Grigoriu Bogdan Ianuarie 2009

Metode de diagnosticExamenul bacteriologic

Examenul histopatologic

Testarea cutanata tuberculinica

Examenul bacteriologicMicroscopie optica (evidentierea BAAR)Sensibilitate 10000 bacili / ml

Cultura micobacteriilor si identificarea specieiMetoda de electieSensibilitate 100 bacili / ml

Inocularea la cobaiCostisitoare, lenta, doar in cercetareSensibilitate 1-10 bacili / ml

Probe cliniceTB pulmonara (contaminate)Sputa spontana sau indusa cu aerosoliMai rar alte

TB extrapulmonara (sterile)Lichid pleural, peritoneal, pericardicLichid cefalorahidianLichid articularUrinaFragmente bioptice

Examenul microscopicColoratia Ziehl-NeelsenEste metoda Standard de diagnostic Identifica Mycobacteriile evidentiind proprietatea de acid alcoolo-rezistenta (nu este specifica de gen)Citirea lamelor este relativ laborioasa: examinarea - la MO cu obiectiv cu imersie 100x ; Se numara BAAR pe 100 de campuri

MB - bastonase subtiri, rosii, usor incurbate, mai mult sau mai putin granulare, izolate sau grupate n perechi, pe fond albastru

Recoltarea probelor de sputaClatirea gurii cu apa pentru indepartarea resturilor alimentare2 inspiratii profunde urmate de retinerea respiratiei dupa fiecare dintre ele timp de cateva secunde, apoi o a treia inspiratie profunda, urmata de un expir fortat. Se declaseaza tusea care va usura expectoratiaDepunerea sputei in recipientul/flaconul care se tine lipit de buze(diam minim 3-4cm)Fixarea stransa a capacului prin infiletareSpalarea pe maini cu apa si sapunSe recolteaza 3 probe pentru fiecare control bacteriologic: 2 sub supraveghere medicala si una din prima sputa emisa spontan dimineataSensibilitatea creste cu volumul de sputa recoltat MINIM 5ml

Sensibilitatea metodei este destul de redusa :Daca bacilii sunt distribuiti uniform:Volumul de sputa pe lama = 0,01 mlLama are 10.000 campuriPentru a gasi 1 bacil pe 100 campuri = 10.000 bacili/ml1 bacil pe 10 campuri= 100,000 bacili/ml1 bacil pe fiecare camp=1,000,000 bacili/mlDoar 100 -200 de campuri sunt examinate (1% din lama)Sensibilitatea creste prin examinareamai multor lame (probe de sputa) 1= 80%, 2 = 10-15%, 3= 5-10%50-70% din TB sunt + la ex directPt un examen pozitiv sunt necesari aprox. 10,000 bacili//ml

Rezultate semicantitativeMarire 1000x (obiectiv cu imersie)

Numar BAARRezultatabsentinegativ1-9 BAAR / 100 campurinr. exact BAAR10-99 BAAR / 100 campuri+1-9 BAAR / 1 camp++ 10 BAAR / 1 camp+++

Examenul microscopicColoratii fluorescente

Rapide ( 15 min pe ZN = 2 min pe Auromina-rhodamina) se xamineaza la x 25 (x100 pt Z-N)

Necesita energie electrica iar microscoapele sunt mai scumpe (x 3) rezolvat prin noile tehnici de LED fluorescenceRezultatul pozitiv necesita confirmare prin Z-N

Utilitatea examenului directExtrem de rapidPoate fi facut oriunde (apa+lumina naturala+foc)Specificitate f bunaMai ales in zonele de endemie mare si HIV scazut (>98%)Repoductibilitate buna > 94%

Se coreleaza foarte bine cu infectiozitatea !!!

Erori la examenul directRezultate fals pozitiveParticule AAR hrana, erori de colorare (precipitare) BAAR nonpatogeni din mediu mycobacterii netuberculoase patogene Nocardia sp., Spori de bacilus subtilis, fibre polen, fungiContaminari prin transfer be bacilede pe o lama pe alta

Rezultate false negativeColectarea si stocarea improprie a sputei Tehnica de preparare a frotiului deficitara

Erori AdministrativeErori de etichetare si identificare a specimenelor

Cultura micobacteriilorMetoda standard de diagnostic al TB (documenteaza in plus 20 30% din cazuri)Permit identificarea specieiPermit ulterior testarea sensibilitatiiMult mai sensibileMedii solide, de ex. Lowenstein-Jensen (medii pe baza de ou + glycerol si asparagina) StandardCrestere in 4-6 saptamani minim 100 bacili /proba Medii lichide (agar + albumina sau ser bovin)Rapide (incepand de la cateva zile) 10 bacili/poba Mult mai scumpe

Coloniile de MTB pe medii solide sunt rotunde, galben palid, conopidiforme, cu suprafata rugoasa,izolate sau confluente n functie de densitatea bacililor din inoculul initial.

Exprimarea rezultatelor se face semicantitativ n functie de densitatea coloniilor. Identificarea speciei se realizeaza prin teste biochimice.

Testarea sensibilitatiiDificila, costisitoare, grevata de erori

Rezistenta MTB la antituberculoase este definita cantitativ (> 1% bacili rezistenti)

Este obligatorie:Pentru izoniazida si rifampicinaLa retratament sau in suspiciunea de chimiorezistenta initiala

Examenul histopatologicProbe clinice

Fragment pleural (biopsie pe ac, mai rar toracoscopica)GanglionFragment pericardic sau peritonealOs sau membrana sinovialaPerete bronsic, laringe, plamanRar alte

Testele ImunologiceTestarea cutanata la tuberculina:

Serologia evaluaza raspunsul umoral (anticorpii) la infectia cu M. tuberculosisSensibilitate si specificitate slabe INUTILA IN PRACTICA

Evaluarea immunitatii celulare teste ce masoara productia de mediatori ai inflamatiei dupa stimularea cu antigene SECIFICE M. tuberculosis (interferon gamma in special)

Testarea cutanata tuberculinica= injectarea strict intradermica de antigene din MTB (denumite PPD = derivat de proteina purificata) ce provoaca o reactie de hipersensibilitate intarziata

ce consta in acumularea locala de limfocite si macrofage

exprimata macroscopic printr-o induratie la locul injectarii

Prima tuberculina a fost produsa de Robert Koch

Utilizarea pentu detectia infectiei a fost descrisa pentru prima data de von Pirquet in 1907

Intradermoreactia (IDR) la tuberculina

Evaluarea induratieiSe utilizeaza si aspectul calitativ al reactiei - scara Palmer

-tip l - induratie ferma,flictene-tip ll- induratie elastica-tiplll- induratie depresibila-tiplV- fara induratie

Variabilitatea interindividuala este destul de mare si aduce putine informatii in plus fata de masurarea diametrului transversal al induratiei

RezultatePozitiva (infectie tuberculoasa) 10 mm 5 mm la cei infectati HIV

Negativa (absenta infectiei tuberculoase)< 10 mm< 5 mm la infectati HIV

Detecteaza doar infectia, nu face dintre infectie si boalaDAR intensitatea raspunsului este corelata cu riscul de boala !!

Rezultate la testari succesiveViraj tuberculinic = pozitivarea reactiei cutanate la tuberculinaDiagnostic de infectie tuberculoasa recenta

Salt tuberculinic = cresterea cu minim 10 mm a diametrului reactiei cutanate la tuberculinaSemnificatie incerta

Rezultate falseFals pozitiveVaccinare BCGContact cu micobacterii atipiceFals negativeErori de tehnica (inject s.c)Sarcoidoza activa, boli hematologice maligne, infectii virale acute (oreion), vaccinari antivirale cu virus viu, infectia HIVsubnutritie, copii< 6 luni-sistem imun imatur.Tratamente imunosupresoare de durata (corticoterapia)Faza initiala a infectiei tuberculoaseefect Boost-la batrani: repetarea reactiei la 2-3 sapt./repetarea cu 10 U.I.PPD

Presentation of myobacterial antigensAntigen presenting cellMemory T cellSkin testIn-vitro blood testMeasurement of induration and erythemaMeasurement of IFN- productionTNF-TNF-IFN-IL-8,etcIFN-IL-8,etcBazate pe secretia de IFNg de catre leucocitele periferice (celule T?) stimulate cu Ag specifici MTB (ESAT-6, CFP-10, TB7.7)

Testele IGRA (TIGRA)Se exprima ca pozitiv, negativ, indeterminabilUsor de realizat ( o singura consultatie) rezultat in 24 hMai scumpe decat IDRMai specifice (rata de fals pozitivi mai redusa)Foarte probabil mai sensibilefara reactie booster, nu este afectat de vaccinare BCG anterioaraInlocuiesc treptat IDRDatele preliminare arata o predictie buna a infectiei recente in populatia vaccinataMai sunt necesare studii in populatii speciale (copi, imunodeprimati etc)

Biologia molecularaPentru diagnosticul de boala (identificarea MTB)In specimenele BK+ la direct permite confirmarea RAPIDA a genului MTB In specimenele BK- performanta diagnostica este modestaSensibilitate 70% fata de culturaSpecificitate buna/f bunaRapiditatea dg nu compenseaza erorirle si pretul ridicat

B. Permite evaluarea rapida a sensibilitatii dupa realizarea culturii primare

Toate persoanle care tusesc de peste 3 saptamani si care nu au o cauza identificata tusei TREBUIE evaluate ca suspecte de TB

Toate persoanele care au leziuni radiologice compatibile cu Tb trebuie sa li se recolteze sputa pentru ex direct/cultura chiar daca istoricul de TB este cunoscut

Daca leziunile radiologice sunt evolutive sau nu exista o radiografie de referintaxamenulsputei trebuie facut indiferentde examenele anterioare

Toti pacientii (adulti, adolescenti sau copii) caresunt capabili sa expectoreze TREBUIE sa li se recolteze minim 2 preferabil 3 probe de sputa.

Cel putin o proba de sputa trebuie sa fie recoltata dimineata

Standardul diagnostic

Daca o localizare extrapulmonare este suspectata trebuie obtinute probe din leziunea suspecta pentru : Ex direct (in cazul lichidelor) cultura si histopatologie;

Realizarea examenului histopatologic nu elimina necesitateaculturii probei bioptice !!!

Diagnosticul de TB negativa la examenul direct trebuie sa fie bazat pe:Cel putin trei sputenegativePrezenta de leziuni radiologiceLipsa raspunsului la tratament cu un antibiotic cu spectru larg (DAR NU chinolone !!!)Cel putin o cultura este in lucru.

La persoanele HIV+ evaluarea diagnostica trebuie facuta cat se poate de rapidStandardul diagnostic

Preventia tuberculozeiPrimara: izolarea si tratarea cazurilor de tuberculoza pulmonara activa

Secundara (prevenirea dezvoltarii bolii tuberculoase):Depistarea si tratarea infectiei tuberculoase latenteVaccinarea BCG

Grupe de riscPersoane expuse surselor de infectieContacti familialiInstitutii medicale (pacienti, personal)ImunodeprimatiInfectie HIVSilicoza, limfoame, diabet zaharat, transplant de organ, etcMarginalizati social (penitenciare, azile, fara locuinta, imigranti)

Infectia tuberculoasa latentaDepistare: testare tuberculinica (diagnostic dificil in tarile unde vaccinarea BCG este obligatorie)+ TIGRA

Tratament (chimioprofilaxie): izoniazida 5 mg/kgcorp/zi (max. 300 mg) timp de 6 luni

Tratamentul infectiei tuberculoase latente = ChimioprofilaxiaINDICATIIContacti familiali < 5 ani indiferent de rezultatul testarii tuberculinice

Infectati HIV cu testare tuberculinica pozitiva (> 5 mm)

Eventual alte categorii:Alti contacti familiali ai bolnavilor cu TBP/M+ (in special cu viraj tuberculinic si/sau < 35 ani)Alte categorii de imunodeprimati cu testare tuberculinica pozitiva

Riscurile HIN induce o toxicitate hepatica a carei frecventa creste cu varsta = risc foarte ridicat peste 30-35 ani

Eficienta chimioprofilaxiei nu este 100%

Riscul de inducere a unei rezistente este real

Utila DOAR DACA riscul de reinfectie este scazut

Vaccinarea BCGVaccin viu atenuat (bacilul Calmette-Guerin provenit din M. bovis)Efect:Protectie partiala (20-60%) impotriva dezvoltarii tuberculozei boalaPrevenirea formelor grave de tuberculoza la copil (TB diseminata, meningita TB)

Indicaiile vaccinrii BCGToi nou nscuii i sugarii pn n 12 luni de via i revaccinarea celor care nu prezint n decurs de 6 luni o cicatrice post-vaccinal mai mare de 3 mm;

EXCEPIE: nou nscui cu mame pozitive pentru BAAR n sput: la acetia se realizeaz chimioprofilaxia (sau terapia antituberculoas)

Sugari i copii cu IDR negativ la tuberculin care se afl la risc crescut de expunere apropiat i prelungit la aduli cu tuberculoz pulmonar netratat sau ineficient tratat i nu pot fi ndeprtai de la sursa de infectie

Copiii nscui din mame HIV pozitive, deja infectai HIV, necesit vaccinare BCG imediat dup natere

Contraindicaiile vaccinrii BCG1. IDR pozitiv;2. SIDA;3.Boli febrile, convalescen dup boli infecioase;4.6 luni dup hepatita viral; 5.TBC activ;6.Afeciuni dermatologice acute;7.Greutate < 2500 g. la natere;8.Imunodeficiene congenitale;9. Leucemii, limfoame, boli maligne.

Evolutie postvaccinalaEvolutie normala: induratie rosie (3-4 saptamani), uneori cu ulcerare, in final cicatrice usor retractila cu diametru de 5 mmComplicatii locale: adenopatii satelite uneori fistulizate, ulceratie locala prelungitaComplicatie generala: BCG-ita (= infectie diseminata, similara tuberculozei diseminate, ce apare la imunodeprimati)

*Ne vom referi in continuare doar la primele doua*Se va sublinia diferenta dintre secretiile respiratorii contaminate si celelalte produse ce trebuie recoltate steril; in plus se va sublinia importanta cultivarii tuturor fragmentelor bioptice de la pacienti suspecti de TB INAINTEA introducerii in formol.*frotiu de sputa ce arata pe langa celule si alte resturi colorate in albastru si numerosi bacili colorati in rosu adica BAAR (Ziehl-Nielsen, 1000x)*The minimum number of acid-fast bacilli necessary to produce a positive smear result has been estimated to be between 5 000 and 10 000 per millilitre. Sputum specimens from patients with pulmonary tuberculosis - particularly those with cavitary disease - often contain sufficiently large numbers of acid-fast bacilli to be readily detected by direct microscopy. The sensitivity can further be improved by examination of more than one smear from a patient. Many studies have shown that examination of two smears will on average detect more than 90% of infectious tuberculosis cases, both in low- and high-prevalence countries. The incremental yield of acid-fast bacilli from serial smear examinations has been shown to be 80%-82% from the first, 10-14% from the second and 5-8% from the third examination. Smear sensitivity is very low in extrapulmonary and childhood tuberculosis and in most cases of disease caused by mycobacteria other than tubercle (MOTT) bacilli. In high-prevalence countries these conditions are, however, far less common than pulmonary tuberculosis and are not rapidly progressive or highly infectious. From a public health perspective, infectious pulmonary cases have the highest priority for detection and treatment until cure.

*Se poate preciza ca in cazul gasirii a doar 1-2 bacili pe 100 campuri se mai citesc inca 200 si in cazul in care raman 1-2 bacili pe 300 de campuri (deci sub 3 bacili pe 300 de campuri) rezultatul este considerat neconcludent si se va repeta proba).*Rolul coloratiilor fluorescente in eliminarea lamelor negative, diminuand numarul de lame colorate cu Z-N*coloratie cu auramina O vizualizata in microscopul cu fluorescenta, 1000x*Culturi de Mycobacterium tuberculosis pe mediul Lowenstein-Jensen*Trimiteri pentru mai tarziu pentru importanta drogurilor majore si respectiv indicatiile testarii sensibilitatii*A se reaminti importanta cultivarii unor portiuni din aceste fragmente, INAINTEA introducerii in formol, intrucat cultura MTB constituie cel mai important argument diagnostic pentru TB.*Fotografie macroscopica pe sectiune de plaman observandu-se o cavitate cu cazeum (alb) in interior*granulom gigantoepitelioid la nivel pulmonar (sageata) cu o zona intinsa de necroza cazeoasa (zona amorfa roza din centrul imaginii), 100xpe slide-ul urmator puteti vedea imaginea marita*fragment pleural cu un granulom epitelioid fara necroza cazeoasa, 100x*The TB skin test it is misleading gives false negative up to 47% for active diseases - and false positive resultsThe interferon gamma- between 20-47% of pts. with extensive disease might be anergic *intradermoreactia la tuberculinain stanga puteti observa tehnica de administrare strict intradermic cu formarea unei papule albe (se observa mai bine in imaginea marita din centru)in dreapta citirea cu ajutorul unei rigle a diametrului transversal al induratiei, aici de 12 mm; subliniati importanta masurarii induratiei si nu a eritemului, a diametrului transversal si nu a celui longitudinal si momentul ideal de 72 de ore a citirii, in orice caz nu imediat, precum si necesitatea identificarii cu cat mai mare precizie a marginilor transversale ale induratiei.*A se sublinia relativitea interpretarii la populatiile vaccinate BCG si faptul ca sunt numeroase rezultate fals pozitive si fals negative vezi slide-urile urmatoare.***