............................….………..9

1.2.1.Familia factorului de creştere epidermică...................................................................................10

1.2.2.Factorul de creştere derivat din plachete.................................................................................................11

1.2.3. Familia factorului de creştere transformant .................................................................................12 1.2.4. Familia factorului de creştere fibroblastică……..................................................................................12

1.2.5.Factorii de creştere asemănători insulinei ....................................................................................13

1.2.6.Factorul de creştere nervoasă.......................................................................................................14

1.2.8.Alţi factori de creştere celulară.................................................................................................................17 1.3. Factorii moleculari executori ai apoptozei celulelor progenitoare/stem.........................................................18

2.CONTRIBUŢII PERSONALE…………………….…..…….................……..41 2.1.Motivaţia alegerii temei........................................................................................................................................41 2.2.Scopul şi obiectivele ........................................................................................................…….……..…………..43

2.3.Materiale şi metode...............................................................................................................................................43

2.3.1. Efectele ionomicinei asupra potenţialului transmembranar mitocondrial

în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca2+

..............................................................................45

2.3.2. Efectele CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial........................................................46

2.3.3. Efectele CnB asupra potenţialului membranar mitocondrial……………............................……46

2.3.4. Efectele Citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului

membranar mitocondrial……………………...…………………………………………………..47

2.3.5. Efectele Tyrphostin AG 1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial.............................48

2.3.6. Efectele Tyrphostin AG 494 asupra potenţialului membranar mitocondrial...............................49

2.3.7. Evidenţierea morţii celulare induse de deltametrin (DMT)

în celule de tip iPSC..........................................................................................................................50

2.3.8. Efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial.....................................50

2.3.9. Efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial......................................................51

2.3.10. Efectele acidului 9 cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar

mitocondrial........................................................................................................................................52

2.4. Rezultate...............................................................................................................................................................53

2.5. Discuţii...................................................................................................................................................................74 CONCLUZII FINALE …………………………….……………………...............……..…...120

BIBLIOGRAFIE ............………………...………………….................…..………………….121

Page 3: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

3

2. CONTRIBUŢII PERSONALE

2.1. Motivaţia alegerii temei Celulele stem sunt celule capabile să se transforme în multiple tipuri celulare, de aceea ele reprezintă

candidatul ideal pentru menţinerea homeostaziei şi pentru repararea tisulară. Teoretic, celulele stem sunt avantajoase

deoarece au capacitatea de a se diferenţia şi înlocui orice tip de ţesut lezat precum şi de a influenţa diferitele căi

biologice prin semnalizarea paracrină.

Celulele stem embrionare (CSE), celulele stem pluripotente induse (celulele iPS), celulele stem

mezenchimale (CSM) și celulele stem adulte sunt surse potențiale pentru terapia celulară în medicina regenerativă.

După cum am menţionat deja, transplantul epiteliului pigmentat retinian (RPE) a fost dezvoltat ca şi terapie

de înlocuire a celulelor pentru degenerarea maculară legată de vârstă. Celulele stem embrionare umane (hESC) şi

celulele stem pluripotente induse (iPSC) - derivate RPE sunt transferate experimental din ce în ce mai mult spre

folosirea clinică. Celulele stem RPE umane (hRPESC) s-au introdus ca şi sursă alternativă de RPE. S-a demonstrat

că monostraturile polarizate ale hRPESC - derivate RPE, crescute pe membrane de polistiren (PET), au avut

caracteristici aproape native. Fragmentul de monostrat RPE pe PET a fost transplantat subretinian (SRS) la iepure,

constituind astfel un model experimental animal de ochi mare.

Dar, după 4 zile din momentul intervenţiei a fost observat edem retinian deasupra implantului, detectat prin

tomografie de coerenţă optică în domeniul spectral (SD-OCT) şi fundoscopie (Stanzel şi colab., 2014). După o

săptămână a fost observată atrofia retinei de deasupra transplantului atât la făt cât şi la adult, fenomenul rămânând

ulterior relativ stabil. Examenul histologic obținut la 4 săptămâni după implantare a confirmat existenţa unui

monostrat RPE polarizat uman continuu pe PET. Luate împreună, datele obţinute demonstrează că xeno-hiPSC-RPE

au supravieţuit în spațiul subretinian. Aceste experimente dovedesc că hiPSC-derivate RPE pot fi considerate a fi o

sursă potenţială pentru terapiile care utilizează transplantul. Nu se cunoaşte însă potenţialul funcţional şi integrativ al

acestor xenogrefe celulare.

Încercările de a compara răspunsurile imune în stratul subretinian (SRS) cu alte modele de xenogrefă nu pot

fi adecvate din cauza mediului imunologic unic de sub retină (mediu privilegiat imun). Există chiar date care arată

că, în cazul alogrefelor RPE, expresia complexului major de histocompatibilitate de tip II (Zhang şi Bok, 1998),

împreună cu producerea de citokine (IL-6 și interferon gama), au fost implicate în respingerea grefei (Enzmann și

colab., 2000).

În schimb, în cazul xenogrefelor RPE la şobolan sau iepure se observă infiltrare cu macrofage şi distrugere

ulterioară (Gabrielian și colab., 1999;Carr și colab., 2009).

Şi citokinele (IL-1 și IL-6) au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și colab., 1999). Infiltrarea cu

limfocite (timice) nu a fost demonstrată în mai mult de 20 de studii publicate despre xenogrefe RPE, dar atât

ciclosporina A (CsA) cât şi tacrolimus (TCA), care se crede că suprimă respingerea mediată de celulele T, au

demonstrat o oarecare eficacitate în întârzierea rejectului xenogrefei la iepuri (Lai și colab, 2000; Wang și colab.,

2002).

Ciclosporina are concentrații plasmatice neregulate (necesitând astfel măsurători serice frecvente) şi nu

împiedică respingerea alo- sau xenogrefei de RPE (suspensie) la şobolani sau iepuri (Carr și colab., 2009; Lai și

colab., 2000), punând astfel sub semnul întrebării utilitatea sa.

Tacrolimus are mecanisme similare de acțiune, dar un risc mai mare de efecte secundare toxice. Într-o

încercare de a ameliora modificările negative retiniene, s-a ales să se administreze dexametazonă (DXP), deoarece

suprimă previzibil toate tipurile de leucocite periferice la iepure (Jeklova și colab., 2008). Efectul advers al DXP

observat asupra supraviețuirii xenogrefei a fost neaşteptat, dar probabil mediat prin receptorul glucocorticoid RPE,

care promovează proliferarea RPE (He și colab., 1994).

În prezent nu există un protocol ideal bazat pe dovezi privind imunosupresia pentru modelele de xenogrefă

hRPE, dar datele indică faptul că administrarea TCA intravitros permite supraviețuirea hRPE timp de cel puțin 1

lună, indicând că acesta ar putea fi utilizat pentru studii pe termen lung. Cert este faptul că implantarea unor

Page 4: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

4

transportatori în SRS, cu sau fără hRPE, a dus la o retină degenerată imediat deasupra implantului. Cauza nu este

clară şi ar putea fi multifactorială.

În ciuda rapoartelor contradictorii (Szurman și colab., 2006), se crede că este puțin probabil ca bRD să

determine degenerarea retinei, pentru că s-a constatat că producerea unei vezicule similare, dar fără inserţia ulterioară

a unui transportor, determină leziuni minime la nivelul fotoreceptorilor şi o degenerare neglijabilă a retinei,

constatare susţinută şi de alţi cercetători (Ivert și colab., 2002).

Retina iepurelui este merangiotică, adică doar o parte a retinei interne este irigată de către vasele retiniene şi

este, prin urmare, mai dependentă de coriocapilare pentru toate necesităţile metabolice, comparativ cu speciile

holangiotice, care au o vascularizație retiniană ce irigă toată retina internă, aşa cum este la oameni şi la şobolani.

Atunci când s-a introdus un dispozitiv transportator de 1 mm grosime între fotoreceptori și RPE s-au distrus

legăturile intercelulare normale printr-o barieră nenaturală, proces care probabil a condus la degenerarea retinei

externe. Observații similare au fost făcute folosind implanturi cu cipuri retiniene, în care variante impermeabile ale

implanturilor au dus la atrofia straturilor de celule fotoreceptoare (Montezuma și colab., 2006).

Activitățile de cercetare actuale s-au concentrat pe identificarea unui transportator de celule adecvat care

imită mai îndeaproape relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare.

Porozitatea transportatorilor de celule pare să joace un rol crucial în menținerea sănătăţii şi a stratificării

neuronale retiniene, astfel încât implantarea unui transportor PET acelular cu diametrul porilor de 3 mm a dus la

conservarea mai bună a straturilor retiniene exterioare comparativ cu un purtător PET cu un diametru al porilor mai

mic, de 0.4 mm. Oricum, înafară de un mic studiu făcut de Lu și colab. (2012), nu au fost evaluate sistematic

membranele de transport cu porozitate optimă pentru conservarea retinei şi care să permită cultura RPE. Un astfel de

studiu este important, deoarece hRPE xenogrefate în SRS pe transportatori PET au indus edem retinian iniţial urmat,

în decurs de o săptămână, de o atrofie dramatică a tuturor straturilor retiniene de deasupra (Stanzel şi colab., 2014),

rezultate reconfirmate recent (Kashani, 2016).

Un astfel de experiment a fost total diferit de controalele “carrier-only”, în care doar straturile retinei

exterioare au degenerat. “Topirea” retinei indusă de transplantul RPE (Del Priore și colab., 2001; Rezai și colab.,

2000) sau distrugerea fotoreceptorilor (Diniz și colab., 2013;. Zhang și Bok, 1998) a fost observată şi de alți

cercetători şi rămâne o problemă nerezolvată în xenotransplanturile RPE (da Cruz și colab., 2007). Multe lucrări

indică faptul că, mai sigur decât leziunile provocate prin traumatismul chirurgical, configurația implanturilor

subretiniene este cea care determină degenerarea retinei.

Optimizarea transportatorilor de celule RPE în sensul imitării mai bune a membranei fiziologice Bruch este

un subiect important şi este în curs de cercetare de către mulți alți cercetători (Liu și colab., 2013;. Hynes și Lavik,

2010;. Kearns și colab., 2012; Subrizi și colab., 2012). Reducerea degenerării retinei după grefarea hRPE în zona

subretiniană (SRS) la iepure va îmbunătăţi utilizarea iepurelui ca şi model ieftin de animal cu ochi mari.

Există o serie de date experimentale, deşi puţine, care sugerează că degenerarea retinei, după grefarea RPE

în zona subretiniană (SRS) la iepure şi la şobolan, s-ar datora apoptozei fotoreceptorilor, dar şi a celulelor de tip RPE

(Hao şi colab., 2011).

Studiile noastre au abordat administrarea de celule stem pluripotente induse din fibroblaste (iPSC) dintr-un

alt unghi: utilizarea acestora ca vehicule pentru administrarea locală şi ţintită de medicamente şi nanoparticule. Din

acest unghi, interesul major a fost reprezentat de apoptoza acestui tip celular şi de mecanismele moleculare care o

guvernează.

2.2. Scopul şi obiectivele Activitățile experimentale s-au concentrat pe identificarea unui transportator celular adecvat care să nu

altereze relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare.

Astfel, primul obiectiv a fost reprezentat de obţinerea celulelor stem iPSC din fibroblastele gingivale de

şobolan prin creştere pe o matrice 3D (Reinnervate). Acestea au fost comparate cu celule stem mezenchimale,

obţinute din creasta iliacă de şobolan.

Page 5: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

5

Apoptoza celor două tipuri celulare de mai sus a fost testată exhaustiv, având în vedere faptul că reprezintă

o etapă deosebită în toleranţa tisulară, la nivelul retinei, dar şi o modalitate de administrare ţintită a medicamentelor

şi nanoparticulelor la acest nivel, utilizând “sinuciderea celulară” ca modalitate terapeutică. Acesta a fost cel de al

doilea obiectiv major al studiului prezent.

Am utilizat fibroblastele gingivale de şobolan pentru obţinerea celulelor stem pluripotente induse pentru că

sunt mai uşor de obţinut şi la îndemână, având în vedere experienţa colectivului de îndrumare. Dezvoltarea

administrării celulelor modificate genetic va fi realizată în viitor tot pe şobolan ca model experimental.

Toate experimentele au fost avizate în prealabil de Comisia de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie

“Grigore T. Popa” din Iaşi.

2.3. Materiale şi metode Obţinerea fibroblastelor s-a realizat prin explant din gingia de şobolan netratat. Şobolanii (200-250 g) în

număr de 5 au fost sacrificaţi, iar probele de gingie de la fiecare şobolan au fost mărunţite şi transferate în eprubete

cu ser fiziologic. Eprubetele cu gingia secţionatǎ au fost transferate în laborator pe pat de gheaţǎ. Probele de gingie

au fost mǎrunţite şi spǎlate de 6 ori cu PBS (phosphat buffered saline), dupǎ care au fost puse în plăcuţe Petri cu

mediu de culturǎ Mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ , 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine

serum), 1% amestec antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat),

1% amfotericinǎ B (Goriuc, 2011).

Probele au fost lǎsate între 2 şi 7 zile la 37°C şi 5 % CO2, dupǎ care gingia a fost îndepărtată iar

fibroblastele ataşate de peretele vasului au fost lǎsate sǎ se înmulţeascǎ în continuare în mediu proaspǎt la 37°C şi 5

% CO2 pentru încǎ 48-72 de ore. Când fibroblastele au ajuns la confluenţă de 90 % vasele au fost tripsinizate cu 2 ml

tripsină EDTA şi spǎlate prin centrifugare la 300xg timp de 5 minute, dupǎ care au fost resuspendate în 40 ml de

mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ , 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS ( fetal bovine serum), 1% antibiotic

penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B. Mediul în

care se aflau celulele a fost agitat şi împǎrţit în 4 flascuri de culturǎ. În acest mediu au fost lǎsate pȃnǎ au ajuns la

confluenţa de 90% (aproximativ 7 zile). Dupǎ cele 7 zile toate vasele au fost tripsinizate, spǎlate prin centrifugare la

300xg timp de 5 minute şi apoi au fost resuspensionate în 1 ml de mediu şi numǎrate. Dupǎ numǎrare, celulele au

fost împǎrţite în mod egal în 4 loturi (flascuri) (aproximativ 100.000 de celule/flasc). În primul flasc celulele

au fost puse în mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine serum),

1% antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ (0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ

B şi a reprezentat lotul martor. Apoi toate flascurile au fost puse la 37°C şi 5 % CO2 pȃnǎ ajung la confluenţǎ. În

acest timp celulele au fost fotografiate la 7, 14 şi 30 de zile utilizând un microscop cu contrast de fază Nikon Eclipse

TE300 şi softul aferent. Fotografiile au fost realizate cu diferite obiective: 4x, 10x şi 20x.

Pentru obţinerea iPSC din fibroblastele gingivale am utilizat tehnica descrisă de Long şi colab. (2015),

respectiv un amestec chimic format din 10 µM 5-bromo-2’-deoxiuridină {5-Bromo-1-(2-deoxi-β-D-

ribofuranozil)uracil}, 10 µM CHIR99021 {6-[[2-[[4-(2,4-Dicloro-fenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-

pirimidinil]amino]ethil]amino]-3-piridincarbonitril}, 10 µM Repsox {2-[3-(6-Metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-1,5-

naftiridin} şi 50 µM forskolin {7β-Acetoxi-8,13-epoxi-1α,6β,9α-trihidroxilabd-14-en-11-onă}. În plus, am utilizat un

agonist al receptorului acidului retinoic, AM580, în concentraţie de 100 nM, cu un randament mărit al procesului de

aproximativ 20 ori, în acord cu tehnica descrisă anterior (Wang şi colab., 2011).

Pentru evidenţierea transformării de tip iPSC am utilizat anticorpi specifici anti-fosfatază alcalină, anti-

Nanog şi anti-SSEA1 şi citometrie de flux (Long şi colab., 2015).

Atât celulele iPSC, induse din fibroblastele gingivale de şobolan, cât şi celulele mezenchimale din creasta

iliacă de şobolan, au fost separate înainte de experiment prin citometrie de flux selectivă, utilizând anticorpi selectivi

marcaţi cu fluoresceină.

În decursul dezvoltării, ambele linii celulare au prezentat caracteristici morfologice de celule embrionare în

cultură, demonstrând încă odată apartenenţa la acest tip celular. Totuşi, celulele stem mezenchimale, obţinute din

creasta iliacă de şobolan au fost mult mai puţin stabile, numărul de pasaje posibile fiind foarte redus.

Page 6: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

6

Pentru obţinerea celulelor stem mezenchimale am utilizat măduva osoasă obţinută prin puncţia crestei iliace

la şobolani Wistar de 200-250 g, sub anestezie. Pe scurt, fragmentele de măduvă au fost suspendate în mediu esenţial

minim α (α-MEM), centrifugate şi depozitul celular resuspendat în α-MEM cu 10 % FBS, Celulele nucleate au fost

însămânţate pe vase Petri de 150 mm diametru şi incubate la 37℃ timp de 6 zile. Apoi, celulele neaderente au fost

îndepărtate şi startul de celule aderente a fost reincubat în mediu complet până la atingerea unei semi-

confluenţe. Celulele au fost apoi tripsinizate cu 0.25% tripsină-EDTA, resuspendate în mediu complet,

reînsămânţate la o densitate de 8.000 cells/cm2 şi incubate pentru 3 zile. Monostraturile de celule rezultate, denumite

celule stem mezenchimale de şobolan, au fost tripsinizate şi celulele rezultate îngheţate sau utilizate pentru

experimente (Seo şi colab., 2009).

Partea experimentală a constat în studierea şi analizarea efectelor unor diferiţi inductori ai morţii celulare

asupra celulelor de tip iPSC şi stem mezenchimale, utilizând tehnici de imunofluorescenţă, reprezentate în principal

de citometria de flux.

Studiul experimental a fost realizat în două centre de cercetare: laboratorul din cadrul Disciplinei de

Fiziopatologie, U.M.F. „Grigore T. Popa” Iaşi şi laboratorul din cadrul Disciplinei de Imunologie şi Alergologie,

U.M.F. „Grigore T. Popa” Iaşi.

Datele obţinute au fost prelucrate statistic utilizând metode fiabile precum testul One Way ANOVA

(completată cu metoda Student-Newman-Keuls), fapt care mi-a permis o interpretare obiectivă şi o analiză pertinentă

a rezultatelor.

2.3.1. Efectele ionomicinei asupra potenţialului transmembranar mitocondrial în

condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca2+

Experimentele au fost realizate pe celule IPSC şi stem mezenchimale, menţinute în mediu stem, suplimentat

cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 g/ml streptomicină, 10 % FBS decomplementat, în incubator, la

37oC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de

aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratamente.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg/ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), ionomicină 1mM (Sigma-Aldrich),

CaCl2 250 mM, valinomicină 1 mM (Sigma-Aldrich), staurosporină 1mM (Sigma-Aldrich), JC1 5 mg/ml (Sigma-

Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml

prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg /ml

streptomicină, 10% FBS).

Celulele au fost incubate cu ionomicină 5 µM în prezenţă de CaCl2 2,5 mM, în mediu stem complet, la 37ºC

şi atmosferă cu 5% CO2, pe o perioadă de timp de până la 24 h. Celulele IPSC, mezenchimale şi de control nu au

primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Verificarea funcţionalităţii fluoroforului s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu 10 µM

valinomicină, un ionofor de K+, care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial, la 37ºC şi

atmosferă cu 5% CO2.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubarea în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1, un marker selectiv pentru potenţialul membranar mitocondrial. După spălare cu PBS de 2 ori

şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate la

citometrul de flux Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V,

FL2 310 V, FL1/FL2 - 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu

ajutorul softului BD CellQuest Pro Software.

2.3.2. Efectele Ciclosporinei A asupra potenţialului membranar mitocondrial

Experimentele au fost realizate pe celule IPSC şi stem mezenchimale. Celulele au fost menţinute în mediu

stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% ser bovin fetal

Page 7: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

7

inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h,

celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 g/ml, FBS (Sigma-Aldrich), Ciclosporină A (CsA) 100µM, valinomicină 1 mM (Sigma-

Aldrich), JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenz-imidazol-carbocyanine iodide) 5 mg/ml (Sigma-Aldrich),

PBS (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104

celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 g/ml streptomicină, 10% FBS).

O parte din celule au fost incubate cu CsA 1 µM în mediu complet timp de 24 h, la 37oC şi atmosferă cu 5%

CO2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37oC şi

atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea, s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o

parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM

valinomicină, un ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37oC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2 -

4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.3.3. Efectele Citosporonei B asupra potenţialului membranar mitocondrial

Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,

100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu

5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml

înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 g/ml, FBS (Sigma-Aldrich), Ciclosporină B (CnB) 1mM Sigma-Aldrich, valinomicină 1 mM

(Sigma-Aldrich), JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine iodide) 5 mg/ml (Sigma-

Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104

celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 g/ml streptomicină, 10% FBS).

O parte din celule au fost incubate cu CnB 50 µM în mediu complet timp de 24 h, la 37oC şi atmosferă cu

5% CO2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37oC şi

atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea, s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o

parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM

valinomicină, un ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37oC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2 -

4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

Page 8: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

8

2.3.4. Efectele Citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial

Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,

100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu

5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml

înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), Citosporonă B 1 mM (Sigma-Aldrich),

CsA 100 µM, CaCl2 250 mM, valinomicină 1 mM (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich), PBS (Sigma-

Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104

celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).

Pentru a evalua efectele citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial, o

parte din celule au fost incubate cu 1 µM CsA şi 10µM, 25 µM, respectiv 50 µM citosporonă B, în mediu complet

timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. De asemenea, o parte din celule au fost tratate doar cu citosporonă B,

10 µM, 25 µM şi respectiv 50 µM, timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu

stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h şi respectiv 48h, după incubare în prealabil timp

de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi

celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de

flux Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V,

FL1/FL2 - 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului

FlowJo 7.6.1.

2.3.5. Efectele Tyrphostin AG 1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial

Tyrphostin AG1295 este un inhibitor selectiv al tirozin-kinazei de la nivelul receptorului factorului de

creştere derivat din plachete (PDGF).

Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,

100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu

5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml

înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), AG 1295 (6,7-Dimethyl-2-phenylquino

xaline) în concentratii 1µm/ml, respectiv 5µm/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml prin adaos de mediu

stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10%

FBS).

Pentru a evalua efectele Tyrphostin AG1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din

celule au fost incubate cu 10 µl/ml AG1295 1mM, respectiv 10 µl/ml AG1295 5mM în mediu complet timp de 24 h,

la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi

atmosferă cu 5% CO2.

Page 9: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

9

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2

- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.3.6. Efectele Tyrphostin AG 494 asupra potenţialului membranar mitocondrial AG-494 este un

membru al familiei inhibitorilor de tirozin-kinază și este un inhibitor puternic al autofosforilării receptorilor EGF

(IC50 = 1,2 pM) și al creșterii celulare dependentă de EGF (IC50 = 6 pM). Sinonime: N-Phenyl-3,4-

dihydroxybenzylidene-cyanoacetamide, Tyrphostin B48 (Sigma-Aldrich).

Celulele IPSC au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de

cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), AG 494 (Sigma Aldrich) in concentratii

1µm/ml, respectiv 5µm/ml , PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml prin adaos de mediu

stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10%

FBS).

Pentru a evalua efectele Tyrphostin AG494 asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule

au fost incubate cu 10 µl/ml AG494 1mM, respectiv 10 µl/ml AG494 5mM în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC

şi atmosferă cu 5% CO2.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu

stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2

- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.3.7. Evidenţierea morţii celulare induse de deltametrin (DMT) în celule de tip IPSC

Deltametrinul (DMT) face parte din categoria piretrinelor semisintetice de tip II care acționează ca un

inhibitor puternic al calcineurinei (protein fosfataza 2B). Această acţiune inhibitoare are ca efect hiperexcitabilitatea

celulară prin rămânerea canalelor de calciu deschise pentru o perioadă extinsă de timp, ceea ce permite ionilor de

Ca2+

să intre în celulă.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,

100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu

5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml

înainte de tratament.

Page 10: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

10

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), deltamethryn (Sigma Aldrich) 10

µm/ml, citosporona B 50 µL/ML, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104

celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).

Pentru a evalua efectele Deltametrin (DMT) asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din

celule au fost incubate cu 10 µl/ml DMT, respectiv 10 µl/ml DMT + 50 µL/ml CsB în mediu complet timp de 24 h,

la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu

stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24-48 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2

- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.3.8. Efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial

Alpidem, cunoscut şi sub denumirea de 2-3-cloro-8-(4-clorofenil)-1,7-diazabiciclo[4.3.0]nona-2,4,6,8-

tetraen-9-yl]-N,N-dipropil-acetamide (Sigma-Aldrich) este un antagonist puternic al receptorilor periferici de

benzodiazepine (PBR), care este situat pe membrana mitocondrială exterioară și interacționează cu porii de tranziție

a permeabilității mitocondriilor (MPT). Alpidem este un medicament anxiolitic din familia imidazopiridinelor.

Alpidem acționează selectiv asupra receptorilor de subtip α3 și în mai mică măsură, la subtipul α1 (Kd de 0.33nM și

respectiv 1.67nM), al receptorului benzodiazepinic.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,

100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu

5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml

înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), IL-3 murină recombinantă (Sigma-

Aldrich), alpidem (Sigma Aldrich) 10 µm/ml, citosporona B 50 µL/ML, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml

(Sigma-Aldrich.

După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml prin adaos de mediu

stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10%

FBS).

Pentru a evalua efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au

fost incubate cu 10 µl/ml ALP, respectiv 10 µl/ml ALP + 50 µL/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi

atmosferă cu 5% CO2.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu

stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Page 11: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

11

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24-48 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2

- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.3.9. Efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial

Celulele IPSC au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de

cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), DCU (Sigma Aldrich) 10 µm/ml

,citosporonaB 50 µL/ML, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104

celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).

Pentru a evalua efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost

incubate cu 10 µl/ml DCU, respectiv 10 µl/ml DCU + 50 µL/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi

atmosferă cu 5% CO2.

Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu

stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24-48 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2

- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.3.10. Efectele acidului 9 cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial

Acidul 9-cis-retinoic (9-R) este un analog de vitamină A, care inhibă proliferarea celulară și induce

diferențierea celulară. Acidul 9-cis-retinoic este un inhibitor al COX-2 și un activator de RAR alfa, RAR beta, RAR

gamma și RXR.

Am utilizat culturi celulare de tip iPSC şi stem mezenchimale care au fost menţinute în mediu stem,

suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în

incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o

densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.

Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +

Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), acid 9-cis retinoic (Sigma-Aldrich)

10µl/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).

După centrifugare, suspensia de celule iPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104

celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,

100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).

Page 12: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

12

Pentru a evalua efectele acidului 9-cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial, am

utilizat solutii de lucru de 9-R 10µL/ml . Au fost pregatite probe din fiecare solutie cu 10 µl/ml în mediu complet

timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Celulele iPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu

stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte

din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un

ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.

Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei

suspensii de celule iPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.

Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la

37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele

martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux

Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM

. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2

- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

7.6.1.

2.4. Rezultate Pentru detectarea variaţiilor potenţialului electric transmembranar (ΔΨ) la nivel de celulă sau de

mitocondrie am utilizat cationul lipofilic iodură de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil-carbocianină

(numit simplu JC-1). Această moleculă este capabilă să pătrundă selectiv în membrana mitocondriilor şi îşi modifică

reversibil culoarea de la verde la oranj, odată cu creşterea ΔΨm peste valori de aproximativ 80-100 mV. Această

proprietate se datorează formării reversibile a agregatelor JC-1 în condiţiile polarizării membranei mitocondriale,

care determină modificarea emisiei luminii de la 530 nm (emisia JC-1 sub formă de monomer) la 590 nm (emisia

JC-1 sub formă de agregate), când fluoroforul este excitat la 490 nm. Pe măsură ce membrana mitocondrială devine

mai polarizată, culoarea fluoroforului se modifică de la verde la oranj. Ambele culori pot fi detectate cu ajutorul

filtrelor montate pe majoritatea citometrelor de flux, astfel că emisia verde (JC-1 monomer) poate fi analizată în

canalul de fluorescenţă 1 (FL1), iar emisia oranj (JC-1 agregate), în FL2. Avantajul folosirii JC-1 este că analiza

probei se poate face atât calitativ, prin observarea modificării fluorescenţei de la verde la oranj, cât şi cantitativ,

considerând intensitatea fluorescenţei pure detectate atât în FL1, cât şi în FL2 (Cossarizza şi Salvioli, 2001).

În cazul experimentelor prezente, imaginile obţinute la analizarea citofluorimetrică a martorului JC-1 pentru

celulele iPSC, respectiv stem mezenchimale, sunt prezentate în figura 2.1. şi figura 2.2.

Figura 2.1. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul JC-1 la 24 h

pentru celulele iPSC

Page 13: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

13

Figura 2.2. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul JC-1 la 24 h

pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.3. Histogramele de fluorescenţă pentru martorul JC-1 la 24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.4. Histogramele de fluorescenţă pentru martorul JC-1 pentru celulele stem mezenchimale

Page 14: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

14

Analiza imaginilor obţinute prin citometrie de flux a probelor martor pentru JC-1 la 24 h evidenţiază

predominanţa clară a agregatelor de JC-1 faţă de forma monomerică, reflectând predominanţa celulelor cu

mitocondrii polarizate.

Rolul controlului pozitiv este de verificare a funcţionalităţii fluoroforului şi de asemenea de a putea stabili

corect setările citometrului. Prin incubarea celulelor cu 10 µM valinomicină, un ionofor de K+ care exercită un efect

toxic şi determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial, am obţinut o populaţie de celule în care aproape

toate mitocondriile erau depolarizate, indicând cadranul în care se vor regăsi ulterior celulele cu caracteristici

similare.

Figura 2.5. Control pozitiv cu valinomicină la 24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.6. Control pozitiv cu valinomicină la 24 h pentru celulele stem mezenchimale

Analiza imaginilor achiziţionate evidenţiază scăderea marcată a populaţiei de celule cu mitocondrii

polarizate la 24 h din proba martor pozitiv comparativ cu martorul de JC-1, ca urmare a acţiunii KCl 137 mM, fiind

cunoscut faptul că KCl induce reducerea potenţialului transmembranar mitocondrial, mediată prin depolarizarea

membranei mitocondriale atât pentru celulele iPSC, cât şi pentru celulele stem mezenchimale.

Page 15: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

15

Figura 2.7. Histogramele de fluorescenţă pentru controlul cu valinomicină la 24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.8. Histogramele de fluorescenţă pentru controlul cu valinomicină la 24 h pentru celulele stem

mezenchimale

Figura 2.9. Distribuţia raportului agregate/monomer după tratarea celulelor cu KCl 137 mM la 24 h pentru

celulele iPSC

Page 16: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

16

Figura 2.10. Distribuţia raportului agregate/monomer după tratarea celulelor cu KCl 137 mM la 24 h pentru

celulele stem mezenchimale

Figura 2.11. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu KCl 137 mM la 24 h pentru celulele

iPSC

Figura 2.12. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu KCl 137 mM la 24 h pentru celulele

stem mezenchimale

Page 17: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

17

Figura 2.13. Efectele ionomicinei 5 µM asupra ΔΨm în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca

2+ la 24 h

pentru celulele iPSC

Figura 2.14. Efectele ionomicinei 5 µM asupra ΔΨm în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca

2+ la 24 h

pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.15. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu ionomicină 5 µM la 24 h pentru celulele

iPSC

Page 18: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

18

Figura 2.16. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu ionomicină 5 µM la 24 h pentru celulele

stem mezenchimale

Figura 2.17. Efectele Citosporonei B (50 µM) asupra ΔΨm în condiţiile asocierii tratamentului cu

Ciclosporină A (1 µM) la 24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.18. Efectele Citosporonei B (50 µM) asupra ΔΨm în condiţiile asocierii tratamentului cu

Ciclosporină A (1 µM) la 24 h pentru celulele stem mezenchimale

Page 19: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

19

Figura 2.19. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu Citosporonă B (50 µM) în

prezenţa Ciclosporinei A (1 µM) la 24 h

Figura 2.20. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Citosporonă B (50

µM) în prezenţa Ciclosporinei A (1 µM) la 24 h

Figura 2.21. Efectele ciclosporinei A (CsA) 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele iPSC

Page 20: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

20

Figura 2.22. Efectele ciclosporinei A (CsA) 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.23. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu CsA 1 µM la 24 h

Figura 2.24. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu CsA 1 µM la 24 h

Page 21: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

21

Figura 2.25. Efectele Citosporonei B (CnB) 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele iPSC

Figura 2.26. Efectele Citosporonei B (CnB) 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.27. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu CnB 50 µM în prezenţa Ca2+

la 24

h

Page 22: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

22

Figura 2.28. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu CnB 50 µM în

prezenţa Ca2+

la 24 h

Figura 2.29. Efectele Tyrphostin AG 1295 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele iPSC

Figura 2.30. Efectele Tyrphostin AG 1295 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele stem mezenchimale

Page 23: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

23

Figura 2.31. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu Tyrphostin AG 1295 10 µM 24 h

Figura 2.32. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Tyrphostin AG

1295 10 µM 24 h

Figura 2.33. Efectele Tyrphostin AG 494 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele iPSC

Page 24: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

24

Figura 2.34. Efectele Tyrphostin AG 494 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h

pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.35. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu Tyrphostin AG 494 10 µM 24 h

Figura 2.36. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Tyrphostin AG 494

10 µM 24 h

Page 25: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

25

Figura 2.37. Efectele DMT 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la

24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.38. Efectele DMT 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la

24 h pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.39. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu DMT 1 µM şi Citosporonă B 50

µM 24 h

Page 26: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

26

Figura 2.40. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DMT 1 µM şi

Citosporonă B 50 µM 24 h

Figura 2.41. Efectele DMT 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele

iPSC

Figura 2.42. Efectele DMT 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele

stem mezenchimale

Page 27: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

27

Figura 2.43. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu DMT 1 µM 24 h

Figura 2.44. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DMT 1 µM 24 h

Figura 2.45. Efectele ALP 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la

24 h pentru celulele iPSC

Page 28: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

28

Figura 2.46. Efectele ALP 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la

24 h pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.47. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu ALP 1 µM şi Citosporonă B 50

µM 24 h

Figura 2.48. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu ALP 1 µM şi

Citosporonă B 50 µM 24 h

Page 29: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

29

Figura 2.49. Efectele ALP 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.50. Efectele ALP 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem

mezenchimale

Figura 2.51. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu ALP 1 µM 24 h

Page 30: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

30

Figura 2.52. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu ALP 1 µM 24 h

Figura 2.53. Efectele DCU 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la

24 h pentru celulele iPSC

Figura 2.54. Efectele DCU 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la

24 h pentru celulele stem mezenchimale

Page 31: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

31

Figura 2.55. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu DCU 1 µM şi Citosporonă B 50

µM 24 h

Figura 2.56. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DCU 1 µM şi

Citosporonă B 50 µM 24 h

Figura 2.57. Efectele acidului 9-cis retinoic 10 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului

membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele iPSC

Page 32: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

32

Figura 2.58. Efectele acidului 9-cis retinoic 10 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului

membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale

Figura 2.59. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu acid 9-cisretinoiuc 10 µM şi

Citosporonă B 50 µM 24 h

Figura 2.60. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu acid 9-cisretinoiuc

10 µM şi Citosporonă B 50 µM 24 h

Page 33: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

33

CONCLUZII FINALE

Activitățile experimentale s-au concentrat pe identificarea unui transportator celular adecvat la nivelul

ochiului, care să nu altereze relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare.

Astfel, primul obiectiv a fost reprezentat de obţinerea celulelor stem iPSC din fibroblastele gingivale de

şobolan prin creştere pe o matrice 3D (Reinnervate). Acestea au fost comparate cu celule stem mezenchimale,

obţinute din creasta iliacă de şobolan.

Apoptoza celor două tipuri celulare de mai sus a fost testată exhaustiv, având în vedere faptul că reprezintă

o etapă deosebită în toleranţa tisulară, la nivelul retinei, dar şi o modalitate de administrare ţintită a medicamentelor

şi nanoparticulelor la acest nivel, utilizând “sinuciderea celulară” ca modalitate terapeutică. Acesta a fost cel de al

doilea obiectiv major al studiului prezent.

Am utilizat fibroblastele gingivale de şobolan pentru obţinerea celulelor stem pluripotente induse pentru că

sunt mai uşor de obţinut şi la îndemână, având în vedere experienţa colectivului de îndrumare. Dezvoltarea

administrării celulelor modificate genetic va fi realizată în viitor tot pe şobolan ca model experimental.

Pentru obţinerea iPSC din fibroblastele gingivale am utilizat o tehnică simplă, fără vectori virali, respectiv

un amestec chimic format din 10 µM 5-bromo-2’-deoxiuridină, 10 µM CHIR99021, 10 µM Repsox şi 50 µM

forskolin. În plus, am utilizat un agonist al receptorului acidului retinoic, AM580, în concentraţie de 100 nM, cu un

randament mărit al procesului de aproximativ 20 ori.

Pentru evidenţierea transformării de tip iPSC am utilizat anticorpi specifici anti-fosfatază alcalină, anti-

Nanog şi anti-SSEA1 şi citometria de flux.

Atât celulele iPSC, induse din fibroblastele gingivale de şobolan, cât şi celulele mezenchimale din creasta

iliacă de şobolan, au fost separate înainte de experiment prin citometrie de flux selectivă, utilizând anticorpi selectivi

marcaţi cu fluoresceină.

În decursul dezvoltării, ambele linii celulare au prezentat caracteristici morfologice de celule embrionare în

cultură, demonstrând încă o dată apartenenţa la acest tip celular. Totuşi, celulele stem mezenchimale, obţinute din

creasta iliacă de şobolan au fost mult mai puţin stabile, numărul de pasaje posibile fiind foarte redus.

În ceea ce priveşte apoptoza indusă experimental au existat diferenţe semnificative între celulele iPSC şi

celulele stem mezenchimale.

În primul rând, pentru ambele tipuri celulare, apoptoza indusă de Citosporona B în prezenţa Ciclosporinei A

a fost evidentă, dar mult mai importantă pentru celulele de tip iPSC. Acest lucru demonstrează implicarea Nur77 în

apoptoză în prezenţa blocării calcineurinei.

În prezenţa Tyrphostin AG 494, DMT şi acidului 9-cis-retinoic mecanismele apoptotice se declanşează

pentru celulele de tip iPSC, nu şi pentru cele stem mezenchimale, demonstrând implicarea unor mecanisme specifice:

inhibarea calcineurinei, inhibarea epoxid hidrolazei importante în biosinteza mediatorilor inflamaţiei şi a

mecanismelor ce induc diferenţierea celulară.

Următoarea etapă va fi reprezentată de o nouă conversie a celulelor iPSC către derivate ale epiteliului

retinian şi aplicarea acestora în ţintirea terapeutică.

Page 34: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

34

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA

ABE, T., TAKEDA, Y., YAMADA, K., AKAISHI, K., TOMITA, H., SATO, M. & TAMAI, M. 1999.

Cytokine gene expression after subretinal transplantation. Tohoku J Exp Med, 189, 179-89.

AGRAWAL, V., TOTTEY, S., JOHNSON, S. A., FREUND, J. M., SIU, B. F. & BADYLAK, S. F. 2011.

Recruitment of progenitor cells by an extracellular matrix cryptic peptide in a mouse model of digit amputation.

Tissue Eng Part A, 17, 2435-43.

AGREN, A., EDGREN, G., AMBROSIO, D., GRYFELT, G., OSTLUND, A. & WIKMAN, A. 2016.

Haemostasis monitored in stored red blood cells, plasma and platelet concentrates in the proportion of 4 : 4 : 1

diluted with crystalloids and colloids. Blood Coagul Fibrinolysis, 27, 334-9.

BABIZHAYEV, M. A. & YEGOROV, Y. E. 2015. Tissue formation and tissue engineering through host

cell recruitment or a potential injectable cell-based biocomposite with replicative potential: Molecular mechanisms

controlling cellular senescence and the involvement of controlled transient telomerase activation therapies. J Biomed

Mater Res A, 103, 3993-4023.

BAKER, D. E., HARRISON, N. J., MALTBY, E., SMITH, K., MOORE, H. D., SHAW, P. J., HEATH, P.

R., HOLDEN, H. & ANDREWS, P. W. 2007. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis

in vivo. Nat Biotechnol, 25, 207-15.

BARRITT, P. W. 1992. General practitioners and asthma. Thorax, 47, 669-70.

BARRY, P. J., RONAN, N. & PLANT, B. J. 2015. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

modulators: the end of the beginning. Semin Respir Crit Care Med, 36, 287-98.

BELIZARIO, J. E., ALVES, J., OCCHIUCCI, J. M., GARAY-MALPARTIDA, M. & SESSO, A. 2007. A

mechanistic view of mitochondrial death decision pores. Braz J Med Biol Res, 40, 1011-24.

BENEDIKT, J., INYUSHIN, M., KUCHERYAVYKH, Y. V., RIVERA, Y., KUCHERYAVYKH, L. Y.,

NICHOLS, C. G., EATON, M. J. & SKATCHKOV, S. N. 2012. Intracellular polyamines enhance astrocytic

coupling. Neuroreport, 23, 1021-5.

BERKOWITZ, B. A., ROBERTS, R., STEMMLER, A., LUAN, H. & GRADIANU, M. 2007. Impaired

apparent ion demand in experimental diabetic retinopathy: correction by lipoic Acid. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48,

4753-8.

CAILLET-BOUDIN, M. L., BUEE, L., SERGEANT, N. & LEFEBVRE, B. 2015. Regulation of human

MAPT gene expression. Mol Neurodegener, 10, 28.

CALDWELL, J. L., SMITH, C. E., TAYLOR, R. F., KITMITTO, A., EISNER, D. A., DIBB, K. M. &

TRAFFORD, A. W. 2014. Dependence of cardiac transverse tubules on the BAR domain protein amphiphysin II

(BIN-1). Circ Res, 115, 986-96.

CALLOE, K., DI DIEGO, J. M., HANSEN, R. S., NAGLE, S. A., TREAT, J. A. & CORDEIRO, J. M.

2016. A dual potassium channel activator improves repolarization reserve and normalizes ventricular action

potentials. Biochem Pharmacol, 108, 36-46.

CAO, Z., LI, X., ZOU, X., GREENWOOD, M., GERWICK, W. H. & MURRAY, T. F. 2015. Involvement

of JNK and caspase activation in hoiamide A-induced neurotoxicity in neocortical neurons. Mar Drugs, 13, 903-19.

CAPPELLARI, O., BENEDETTI, S., INNOCENZI, A., TEDESCO, F. S., MORENO-FORTUNY, A.,

UGARTE, G., LAMPUGNANI, M. G., MESSINA, G. & COSSU, G. 2013. Dll4 and PDGF-BB convert committed

skeletal myoblasts to pericytes without erasing their myogenic memory. Dev Cell, 24, 586-99.

CHUNG, S., KIM, I. H., LEE, D., PARK, K., KIM, J. Y., LEE, Y. K., KIM, E. J., LEE, H. W., CHOI, J. S.,

SON, G. H., SUN, W., SHIN, K. S. & KIM, H. 2016. The role of inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A in

regulating emotional behavior and amygdala function. Sci Rep, 6, 23757.

CHWEE, J. Y., KHATOO, M., TAN, N. Y. & GASSER, S. 2016. Apoptotic Cells Release IL1 Receptor

Antagonist in Response to Genotoxic Stress. Cancer Immunol Res, 4, 294-302.

Page 35: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

35

COLWELL, A. S., LONGAKER, M. T. & LORENZ, H. P. 2003. Fetal wound healing. Front Biosci, 8,

s1240-8.

CORRADI, V., VERGANI, P. & TIELEMAN, D. P. 2015. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance

Regulator (CFTR): CLOSED AND OPEN STATE CHANNEL MODELS. J Biol Chem, 290, 22891-906.

CORREA, F., BUELNA-CHONTAL, M., CHAGOYA, V., GARCIA-RIVAS, G., VIGUERAS, R. M.,

PEDRAZA-CHAVERRI, J., GARCIA-NINO, W. R., HERNANDEZ-PANDO, R., LEON-CONTRERAS, J. C. &

ZAZUETA, C. 2015. Inhibition of the nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate pathway limited the

cardioprotective effect of post-conditioning in hearts with apical myocardial infarction. Eur J Pharmacol, 765, 472-

81.

CORVOL, H., THOMPSON, K. E., TABARY, O., LE ROUZIC, P. & GUILLOT, L. 2016. Translating the

genetics of cystic fibrosis to personalized medicine. Transl Res, 168, 40-9.

DONOHUE, P. J., ALBERTS, G. F., HAMPTON, B. S. & WINKLES, J. A. 1994. A delayed-early gene

activated by fibroblast growth factor-1 encodes a protein related to aldose reductase. J Biol Chem, 269, 8604-9.

DOZMOROV, M., WU, W., CHAKRABARTY, K., BOOTH, J. L., HURST, R. E., COGGESHALL, K. M.

& METCALF, J. P. 2009. Gene expression profiling of human alveolar macrophages infected by B. anthracis spores

demonstrates TNF-alpha and NF-kappab are key components of the innate immune response to the pathogen. BMC

Infect Dis, 9, 152.

DU, Y., BUDMAN, H. M. & DUEVER, T. A. 2016. Classification of Normal and Apoptotic Cells from

Fluorescence Microscopy Images Using Generalized Polynomial Chaos and Level Set Function. Microsc Microanal,

1-12.

DU, Y., VEENSTRA, A., PALCZEWSKI, K. & KERN, T. S. 2013. Photoreceptor cells are major

contributors to diabetes-induced oxidative stress and local inflammation in the retina. Proc Natl Acad Sci U S A, 110,

16586-91.

DURAN-GONZALEZ, J., MICHI, E. D., ELORZA, B., PEREZ-CORDOVA, M. G., PACHECO-

OTALORA, L. F., TOUHAMI, A., PAULSON, P., PERRY, G., MURRAY, I. V. & COLOM, L. V. 2013. Amyloid

beta peptides modify the expression of antioxidant repair enzymes and a potassium channel in the septohippocampal

system. Neurobiol Aging, 34, 2071-6.

EBRAHIM, M., MULAY, S. R., ANDERS, H. J. & THOMASOVA, D. 2015. MDM2 beyond cancer:

podoptosis, development, inflammation, and tissue regeneration. Histol Histopathol, 30, 1271-82.

ELSAYED, A. M., ABDELGHANY, T. M., AKOOL EL, S., ABDEL-AZIZ, A. A. & ABDEL-BAKKY,

M. S. 2016. All-trans retinoic acid potentiates cisplatin-induced kidney injury in rats: impact of retinoic acid

signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 389, 327-37.

ENGLAND, P. J. 1986. Intracellular calcium receptor mechanisms. Br Med Bull, 42, 375-83.

ENZMANN, V., FAUDE, F., WIEDEMANN, P. & KOHEN, L. 2000. The local and systemic secretion of

the pro-inflammatory cytokine interleukin-6 after transplantation of retinal pigment epithelium cells in a rabbit

model. Curr Eye Res, 21, 530-4.

FADILAH, S. A., VUCKOVIC, S., KHALIL, D. & HART, D. N. 2007. Cord blood CD34+ cells cultured

with FLT3L, stem cell factor, interleukin-6, and IL-3 produce CD11c+CD1a-/c- myeloid dendritic cells. Stem Cells

Dev, 16, 849-55.

FEDICK, A., JALAS, C. & TREFF, N. R. 2014. A deleterious mutation in the PEX2 gene causes Zellweger

syndrome in individuals of Ashkenazi Jewish descent. Clin Genet, 85, 343-6.

FELIZOLA, S. J., MAEKAWA, T., NAKAMURA, Y., SATOH, F., ONO, Y., KIKUCHI, K., ARITOMI,

S., IKEDA, K., YOSHIMURA, M., TOJO, K. & SASANO, H. 2014. Voltage-gated calcium channels in the human

adrenal and primary aldosteronism. J Steroid Biochem Mol Biol, 144 Pt B, 410-6.

HAZRA, S., JARAJAPU, Y. P., STEPPS, V., CABALLERO, S., THINSCHMIDT, J. S., SAUTINA, L.,

BENGTSSON, N., LICALZI, S., DOMINGUEZ, J., KERN, T. S., SEGAL, M. S., ASH, J. D., SABAN, D. R.,

BARTELMEZ, S. H. & GRANT, M. B. 2013. Long-term type 1 diabetes influences haematopoietic stem cells by

reducing vascular repair potential and increasing inflammatory monocyte generation in a murine model.

Diabetologia, 56, 644-53.

Page 36: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

36

HE, S., WANG, H. M., YE, J., OGDEN, T. E., RYAN, S. J. & HINTON, D. R. 1994. Dexamethasone

induced proliferation of cultured retinal pigment epithelial cells. Curr Eye Res, 13, 257-61.

HEESE, K., LOW, J. W. & INOUE, N. 2006. Nerve growth factor, neural stem cells and Alzheimer's

disease. Neurosignals, 15, 1-12.

HELLINGMAN, C. A., KOEVOET, W., KOPS, N., FARRELL, E., JAHR, H., LIU, W., BAATENBURG

DE JONG, R. J., FRENZ, D. A. & VAN OSCH, G. J. 2010. Fibroblast growth factor receptors in in vitro and in vivo

chondrogenesis: relating tissue engineering using adult mesenchymal stem cells to embryonic development. Tissue

Eng Part A, 16, 545-56.

HOLTHOFF, H. P., GOEBEL, S., LI, Z., FASSBENDER, J., REIMANN, A., ZEIBIG, S., LOHSE, M. J.,

MUNCH, G. & UNGERER, M. 2015. Prolonged TSH receptor A subunit immunization of female mice leads to a

long-term model of Graves' disease, tachycardia, and cardiac hypertrophy. Endocrinology, 156, 1577-89.

JAFARI, A., NOURSADEGHI, E., KHODAGHOLI, F., SAGHIRI, R., SAUVE, R., ALIAGHAEI, A. &

ELIASSI, A. 2015. Brain mitochondrial ATP-insensitive large conductance Ca(+)(2)-activated K(+) channel

properties are altered in a rat model of amyloid-beta neurotoxicity. Exp Neurol, 269, 8-16.

JAHNS, R., SCHLIPP, A., BOIVIN, V. & LOHSE, M. J. 2010. Targeting receptor antibodies in immune

cardiomyopathy. Semin Thromb Hemost, 36, 212-8.

JANSSEN, L. J., MUKHERJEE, S. & ASK, K. 2015. Calcium Homeostasis and Ionic Mechanisms in

Pulmonary Fibroblasts. Am J Respir Cell Mol Biol, 53, 135-48.

JEKLOVA, E., LEVA, L., JAGLIC, Z. & FALDYNA, M. 2008. Dexamethasone-induced

immunosuppression: a rabbit model. Vet Immunol Immunopathol, 122, 231-40.

JEPPS, T. A., OLESEN, S. P., GREENWOOD, I. A. & DALSGAARD, T. 2016. Molecular and functional

characterization of Kv 7 channels in penile arteries and corpus cavernosum of healthy and metabolic syndrome rats.

Br J Pharmacol, 173, 1478-90.

JIA, F., WILSON, K. D., SUN, N., GUPTA, D. M., HUANG, M., LI, Z., PANETTA, N. J., CHEN, Z. Y.,

ROBBINS, R. C., KAY, M. A., LONGAKER, M. T. & WU, J. C. 2010. A nonviral minicircle vector for deriving

human iPS cells. Nat Methods, 7, 197-9.

JIN, N., JIN, X., GU, X., NA, W., ZHANG, M. & ZHAO, R. 2015. Screening biomarkers of bladder cancer

using combined miRNA and mRNA microarray analysis. Mol Med Rep, 12, 3170-6.

JIPU, R., AMITITELOAIE, C., ZONDA, G. I., IANCU, R. I., CARASEVICI, E. & COSTULEANU, M.

2012. Thapsigargin-induced endoplasmic reticulum stress is not accompanied by mitochondrial membrane potential

dissipation in murine pro-B cells. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 116, 557-62.

KIKUCHI, H., MIURA, H., YAMAMOTO, H., TAKEUCHI, T., DEI, T. & WATANABE, M. 1989.

Characteristic sequences in the upstream region of the human tyrosinase gene. Biochim Biophys Acta, 1009, 283-6.

KIM, D. H., PARK, H. K., PARK, Y. H., LEE, S. H., JOO, H. C., LEE, S., YOUN, Y. N. & SHIN, H. J.

2015. Degenerative Calcification of Pericardial Bioprostheses: Comparison of Five Implantation Methods in a

Rabbit Model. J Heart Valve Dis, 24, 621-8.

KIM, J. B., SEBASTIANO, V., WU, G., ARAUZO-BRAVO, M. J., SASSE, P., GENTILE, L., KO, K.,

RUAU, D., EHRICH, M., VAN DEN BOOM, D., MEYER, J., HUBNER, K., BERNEMANN, C., ORTMEIER, C.,

ZENKE, M., FLEISCHMANN, B. K., ZAEHRES, H. & SCHOLER, H. R. 2009. Oct4-induced pluripotency in adult

neural stem cells. Cell, 136, 411-9.

KIM, K. S., PARK, J. M., KONG, T., KIM, C., BAE, S. H., KIM, H. W. & MOON, J. 2015. Retinal

angiogenesis effects of TGF-beta1, and paracrine factors secreted from human placental stem cells in response to a

pathological environment. Cell Transplant.

KIM, N., MIN, K. W., KANG, K. H., LEE, E. J., KIM, H. T., MOON, K., CHOI, J., LE, D., LEE, S. H. &

KIM, J. W. 2014. Regulation of retinal axon growth by secreted Vax1 homeodomain protein. Elife, 3, e02671.

KIM, W. S., ZHU, Y., DENG, Q., CHIN, C. J., HE, C. B., GRIECO, A. J., DRAVID, G. G., PAREKH, C.,

HOLLIS, R. P., LANE, T. F., BOUHASSIRA, E. E., KOHN, D. B. & CROOKS, G. M. 2014. Erythropoiesis from

human embryonic stem cells through erythropoietin-independent AKT signaling. Stem Cells, 32, 1503-14.

Page 37: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

37

KLUEVA, J., GUNDELFINGER, E. D., FRISCHKNECHT, R. R. & HEINE, M. 2014. Intracellular

Ca(2)(+) and not the extracellular matrix determines surface dynamics of AMPA-type glutamate receptors on aspiny

neurons. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 369, 20130605.

KOCAB, A. J. & DUCKETT, C. S. 2016. Inhibitor of apoptosis proteins as intracellular signaling

intermediates. FEBS J, 283, 221-31.

KRAFT, D., RALL, M., VOLCIC, M., METZLER, E., GROO, A., STAHL, A., BAUER, L.,

NASONOVA, E., SALLES, D., TAUCHER-SCHOLZ, G., BONIG, H., FOURNIER, C. & WIESMULLER, L.

2015. NF-kappaB-dependent DNA damage-signaling differentially regulates DNA double-strand break repair

mechanisms in immature and mature human hematopoietic cells. Leukemia, 29, 1543-54.

KRITIS, A. A., STAMOULA, E. G., PANISKAKI, K. A. & VAVILIS, T. D. 2015. Researching glutamate

- induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Front Cell Neurosci, 9, 91.

KUCUKALI, C. I., KURTUNCU, M., AKCAY, H. I., TUZUN, E. & OGE, A. E. 2015. Peripheral nerve

hyperexcitability syndromes. Rev Neurosci, 26, 239-51.

LAI, C. C., GOURAS, P., DOI, K., TSANG, S. H., GOFF, S. P. & ASHTON, P. 2000. Local

immunosuppression prolongs survival of RPE xenografts labeled by retroviral gene transfer. Invest Ophthalmol Vis

Sci, 41, 3134-41.

LANGE, I. & KOOMOA, D. L. 2014. MycN promotes TRPM7 expression and cell migration in

neuroblastoma through a process that involves polyamines. FEBS Open Bio, 4, 966-75.

LE GUEN, L., MARCHAL, S., FAURE, S. & DE SANTA BARBARA, P. 2015. Mesenchymal-epithelial

interactions during digestive tract development and epithelial stem cell regeneration. Cell Mol Life Sci, 72, 3883-96.

LEE, P., HOCK, A. K., VOUSDEN, K. H. & CHEUNG, E. C. 2015. p53- and p73-independent activation

of TIGAR expression in vivo. Cell Death Dis, 6, e1842.

LEE, W. S., JOO, Y. D., OH, K. H., WON, H. J., LEE, S. M., CHOI, M. Y., HAN, G. H., PARK, S. G.,

CHOI, I. W., CHOI, I. & SEO, S. K. 2012. G-CSF-induced myeloid cells stimulated by TLR2 enhance engraftment

after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Immunol Lett, 143, 177-83.

LIU, Z., CAI, H., DANG, Y., QIU, C. & WANG, J. 2016. Adenosine triphosphate-sensitive potassium

channels and cardiomyopathies (Review). Mol Med Rep, 13, 1447-54.

LOGOTHETIS, D. E., MAHAJAN, R., ADNEY, S. K., HA, J., KAWANO, T., MENG, X. Y. & CUI, M.

2015. Unifying Mechanism of Controlling Kir3 Channel Activity by G Proteins and Phosphoinositides. Int Rev

Neurobiol, 123, 1-26.

LONG, Y., WANG, M., GU, H. & XIE, X. 2015. Bromodeoxyuridine promotes full-chemical induction of

mouse pluripotent stem cells. Cell Res, 25, 1171-4.

LOPEZ-CONTRERAS, A. J., DE LA MORENA, M. E., RAMOS-MOLINA, B., LAMBERTOS, A.,

CREMADES, A. & PENAFIEL, R. 2013. The induction of cardiac ornithine decarboxylase by beta2 -adrenergic

agents is associated with calcium channels and phosphorylation of ERK1/2. J Cell Biochem, 114, 1978-86.

LORENZ, H. P., LONGAKER, M. T., PERKOCHA, L. A., JENNINGS, R. W., HARRISON, M. R. &

ADZICK, N. S. 1992. Scarless wound repair: a human fetal skin model. Development, 114, 253-9.

LU, B., ZHU, D., HINTON, D., HUMAYUN, M. S. & TAI, Y. C. 2012. Mesh-supported submicron

parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices, 14, 659-67.

LUTZ, A., SANWALD, J., THOMAS, M., FEUER, R., SAWODNY, O., EDERER, M., BORNER, C.,

HUMAR, M. & MERFORT, I. 2014. Interleukin-1beta enhances FasL-induced caspase-3/-7 activity without

increasing apoptosis in primary mouse hepatocytes. PLoS One, 9, e115603.

MACCONI, D., REMUZZI, G. & BENIGNI, A. 2014. Key fibrogenic mediators: old players. Renin-

angiotensin system. Kidney Int Suppl (2011), 4, 58-64.

MOEHRLE, B. M., NATTAMAI, K., BROWN, A., FLORIAN, M. C., RYAN, M., VOGEL, M.,

BLIEDERHAEUSER, C., SOLLER, K., PROWS, D. R., ABDOLLAHI, A., SCHLEIMER, D., WALTER, D.,

MILSOM, M. D., STAMBROOK, P., PORTEUS, M. & GEIGER, H. 2015. Stem Cell-Specific Mechanisms Ensure

Genomic Fidelity within HSCs and upon Aging of HSCs. Cell Rep, 13, 2412-24.

Page 38: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

38

MONTALDO, E., VITALE, C., COTTALASSO, F., CONTE, R., GLATZER, T., AMBROSINI, P.,

MORETTA, L. & MINGARI, M. C. 2012. Human NK cells at early stages of differentiation produce CXCL8 and

express CD161 molecule that functions as an activating receptor. Blood, 119, 3987-96.

MONTEZUMA, S. R., LOEWENSTEIN, J., SCHOLZ, C. & RIZZO, J. F., 3RD 2006. Biocompatibility of

materials implanted into the subretinal space of Yucatan pigs. Invest Ophthalmol Vis Sci, 47, 3514-22.

MU, C., YANG, Y., LUO, Z., GUAN, L. & ZHU, W. 2016. The Colonic Microbiome and Epithelial

Transcriptome Are Altered in Rats Fed a High-Protein Diet Compared with a Normal-Protein Diet. J Nutr, 146, 474-

83.

NAFFAA, M. M., CHEBIB, M., HIBBS, D. E. & HANRAHAN, J. R. 2015. Comparison of templates for

homology model of rho1 GABAC receptors: More insights to the orthosteric binding site's structure and

functionality. J Mol Graph Model, 62, 43-55.

NEHME, R., GROTE, P., TOMASI, T., LOSER, S., HOLZKAMP, H., SCHNABEL, R. & CONRADT, B.

2010. Transcriptional upregulation of both egl-1 BH3-only and ced-3 caspase is required for the death of the male-

specific CEM neurons. Cell Death Differ, 17, 1266-76.

NEWTON, F. G., HARRIS, R. E., SUTCLIFFE, C. & ASHE, H. L. 2015. Coordinate post-transcriptional

repression of Dpp-dependent transcription factors attenuates signal range during development. Development, 142,

3362-73.

NICHOLS, J. M., MAIELLARO, I., ABI-JAOUDE, J., CURCI, S. & HOFER, A. M. 2015. "Store-

operated" cAMP signaling contributes to Ca2+-activated Cl- secretion in T84 colonic cells. Am J Physiol

Gastrointest Liver Physiol, 309, G670-9.

OBUROGLU, L., ROMANO, M., TAYLOR, N. & KINET, S. 2016. Metabolic regulation of hematopoietic

stem cell commitment and erythroid differentiation. Curr Opin Hematol, 23, 198-205.

OCANA, A., PEREZ-PENA, J., DIEZ-GONZALEZ, L., SANCHEZ-CORRALES, V., TEMPLETON, A.,

SERUGA, B., AMIR, E. & PANDIELLA, A. 2016. Transcriptomic analyses identify association between mitotic

kinases, PDZ-binding kinase and BUB1, and clinical outcome in breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 156, 1-8.

PUCKERIN, A., AROMOLARAN, K. A., CHANG, D. D., ZUKIN, R. S., COLECRAFT, H. M.,

BOUTJDIR, M. & AROMOLARAN, A. S. 2016. hERG 1a LQT2 C-terminus truncation mutants display hERG 1b-

dependent dominant negative mechanisms. Heart Rhythm, 13, 1121-30.

PUHL, A. C., MILTON, F. A., CVORO, A., SIEGLAFF, D. H., CAMPOS, J. C., BERNARDES, A.,

FILGUEIRA, C. S., LINDEMANN, J. L., DENG, T., NEVES, F. A., POLIKARPOV, I. & WEBB, P. 2015.

Mechanisms of peroxisome proliferator activated receptor gamma regulation by non-steroidal anti-inflammatory

drugs. Nucl Recept Signal, 13, e004.

RAJAIYA, J., YOUSUF, M. A., SINGH, G., STANISH, H. & CHODOSH, J. 2012. Heat shock protein 27

mediated signaling in viral infection. Biochemistry, 51, 5695-702.

RAJASHEKHAR, G., RAMADAN, A., ABBURI, C., CALLAGHAN, B., TRAKTUEV, D. O., EVANS-

MOLINA, C., MATURI, R., HARRIS, A., KERN, T. S. & MARCH, K. L. 2014. Regenerative therapeutic potential

of adipose stromal cells in early stage diabetic retinopathy. PLoS One, 9, e84671.

RAMASWAMY, S., JAIN, S. & RAVINDRAN, V. 2016. Hematopoietic stem cell transplantation for auto

immune rheumatic diseases. World J Transplant, 6, 199-205.

RANGASAMY, S., JU, H., UM, S., OH, D. C. & SONG, J. M. 2015. Mitochondria and DNA Targeting of

5,10,15,20-Tetrakis(7-sulfonatobenzo[b]thiophene) Porphyrin-Induced Photodynamic Therapy via Intrinsic and

Extrinsic Apoptotic Cell Death. J Med Chem, 58, 6864-74.

RATAJCZAK, J., SHIN, D. M., WAN, W., LIU, R., MASTERNAK, M. M., PIOTROWSKA, K.,

WISZNIEWSKA, B., KUCIA, M., BARTKE, A. & RATAJCZAK, M. Z. 2011. Higher number of stem cells in the

bone marrow of circulating low Igf-1 level Laron dwarf mice--novel view on Igf-1, stem cells and aging. Leukemia,

25, 729-33.

REDDY, J. K. & CHU, R. 1996. Peroxisome proliferator-induced pleiotropic responses: pursuit of a

phenomenon. Ann N Y Acad Sci, 804, 176-201.

Page 39: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

39

ROSENBERG, A. R., SYRJALA, K. L., MARTIN, P. J., FLOWERS, M. E., CARPENTER, P. A., SALIT,

R. B., BAKER, K. S. & LEE, S. J. 2015. Resilience, health, and quality of life among long-term survivors of

hematopoietic cell transplantation. Cancer, 121, 4250-7.

ROSEWEIR, A. K., QAYYUM, T., LIM, Z., HAMMOND, R., MACDONALD, A. I., FRASER, S.,

OADES, G. M., AITCHISON, M., JONES, R. J. & EDWARDS, J. 2016. Nuclear expression of Lyn, a Src family

kinase member, is associated with poor prognosis in renal cancer patients. BMC Cancer, 16, 229.

SALIBA, A., DU, Y., LIU, H., PATEL, S., ROBERTS, R., BERKOWITZ, B. A. & KERN, T. S. 2015.

Photobiomodulation Mitigates Diabetes-Induced Retinopathy by Direct and Indirect Mechanisms: Evidence from

Intervention Studies in Pigmented Mice. PLoS One, 10, e0139003.

SCARDIGLI, R., CAPELLI, P., VIGNONE, D., BRANDI, R., CECI, M., LA REGINA, F., PIRAS, E.,

CINTOLI, S., BERARDI, N., CAPSONI, S. & CATTANEO, A. 2014. Neutralization of nerve growth factor impairs

proliferation and differentiation of adult neural progenitors in the subventricular zone. Stem Cells, 32, 2516-28.

SHABIR, I., KHURANA, M. L., JOSEPH, A. A., EUNICE, M., MEHTA, M. & AMMINI, A. C. 2015.

Phenotype, genotype and gender identity in a large cohort of patients from India with 5alpha-reductase 2 deficiency.

Andrology, 3, 1132-9.

SHAHIDULLAH, M., MANDAL, A. & DELAMERE, N. A. 2015. Damage to lens fiber cells causes

TRPV4-dependent Src family kinase activation in the epithelium. Exp Eye Res, 140, 85-93.

SHAIKH, S. A., SAHOO, S. K. & PERIASAMY, M. 2016. Phospholamban and sarcolipin: Are they

functionally redundant or distinct regulators of the Sarco(Endo)Plasmic Reticulum Calcium ATPase? J Mol Cell

Cardiol, 91, 81-91.

SHAO, R. G., CAO, C. X., NIEVES-NEIRA, W., DIMANCHE-BOITREL, M. T., SOLARY, E. &

POMMIER, Y. 2001. Activation of the Fas pathway independently of Fas ligand during apoptosis induced by

camptothecin in p53 mutant human colon carcinoma cells. Oncogene, 20, 1852-9.

SHENG, Y., GOURAS, P., CAO, H., BERGLIN, L., KJELDBYE, H., LOPEZ, R. & ROSSKOTHEN, H.

1995. Patch transplants of human fetal retinal pigment epithelium in rabbit and monkey retina. Invest Ophthalmol Vis

Sci, 36, 381-90.

SHOSHAN-BARMATZ, V., BEN-HAIL, D., ADMONI, L., KRELIN, Y. & TRIPATHI, S. S. 2015. The

mitochondrial voltage-dependent anion channel 1 in tumor cells. Biochim Biophys Acta, 1848, 2547-75.

SIEBER, T. & DOBNER, T. 2007. Adenovirus type 5 early region 1B 156R protein promotes cell

transformation independently of repression of p53-stimulated transcription. J Virol, 81, 95-105.

SINGER, A. J. & CLARK, R. A. 1999. Cutaneous wound healing. N Engl J Med, 341, 738-46.

SINGH, R., PHILLIPS, M. J., KUAI, D., MEYER, J., MARTIN, J. M., SMITH, M. A., PEREZ, E. T.,

SHEN, W., WALLACE, K. A., CAPOWSKI, E. E., WRIGHT, L. S. & GAMM, D. M. 2013. Functional analysis of

serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci, 54, 6767-78.

SKIBSBYE, L., WANG, X., AXELSEN, L. N., BOMHOLTZ, S. H., NIELSEN, M. S., GRUNNET, M.,

BENTZEN, B. H. & JESPERSEN, T. 2015. Antiarrhythmic Mechanisms of SK Channel Inhibition in the Rat

Atrium. J Cardiovasc Pharmacol, 66, 165-76.

SONG, Y. 2016. Function of Membrane-Associated Proteoglycans in the Regulation of Satellite Cell

Growth. Adv Exp Med Biol, 900, 61-95.

SOO, C., SHAW, W. W., ZHANG, X., LONGAKER, M. T., HOWARD, E. W. & TING, K. 2000.

Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue-derived inhibitors in cutaneous wound repair.

Plast Reconstr Surg, 105, 638-47.

TSAI, F. Y., CHENG, Y. T. & TSOU, T. C. 2014. A recombinant PPRE-driven luciferase bioassay for

identification of potential PPAR agonists. Vitam Horm, 94, 427-35.

TSE, G. & YEO, J. M. 2015. Conduction abnormalities and ventricular arrhythmogenesis: The roles of

sodium channels and gap junctions. Int J Cardiol Heart Vasc, 9, 75-82.

TSUCHIYA, Y., NAKABAYASHI, O. & NAKANO, H. 2015. FLIP the Switch: Regulation of Apoptosis

and Necroptosis by cFLIP. Int J Mol Sci, 16, 30321-41.

Page 40: UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE … Doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru degenerarea ... au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și ... Tacrolimus

40

TUBY, H., MALTZ, L. & ORON, U. 2011. Induction of autologous mesenchymal stem cells in the bone

marrow by low-level laser therapy has profound beneficial effects on the infarcted rat heart. Lasers Surg Med, 43,

401-9.

TUKAJ, S., ZILLIKENS, D. & KASPERKIEWICZ, M. 2015. Heat shock protein 90: a pathophysiological

factor and novel treatment target in autoimmune bullous skin diseases. Exp Dermatol, 24, 567-71.

TUNBAK, H., GEORGIOU, C., GUAN, C., RICHARDSON, W. D. & CHITTKA, A. 2016. Zinc fingers 1,

2, 5 and 6 of transcriptional regulator, PRDM4, are required for its nuclear localisation. Biochem Biophys Res

Commun.

TZENG, H. H., HSU, C. H., CHUNG, T. H., LEE, W. C., LIN, C. H., WANG, W. C., HSIAO, C. Y., LEU,

Y. W. & WANG, T. H. 2015. Cell Signaling and Differential Protein Expression in Neuronal Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal Stem Cells with Hypermethylated Salvador/Warts/Hippo (SWH) Pathway Genes. PLoS One,

10, e0145542.

VIDAL-SANZ, M., VALIENTE-SORIANO, F. J., ORTIN-MARTINEZ, A., NADAL-NICOLAS, F. M.,

JIMENEZ-LOPEZ, M., SALINAS-NAVARRO, M., ALARCON-MARTINEZ, L., GARCIA-AYUSO, D.,

AVILES-TRIGUEROS, M., AGUDO-BARRIUSO, M. & VILLEGAS-PEREZ, M. P. 2015. Retinal

neurodegeneration in experimental glaucoma. Prog Brain Res, 220, 1-35.

WANG, F., YAN, Z., LIU, Z., WANG, S., WU, Q., YU, S., DING, J. & DAI, Q. 2016. Molecular basis of

toxicity of N-type calcium channel inhibitor MVIIA. Neuropharmacology, 101, 137-45.

WATERHAM, H. R. & EBBERINK, M. S. 2012. Genetics and molecular basis of human peroxisome

biogenesis disorders. Biochim Biophys Acta, 1822, 1430-41.

WEN, X., WU, J., WANG, F., LIU, B., HUANG, C. & WEI, Y. 2013. Deconvoluting the role of reactive

oxygen species and autophagy in human diseases. Free Radic Biol Med, 65, 402-10.

WENKEL, H. & STREILEIN, J. W. 2000. Evidence that retinal pigment epithelium functions as an

immune-privileged tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41, 3467-73.

WESA, A. K. & GALY, A. 2001. Regulation of T cell cytokine production by dendritic cells generated in

vitro from hematopoietic progenitor cells. Cell Immunol, 208, 115-24.

WEST, D. C., SHAW, D. M., LORENZ, P., ADZICK, N. S. & LONGAKER, M. T. 1997. Fibrotic healing

of adult and late gestation fetal wounds correlates with increased hyaluronidase activity and removal of hyaluronan.

Int J Biochem Cell Biol, 29, 201-10.

XU, H., WASHINGTON, S., VERDERAME, M. F. & MANNI, A. 2008. Role of non-receptor and receptor

tyrosine kinases (TKs) in the antitumor action of alpha-difluoromethylornithine (DFMO) in breast cancer cells.

Breast Cancer Res Treat, 112, 255-61.

XU, J. H., YANG, Z. B., WANG, H. & TANG, F. R. 2014. Co-localization of L-type voltage dependent

calcium channel alpha 1D subunit (Ca(v)1.3) and calbindin (CB) in the mouse central nervous system. Neurosci Lett,

561, 80-5.

YOKOTA, J., CHOSA, N., SAWADA, S., OKUBO, N., TAKAHASHI, N., HASEGAWA, T., KONDO,

H. & ISHISAKI, A. 2014. PDGF-induced PI3K-mediated signaling enhances the TGF-beta-induced osteogenic

differentiation of human mesenchymal stem cells in a TGF-beta-activated MEK-dependent manner. Int J Mol Med,

33, 534-42.

YU, G. J., CHOI, I. W., KIM, G. Y., HWANG, H. J., KIM, B. W., KIM, C. M., KIM, W. J., YOO, Y. H. &

CHOI, Y. H. 2015. Induction of reactive oxygen species-mediated apoptosis by purified Schisandrae semen essential

oil in human leukemia U937 cells through activation of the caspase cascades and nuclear relocation of mitochondrial

apoptogenic factors. Nutr Res, 35, 910-20.

YVON, C., RAMSDEN, C. M., LANE, A., POWNER, M. B., DA CRUZ, L., COFFEY, P. J. & CARR, A.

J. 2015. Using Stem Cells to Model Diseases of the Outer Retina. Comput Struct Biotechnol J, 13, 382-9.

ZHANG, H., LIU, J., SUN, S., PCHITSKAYA, E., POPUGAEVA, E. & BEZPROZVANNY, I. 2015.

Calcium signaling, excitability, and synaptic plasticity defects in a mouse model of Alzheimer's disease. J

Alzheimers Dis, 45, 561-80.