universitatea „alexandru ioan cuza”iaŞi · pdf filefacultatea de biologie...

UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA”IAŞI FACULTATEA DE BIOLOGIE

PROGRAM IDEI Cod CNCSIS 2100 Tema 1040/2009

STUDIUL COMPLEX AL FILOSFEREI UNOR SPECII DE PLANTE DIN COLECTIILE GRĂDINII BOTANICE IAŞI

REZULTATE – 2010

(RAPORT )

Frunzele, tulpinile, florile şi fructele plantelor sunt frecvent colonizate de microorganisme epifile (bacterii, alge albastre-verzi, alge verzi, levuri, licheni si chiar briofite), pentru care acestea reprezintă habitate adecvate. Microflora epifitică specifică, existentă în habitatul adiacent aparatului foliar, formează filosfera, prin analogie cu rizosfera, iar cea din habitatul direct asociat cu frunza formează fitoplanul.

Filosfera constituie un micromediu ale cărui particularităţi sunt dependente atât de condiţiile oferite de frunză: compoziţia şi cantitatea de nutrienţi, inclusiv de carbohidraţi, acizi organici si aminoacizi care susţin creşterea comunităţilor de microorganisme filosferice şi care depind de specia de plantă, de vârsta frunzei, de starea fiziologică a acesteia şi de prezenţa deteriorărilor tisulare, cât şi de condiţiile mediului fizic în care se dezvoltă plantele şi de disponibilitatea de migrare microorganismelor. În acelaşi timp suprafaţa frunzelor oferă condiţii foarte heterogene dezvoltării microorganismelor datorită cantităţilor variabile de apă provenită din precipitaţii, rouă, gutaţie (mai ales pe timpul nopţii), a temperaturilor variabile în limite extrem de largi (până la 45-550C ziua şi numai 5-100C noaptea), a iluminării cu intensităţi diferite pe parcursul zilei, cât si a prezenţei radiaţiilor UV puternice (FENIN şi colab., 1989; YANG şi colab., 2000; JACOBS şi SUNDIN, 2001)(cf. VARMA şi colab., 2003); (SUNDIN şi MORRIS, 2004). Prin urmare, cu toate că microorganismele trăiesc pe un substrat sub care există condiţii foarte bune în ceea ce priveşte aportul de apă şi concentraţia nutrienţilor, suprafaţa frunzei este un mediu cu condiţii total nefavorabile, datorită faptului că, în mod obişnuit, rezervele subcuticulare sunt rar accesibile microorganismelor ce se găsesc pe suprafaţa frunzei (SCHÖNNER şi BAUER,1996)(cf. VARMA şi colab., 2003).

Aceasta variaţie a condiţiilor oferite de filosferă determină diversitatea populaţiilor de microorganisme, care sunt fie ocazionale, fie rezidente pe suprafaţa frunzei. Actualmente există dovezi considerabile referitoare la faptul că bacteriile formează agregate heterogene de mari dimensiuni pe suprafeţele vegetale. Examinările microscopice ale frunzelor colonizate au arătat că pe suprafeţele vegetale se găsesc numeroase microorganisme epifite în agregate mari de specii bacteriene mixte care cuprind şi fungi (LINDOW, 2002; MORRIS şi colab., 1997, 1998) ) (cf. VARMA şi colab., 2003). Asemenea agregate pot constitui 30% până la 80% din totalul de populaţii bacteriene la unele specii vegetale; având o proporţie şi structură similară cu cea a biofilmelor care se dezvoltă în habitate acvatice, ele se găsesc probabil doar pe frunze mature din climatele umede, cum sunt tropicele sau regiunile temperate umede din nord-vestul Pacificului (ANDREWS şi HARRIS, 2000) ) (cf. VARMA şi colab., 2003). Aglomerările bacteriene de pe majoritatea altor plante au dimensiuni considerabile şi pot fi mai degrabă numite agregate; formarea lor pe plante are implicaţii importante pentru abilitatea acestor microorganisme de a coloniza şi de a supravieţui mediului neprielnic al filosferei, capacitatea de agregare asigurându-le o modalitate de a modifica mediul din imediata lor apropiere în acest habitat.

Matricea densă care înconjoară celulele din cadrul agregatelor poate duce la concentrarea nutrienţilor, beneficiu evolutiv deosebit al bacteriilor epifite, dat fiind faptul că filosfera este un mediu sărac în nutrienţi. Rezultatele recente indică faptul că agregatele celulare de pe frunze sunt mult mai tolerante la stresul hidric comparativ cu celulele solitare. În acest fel celulele bacteriene din cadrul agregatelor ar putea avea capacitatea de a-şi modifica microhabitatul de pe suprafaţa foliară, profitând de starea de sănătate a plantelor gazdă.

Se poate deci considera faptul că suprafeţele lipofile ale frunzelor formează microhabitate pentru multe microorganisme, cu toate că, în ceea ce priveşte condiţiile de viaţă asigurate (prezenţa apei şi disponibilitatea nutrienţilor, precum şi condiţiile climaterice) acestea sunt departe de a fi optime.

Ca urmare, există încă o serie de întrebări care merită atenţia unor cercetări ulterioare. Utilizând metode de biologie moleculară, se speră a se ajunge la o descriere mai apropiată de realitate a

diversităţii în ceea ce priveşte componenţa speciilor în filosferă, experimentele fiziologice urmând să analizeze în mod detaliat mecanismele ce stau la baza diferitele interacţiuni ce au loc între microorganismele epifile şi cuticula plantelor.

O întrebare importantă în acest sens urmăreşte în ce măsură agregarea de specii epifite diferite ce formează biofilme duce la creşterea „sănătăţii” lor ecologice în filosferă.

Răspunzând la aceste întrebări în viitor se speră a se îmbunătăţi cunoaşterea ecologiei microbiene a filosferei. În contextul datelor anterior prezentate, cercetările derulate prin prezentul proiect îşi propun clarificarea unor aspecte fundamentale legate de structurarea si funcţionarea filosferei la specii din familia Lamiaceae, cât şi la alte specii de plante a căror apart foliar reprezintă suportul existenţei unor comunităţi bacteriene (specii de Dioscorea) sau care au structuri idividualizate strict, ca sediu al comunităţilor bacteriene (noduli foliari bine individualizaţi morfologic şi anatomic-(specii de Ardisia), prin continuarea investigaţiilor de factură anatomo-histologică, fiziologică, biochimică, şi microbiologică.

Dorim astfel să consolidăm, prin rezultate practice, conceptele actuale despre filosfera plantelor, unanim recunoscută astăzi ca realitate biologică în regnul vegetal, dar evidenţiată strict doar pentru un număr redus de plante.

1. Elaborarea şi parcurgerea unui model experimental optim caracterizării filosferei la specii aparţinând genului

Ocimum şi Perovskia, cultivate în condiţii naturale. 1.1. Cultivarea şi caracterizarea macro- şi micromorfologică a microorganismelor din filosfera unor specii de

Ocimum şi Perovskia în condiţii diferite de cultivare oferite de Grădina Botanică din Iaşi Izolarea microorganismelor de pe frunzele de Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia s-a realizat pe parcursul a două etape corespunzătoare unor fenofaze diferite (vegetativ şi înflorire). Pentru izolarea microorganismelor de pe suprafeţele foliare ale unor plante aparţinând speciilor Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia s-au utilizat două metode: amprentarea, respectiv însămânţarea la suprafaţa mediului de cultură a unor diluţii zecimale provenite din suspensii microbiene în apă distilată sterilă. Atât pentru izolare cât şi pentru cultivarea ulterioară a tulpinilor bacteriene s-au folosit aceleaşi condiţii: agar nutritiv, temperatură de incubare: 280 C, timp: 24-48 ore. Pentru păstrare s-au pregătit culturi stoc (glicerol 30 %) menţinute la -800 C.

Caracterizarea macro- şi micro-morfologică a tulpinilor microbiene izolate din filosfera speciei Ocimum

basilicum Pentru descrierea caracterelor macro-morfologice ale tulpinilor izolate s-au urmărit o serie de caractere ale

coloniilor precum: forma, aspectul marginilor, profilul coloniei, consistenţa, transparenţa/opacitatea, suprafaţa şi culoarea. Pe baza acestor caractere au fost izolate un număr total de 19 tulpini diferite. Principalele caractere macro-morfologice ale tulpinilor bacteriene izolate sunt prezentate în Tabelul 1, Foto 1-6 (Anexa).

Pentru descrierea caracterelor micro-morfologice, s-au efectuat frotiuri colorate după metoda Gram (Dunca et al., 2004). Examinarea s-a realizat cu ajutorul microscopului Olympus CH2, folosindu-se obiectivul de imersie (putere totală de mărire 1000 x). Principalele caractere analizate ale tulpinilor izolate sunt prezentate în Tabelul 2 (Anexă).

Analiza micro-morfologică a tulpinilor izolate a evidenţiat faptul că microbiota filosferică a speciei Ocimum basilicum este relativ puţin diversificată din punct de vedere morfologic, fiind reprezentată predominant prin bacterii de tip bacilar (73,69 %, Foto 7), dar şi de tipul cocoid (15,78 %, Foto 8), respectiv cocobacilar (10,52%, Foto 9) – Fig. 1.

Foto 7 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii O3FV3 (1000 x)



73,69%

15,78%

10,52%

tip morfologic bacilartip morfologic cocoidtip morfologic cocobacilar

Fig. 1 - Principalele tipuri morfologice de bacterii izolate din filosfera plantelor de Ocimum basilicum

Caracterizarea macro- şi micro-morfologică a tulpinilor microbiene izolate din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia

În urma analizei macro-morfologice a coloniilor bacteriene dezvoltate pe suprafaţa mediului de cultură au fost selectate 25 de tulpini diferite. Principalele caractere macro- şi micro-morfologice ale acestor tulpini sunt prezentate în Tabelul 3, Tabelul 4, respectiv Foto 10 - 15 (Anexa). Analizele efectuate au permis evidenţierea unei populaţii microbiene puţin diversificată din punct de vedere morfologic în filosfera plantelor de Perovskia atriplicifolia. În cadrul acestei polulaţii predominant este tipul bacilar (22 tulpini) – Foto 16, 17, însă au fost descrise şi 3 tulpini reprezentate morfologic prin tipul cocoid – Foto 18 (Fig. 2).

Foto 16 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii FV 2 (1000 x)

Foto 17 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii F2-2d (1000 x)

Foto 18 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii FV3 (1000 x)

88%

12%

tip morfologic bacilartip morfologic cocoid

Fig. 2 - Principalele tipuri morfologice de bacterii izolate din filosfera plantelor de Perovskia atriplicifolia

Prezenţa unor populaţii microbiene puţin diversificate în filosfera speciilor Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia poate fi explicată prin particularităţile eco-fiziologice ale celor două plante. Capacitatea acestora de a produce metaboliţi secundari (uleiuri volatile) cu proprietăţi antimicrobiene (Basher et al., 1997; Burt, 2004) limitează gradul de colonizare cu microorganisme a suprafeţelor foliare. Investigaţii similare efectuate de Karamanoli şi colab. pe plante de origine mediteraneană (lavandă, rozmarin, salvie şi oregano) au evidenţiat diferenţe în ceea ce priveşte colonizarea suprafeţelor foliare în funcţie de cantitatea de compuşi fenolici produşi de fiecare specie în parte (Karamanoli et al., 2000). Cel mai mare grad de colonizare a fost observat la lavandă, acesta fiind corelat cu concentraţia cea mai mică de uleiuri volatile produsă şi prin urmare cu cea mai slabă activitate antibacteriană dintre toate speciile investigate. 2. Caracterizarea filosferei în corelaţie cu particularităţile morfo-anatomice şi fiziologice ale aparatului foliar şi cu productia de uleiuri volatile la specii de Ocimum si Perovskia, în condiţii naturale de cultivare şi/sau condiţii de seră, în ciclul ontogenetic al plantelor 2.1. Caracterizarea fiziologică a microorganismelor din filosfera unor specii de Ocimum şi Perovskia în momente ontogenetice diferite În vederea caracterizării fiziologice s-a optat pentru utilizarea testelor Api 50CH (Biomerieux). Avantajul acestor teste constă, pe de o parte, în posibilitatea evaluării potenţialului metabolic al microorganismelor de a utiliza diferite surse de carbon (carbohidraţi şi derivaţi ai acestora: heterozide, polialcooli, acizi uronici etc.), iar pe de altă parte în oportunitatea identificării taxonomice a tulpinilor bacteriene filosferice. Api 50 CH este un sistem standardizat care asociază 50 teste biochimice pentru studiul metabolismului carbohidraţilor la microorganisme. Sistemul este utilizat împreună cu mediul Api 50 CHB pentru identificarea genului Bacillus şi a genurilor înrudite. Este compus din 50 microtuburi cu substraturi utilizate pentru evidenţierea proceselor de fermentaţie ale glucidelor şi derivaţilor. Pentru hidratarea substraturilor din microtuburi s-a utilizat mediul Api 50 CHB inoculat cu o suspensie din cultura de 24 ore a bacteriei de testat. După introducerea mediului inoculat în microtuburi, galeriile au fost incubate 24 ore la 280 C. În timpul incubării, desfăşurarea proceselor de fermentaţie este evidenţiată printr-o modificare a culorii din roşu (control negativ, poziţia 0) în galben (reacţie pozitivă, pozi�iile 1-49) ca urmare a producerii de acid detectată de un indicator de pH prezent în microtuburi.

Pentru realizarea acestor teste au fost selectate (pe baza caracterelor micro-morfologice) 7 tulpini izolate din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia şi 4 tulpini din filosfera speciei Ocimum basilicum (Foto 16-26) recoltate în două

etape corespunzătoare unor fenofaze diferite (vegetativ şi înflorire). Au fost alese doar tulpinile reprezentate morfologic prin bacili. Rezultatele analizelor efectuate demonstrează că microorganismele care populează suprafeţele foliare ale celor două plante investigate utilizează cu precădere monoglucidele, toate tulpinile testate metabolizând D-glucoza, D-fructoza, dar şi esculina – un glicozid, derivat al glucozei cu cumarina - Fig. 3 (Tabelul 6 – Anexa). De asemenea, 81 % din tulpinile testate utilizează D-maltoza, D-trehaloza, D-riboza şi N-acetiglucozamina.

Nici una din tulpinile testate nu au fost capabile să metabolizeze eritrolul, D-arabinoza, D şi L-xiloza, dulcitolul, inozitolul, sorbitolul, ş.a.

Preferinţele metabolice ale bacteriilor filosferice testate sunt asemănătoare majorităţii microorganismelor, ele utilizând cu preferinţă monoglucidele simple (Morris et al., 1996).

54

94

51111

61

51

92

811

85

1011

89

11

87

11

31

0 2 4 6 8 10 12

Gluconat de potasiuD-tagatozăD-turanozăGentibiozăGlicogenAmidonD-rafinozăInulinăD-trehalozăD-zaharozăD-melibiozăD-lactozăD-maltozăD-celobiozăSalicinăEsculinăArbutinăAmigdalinăN-acetiglucozaminăMetil D-glucopiranozidD-manitolL-ramnozăD-manozăD-fructozăD-glucozăD-galactozăD-xilozăD-ribozăL-arabinozăGlicerol

Fig. 3 – Utilizarea surselor de C de către tulpinile bacteriene izolate din filosfera speciilor

Perovskia atriplicifolia şi Ocimum basilicum (Api 50CH)

Utilizarea testelor API 50CH şi a programului Apiweb au permis identificarea taxonomică a celor 11 tulpini bacteriene testate (Tabelul 6). Rezultatele obţinute demonstrează că microbiota ce se dezvoltă pe suprafaţa foliară la cele două specii de plante este puţin diversificată, fiind reprezentată prin Bacillus cereus şi Bacillus pummilus la Perovskia atriplicifolia, respectiv prin Bacillus mycoides şi Bacillus pummilus la Ocimum basilicum. Datele confirmă concluziile descrierii morfologice a tulpinilor testate, cauza diversităţii scăzute fiind probabil legată de capacitatea celor două plante de a produce uleiuri volatile. Datorită efectului antimicrobian indus de aceste uleiuri, pe suprafaţa frunzelor nu se poate dezvolta o comunitate de microorganisme foarte bine reprezentată din punct de vedere calitativ.

Tabelul 6 – Încadrarea taxonomică a tulpinilor izolate din filosfera speciilor Perovskia atriplicifolia şi Ocimum basilicum (Api 50CH)

Nr. crt.

Tulpina Genul Specia % identificare

1 F1-2v Bacillus cereus 89,1 2 FB1 Bacillus cereus 97,8 3 FM1 Bacillus lentus 65,2 4 FV2 Bacillus pummilus 99,8 5 FB6 Bacillus pummilus 64,6 6 FM3 Geobacillus thermoglucosidasius 58,8

Nr. crt.

Tulpina Genul Specia % identificare

7 F2-6 Bacillus mycoides 71,9 8 O3FV3 Bacillus pummilus 99,9 9 O3FV1 Bacillus mycoides 73,3

10 O4FV2 Bacillus mycoides 88,5 11 O3FD2 Bacillus mycoides 71,9

2.2. Caracterizarea morfologică a limbului foliar la specii de Ocimum şi Perovskia (microscopie optică) în corelaţie cu intensitatea unor procese fiziologice fundamentale (fotosinteză, respiraţie, activitate catalazică si peroxidazică, conţinut de pigmenţi asimilatori) şi cu producţia de uleiuri volatile

Materialul vegetal investigat morfo-anatomic (microscopie optică) este reprezentat de frunze de Ocimum basilicum L. şi de Perovskia atriplicifolia Benth. Cultivate în zona de cercetare. Protocolul de pregătire a materialului vegetal în vederea secţionării impune fixarea materialului proaspăt în alcool etilic 70% şi parcurgerea ulterioară a următoarelor etape: Secţionarea materialul vegetal; javelizarea secţiunilor; colorarea secţiunilor cu verde iod şi roşu ruteniu; montarea secţiunilor în glicero-gelatină.

Preparatele obţinute au fost analizate şi fotografiate la microscopul fotonic Novex (Holland) Investigaţiile realizate asupra aparatului foliar al speciilor Ocimum basilicum L. şi Perovskia atriplicifolia Benth.

confirmă o serie de date din literatura de specialitate referitoare la particularităţile structurale ale lamiaceelor în general, dar aduc şi informaţii noi referitoare la:

• prezenţa perilor secretori în ambele epiderme ale limbului foliar la ambele specii; • cei mai numeroşi sunt perii secretori cu bază unicelulară, pedicel unicelular şi parte secretoare bicelulară

(prezenţi mai cu seamă pe tulpină), precum şi cei cu partea secretoare tetra- (rar octo-) celulară (prezenţi mai cu seamă pe frunze); mai puţin numeroşi sunt perii cu pedicel bicelular şi parte secretoare unicelulară (prezenţi mai cu seamă pe tulpină) în cazul speciei Ocimum basilicum L.;

• la Perovskia atriplicifolia Benth. s-au observat numeroşi peri secretori cu parte secretoare bicelulară şi un număr mai mic de peri cu partea secretoare pluricelulară.

Pentru analiza parametrilor funcţionali - proces de fotosinteză (A) şi respiraţie (R) - a fost folosit aparatul portabil de determinare „in vivo” LCi, rezultatele raportându-se la gradul de iluminare de care a beneficiat aparatul fotosintetic al plantelor (Q leaf). Aparatul LCi funcţionează după următorul principiu: Componenta LCi (camera frunzei) este construită special pentru utilizarea pe teren. Scopul ei este acela de a măsura parametrii mediului frunzei cuprinşi între cele două fălci ale camerei şi de a calcula activitatea de fotosinteză a plantei. Instrumentul este alcătuit dintr-o consolă principală ce conţine un ecran cu cristale lichide, LCD, o tastatură cu 5 taste şi un sistem de operare cu sistem de potenţare a semnalului, controlat de un microprocesor, o unitate de aer şi un card de stocare a datelor. Camera frunzei conţine placa de circuite PCA-275A, alcătuită din circuitele de condiţionare şi pre-amplificate a temperaturii din cameră şi a frunzei, şi senzorii PAR ( Radiaţiile Active Fotosintetice). Cei doi senzori ce utilizează radiaţii laser oferă reperele şi semnalele de analiză a umidităţii, iar bancul Optic Infraroşu este folosit la analiza CO

2. Consola centrală asigură un aport constant de aer cu o concentraţie relativ stabilă de CO2. Concentraţiile de CO2 şi

H2O sunt măsurate şi se asigură un curent de aer peste ambele feţe ale frunzei. Apoi se analizează calitatea aerului care

iese, determinându-se cantitatea (mai scăzută) de CO2 şi cantitatea (mai crescută) de H2O. Cunoscându-se rata de circulaţie a aerului şi diferenţele de concentraţie a gazelor, se calculează şi se actualizează ratele de asimilaţie şi transpiraţie aproximativ o dată pe secundă, iar un ciclu complet de analiză durează aproximativ 20 de secunde, în funcţie de cantitatea fluxului de aer folosit. Sistemul măsoară atât temperatura frunzei, a camerei şi a aerului, PAR-ul (Radiaţiile Active Fotosintetice) şi presiunea atmosferică. Se calculează PAR-ul la nivelul frunzei şi media energiei radiante a frunzei. Datele măsurate şi calculate sunt afişate pe ecranul LCD plasat pe faţa consolei.

Înregistrarea parametrilor s-a realizat în etape ontogenetice succesive (vegetativ, înflorire, fructificare), pe un nuăr de 5 frunze pentru ficare individ analizat (câte 5 indivizi la fiecare determinare). Rezultatele obţinute reprezintă astfel media aritmetică a citirilor efectuate.

Tabelul 7 Valorile medii ale ritmului fotosintetic şi respirator la Perovkia atriplicifolia pe parcursul perioadei de vegetaţie a anului 2010

Q leaf 89.2 312.6 264.8 200.6 279.4 A 1.598 3.61 5.502 4.386 6.512 R 0.146 0.174 2.714 1.8 2.388

Q leaf 1034.88 229.32 92.28 A 48.8216 4.3216 1.412 R 0.5612 1.4444 4.9

Analizând, ritmul fotosintetic (A) şi respirator (R) la Perovskia atriplicifolia (Figura 4), în funcţie de gradul de

insolaţie de care a beneficiat aparatul său foliar (Q leaf), observăm o reducere a procesului fotosintetic, odată cu parcurgerea ciclului ontogenetic, maximum fotosintetic înregistrându-l frunzele în etapa vegetativă, de tinereţe structurală, când structurile fotosintetice aveau un potenţial funcţional maxim, în timp ce procesul respirator debutează cu valori minime, se intensifică vizibil în etapa de înflorire (motivat, probabil, de necesarul energetic sporit al plantelor pentru constituirea aparatului reproducător), pentru a se finaliza la cote maxime, cerute, pe cât se pare, de formarea organelor de înmulţire, care necesită pentru constituire un efort energetic sporit al întregului organism vegetal. Conţinutul de pigmenţi asimilatori foliari (Figura 5), dozat prin metoda spectrofotometrică pe extracte acetonice (Artenie şi Tănase, 1982), se pliază, prin valorile înregistrate pe ritmul fotosintetic discutat, anterior

Qleaf 1364 1434.8 262.8 1101.6 1011.2

A 2.492 20.766 35.408 54.238 131.204

R -0.076 -0.444 0.252 1.818 1.256

Q leaf 56.6 58.2 67 198.8 80.8 A 0.904 1.316 1.718 2.124 0.998 R 4.432 4.774 4.902 5.06 5.332

Tabelul 8 - Ritmului mediul al proceselor fotosintetic şi repirator la Perovkia atrilicifolia pe parcursul perioadei de vegetaţie a anului 2010

Fig. 4 Reprezentarea ritmului mediul al proceselor fotosintetic şi repirator la Perovkia atrilicifolia pe parcursul perioadei de vegtaţie a anului 2010

0

10

20

30

40

50

60

Vegetativ Inflorire Fructificare0

200

400

600

800

1000

1200ARQ leaf

Enzimele repiratorii peroxidaza şi catalaza, dozate prin metode spectrofotometrice specifice (Artenie şi Tănase, 1982), reprezintă, la rândul lor, indici biochimici importanţi pentru aprecierea ritmului metabolic celular în cazul aparatului foliar supus unor condiţii stresante de ambient (factori abiotici de mediu variabili, dar şi factori biotici specifici, ca de exemplu instalarea şi constituirea comunităţilor microbiene în filosfera specifică). Activităţile enzimatice investigate au demonstrat (prin înregistrările concomitente cu cele efectuate pentru procesul respirator) variaţii + / - semnificative indicând, considerăm noi, ritmuri metabolice diferite, corelate în special cu vârsta organului investigat (frunza), care răspunde unitar la acţiunea cumulată a unor factori de stres abiotic şi / sau biotic. Analiza calitativă a uleiurilor volatile produse de frunze, realizată prin metoda cromatografiei GC-MS pe probe extrase prin hisrodistilarea materialului vegetal cu un aparat de tip Clevenger, a evidenţiat compuşii caracteristici, dintre care amintim, în funcţie de procentajul de identificare eucalyptole (24.62%), o-cymene (17.87%) şi borneol (15.37%), urmaţi de γ-terpinene (6.39%), bornyl acetate (4.83%) şi camphene (4.66%). În uleiul obţinut din planta întreagă au fost identificaţi în total 32 compuşi; 27 dintre aceştia au fost identificaţi şi în uleiul din tulpini, iar 27 dintre constituenţii evidenţiaţi în planta analizată integral au fost identificaţi şi în frunze, în timp ce 24 dintre aceştia au fost detectaţi în uleiul volatil obţinut din flori (Tabelul 9, Figura 6).

Fig. 5 - Variaţia conţinutului de pigmenţi asimilatori foliari la Perovskia atriplicifolia pe parcursul perioadei de vegetaţie a anului 2010

Fig. 6 Compoziţi uleiului volatil produs de frunze de Perovskia atriplicifolia în faza de anteză

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

Cl a Cl b Pigm carot

mg/g s.pr. Stadiu vegInflorireFructificare

Pentru specia Ocimum basilicum L. ritmul fotosintetic urmează o curbă cu valori maxime în faza de anteză, de construcţie a aparatului reproducător, fază în care şi conţinutul de pigemnţi asimilatori totali şi pe forme componente (Tabelul 10), alături de conţinutul de uleiuri volatile, ca produşi secundari de maximă importanţă pentru ecologia speciei, ating valori maxime.

Tab. 9 - Compoziţia uleiurlui volatile extras în perioada de vegetaţie 2010 din Perovskia atriplicifolia prezentată pe organe analizate

Nr. Compus chimic Plantă întreagă (%) Tulpină (%) Frunze (%) Flori (%) 1 tricyclene 0.07 0.11 0.11 0.80 2 α-thujene 0.15 0.95 0.80 - 3 α-pinene 1.38 3.41 3.21 7.33 4 camphene 4.66 3.39 3.47 2.52 5 sabinene 0.27 - - - 6 β-pinene 3.58 3.03 2.37 2.90 7 3-octanone 0.08 - 0.26 - 8 β-myrcene 1.10 0.60 0.64 0.68 9 α-phellandrene 0.13 - - -

10 3-carene 0.06 - - - 11 α-terpinene 0.94 0.20 0.36 0.50 12 o-cymene 17.87 18.23 13.91 11.81 13 eucalyptole 24.62 18.44 19.70 16.30 14 γ-terpinene 6.39 1.81 1.54 4.37 15 terpinolene 0.26 0.13 0.13 0.17 16 linalool 0.73 0.62 0.86 0.57 17 α-thujone 0.20 0.25 0.18 - 18 cis-sabinol 0.30 0.34 0.20 0.34 19 camfor 0.12 0.54 0.40 0.25 20 borneol 15.37 9.61 20.41 9.71 21 terpinolene 4-ol 0.36 0.29 0.45 0.36 22 α-terpineole 0.39 0.33 0.56 0.47 23 bornil acetate 4.83 14.65 5.02 7.46 24 timol 0.15 0.40 0.49 0.40 25 carvacrol 0.15 0.49 0.53 0.27 26 α-terpinil acetate 1.77 2.76 2.07 1.40 27 β-cariophyllene 3.29 2.36 4.66 3.32 28 α-cariophyllene 3.04 2.85 5.11 3.24 28 aromadendrene 0.07 - - - 30 α-selenene 0.08 0.16 - - 31 cariophyllene oxide 1.33 6.02 4.78 2.67 32 ledol 0.26 1.06 1.60 0.81 33 trans β-ocymene - 0.20 - 0.42 34 izopropilmetilbiciclohexane 2-ol - 0.32 0.37 0.52 35 bornil formiate - 0.12 - 0.11 36 β-selinene - 0.11 - 0.33 37 δ-cadinene - 0.18 - 0.08 38 γ-cadinene - 0.23 - 0.31 39 germacrene-B - 0.27 0.15 0.98 40 trans bisabolene epoxide - 2.70 2.91 1.41 41 azulene - - 0.17 - 42 carvone - - 0.20 9.06 43 cis bisabolene epoxide - - 0.46 - 44 selinene 4-ol - - - 0.10 45 selinadiene - - - 0.64 46 germacrene D - - - 0.73 47 γ-humulene - - - 0.12 48 epi biciclosesquiphelandrene - - - 0.10 49 cis jasmone - - - 0.10 50 β-burbonene - - - 0.46 51 dehidrocarvil acetate - - - 0.09 52 pupegone - - - 0.49 53 cis charveole - - - 0.12 54 trans charveole - - - 0.08 55 dehidrocharveole - - - 0.49 56 menthone - - - 0.49 57 β-thujone - - - 0.17

Intensitatea mai redusă a procesului de fotosinteză din faza vegetativă se poate explica prin suprafaţa foliară totală mai mică atinsă de aparatul vegetativ, acest moment constituind etapa de consolidare morfologică, structurală şi funcţională a aparatului fotoasimilator; spre finele cilului ontogenetic plantele investigate îşi reduc mult ca intensitate procesul fotosintetic, îmbătrânirea funcţională a structurilor fotoasimilatoare fiind clar exprimată şi de scăderea conţinutului de pigmenţi asimilatori foliari totali şi pe forme componente.

Procesul respirator are la rândul său un ritm de realizare specific, cu valori sporite pornind de la faza vegetativă

spre faza de anteză, fază intens consumatoare de resurse energetice, direcţionate cu preponderenţă pentru construirea aparatului reproducător şi pentru asigurarea proceselor metabolice suport de sinteza a numeroşi compuşi de maximă importanţă pentru viaţa indivizilor vegetali luaţi ca întreg, printre care uleiurile volatile ocupă un loc primordial; uletrior respiraţia foliară se reduce valoric semnificativ spre finele cilului de vegetaţie, iar ezimele cilului respirator (peroxidaza şi catalaza) activează, la rândul lor oarecum proporţional cu intensitatea acestui proces catabolic (Figura 7).

3. Evidenţierea particularităţilor filosferei la specii de plante (Dioscorea şi Ardisia) care manifestă grade diferite ale interrelaţiilor dintre microorganisme şi suportul foliar 3.1. Izolarea si cultivarea microorganismelor din filosfera speciilor de Dioscorea si Ardisia

În vederea izolării microorganismelor din filosfera speciilor Dioscorea batata, D. japonica şi Ardisia crenata au fost utilizate două metode:

1. Amprentarea pe agar nutritiv (Tsavkelova et al., 2007): frunze din diferite regiuni ale plantei (bază şi vârf) au fost aşezate în condiţii sterile pe suprafaţa mediului de cultură, atât pe faţa ventrală cât şi pe cea dorsală; plăcile Petri au fost ulterior incubate 48 ore la 280 C (Foto 27-28).

2. Însămânţarea la suprafaţa mediului de cultură (agar nutritiv) a unor diluţii zecimale provenite din suspensii

microbiene în apă distilată sterilă: frunze de Dioscorea batata, D. japonica şi Ardisia crenata au fost introduse în baloane cu apă distilată sterilă, agitate apoi la 190 rpm şi 280 C, timp de 30 min; din aceste suspensii au fost obţinute diluţii zecimale seriate care au fost însămânţate prin etalare (Dunca et al., 2004). Ulterior, plăcile Petri au fost incubate 72 ore la 280 C (Foto 29-31).

Tab. 10 - Variaţia conţinutului de pigmenţi asimilatori foliari la Ocimum basilicum pe parcursul perioadeid e vegetaţie a a nului 2010

Etapa ontogenetică

clorofila a (mg/g s. pr)

clorofila b (mg/g s. pr)

pig carot. (mg/g s. pr)

cl a/cl b

Vegetativ 0,51 0,22 0,00018 2,31 Înflorire 0,69 0,30 0,00026 2,30 Fructificare 0,53 0,17 0,00016 3,09

Fig. 7 - Variaţia activităţii peroxidazei şi catalazei la Ocimum basilicum pe parcursul perioadei de vegetaţie (anul 2010)

0

100

200

300

400

500

600

700

UC

vegetativ inflorire fructificare

UP/g Prot

peroxidazacatalaza

După cele trei zile de incubare s-au izolat de pe suprafaţa plăcilor cu coloniile dezvoltate (pe baza caracterelor macro-morfologice) mai multe tulpini bacteriene. Repicarea s-a făcut cu ajutorul ansei sterile, în eprubete cu mediu de cultură înclinat, având aceeaşi compoziţie cu cea a mediului iniţial folosit pentru izolare. Eprubetele însămânţate prin tehnica descrierii de striuri la suprafaţă au fost incubate la 280 C, timp de trei zile.

Foto 29 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Dioscorea batata dezvoltate pe agar nutritiv

Foto 30 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Dioscorea japonica dezvoltate pe agar nutritiv

Foto 31 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Ardisia crenata dezvoltate pe agar nutritiv Pentru verificarea purităţii tulpinilor izolate, dar şi pentru descrierea caracterelor micro-morfologice, s-au efectuat

frotiuri colorate după metoda Gram (Dunca et al., 2004) care au fost supuse examenului microscopic (1000 x). După întocmirea colecţiei, tulpinile pure s-au păstrat la temperatura de + 40 C. Au fost obţinute culturi stoc

(glicerol 30 %) pentru păstrare la -800 C. Colecţia de microorganisme astfel întocmită a servit studiilor ulterioare. 3.2. Aprecierea macro – şi micromorfologică a suprafeţei foliare la specii de Ardisia şi Dioscorea, în corelaţie cu poziţionarea comunităţilor de microorganisme pe aparatul foliar Material si metoda de lucru

Pregătirea probelor pentru SEM. Microscopul electronic cu scanare (SEM) produce imagini prin detecţia electronilor secundari, cu energie scăzută, emisii de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza

Foto 27 – Dioscorea batata - frunze bazale: amprentă pe

agar nutritiv

Foto 28 – Dioscorea japonica - frunze bazale: amprentă

pe agar nutritiv

principală de electroni. In cazul SEM, raza de electroni parcurge întreg specimenul, detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziţia razei.

În general, rezoluţia TEM este de regulă cu un ordin de mărime mai mare decât cea a SEM, dar, datorită faptului ca imaginea produsă de microscoapele cu scanare se bazează pe procese de suprafaţă şi nu pe transmisie, este capabil să vizualizeze probe mai mari, şi are o adâncime de penetrare mult mai mare, producând astfel imagini care sunt o bună reprezentare tridimensională a probei.

Operaţiunile de pregătirea a materialului biologic includ: • Recoltarea probelor – Prelevarea probelor se realizează de pe exemplare vii, secţionarea ţesuturilor realizându-

se direct intr-o picătura de fixator (glutaraldehida). • Fixarea si deshidratarea • Deshidratarea • Uscarea la punctul critic al dioxidului de carbon (cu EMS 850 Critical Point Dryer • Metalizarea probelor uscate (cu metalizorul EMS 550X Sputter Coater) este necesara pentru observarea

acestora în camera de vid a SEM. • Analiza probelor cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj TESCAN Vega II SBH, la o acceleraţie a

electronilor de 30 kV. • Măsurătorile diferiţilor parametri morfologici au fost efectuate cu ajutorul softului de morfometrie NIS – Elements

furnizat de firma Nikon. Pregătirea probelor pentru investigaţiile histo-anatomice

Materialul vegetal a fost fixat in FEA (formol: alcool etilic 70%: acid acetic glacial 5:5:90) timp de 72 de ore, apoi spălat şi conservat în alcool etilic 70%. Ulterior, a fost prelucrat fie prin imparafinare (secţiunile fiind colorate cu roşu ruteniu şi albastru de metilen) şi secţionate manual cu briciul botanic (şi colorate cu roşu ruteniu si verde iod). Fotografiile au fost efectuate la microscopul de cercetare trinocular Olympus BX50 cu camera foto digitala Olympus E 330.

Aspecte anatomice si micromorfologice la Ardisia crenata Sims

Nodulii bacterieni de pe frunzele unor specii din familia Myrsinaceae (inclusiv din genul Ardisia) au fost pentru prima dată descrişi de Hohnel (1881). Aceştia apar pe marginea frunzei şi fac parte dintr-o simbioza obligatorie pentru desfăşurarea ciclului de viaţă la aceste specii; bacteriile sunt prezente în muguri şi infectează toate primordiile foliare precum şi florile şi seminţele. Studiile au arătat că tratamentele ce distrug bacteriile se soldează cu moartea plantei (Nakahashi et al., 2005). Secţiunile transversale prin frunze tinere ne arată noduli bacterieni complet formaăi. Infectarea frunzelor are loc în stadiile timpurii ale ontogenezei printr-o stomată asemănătoare unei hidatode, care se inchide ulterior. Aceasta este de dimensiuni mai mari decât o stomată obişniută de pe frunză. După infectare, stomata se închide prin fuzionarea celulelor din camera substomatică (Miller, 1990). Partea centrală a nodozităţii este alcatuită din celule tubulare, alungite spre zona de pătrundere a bacteriilor. Aceasta apare aproape incoloră pe secţiuni proaspete, în zonele laterale observţndu-se puţine cloroplaste, mult mai mici decât cele din mezofilul adiacent. Gardner et al. (1984) descriu din punct de vedere ultrastructural cloroplastele din această regiune ca fiind aproape complet degenerate, cu membrana internă uneori dezorganizată, cu grane dezorganizate şi fără plastoglobuli. Lersten si Horner (1976) precizează faptul că bacteriile încep să se dividă după ce au intrat în celule. Prezenţa lor inhibă dezvoltatea cloroplastelor. Bacteriile sunt prezente atât intracelular, cât şi în spaţiile extracelulare. În acest stadiu nodozitatea este alcatuită doar din masa centrală de celule şi conexiunea vasculară cu ţesutul conducător al frunzei (vizibilă la partea internă a nodozităţii).

La frunza matură nodozităţile sunt de dimensiuni mult mai mari, prezintă o structură mai organizată, zona centrală compactă fiind inconjurată de o zonă vasculară continuă. Aceasta este alcatuită atât din vase conducătoare lemnoase, cât şi liberiene (în partea internă a nodozităţii) şi numai din ţesut liberian în rest. La periferia zonei vasculare se poate observa un strat de celule strâns unite între ele, dispuse ordonat (structura lor amintind de un endodermoid, cu rol, probabil în izolarea nodozităţii). Unele dintre aceste celule, situate în apropierea fasciculului conducător libero-lemnos, prezintă pereţi celulari îngroşaţi şi lignificaţi. Aceast strat protector este întrerupt doar în dreptul fostei camere substomatice prin care s-a realizat infectarea. Ţestutul conducător liberian predominant în această structură vasculară asigură translocarea substanţelor nutritive de la planta gazdă spre celulele nodozităţii (Miller, 1990). Bacteriile vii se găsesc atât în celule, cât şi în afara lor, în strânsă legătură cu peretele celulelor din stratul protector; aceasta ar sugera faptul că bacteriile ar prelua o parte din materialul parietal al gazdei pentu a-l folosi la sinteza peretelui propriu (Gardner, 1984). În nodozitatea matură, unele celule au pereţii distrusi, fapt observat şi de către Gardner (1984). În vecinătatea nodozităţii se observă numeroşi ursini de oxalat de calciu; aceştia au fost evidenţiaţi atât în lumină directă, cât şi în lumină polarizată şi prin microscopia electronică cu baleiaj. Deşi prezenţi în toată structura frunzei, numărul relativ crescut în vecinătatea nodozităţii sugerează rolul protector al acestora, cât şi realizarea unui depozit de calciu ionic, necesar metabolismului nodozităţii (calciul fiind implicat în biogeneza peretelui celular).

Foto 32 – Morfologia frunzei de Ardisia crenata (A – faţa adaxială, B – faţa abaxială) – se observă nodozităţile situate pe margine, C – secţiune transversală printr-o frunză tânără (x20) – se observă o nodozitate în curs de formare, D – secţiune transversală printr-o frunză tânără (x20) – se observă nodozitatea cu celule tubulare, alungite spre locul de pătrundere al bacteriilor, E, F – detalii cu nodozitatea din frunza tânără (x40) – se observă stomata modificată prin care s-a realizat infecţia, deschisă încă; de asemenea, putem observa fasciculul conducător ce va asigura vascularizatia nodozităţii (orig.)

Iniţierea nodulilor bacterieni se realizează timpuriu în ontogeneză, prin infectarea frunzelor cu bacterii ce se află pe suprafaţa lor (în filosferă) (Lersten, 1976). Frunzele ajunse la maturitate nu mai pot incorpora bacterii pentru a realiza acest tip de simbiozî (stomatele modificate prin care se realizeazî infecţia se inchid între timp). Nodulii bacterieni de la speciile de Ardisia au fost consideraţi ca fiind hidatode modificate (Miehe, 1911). Rolul lor este încă controversat. Iniţial se credea că ar avea rol în fixarea azotului, într-un mod similar cu cele din genul Rhizobium, de la leguminoase; ulterior, alţi cercetători au presupus faptul că nodulii bacterieni ar fi o sursă de substanţe de creştere pentru plante (Becking, 1977), substanţe pe care ele nu ar fi capabile să le producă. Investigaţţiile ultrastructurale relevă însă similarităţi morfologice între bacteriile din nodozităţile foliare de la Ardisia şi cele din nodozităţile fixatoare de azot de la legumnioase (din genul Rhizobioum). Cercetări recente (Nakahashi et al. 2005) par să infirme simbioza obligatorile între bacterii şi frunzele de la Ardisia.

Investigaţiile electronomicroscopice, utilizând microscopul electronic cu baleiaj au evidenţiat morfologia bacteriilor atât în nodozităţile tinere, cât şi în cele mature. În nodozitatile tinere numărul bacteriilor observate este foarte mare; ele manifestă un vizibil pleiomorfism, majoritatea având forma de bastonaş, de 1,5-2,5 μm, altele fiind in forma de V sau Y. Unele dintre ele (puţine la număr) sunt în faza de diviziune. În nodozităţile mature bacteriile observate sunt mai puţine ca număr, dar au dimensiuni mai mari. O parte dintre ele au degenerat în cursul dezvoltării nodozităţii, resturile lor fiind prezente în spaţiile intra şi inter celulare. Degenerarea bacteriilor în nodozitatea adultă a fost observată şi de Gardner (1984), care precizează faptul că materialul organic rezultat poate fi refoslosit de cărte bacteriile rămase.

A B

DC

E F.

Foto 33 – Secţiune transversală prin marginea frunzei de la Ardisia crenata (x20) (necolorată) A – se observă nodozitatea matură aproape incoloră, celulele având un număr redus de cloroplaste mici, B - secţiune transversală prin nodozitatea matură (coloraţie cu roşu rutheniu şi verde iod) (x20) – se observă fasciculul conducător mixt, libero-lemnos din partea internă a nodozităţii şi stratul protector ce înconjoară nodozitatea, C – detaliu din nodozitatea matură (x40) – se observă mici fascicule liberiene de jur împrejurul nodozităţii, sub startul protector, D – secţiune transversală prin nodozitatea matură (x20) – se observă conexiunea vasculară cu sistemul conducător al frunzei, E – detaliu din zona conexiunii vasculare (x40) – se observa vase de lemn si de liber sectionate longitudinal, E – sectiune transversala prin marghinea frunzei intr-o zona fara nodozitati (x20) (orig.)

A.

E.

D. C.

B.

F.

Foto 34 – Secţiune transversală prin nodozitatea de la frunza matură observată în lumină polarizată A (x20) – sunt vizibile numaroase cristale de oxalat de calciu în vecinătatea nodozităţii, B – detaliu din nodozitatea matură (observaţie în lumină polarizată) (x40), C, D –

secţiuni transversale prin frunza matură (x40) – se observă peri secretori peltaţi, cu baza unicelulară, piciorul unicelular şi glanda pluricelulară, E – stomată situată uşor peste nivelul celulelor epidermice (x40) (orig)

A B C D E F Micromorfologia epidermei

Au fost investigate din punct de vedere micromorfologic atât epiderma superioară, cât şi cea inferioară. Stomatele, prezente în ambele epiderme sunt de tip anizocitic (mai numeroase în epiderma inferioară). Cuticula prezintă o granulaţie fină de ceară epicuticulară şi este striată la baza perilor secretori. Pe epiderma inferioara se observă

numeroşi peri secretori scurţi, peltaţi, cu glanda bi-, tetra- sau multi celulară. Conform unelor ipoteze (Miller 1990), aceşti peri ar juca un rol important în realizarea infecţiei bacteriene din mugur la primordiile foliare tinere.

A. B.

C. E.D.

Foto 35 – Aspecte electrono-microscopice ale nodozităţilor bacteriene de pe frunzele de Ardisia: A –secţiune transversală prin frunza tânără (bara = 200 μm), B - secţiune transversală prin frunza matură (bara = 500 μm), C –bacterii cu localizare intracelulară din nodozitatea frunzei tinere (bara = 10 μm), D –bacterii alungite sau în formă de Y sau V cu localizare intracelulară din nodozitatea frunzei tinere (bara = 5 μm), E – bacterii viabile şi degenerate în nodozitatea frunzei mature (bara = 5 μm), F – bacterie în formă de Y din nodozitatea frunzei mature (bara = 2 μm) (orig.)

Pe suprafaţa ambelor epiderme au fost observate bacterii izolate, de tip bacil, de 2-3 μm, unele aflate în proces de diviziune.

Aspecte micromorfologice la specii de Dioscorea

Au fost investigate din punct de vedere micromorfologic două specii ale genului Dioscorea: D. batata L. şi D. japonica Thunb.Între cele două specii analizate apar diferenţe micromorfologice evidente. La Dioscorea jaopnica cuticula, îndeosebi pe epiderma inferioară, este striată şi prezintă ceară epicuticulară densă, sub formă de plăci. Perii secretori sunt numeroşi la Dioscorea batata, în timp ce la D. japonica întâlnim îndeosebi peri tectori. În mezofilul frunzelor s-au observat celule mari, cu cristale de oxalat de calciu (rafide). Pe suprafeţele foliare au fost observate bacterii şi fungi aparţinând filosferei, bacteriile fiind izolate, mai rar în asociere cu hifele fungale

Foto 36 – Aspectul general al nodozităţii de pe frunza matură (bara = 500 μm) A, B – zona de intrare a bacteriilor este obturată la frunza matură (bara = 50 μm), C – ursin de oxalat de calciu în vecinătatea nodozităţii (bara = 20 μm) (orig)

Foto 37 – Micromorfologia epidermei inferioare de la frunza matură: A – apect general – se observă numeroase stomate de tip anizocitic şi un păr secretor peltat (bara = 100 μm), B – păr secretor cu glanda bicelulară (bara = 20 μm), C – păr secretor cu glanda tertacelularaă(bara = 20 μm), D – păr secretor cu glanda pluricelulară (bara = 20 μm), E - păr secretor cu glanda pluricelulară (bara = 20 μm), F - păr secretor cu glanda pluricelulară văzut lateral (bara = 20 μm) (orig).

Foto 38 – Aspecte micromorfologice ale frunzei de Dioscorea batata. – A – epiderma inferioară în dreptul nervurii mediane (imagine de ansamblu); se observă peri secretori localizaţi pe nervură (bara = 200 μm), B – epiderma inferioară între nervuri – se observă hife miceliene (bara = 50 μm), C – detaliu (bara = 10 μm), D, E – bacterii localizate pe epiderma inferioară (bara = 5 μm), F – bacterie şi o hifă miceliană de pe epiderma inferioară (bara = 10 μm (orig.)

A.

B. C.

A.

D.

C. B.

E. F.

A

D

CB

E F

A, B, C D, E Foto 39 – Aspecte micromorfologice ale frunzei de Dioscorea batata - A – epiderma superioarp – se observp bacterii din filosfera pe suprafaţa cuticulei (bara = 200 μm), B – ppr secretor cu glandp pluricelulară de pe epiderma inferioară (bara = 20 μm) – se observă o hifă la partea superioară, C – aspect general al epidermei inferioare; se observă un păr secretor (bara = 100 μm), D – sectiune transversală prin frunza in dreptul nervurii mediane (bara = 200 μm), E – cristale de oxalat de calciu – rafide – in mezofilul frunzei (bara = 5 μm) (orig.). A, B, C D, E Foto 40 - Aspecte micromorfologice ale frunzei de Dioscorea japonica. A – stomata în epiderma inferioară Aspecte micromorfologice ale frunzei de Dioscorea batata. (bara = 20 μm) se observă cuticula striată si ceara epicuticulară sub formă de plăci dense, B – epiderma inferioară – aspect general (bara = 1000 μm) se observă numeroşi peri tectori unicelulari, simpli sau ramificaţi, C- bacterie de pe suprafaţa cuticulară (bara = 5 μm), D – bacterii pe epiderma superioară (bara = 5 μm), E - bacterii pe epiderma superioară (bara = 5 μm) (orig). 4. Studiul comparativ al factorilor ce intervin în constituirea şi funcţionarea comunităţilor filosferice la specii de Dioscorea si Ardisia 4.1. Înregistrarea factorilor de mediu cu efect major asupra dezvoltării plantelor test în Grădina Botanică (temperatură, umiditate, insolaţie)

Înregistrarea factorilor de mediu în funcţie de care s-au dezvoltat plantele test s-a realizat utilizând un aparat portabil LCi de determinare a intensităţii fotosintezei, repiraţiei, transpiraţiei, cu înregistrare automată a gradului de insolaţie la

nivelul funzelor; umiditatea aerului şi temperaturii de lucru au fost măsurate pe parcursul realizării determinărilor folosind un Termohigrometru Testo 625 cu sensor de umiditate şi temperatură (Tabelul 11).

4.2. Cercetări preliminare privind dinamica numerică a populaţiilor de microorganisme din asociaţiile filosferice la Ardisia şi Dioscorea cultivate în Grădina Botanică Iaşi

Izolarea şi aprecierea cantitativă a microbiotei de pe frunzele de Dioscorea batata şi D. japonica au fost corelate cu două fenofaze corespunzătoare creşterii vegetative şi înfloririi, iar pentru Ardisia crenata determinările s-au realizat la faza de înflorire. Pentru estimarea numărului de UFC (unităţi formatoare de colonii) s-au prelevat steril fragmente de frunze cu greutatea de 1 g utilizate pentru ob�inerea de suspensii în apă distilată sterilă (agitare la 190 rpm, 280 C). Suspensiile obţinute au fost însămânţate pe agar nutritiv.

Numărul de UFC/g frunză a variat la speciile analizate în funcţie de fenofaza urmarită (Tabelul 12). Cel mai mare grad de colonizare al suprafeţelor foliare a fost înregistrat pe parcursul creşterii vegetative, numărul de UFC/g frunză scăzând ulterior spre înflorire. O posibilă explicaţie este legată de faptul că planta eliberează la nivel foliar pe parcursul creşterii vegetative cantităţi mai abundente de exudate, ceea ce determină o proliferare a microbiotei epifite (Lindow et al., 2003). De asemenea, la momentul înfloririi, cantităţile de uleiuri volatile produse de structurile foliare specializate sunt mai ridicate, ceea ce determină un efect antimicrobian mai pronunţat şi, prin urmare, o mai slabă reprezentare cantitativă a microbiotei filosferice (Jurkevitch et al., 2000; Thompson et al., 1995).

Tabelul 12 - Dinamica numerica a populatiilor de microorganisme din filosfera plantelor de

Dioscorea batata, D. japonica şi Ardisia crenata Dioscorea batata Dioscorea japonica Ardisia crenata Izolare

UFC/g frunză UFC/g frunză UFC/g frunză Vegetativ 1 32 x 105 14 x 104 Vegetativ 2 57 x 105 31 x 104 Înflorire 19 x 104 84 x 102 61 x 102

4.3. Cuantificarea reacţiilor de răspuns fiziologic (fotosinteză, respiraţie) ale aparatului foliar suport pentru comunităţile de microorganisme simbionte la specii de Ardisia şi Dioscorea

Pentru speciile genului Dioscorea înregistrarea parametrilor s-a realizat în momente diferite, la interval de 30 zile, datorită faptului că cele două specii au port lianoid, cu o creştere prelungită a lăstarilor. Au fost efectuate determinări la un număr de 5 frunze pentru ficare individ analizat (câte 5 indivizi la fiecare determinare). Rezultatele obţinute reprezenta astfel media aritmetică a citirilor efectuate (Tabelul 13, Tabelul 14).

Tabelul 11 - Variaţia factorilor de mediu în spaţiul de analiză (perioada de vegetaţie - anul 2010)

Specia investigată Recoltarea Insolaţie (Q leaf)

Temperatură (0C)

Umiditate (%)

Vegetativ 110.2 34.3 58.5 Înflorire 200 26.3 70

Ocimum basilicum

Fructificare 120.3 29 47.7 Vegetativ 1034.88 35.4 55.6 Înflorire 229.32 24.5 72

Perovskia atriplicifolia

Fructificare 92.28 22.7 53.2 Determ. I 89.6 27.3 72.9 Dioscorea (D. batata şi D.

japonica) Determ. II 67.6 28.7 57.2 Determ. I 50.4 26 55 Ardisia crenata Determ. II 55 24.5 50

Tabelul 13 - Valorile medii ale ritmului fotosintetic şi respirator la Dioscorea batata pe parcursul perioadei de vegetaţie a anului 2010 (frunze din vâr, respectiv de la bază)

B –fr. bază Q leaf 72 72 72 72 72

A 0.45 0.33 0.28 0.45 0.21

R 3.69 3.27 3.59 3.69 0.71

A – fr. vârf Q leaf 95 108 113 110 110

A 0.26 0.18 0.26 0.17 0.17

R 0.1 0.21 0.18 0.18 0.18

Datorită portului caracteristic al plantelor, gradul de iluminare al frunzelor este oarecum uniform, inducând un ritm echilibrat al celor două procese de bază, fără diferenţe semnificative funcţie de poziţionarea frunzelor pe lăstari. În acelaşi timp ambele specii ating valori, în mărime absolută a celor doi parametri, destul de asemănătoare.

Nu s-a putu realiza, deocamdată, o corelaţie vizibilă între intensitatea celor două procese măsurate şi gradul de dezvoltare a microorganismelor din filosfera proprie (astfel de date nu au fost regăsite nici în literatura de specialitate). La Ardisia crenata, specie cultivată în spaţii protejate, investigaţiile noastre au evidenţiat valori fotosintetice şi respiratorii foarte asemănătoroare pentru toate frunzele analizate, care au beneficiat, la rândul lor, de condiţii mult mai uniforme de iluminare (condiţii de cultivare în seră), respectiv de temperatură şi umiditate (Tabelul 15).

Nici în acest caz nu ne putem pronunţa încă (datele noastre au caracter preliminar), dacă ar putea exista o corelaţie între intensitate proceselor analizate şi gradul de dezcoltare a nodulilor foliari, a căror microorganisme ar putea furniza susra azotată necesară unui cilcu nutriţional normal frunzelor în interiorul cărora se cantonează.

Bibliografie selectivă

• Artenie V., Tănase E., 1982, Practivum de Biochimie, Ed. Univ. „Al. I. Cuz” Iaşi. • Basher, K., Ozek, T., Demirchakmak, B., Abduganiev, B., Nuriddinov, K., Aripov, K., Doriev, A. and Karataeva, C., 1997. "Essential oil of

Perovskia angustifolia from Kyrgyzystan." Chemistry of Natural Compounds 33(3): 296-298. • Burt, S., 2004. "Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review." International Journal of Food

Microbiology 94(3): 223-253. • Dunca, S., Ailiesei, O., Nimitan, E. and Ştefan, M., 2004. Microbiologie aplicată. Iasi, Editura Tehnopress. • Horner, H. T., Lersten N. R.. 1972. Nomenclature of bacteria in leaf nodules of the families Myrsinaceae and Rubiaceae. Int. J. Syst.

Bacteriol. 22: 117-122. • Jurkevitch, E. and Shapira, G., 2000. "Structure and colonization dynamics of epiphytic bacterial communities and of selected

component strains on tomato (<i>Lycopersicon esculentum</i>) leaves." Microbial Ecology 40(4): 300-308. • Karamanoli, K., Vokou, D., Menkissoglu, U. and Constantinidou, H. I., 2000. "Bacterial Colonization of Phyllosphere of Mediterranean

Aromatic Plants." Journal of Chemical Ecology 26: 2035-2048. • Lebard S., Belin-Depoux M., 2003. Structure and ontogeny of foliar bacterial nodules of Ardisia crenata Sims (Myrsinaceae). Acta

Botanica Gallica, 150, 19–33. • Lersten, N. R., Horner H. T. 1967. Development and structure of bacterial leaf nodules in Psychotria bacteriophila Val. (Rubiaceae). J.

Bacteriol. 94: 2027-2036. • Lersten, N. R., Horner H. T., 1976. Bacterial leaf nodule symbiosis in angiosperms with emphasis on Rubiaceae and Myrsinaceae.

Botanical Review, 42: 145-214. • Lindow, S. E. and Brandl, M. T., 2003. "Microbiology of the Phyllosphere." Appl. Environ. Microbiol. 69(4): 1875-1883. • Miehe, H. 1911. Die sogenannten Eiweissdrusen an den Blittern von Ardisia crispa A. Ber. deut. Bot. Ges. 29: 156-157. • Miller, I. M., Scott, A., Gardner, I. C., 1978. Pleomorphism of the endophyte in leaf nodules ofArdisia crispa. Microbios Ltters, 9: 133-

137. • Miller I. M., 1990. Bacterial leaf nodule symbiosis. Advances in Botanical Research Incorporating Advances in Plant Pathology 17, 163–

234. • Morris, C. E., Nguyen-The, C. and Nicot, P. C., 1996. Aerial Plant Surface Microbiology (The Language of Sc ience), Springer • Thompson, I. P., Bailey, M. J., Ellis, R. J., Lilley, A. K., McCormack, P. J., Purdy, K. J. and Rainey, P. B., 1995. "Short-term community

dynamics in the phyllosphere microbiology of field-grown sugar beet." FEMS Microbiology Ecology 16(3): 205-212. • Saikkonen K., Wali P., Helander M., Faeth S. H., 2004. Evolution of endophyte-plant symbioses. Trends in Plant Science, 9, 275–280. • Tsavkelova, E. A., Cherdyntseva, T. A., Botina, S. G. and Netrusov, A. I., 2007. "Bacteria associated with orchid roots and microbial

production of auxin." Microbiol Res 162(1): 69-76. VARMA A, ABBOT L., WERNER D., HAMPP R., 2004. Plant surface Microbiology. Ed. Springer Berlin, Heidelberg, New york, Hong kong, London, Milan, Paris, Tokyo:145-157.

Tabelul 14 - Valorile medii ale ritmului fotosintetic şi respirator la Dioscorea japonica pe parcursul perioadei de vegetaţie a anului 2010 (frunze din vâr, respectiv de la bază)

A – fr. vârf Q leaf 110 110 105 105 110

A 0.18 0.11 0.12 0.36 0.36

R 0.38 0.36 0.36 0.36 0.36

B – fr. bază Q leaf 49 46 46 46 49

A 0.19 0.1 0.27 0.41 0.24

R 0.39 0.44 0.49 0.49 0.52

Tabelul 15 - Valorile medii ale ritmului fotosintetic şi respirator la Ardisia crenata cultivată în condiţii protejate

Q leaf 57 51 54 46 44

A 0.23 0.19 0.27 0.32 0.32

R 0.72 0.65 0.78 0.83 0.83

Tabelul 1. Descrierea macro-morfologică a tulpinilor bacteriene izolate de pe suprafeţele foliare de la Ocimum basilicum L.

Nr. crt. Tulpina

izolată Tipul

coloniei Forma Aspectul marginilor

Profilul coloniei Consistenţa Transparenţă/

Opacitate Culoarea

1 O1FV R neregulată rizoidale plat uscată opacă bej 2 O1FD1 S rotundă întregi bombat uscată opacă bej 3 O1FD2 R neregulată lobate plat cu excavaţii uscată opacă albă 4 O2FV1 S rotundă întregi emisferic mucoasă opacă bej 5 O2FV2 R neregulată ondulate bombat uscată opacă bej 6 O2FD R neregulată dinţate plat uscată opacă bej 7 O3FV1 R neregulată rizoidale plat uscată opacă crem 8 O3FV2 R neregulată lobate plat uscată opacă bej 9 O3FV3 R neregulată ondulate plat pieloasă opacă alb-crem 10 O3FV4 S rotundă întregi emisferic mucoasă opacă galbenă 11 O3FD R neregulată rizoidale plat uscată opacă crem 12 O3FD1 R neregulată ondulate plat uscată opacă crem 13 O3FD2 R neregulată ondulate plat pieloasă opacă crem 14 O4FV1 S rotundă întregi emisferic mucoasă translucidă portocalie 15 O4FV2 R neregulată lobate plat uscată opacă alb-crem 16 O4FV3 S rotundă întregi emisferic mucoasă translucidă crem 17 O4FD S rotundă întregi bombat mucoasă opacă albă 18 O4FD1 R neregulată rizoidale plat uscată opacă crem 19 O4FD2 R neregulată lobate plat uscată opacă alb-crem

Tabelul 2. Descrierea micro-morfologică a tulpinilor bacteriene izolate de pe suprafeţele foliare de la Ocimum basilicum L.

Nr. crt. Tulpina

izolată

Grup taxonomic Tip morfologic Afinitatea tinctorială Mod de grupare Capacitatea de sporulare

1 O1FV bacterie bacilar Gram + izolat nesporulat 2 O1FD1 bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte sporulat, spor de tip deformant,

central şi subterminal 3 O1FD2 bacterie bacilar Gram + lanţuri lungi sporulat, spor de tip nedeformant,

subterminal 4 O2FV1 bacterie bacilar Gram + lanţuri încolăcite nesporulat 5 O2FV2 bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat

Nr. crt. Tulpina

izolată

Grup taxonomic Tip morfologic Afinitatea tinctorială Mod de grupare Capacitatea de sporulare

6 O2FD bacterie cocoid Gram + tetradă nesporulat 7 O3FV1 bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte sporulat, spor de tip nedeformant,

central 8 O3FV2 bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte nesporulat 9 O3FV3 bacterie bacilar Gram + lanţuri lungi sporulat, spor de tip nedeformant,

central 10 O3FV4 bacterie cocoid Gram + sarcină nesporulat 11 O3FD bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat 12 O3FD1 bacterie bacilar Gram + lanţuri sporulat, spor de tip deformant,

central 13 O3FD2 bacterie bacilar Gram + lanţuri sporulat, spor de tip nedeformant,

subterminal 14 O4FV1 bacterie cocoid Gram + tetradă nesporulat 15 O4FV2 bacterie bacilar Gram + lanţuri lungi sporulat, spor de tip nedeformant,

subterminal 16 O4FV3 bacterie cocobacilar Gram + izolat nesporulat 17 O4FD bacterie cocobacilar Gram + izolat nesporulat 18 O4FD1 bacterie bacilar Gram + lanţuri lungi sporulat, spor de tip nedeformant,

central 19 O4FD2 bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat

Tabelul 3. Descrierea macro-morfologică a tulpinilor bacteriene izolate de pe suprafeţele foliare de la Perovskia atriplicifolia

Nr. crt. Tulpina

izolată Tipul



Opacitate Culoarea

1 FM1 S punctiformă întreg emisferic mucoasă opacă albă 2 FM2 S neregulată neregulat plat mucoasă opacă albă 3 FM3 S neregulată neregulat plat mucoasă transparentă galbenă 4 FB2 S rotundă întreg plat mucoasă opacă albă 5 FV4 S neregulată neregulat plat mucoasă transparentă galbenă

Nr. crt. Tulpina

izolată Tipul



Opacitate Culoarea

6 FB1 R nereg. lobat striat uscată opacă albă 7 FB3 S rotundă întreg umbonat mucoasă transparentă gălbui 8 FB4 S rotundă întreg crateriform mucoasă transparentă gălbui 9 FB5 R neregulată neregulat plat mucoasă opacă galbenă

10 FB6 R neregulată neregulat plat uscată opacă galbenă 11 FV1 S punctiformă întreg ridicat mucoasă transparentă alb-gălbui 12 FV 2 S neregulată neregulat ridicat mucoasă opacă albă 13 FV3 S punctiformă întreg ridicat mucoasă opacă alb-crem 14 FM4 R neregulată neregulat striat uscată opacă albă 15 F1-1v R neregulată neregulat striat uscată opacă albă 16 F1-2v R neregulată neregulat striat uscată opacă albă 17 F2-1d R neregulată neregulat striat uscată opacă albă 18 F1-3v R neregulată neregulat striat uscată transparentă alb-gălbui 19 F2-2d S rotundă întreg bombat mucoasă opacă albă 20 F2-5 S rotundă întreg bombat mucoasă transparentă alb-gălbui 21 F2-6 S rotundă întreg bombat mucoasă transparentă alb-gălbui 22 F2-7 R neregulată neregulat striat uscată transparentă albă 23 F2-4v R neregulată neregulat striat uscată transparentă albă 24 F1-4v R neregulată neregulat striat uscată transparentă alb-gălbui 25 F1-5 R neregulată neregulat striat uscată transparentă alb-gălbui

Tabelul 4. Descrierea micro-morfologică a tulpinilor bacteriene izolate de pe suprafeţele foliare de la Perovskia atriplicifolia Nr. crt.

Tulpina izolată

Grup

taxonomic Tip morfologic

Afinitatea tinctorială

Mod de grupare

Capacitatea de sporulare

1 FM1 bacterie bacilar Gram + lanțuri lungi sporulat, spor de tip deformant, central 2 FM2 bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat 3 FM3 bacterie bacilar Gram + grămezi nesporulat 4 FB2 bacterie bacilar Gram + diplo sporulat, spor de tip deformant, central,

subterminal 5 FV4 bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte sporulat, spor de tip deformant, central,

subterminal şi terminal

Nr. crt.

Tulpina izolată

Grup

taxonomic Tip morfologic

Afinitatea tinctorială

Mod de grupare

Capacitatea de sporulare

6 FB1 bacterie bacilar Gram + lanţuri lungi sporulat, spor de tip nedeformant, central 7 FB3 bacterie bacilar Gram + palisade nesporulat

8 FB4 bacterie bacilar Gram + palisade nesporulat

9 FB5 bacterie cocoid Gram + lanţuri scurte nesporulat 10 FB6 bacterie bacilar Gram + palisade nesporulat 11 FV1 bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat 12 FV 2 bacterie bacilar Gram + lanțuri sporulat, spor de tip nedeformant, central 13 FV3 bacterie cocoid Gram + tetradă nesporulat

14 FM4 bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte nesporulat

15 F1-1v bacterie bacilar Gram + diplo sporulat, spor de tip deformant, central 16 F1-2v bacterie bacilar Gram + diplo sporulat, spor de tip nedeformant, central 17 F2-1d bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat 18 F1-3v bacterie bacilar Gram + palisade sporulat, spor de tip deformant, central şi

terminal 19 F2-2d bacterie bacilar Gram + izolaţi nesporulat 20 F2-5 bacterie bacilar Gram + grămezi sporulat, spor de tip deformant, central şi

subterminal 21 F2-6 bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte sporulat, spor de tip nedeformant, central şi

subterminal 22 F2-7 bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat

23 F2-4v bacterie cocoid Gram + diplo nesporulat

24 F1-4v bacterie bacilar Gram + lanţuri scurte nesporulat

25 F1-5 bacterie bacilar Gram + diplo nesporulat

Foto 1 – Aspectul macroscopic al tulpinii O1FD1

Foto 2 – Aspectul macroscopic al tulpinii O2FV1



Foto 5 – Aspectul macroscopic al tulpinii O4FD


Foto 10 – Aspectul macroscopic al tulpinii FB1



Foto 13 – Aspectul macroscopic al tulpinii F2-2d

Foto 14 – Aspectul macroscopic al tulpinii FM1

Foto 15 – Aspectul macroscopic al tulpinii FM2

Foto 16 – Rezultatele testului Api 50 CH - tulpina F1-2v

Foto 17 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina FB1

Foto 18 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina FM1

Foto 19 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina O3FV3

Foto 20 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina FV2

Foto 21 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina FB6

Foto 22 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina FM3

Foto 23 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina F2-6



Foto 26 – Rezultatele testului Api 50 CH – tulpina O3FD2

Tabelul 6 – Utilizarea surselor de carbon de către tulpinile bacteriene izolate din filosfera plantelor de Perovskia atriplicifolia şi Ocimum basilicum (Api 50CH)

Tulpina

Nr. crt. Sursa de Carbon F1-2v FB1 FM1 FV2 FB6 FM3 F2-6 O3FV3 O3FV1 O4FV2 O3FD2 1 Glicerol * * * * * 4 L-arabinoză * * * * 5 D-riboză * * * * * * * * * 6 D-xiloză * * * * 10 D-galactoză * * * * * 11 D-glucoză * * * * * * * * * * * 12 D-fructoză * * * * * * * * * * * 13 D-manoză * * * * * * 15 L-ramnoză * 18 D-manitol * * * * * 21 Metil D-glucopiranozid * 22 N-acetiglucozamină * * * * * * * * * 23 Amigdalină * * 24 Arbutină * * * * * * * * 25 Esculină * * * * * * * * * * * 26 Salicină * * * * * * * * 27 D-celobioză * * * * * 28 D-maltoză * * * * * * * * * * 29 D-lactoză * 30 D-melibioză * 31 D-zaharoză * * * * * * * * 32 D-trehaloză * * * * * * * * * 33 Inulină * 35 D-rafinoză * 36 Amidon * * * * * * * * 37 Glicogen * * * * * * * 39 Gentibioză * 40 D-turanoză * 42 D-tagatoză * * * 47 Gluconat de potasiu *

universitatea „alexandru ioan cuza”iaŞi · pdf filefacultatea de biologie...

Documents