UNIVERSITATEA DIN BUCUREŞTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

INHIBITORI DE PROTEAZE

CU IMPLICAŢII ÎN DOMENIUL MEDICAL ŞI ÎN BIOTEHNOLOGIE

- REZUMAT -

Coordonator Ştiinţific:

Dr.Honoris causa Maria Caloianu

Doctorand:

Mihaela Carmen Rădan (Eremia)

BUCUREŞTI

2010

CUPRINS

PARTEA I - STADIUL ACTUAL AL CUNOŞTIINŢELOR 10 CAPITOLUL I: CARACTERISTICI ALE PROTEAZELOR 10 1.Aspecte generale privind proteazele. Clasificarea proteazelor 10 2.Serin-proteaze de tip chimotripsină 12 3.Serin-proteazele din mastocite 15 CAPITOLUL II: INHIBITORII SERIN-PROTEAZELOR 18 1. Clasificarea şi caracterizarea inhibitorilor serin-proteazici 18 2. Rolul fiziologic al serin-proteazelor și al inhibitorilor specifici 20 3. Inhibitori serin-proteazici de origine vegetală 30 4. Elemente structurale responsabile de efectul inhibitor al unor polipeptide naturale asupra serin-proteazelor

33

CAPITOLUL III: POLIMERI BIODEGRADABILI TIP POLIHIDROXIALCANOAŢI 38 1.Aspecte generale privind polihidroxialcanoaţii 38 1.1.Microorganisme producătoare de PHA şi condiţii specifice de biosinteză 39 1.2.Substraturi lipidice folosite pentru obţinerea biopolimerilor biodegradabili 41 1.3. Prelucrarea biomasei şi obţinerea matricii polimerice 42 1.4.Structura polihidroxialcanoaţilor de tip polihidroxibutirat 43 1.5.Influenţa structurii polihidroxialcanoaţilor asupra morfologiei polihidroxibutiratului.

43

1.6.Proprietăţile şi aplicaţiile polihidroxialcanoaţilor biodegradabili 44 1.6.1.Polihidroxialcanoaţii cu catena scurta (SCL-PHA) 45 1.6.2. Polihidroxialcanoaţii cu catenă medie (MCL-PHA) 45 1.6.3. Polihidroxialcanoaţii micşti (SCL-MCL-PHA) 45 1.6.4. Biodegradabilitatea PHA 45 2.Aplicaţii ale biopolimerilor de tip polihidroxialcanoaţi biodegradabili 46 CAPITOLUL IV: BIOMATERIALE PE BAZĂ DE POLIMERI BIODEGRADABILI ŞI INHIBITORI PROTEAZICI

48

1.Generalităţi privind biomaterialele compozitele şi hidrogelurile 48 2.Imobilizarea pe suporturi polimerice 53 2.1.Imobilizarea prin adsorbţăie fizică 53 2.2. Entraparea şi incluziunea 54 2.2.1.Includerea în structuri macromoleculare 54 2.2.2.Microencapsularea moleculelor substanţelor biologic active 55 2.3.Procedee chimice de imobilizare 55 2.3.1. Legarea covalentă 55 2.3.2. Copolimerizarea 56 3.Aplicaţii biomedicale ale inhibitorilor serin-proteazici imobilizaţi 57 3.1.Inhibitorii triptazei 57 3.2.Inhibitorul de tripsină şi kalikreină 58 PARTEA II – CERCETĂRI PERSONALE 60 OBIECTIVE 60 CAPITOLUL I: MATERIALE ŞI METODE 61 A.MATERIALE 61 B.METODE 61 1.Metode de obţinere şi caracterizare a diferitelor tipuri de materiale vegetale 61 1.1.Biosinteza in vitro a unor inhibitori proteazici 61 1.1.1.Surse de explante (celulele vegetale ale explantelor). 62 1.1.2.Sterilizarea de suprafaţă. 62 1.1.3.Condiţiile de cultivare pentru inducţia şi stabilirea culturilor celulare 62 1.1.4.Mediu de cultură. 62 2.Metode utilizate pentru extracţia şi purificarea inhibitorilor proteazici de origine 63

vegetală 2.1.Extracţia proteinelor cu activitatea inhibitoare din organismele vegetale (explante şi seminţe)

63

2.1.1.Delipidizarea materialului vegetal 64 2.1.2.Solubilizarea proteinelor vegetale. 64 2.1.3.Separarea inhibitorilor din materialul vegetal. 64 2.2.Purificarea inhibitorilor prin fracţionare cu alcool etilic 64 2.2.1.Îndepărtarea compuşilor poliglucidici. 65 2.2.2.Precipitarea proteinelor cu activitate inhibitoare serin-proteazică. 65 2.3.Purificarea inhibitorilor serin-proteazici prin cromatografie de schimb ionic 65 2.4.Purificarea inhibitorilor serin-proteazici prin cromatografie de afinitate pe tripsină imobilizată

66

3.Proteoliza enzimatică limitată a polipeptidelor 68 3.1.Substratul polipeptidic supus hidrolizei 68 3.2.Enzimele utilizate pentru proteoliza limitată 68 3.3.Hidroliza parţială a substratului polipeptidic 69 3.4.Gradul de hidroliză 70 4.Metode de caracterizare a inhibitorilor de serin-proteaze 71 4.1. Metoda de determinare a activităţii inhibitoare 71 4.2. Determinarea conţinutului proteic prin metoda Lowry 72 4.3.Determinarea concentraţiei proteice prin metoda Bradford 74 4.4. Analiza proteinelor din extractele vegetale şi din purificate prin separare electroforetică (Metoda Laemmli)

76

4.5. Analiza proteinelor din extractele vegetale prin centriconare şi gel electroforeză. 77 5.Metoda „molecular docking” 80 6.Obţinerea polihidroxibutiratului pe cale microbiană 81 6.1.Prepararea culturilor de întreţinere 81 6.2.Prepararea mediilor de cultură 81 6.3.Biosinteza PHB 82 6.4.Prelucrarea post-biosinteză 84 6.5.Analiza cantitativă a PHB 84 7. Obţinerea matricii polimerice ca suport biodegradabil 87 7.1.Suport de chitosan (CH) 88 7.2.Suport de chitosan şi polihidroxibutirat (CH-PHB) 88 8.Metode de imobilizare a inhibitorilor de proteaze pe suport biodegradabil 89 8.1. Imobilizarea prin entrapare a inhibitorilor proteazici pe suport de chitosan şi reticulare cu glutaraldehidă

89

8.2.Imobilizarea inhibitorilor serin-proteazici pe suportul biodegradabil copolimeric (CH-PHB)

90

8.2.1.Imobilizarea prin entrapare în compozit si reticulare 90 8.2.2.Imobilizarea prin adsorbţie pe gel de compozit 91 9.Metode de obţinere şi caracterizare a nanoparticulelor cu inhibitor proteazic imobilizat

91

10.Teste farmacologice de toleranţă locală 92 10.1.Toleranţa locală cutanată şi oculară a inhibitorului serin-proteazic 92 10.2. Testarea potenţialului sensibilizant 93 CAPITOLUL II: REZULTATE ŞI DISCUŢII 94 1. Studii privind biosinteza in vitro a unor inhibitori de proteaze 94 1.1.Biosinteza inhibitorilor proteazici din explante somatice de Momordica charantia 94 1.2.Biosinteza inhibitorilor proteazici prin germinarea seminţelor de Linum

usitatissimum

97

2.Studii comparative de extracţie a proteinelor cu activitate inhibitoare proteazică din diferite surse vegetale

101

3.Studii comparative de purificare a extractelor proteinelor vegetale prin metode 102

cromatografice 3.1.Purificarea extractelor din seminţe şi culturi celulare de Linum usitatissimum 102 3.2. Purificarea extractul din seminţe de Citrullus vulgaris 103 3.3.Purificarea extractelor din seminţe şi culturi celulare de Momordica charantia L. 105 4. Analize moleculare definitorii activităţii inhibitoare proteazice specifice 106 4.1. Proteina din seminţe de Linum usitatissimum (LUTI) 106 4.2. Proteina din seminţe de Citrullus vulgaris (CVTI) 109 5.Proteoliza enzimatică limitată a polipeptidelor vegetale cu activitate inhibitoare serin-proteazică

111

5.1. Determinarea gradului de hidroliză enzimatică a inhibitorilor 112 5.2.Determinarea masei moleculare a fracţiunilor peptidice din hidrolizate 113 6. Teste prin metoda ”molecular docking” 115 7.Biosinteza polihidroxibutiratului ca suport pentru imobilizarea inhibitorilor proteazici 123 7.1. Studiul influenţei substratului lipidic asupra biosintezei PHB 123 7.2. Studiul condiţiilor specifice de biosinteză şi acumulare a PHB în medii conţinând ulei de floarea soarelui ca sursă de carbon şi energie

125

8. Caracterizarea polihidroxibutiratului ca polimer biodegradabil 127 8.1. Absorbţia luminii 128 8.2. Studii de morfologie 129 8.3.Cercetări privind comportarea la prelucrare a PHB-ICCF pentru aplicaţii medicale 130 9. Materiale cu proprietăţi bioactive obţinute prin imobilizarea inhibitorilor serin-proteazici vegetali. Obţinere şi caracterizare.

132

9.1. Imobilizarea inhibitorilor serin-proteazici pe suporturi biodegradabile 132 9.1.1. Imobilizarea prin includere a inhibitorilor proteazici pe suporturi polimerice şi reticulare cu glutaraldehidă

133

9.1.2.Imobilizarea inhibitorilor serin-proteazici prin adsorbţie pe suporturi polimerice biodegradabile

133

9.2.Caracterizarea imobilizatelor pe suporturi polimerice biodegradabile cu activitate biologică

134

9.3.Testarea biocompatibilităţii compozitelor formate din inhibitori serin-proteazici imobilizaţi

137

9.4. Materiale nanostructurale cu proprietăţi bioactive inhibitoare proteazice. Obţinere şi caracterizare.

138

10.Studii farmacodinamice efectuate asupra inhibitorilor serin-proteazici 143 10.1. Toleranţa locală cutanată şi oculară a inhibitorului LUTI 143 10.1.1.Toleranţa locală cutanată în administrare unică a probelor A şi B 144 10.1.2.Toleranţa locală oculară în administrare unică a probelor A şi B 145 10.2. Testarea potenţialului sensibilizant al inhibitorului LUTI 145 CONCLUZII GENERALE 147 REFERINŢE BIBLIOGRAFICE 151 Anexa 1 - Listă de abrevieri 166 Anexa 2 - Listă lucrărilor publicate şi comunicate din subiectul tezei 168

Progresele realizate în ultimul timp în cunoaşterea la nivel molecular a interacţiilor extra-

şi intracelulare au dus la validarea ca ţinte terapeutice a unui număr mare de proteaze.

Inhibitorii proteazelor joacă un rol deosebit în elucidarea implicării acestor enzime în procesele

de degradare la nivel celular.

În ceea ce priveşte inhibitorii de proteaze din plante, există preocupări la nivel

internaţional, concretizate în cercetări de laborator, privind structura, purificarea şi mecanismul

de inhibiţie produs de o serie de polipeptide extrase din seminţele a numeroase soiuri de plante,

sugerând posibilitatea utilizării lor ca agenţi terapeutici.

În acest context, tematica tezei de doctorat se încadrează într-una din cele mai dinamice

direcţii de dezvoltare a cercetărilor din domeniul produselor farmaceutice, direcţie ce se axează

pe valorificarea potenţialului materiilor prime vegetale, în scopul obţinerii de principii active

naturale. Purificate corespunzător, aceste produse permit, faţă de terapia clasică cu

medicamente de sinteză, o manieră de tratament neagresiv asupra organismului, cu efecte

favorabile de lungă durată, fără reacţii secundare şi fără acţiuni toxice pregnante.

Pornind de la identificarea inhibitorilor de serin-proteaze ca o nouă clasă de agenţi

terapeutici eficienţi în tratarea bolilor sistemelor cardiovascular, respirator, gastrointestinal şi

renal, a bolilor alergice şi inflamatorii, teza de doctorat şi-a propus ca obiectiv general obţinerea

unui biopreparat cu activitate inhibitoare serin-proteazică eficient în tratarea bolilor alergice şi

inflamatorii.

Ca urmare s-a optat pentru următoarea strategie de experimentare:

1. Obţinerea inhibitorilor proteazici prin prelucrări directe din seminţele speciilor

vegetale: Citrullus vulgaris (pepene verde), Linum usitatissimum (in) şi Momordica charantia

(castravete amar).

2. Selectarea variantelor optime de biosinteză in vitro a inhibitorilor proteazici din

speciile Linum usitatissimum şi Momordica charantia în scopul obţinerii de celule vegetale

selecţionate cu un potenţial inhibitor proteazic mai mare.

3. Analiza şi caracterizarea extractelor şi puficatelor cu efecte inhibitoare proteazice prin

metode biochimice specifice (analiză enzimatică spectofotometrică, determinări de masă

moleculară prin gel electroforeză). Determinările biochimice efectuate în vederea demonstrării

activităţii inhibitoare proteazică s-au realizat prin dozarea enzimatică faţă de tripsină, serin-

protează considerată etalon de studiu pentru domeniul medical.

4. Pentru evidenţierea funcţionalităţii inhibitorilor proteazici în vederea diversificării

folosirii lor terapeutice s-a optat pentru două variante:

A. Proteoliza enzimatică limitată pentru diminuarea masei moleculare a proteinelor

vegetale şi o îmbunătăţire a efectului inhibitor faţă de triptaza mastocitară.

Investigarea proteolizei polipeptidelor prin metode specifice de determinare a

gradului de hidroliză, determinare prin gel electroforeză a maselor peptidelor

rezultate.

B. Imobilizarea inhibitorilor pe suporturi polimerice fără a afecta situsul activ, în scopul

creşterii specificităţii de acţiune şi a valorificării lor în domeniul terapeutic.

5. Testarea eficienţei terapeutice a peptidelor rezultate prin proteoliza enzimatică limitată

prin tehnica de „molecular docking” prin care legarea unui inhibitor de un receptor poate fi

explorată în detaliu demonstrând specificitatea acestuia faţă de proteazele ţintite. Utilizând

funcţii parametrice 3D în urma procesului de ,,docare’’ se modelează structuri optimizate care au

valori energetice mici.

6. Selectarea variantelor de obţinere a polihidroxibutiratului pe cale microbiologică în

scopul folosirii lui ca suport de imobilizare a inhibitorilor protreazici, precum şi caracterizarea

polimerului prin: analize de microscopie electronica de baleaj (SEM), capacitatea de adsorbţie a

luminii, comportarea la prelucrare pentru aplicaţii medicale.

7. Obţinerea biomaterialelor realizate prin imobilizarea pe suporturi polimerice

biodegradabile, în vederea creşterii stabilităţii şi biodisponibilităţii inhibitorilor serin-proteazici.

Aceasta s-a făcut prin includere şi adsorbţie cu obţinere de filme polimerice, precum şi prin

obţinerea de nanoparticule învelite cu straturi de polimer (chitosan) şi acid hialulonic în care s-a

entrapat inhibitorul proteazic.

8. Pentru evidenţierea performanţelor specifice inhibitoare s-au efectuat pe lângă

analizele enzimatice, metode biologice performante şi anume: microscopie optică, microscopie

electronică, citometrie în flux, precum şi studii ale interacţiei microorganismelor (bacterii Gram-

pozitive, bacterii Gram-negative şi fungi) cu biomaterialele obţinute, respectiv studii ale

efectului antibacterian şi studii de aderenţă microbiană.

9. Evaluarea posibilităţii de valorificare a inhibitorului proteazic s-a investigat in vivo prin

determinări ale potenţialului sensibilizant şi a toleranţei locale.

În scopul menţionat de obţinere şi diversificare pentru noi bioproduse din surse naturale

de origine biologică, investigaţiile noastre s-au orientat spre:

� Folosirea opţională de specii vegetale din familia Squash (Cucurbitaceae), seminţe

de Momordica charantia (castravete amar) şi de Citrullus vulgaris (pepene verde),

precum şi din familia Linaceae, seminţe de Linum usitatissimum (in).

� Surse vegetale obţinute prin multiplicare in vitro (Momordica charantia şi Linum

usitatissimum) pentru obţinerea de inhibitori de proteaze.

� Culturi intensive de tulpini bacteriene (Cupriavidus necator DSM 545) cu înalte

capacităţi de biosinteză a polimerului de tip pohidroxialcanoat, poli-3-

hidroxibutiratul (PHB), în vederea obţinerii de biomateriale suport pentru

imobilizarea inhibitorilor de proteaze.

Investigaţiile noastre se bazează pe tehnici general cunoscute, cu unele adaptări personale

şi tehnici originale, în funcţie de sursa biologică, de materia primă regenerabilă şi parametrii

necesari de optimizare a proceselor şi a calităţii inhibitorilor proteazici, prin utilizarea lor ca

atare sau imobilizaţi. Inhibitorii de proteaze din plante sunt în atenţia preocupărilor la nivel

internaţional, concretizate în cercetări de laborator, privind structura, purificarea şi mecanismul

de inhibiţie produs de o serie de polipeptide extrase din seminţele a numeroase soiuri de plante,

sugerând posibilitatea utilizării lor ca agenţi terapeutici. De asemenea este acceptat faptul că în

cadrul noilor biotehnologii tehnicile moderne de culturi de ţesuturi şi de celule vegetale oferă

potenţiale relevante de aplicabilitate în multe domenii biotehnologice competitive, vizând

obţinerea unor medicamente.

În acest contest studiile preliminare în ceea ce priveşte biosinteza in vitro a inhibitorilor

proteazici au fost focalizate atât pe definirea condiţiilor pentru obţinerea de biomasă celulară,

cât şi pe izolarea şi purificarea proteinelor vegetale care prezintă activitate specifică inhibitoare.

Manipulând compoziţia mediului de cultură în ce priveşte suplimentul hormonal şi

condiţiile de incubare, testările au condus la stabilirea formulelor optime pentru inducerea

calusului de la diferite tipuri de explante somatice, precum şi pentru menţinerea culturilor de

calus pe termen lung. Rezultatele testării răspunsului in vitro al explantelor de diferite tipuri

prelevate de la plantule obţinute prin germinarea seminţelor de Linum usitatissimum şi de

Momordica charantia în condiţii aseptice permit să se formuleze următoarele:

1. Fitohormonii administraţi în mediul de cultură în diferite variante privind concentraţiile

şi combinaţiile au stimulat dezvoltarea de calus organogen care poate fi menţinut în

cultură pe termen lung.

2. Inducerea diferenţierii tisulare şi organogene pe variantele de medii care au stimulat

dezvoltarea calusului, poate reprezenta un model pentru identificării de inhibitori

proteazici în culturi celulare de Linum usitatissimum şi de Momordica charantia.

3. Întrucât nu cunoaştem din literatura de specialitate consultată existenţa unor lucrări

ştiinţifice care să-şi fi propus studiul biosintezei de inhibitori proteazici în culturi

celulare de Linum usitatissimum şi de Momordica charantia, cercetările noastre capătă o

notă în plus de originalitate şi de semnificaţie teoretică şi practică.

Studiile comparative de extracţie şi de precipitate alcoolică a proteinelor cu activitate

inhibitoare proteazică, din sursele vegetale testate au arătat o îmbunătăţire a activităţii specifice

inhibitoare în cazul utilizării ca materie primă a culturilor celulare faţă de seminţele ca atare.

Studiile experimentale de caracterizare a proteinelor de origine vegetală, potenţiali

inhibitori enzimatici s-au efectuat şi prin determinarea concentraţiei proteice și prin

detreminări de masă moleculară. Pentru determinarea masei moleculare a inhibitorului

proteazic din seminţe de in (Linum usitatissimum) s-a utilizat metoda de separare electroforetică

a proteinelor din extractele analizate, (conform protocolului descris de Laemmli), prin

electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezenţă de SDS. În urma analizelor efectuate se poate

spune că proteina vegetală cu activitate inhibitoare serin-proteazică din seminţele de Linum

usitatissimum are o masă moleculară în jur de 7000 D şi calitate confirmată de acţiune

inhibitoare.

Pentru extractul din seminţe de Citrullus vulgaris, purificat prin cromatografie de schimb

ionic şi de afinitate, a rezultat o soluţie proteică cu activitate inhibitoare de 151.512UI şi

respectiv o activitate specifică de 9.122UI/mg proteină. Soluţiile rezultate din fazele de

purificare au fost supuse concentrării folosind două tipuri de centricoane YM 10 şi YM 3 prin

centrifugare la 5000xg/1oră/4°C. După centrifugare extractele conţinând proteine cu mase

moleculare mai mici de 3 kDa şi 10 kDa au fost supuse separării în 15 % gel de poliacrilamidă, în

sistem denaturant. În aceleaşi condiţii au fost separate şi extractele care conţin proteine mai

mari de 3 kDa şi 10 kDa. În urma analizelor efectuate s-a determinat că proteina vegetală cu

activitate inhibitoare serin-proteazică izolată din seminţe de Citrullus vbulgaris are o masă

moleculară în jur de 3000 Da (figura 1).

Figura 1. Separarea în 15% gel de poliacrilamidă în sistem denaturant (SDS PAGE) a soluţiilor de proteine extrase din Citrullus vulgaris

Pentru îmbunătăţirea efectului inhibitor asupra triptazei polipeptidul vegetal trebuie

supus hidrolizei partiale în vederea micşorării masei moleculare. Pentru acest studiu s-au ales

extractele purificate din seminţe de Citrullus vulgaris şi seminţe de Linum usitatissimum. Este

cunoscut conţinutul în substanţe biologic active al seminţelor speciei Momordica charantia.

Printre proteinele active sunt şi inhibitorii de serin-proteaze: MCTI-I, MCTI-II şi MCTI-III. Acest

conţinut de trei inhibitori ne-a determinat să nu alegem în acest studiu specia Momordica.

Trebuie amintit că inhibitorii vegetali proteazici existenţi în speciile studiate au structura:

A

B

1) Inhibitorul din seminţele de Linum usitatissimum (LUTI) are o moleculă compusă din

69 resturi de aminoacizi şi o masă moleculară de 7655 Da. Molecula conţine o singură

legătură disulfidică, având doar două resturi Cys. Centrul activ al moleculei

inhibitorului este compus din Lys-45 şi Asp-46.

2) Inhibitorul din seminţele de Citrullus vulgaris (CVTI) are o secvenţă de 30 de

aminoacizi, trei legături disulfidice în poziţiile 4-21, 11-23 şi respectiv 17-29; centrul

activ fiind în poziţia 6-7 şi o masă moleculară de 3500Da. Centrul activ al moleculei

inhibitorului este compus din Arg-87 şi Ile-88.

Mk P1 P5'T P2'T P2P P5'PP2'PP2TP3T Mk P1' P3'T P3'P P3P P5T P4'TP4TP5PP4'P

Figura 2. Electroforegramele SDS-PAGE ale hidrolizei inhibitorilor CTVI (P') şi LUTI (P) cu termolizină (T)şi cu pepsină (P); Mk(amestecul de proteine marker); 1 (proba nehidrolizată); 2 (2 ore); 3

(4ore); 4 (6ore); 5 (12ore).

În urma migrării electroforetice (Figura2) a probelor obţinute prin hidroliza enzimatică a

proteinelor din CVTI şi LUTI sub acţiunea termolizinei şi pepsinei au rezultat funcţie de timpul

de hidroliză diverse peptide cu mase moleculare diferite.

După scindarea enzimatică a proteinelor din CVTI şi LUTI, pentru a demonstra eficienţa

terapeutică a acestora faţă de proteazele şi receptorii împlicaţi în diverse boli ale sistemelor

cardiovascular, respirator, gastrointestinal, renal, s-a apelat la tehnica ,,molecular docking’’.

Tehnică în care legarea unui inhibitor de un receptor poate fi explorată în detaliu.

Pentru acest experiment s-au ales: 4 polipeptide provenite din hidroliza enzimatică a

moleculei proteice de inhibitor serin-proteazic din seminţe de Linium usitatissimum (LUTI) cu

Lys-↓-Asp centru activ, notate LUTI 1, LUTI 2, LUTI 3, LUTI 4 şi respectiv 2 polipeptide provenite

prin hidroliza enzimatică a moleculei proteice de inhibitor serin-proteazic din seminţe de

Citrullus vulgaris (CVTI), cu Arg-↓-Ile centru activ, notate CVTI 1 şi CVTI 2.

Formulele peptidelor s-au testat faţă de patru receptori, şi anume: β-triptază umană (Try)

şi proteinase-activated receptors (PARs): PAR 1, PAR 3 şi PAR 4, aleşi pentru importanţa lor ca

ţinte terapeutice.

Pentru determinarea orientărilor favorabile se apelează la analiza statistică. Atât structura

receptorilor cât şi structurile celor 6 complecşi formaţi între liganzi (inhibitori) şi receptori, au

fost pregătite pentru procesul de ,,molecular docking’’ cu ajutorul programului Hex 5.5

[D.Ritchie, Hex Protein Docking, http://www.csd.abdn.ac.uk/hex/]. Modelarea s-a efectuat

utilizând funcţii parametrice 3D care codifică deopotrivă forma suprafeţei, sarcina electrostatică

cât şi distribuţia de potenţial. Aceste funcţii parametrice se bazează pe funcţii de bază ortogonal

sferice sau polare. Pentru o evaluare vizuală a complecşilor sunt prezentate tabelul 1, energiile

legăturilor complecşilor formaţi, iar în figurile 3-6 structurile optimizate în urma procesului de

modelare.

Tabelul 1. Valorile energetice şi dimensiunile celulelor „grid” ale complecselor formate între formulele de inhibitori şi de receptori

Complex Etotal

(kJ/mol) Eforma

(kJ/mol) Epatrundere

(kJ/mol) Celule grid

Å Receptor: Triptază cod PDB 1A0L

TRY-luti1 -2942.4 65.3 -3007.7 0.6 TRY-luti2 -1401.8 22.9 -1424.6 0.6 TRY-luti3 -735.8 25.7 -761.4 0.6 TRY-luti4 -513 21 -534.0 0.6

TYR-CVTI1 -2498.5 42.0 -2540.5 0.6 TYR-CVTI2 -2017.2 29.7 -2046.9 0.6

Receptor: PAR 1 cod PDB 1NRN PAR1-luti1 -401.7 -10.1 -391.6 0.6 PAR1-luti2 -144.9 -1.8 -143.0 0.6 PAR1-luti3 -95.5 6.3 -101.8 0.6 PAR1-luti4 -88.7 -4.5 -84.2 0.6

PAR1-CVTI1 -377.0 -13.7 -363.2 0.6 PAR1-CVTI2 -200.5 -1.9 -198.6 0.6

Receptor: PAR 3 cod PDB 2PUX PAR3-luti1 -710.7 -233.5 -477.2 0.6 PAR3-luti2 -520.6 -155.1 -361.5 0.6 PAR3-luti3 -339.5 -154.2 -185.2 0.6 PAR3-luti4 -351.4 -91.4 -260.0 0.6

PAR3-CVTI1 -669.9 -126.5 -543.4 0.6 PAR3-CVTI2 -589.1 -131.1 -458.0 0.6

Receptor: PAR 4 cod PDB 2ZPK PAR4-luti1 -933.7 44.3 -977.9 0.6 PAR4-luti2 -486.0 0.2 -486.2 0.6 PAR4-luti3 -329.3 18.0 -347.3 0.6 PAR4-luti4 -309.8 5.0 -314.8 0.6

PAR4-CVTI1 -890.6 7.4 -898.0 0.6 PAR4-CVTI2 -703.0 10.0 -713.0 0.6

Figura 3. Structura optimizată a complecsului TRY-CVTI1 modelată utilizând funcţii parametrice 3D în urma procesului de ,,docare’’

Figura 4. Structura optimizată a complecsului PAR1-CVTI1 modelată utilizând funcţii parametrice 3D în urma procesului de ,,docare’’

Figura 5. Structura optimizată a complecsului PAR3-CVTI1 modelată utilizând funcţii parametrice 3D în urma procesului de ,,docare’’

Figura 6. Structura optimizată a complecsului PAR4-CVTI1 modelată utilizând funcţii parametrice 3D în urma procesului de ,,docare’’

Din datele prezentate se poate concluziona că formulele complecşilor TRY-CVTI1, PAR1-

CVTI1, PAR3-CVTI1 şi PAR4-CVTI1 având valorile energetice cele mai mici, ligandul CVTI1 poate

reprezenta un potenţial agent de inhibare al triptazei şi poate interacţiona cu receptorii PAR1,

PAR 3 şi PAR4.

Pentru valorificarea inhibitorilor proteazici ca agenţi terapeutici pe lângă proteoliza lor

cuplată cu testarea prin „molecular docking”, s-au efectuat studii de imobilizare a acestora pe

suporturi polimerice.

Astfel, investigaţiile noastre s-au axat pe obţinerea polihidroxibutiratului (PHB), prin

stabilirea raportului optim de inoculare a mediului de fermentaţie conţinând substrat lipidic şi a

influenţei lui asupra biosintezei polimerului.

La noi în ţară uleiul de floarea soarelui este o materie prima uşor accesibilă pentru

producerea la scară a polimerilor biodegradabili de tip PHB. Din acest motiv, am considerat

oportun studiul amănunţit al utilizării acestuia ca substrat lipidic pentru biosinteza PHB cu

tulpina consacrată, Cupriavidus necator DSM 545. Rezultatele experientelor efectuate în acest

scop sunt prezentate în tabelul 2 şi reprezentate în figura 7.

Pe baza rezultatelor obţinute se pot trage următoarele concluzii:

1. Concentraţia optimă de ulei de floarea soarelui este de 1g/100 mediu.

2. Odată ce concentraţia de ulei de floarea soarelui creşte de la 1g% la 1,38–1,84g%, toţi

parametrii: pH final, acumularea de biomasă, acumularea de PHB ca şi randamentele de

obţinere de PHB scad tot mai mult.

3. Scăderea tuturor parametrilor este influenţată şi este evidenţiată în mod direct, prin

scăderea pH-ului dincolo de limita de supravieţuire a microorganismului producător de PHB.

Tabelul 2. Biosinteza PHB pe tulpina Cupriavidus necator DSM 545, utilizând ulei de floarea ca sursă de carbon şi energie

Concentraţia de ulei la 100 ml

mediu

pH DO (550 nm)

Biomasă uscată (BU) (g/L)

PHA (g/L)

Randament în PHB

(%) iniţial final

0,92 g (1,0 ml)

7,5 6,2 25,125 6,440 5,1900 80,67

7,5 6,3 30,000 4,171 4,3250 100,00

1 g 7,5 6,0 31,300 7,215 6,0800 84,27

7,5 6,4 30,500 6,520 5,1200 78,53

1,38 g (1,5 ml)

7,5 6,3 31,125 8,900 7,8800 88,56

7,5 5,0 16,925 4,194 1,1760 28,00

1,84 g (2,0 ml)

7,5 4,6 13,523 2,541 0,5676 22,30

Figura 7. Influenţa concentraţiei de ulei de floarea soarelui

asupra biosintezei PHB

Caracterizarea polihidroxibutiratului ca polimer biodegradabil s-a făcut prin determinări

comparative între polimerul obţinut prin procedeul ICCF (PHB-ICCF) şi polimerul martor, Fluka

(PHB-F), din punctul de vedere al proprietăţilor fizice: solubilitate, temperatura de topire,

absorbţia luminii. Morfologia a fost investigată asupra polimerului ce trebuie supus prelucrării

(figura 8).

În cazul cercetărilor privind comportarea la prelucrare a PHB-ICCF pentru aplicaţii

medicale se pot spune următoarelele:

1) Este insolubil în apă şi relativ rezistent la degradare hidrolitică. Aceasta îl diferenţiază

de celelalte materiale plastice biodegradabile, care sunt solubile în apă sau sensibile la

umezeală.

2) Prezintă o bună permeabilitate la hidrogen, bună rezistenţă la radiaţii UV, dar slabă

rezistenţă la acizi şi baze.

3) Este solubil în cloroform şi alte hidrocarburi clorurate.

4) Are temperatura de topire 175oC şi temperatura de tranziţie vitroasă 15oC.

5) Rezistenţa la tracţiune 40 Mpa este apropiată de cea a polipropilenei.

6) Se scufundă în apă, în timp ce polipropilena pluteşte pe apă.

7) Scufundarea în apă a PHB-ICCF înlesneşte biodegradarea sa anaerobică.

8) Este netoxic şi biocompatibil ceea ce îl face potrivit pentru aplicaţii medicale.

Figura 8. Film de PHB-ICCF

În urma determinărilor efectuate se poate indica un domeniu de aplicabilitate al

biopolimerului în domeniul medical, atât la dispozitive medicale, cât şi în scopuri chirurgicale, ca

material medical, cum ar fi: vehicul pentru transportul şi eliberarea gradată a medicamentelor.

Necesitatea imobilizării inhibitorilor serin-proteazici naturali pentru creşterea stabilităţii

şi biodisponibilităţii în cazul utilizării lor ca ingrediente active în sistemele medicamentoase

retard sau ca ţesut, a condus la studierea obţinerii unor biomateriale cu activitate inhibitoare

proteazică.

Au intrat în atenţia noastră suporturile compozite biodegradabile formate din chitosan şi

polihidroxibutiratul obţinut pe cale microbiană prin tehnologie proprie. S-au obţinut compozite

copolimerice din amestecul CH cu PHB-ICCF în diferite proporţii analizate din punct de vedere al

posibilităţilor de utilizare în scopul propus. Pe acestea s-au imobilizat inhibitorii CVTI şi MoCTI,

prin includere şi adsorbţie.

Pentru scopul urmărit de obţinere a unor compuşi biologic activi s-au imobilizat inhibitorii

serin-proteazici CVTI şi MoCTI prin includere în gelul de chitosan, precum şi pe membranele de

copolimer CH-PHB cu reticulare, şi prin adsorbţie în sistem ”batch” pe aceleaşi suporturi

polimerice. Materialele obţinute au fost analizate, rezultatele fiind prezentate în tabelul 3.

Tabelul 3. Imobilizarea inhibitorilor serin-proteazici prin includere

Suport

polimeric Inhibitor

imobilizat Greutate

imobilizat rezultat

(g)

Activitate iniţială

(UIT)

Activitate imobilizat

Nivel de încărcare

suport (%)

(UIT/ imob)

(UIT/g Imob)

Imobilizare prin includere CH MoCTI 0,8375 294 0,052 0,062 0,018

CH-PHB (1:1)

MoCTI 0,4557 294 0,237 0,520 0,081

CH CVTI 0,6009 117 0,226 0,376 0,193 CH-PHB

(1:1) CVTI 0,8241 117 0,678 0,823 0,579

Imobilizare prin adsorbţie CH MoCTI 0,8383 294 0,504 0,601 0,17

CH-PHB (1:5)

MoCTI 3,2224 294 1,29 0,402 0,44

CH CVTI 1,0883 117 0,514 0,472 0,44

CH-PHB (1:5)

CVTI 1,2425 117 1,54

1,239 1,32

Din tabel se observă faptul că în cazul inhibitorului MoCTI în urma imobilizării prin

includere încărcarea pe suportul CH-PHB are un nivel mai mare faţă de cea pe suportul CH. De

asemenea, în cazul inhibitorului CVTI imobilizarea prin includere este eficientă pe suportul CH-

PHB.

În urma experimentului imobilizării prin adsorbţie se observă că, în cazul inhibitorului

MoCTI nivelul de încărcare al suportului este mai ridicat pe CH-PHB faţă de CH, iar în cazul

inhibitorului CVTI se observă cea mai bună încărcare pe suportul copolimeric CH-PHB, faţă

suportul din chitosan.

Pentru caracterizarea imobilizatelor s-au efectuat studii morfologice prin expunerea

filmelor compozite, în stare lichidă şi solidă, la microscopul optic (microscop de cercetare tip MC

5A cu observare în lumină transmisă). Imaginile rezultate sunt prezentate în figurile 9 şi 10.

(a) (b) (c)

Figura 9. Imaginile la microscop optic ale compozitelor formate din inhibitori serin-proteazici imobilizaţi pe copolimerul CH-PHB în soluţie de cloroform: (a) film cu CH-PHB (1:1) şi MoCTI; (b) film cu CH-PHB

(1:5) şi MoCTI; (c) film cu CH-PHB (1:5) şi CVTI

(a) (b) (c)

Figura 10. Imaginile la microscop optic ale compozitelor formate din inhibitori serin-proteazici imobilizaţi pe copolimerul CH-PHB în stare solidă: film cu CH-PHB (1:1) şi MoCTI; (b) film cu CH-PHB (1:5) şi MoCTI;

(c) film cu CH-PHB (1:5) şi CVTI

În figura 9 sunt prezintate compozitele în soluţie de cloroform. Timpi de expunere

texp=1/8, texp=1/30 şi texp=1/15. La probele din figurile 9(a) şi 9(b) se observă prezenţa

monocristalelor aglomerate. Pe când la proba din figura 9(c) se observă prezenţa

monocristalelor neaglomerate.

Pentru determinările microscopice ale materialelor compozite în stare solidă (figura 10)

timpul de expunere a fost de texp=1/30. Se observă diferenţe între materialele analizate, astfel

probele cu acelaşi inhibitor (MoCTI) sunt identice pe când proba cu inhibitorul CVTI este ca şi în

soluţie cu aspect izomorf.

Pentru testarea materialelor polimerice din punct de vedere al biodegradabilităţii s-au

investigat 2 substanţe biologic active, o enzimă şi inhibitorului ei. S-au ales: tripsina şi

inhibitorul tripsinic din soia, STI, efectuându-se studii ale comportării acestora la imobilizare şi

caracteristicile cinetice în diferite soluţii (ser fiziologic şi soluţie tampon de HCl-KCl 0,015 M pH

2). Concluzia ce se poate trage în urma acestor teste este că, spre deosebire de eliberarea

tripsinei, eliberarea inhibitorul STI din membrană este favorizată de pH-ul acid. Filmul cu STI

imobilizat a eliberat lent inhibitorul comparativ cu cel enzimatic, în aceleaşi condiţii. Putem

spune că biomaterialele obţinute pot fi folosite în scopuri medicale pentru medicamentele retard

sau plasturi, ţesuturi.

În vederea creşterii stabilităţii şi biodisponibilităţii inhibitorilor serin-proteazici ne-am

propus realizarea unor materiale cu proprietăţi bioactive. Studiile s-au concentrat pe obţinerea

de nanoparticule magnetice învelite în hidrogel pe bază de chitosan şi acid hialuronic, astfel

încât dimensiunile lor să fie suficient de mici încât să pătrundă în ţesuturi sau celule. S-au

încercat două variante: învelirea nanoparticulelor magnetice cu straturi succesive de chitosan şi

acid hialuronic după metoda “layer-by-layer”, precum şi învelirea nanoparticulelor magnetice cu

hidrogel obţinut din amestecuri diferite de chitosan şi acid hialuronic prin care s-au realizat mai

multe variante de probe.

Inhibitorul proteazic din seminţe de Linum usitatissimum (LUTI) (activitate specifică de

6.552 UI/mg proteină) a fost imobilizat prin metoda includerii în stratul de hidrogel.

Nanoparticulele cu inhibitor înglobat au fost analizate din punct de vedere al dimensiunilor,

structurii şi activităţii de inhibare a tripsinei. S-au făcut şi studii de stabilitate a activităţii

inhibitoare după o lună de păstrare la 40C.

Caracterizarea nanoparticulelor magnetice din punct de vedere al dimensiunilor, formei şi

structurii a fost realizată prin metode de analiză specifice, cum ar fi difuzia dinamică a luminii

(DLS) şi zetametria.

Figura 11. Nanoparticule magnetice cu LUTI entrapat (microscopie electronică de transmisie), proba 42.

Conform rezultatelor probele 42 şi 45 sunt cele mai apropiate de scopul urmărit având

diametrul între 180-278 nm. Ca urmare s-au continuat investigaţiile pe aceste probe prin

microscopie confocală, microscopie electronică care confirmă dimensiunile şi morfologia

nanoparticulelor cu activitate inhibitoare serin-proteazică (figurile 11, 12) şi analize de

spectofotometrie FT-IR pentru studierea encapsulării nanoparticulelor magnetice cu hidrogel şi

inhibitor LUTI entrapat (figura 13).

Figura 12. Microscopie confocală (250x250 µm) a nanoparticulelor cu LUTI entrapat, proba 42

3688

.64

3126

.02

2374

.57

1718

.92

1576

.18

1378

.74

806.

20

709.

66

100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

98.5

99.0

99.5

100.

0

Tran

smitt

ance

[%]

C:\Documents and Settings\Chitosan\pr20pastilakbr.3 7/23/2007 10:53:41 AM

Page 1 of 1

Figura 13. Spectrul FT-IR al nanoparticulelor encapsulate cu LUTI entrapat şi spectrul FT-IR al inhibitorului LUTI (înăuntru).

În concluzie, prin alternanţa straturilor de chitosan (electropozitiv) şi acid hialuronic

(electronegativ) pe suprafaţa nanoparticulelor magnetice se obţin structuri cu dimensiuni

nanometrice, ce pot pătrunde în ţesuturi sau celule şi pot îngloba în stratul de tip hidrogel

substanţe biologic active, de exemplu inhibitorul proteazic, cunoscut pentru combaterea

proliferării celulelor canceroase şi a efectelor antiinflamatoare. Nanostructurile obţinute nu au

prezentat toxicitate şi nu stimulează creşterea şi dezvoltarea bacteriilor sau fungilor (aspect

neabordat până acum). Datorită miezului magnetic, aceste nanoparticule obţinute pot fi dirijate

printr-un câmp magnetic direct la o zonă ţintă (ţesut, organ).

Pe baza modelelor experimentale şi a procedeelor de analiză rezultatele obţinute

evidenţiază un grad de noutate prin următoarele:

1. Obţinerea inhibitorilor de proteaze din seminţe de Citrullus vulgaris (pepene verde)

abreviat CVTI, Linum usitatissimum (in) abreviat LUTI şi Momordica charantia

(castravete amar) abreviat MoCTI, prin metode elaborate şi modificate în fazele de

purificare cromatografică.

2. Obţinerea prin biosinteză in vitro a inhibitorilor de proteaze din speciile Linum

usitatissimum şi Momordica charantia, prin strategii de dezvoltare şi exploatare a

culturilor de celule şi ţesuturi ca surse pentru inhibitorii serin-proteazici. Literatuta de

specialitate nu furnizează date asupra studiului biosintezei acestor inhibitori ceea ce

conferă cercetărilor noastre o notă de originalitate şi de semnificaţie teoretică şi

practică.

3. Inhibitorii proteazici CVTI şi LUTI au fost caracterizaţi prin punerea în evidenţă a

activităţii inhibitoare şi prin determinarea electroforetică a maselor moleculare

evidenţiind activităţi specifice echivalente inhibitorilor endogeni şi mase moleculare

conforme cu literatura, ~3000Da pentru CVTI şi respectiv ~7000Da pentru LUTI.

4. Pentru îmbunătăţirea efectului inhibitor proteazic aplicat asupra triptazei mastocitare,

serin-protează implicată în astm bronşic, precum şi în boli alergice şi inflamatorii,

trebuie diminuată masa moleculară a proteinelor studiate prin proteoliză enzimatică

limitată. Pentru aceasta s-a recurs la proteoliza enzimatică cu pepsină şi termolizină în

condiţii date, rezultând hidrolizate bogate în fracţiuni peptidice a căror mase

moleculare au fost determinate prin separare electroforetică.

5. În urma migrării electroforetice a probelor obţinute prin hidroliza enzimatică cu

termolizină la un DH de 12,3% se disting benzi vizibile în intervalul de mase moleculare

de 6-20kDa, ajungând după 12 ore de hidroliză la un DH de 19,7% subunităţile formate

să fie cu M<6kDa. În cazul probelor obţinute prin hidroliza enzimatică sub acţiunea

pepsinei la 4 ore de hidroliză cu un DH de 11,8% se disting mase moleculare cuprinse

între 6-4kDa, ajungand dupa 6 ore de hidroliza la un DH de 17,9% peptidele formate

fiind cu M<4kDa.

6. Aplicarea celei mai noi tehnici de testarea a eficienţei terapeutice a inhibitorilor

proteazici, metoda „molecular docking”, în care legarea unui inhibitor de un receptor

poate fi explorată în detaliu demonstrând specificitatea acestora faţă de proteazele

ţintite. Utilizând funcţii parametrice 3D în urma procesului de ,,docare’’ s-au modelat

structurile optimizate ale complecşilor TRY-CVTI1, PAR1-CVTI1, PAR3-CVTI1 şi PAR4-

CVTI1 având valorile energetice cele mai mici. Ca urmare, ligandul CVTI1, obţinut prin

proteoliza enzimatică a inhibitorului din seminţe de Citrullus vulgaris, poate reprezenta

un potenţial agent de inhibare atât a triptazei cât şi a receptorilor PAR1, PAR 3 şi PAR4.

7. În scopul utilizării polimerilor biodegradabili ca suporturi pentru imobilizarea

inhibitorilor proteazici s-a obţinut polihidroxibutiratul, PHB, pe cale microbiană

utilizând tulpina Ralstonia eutropha DSM 545 şi uleiul de floarea soarelui ca sursă de

carbon şi energie, printr-o tehnologie ICCF, originală şi brevetată.

8. În urma caracterizării atât din punctul de vedere al proprietăţilor fizice ale PHB-ICCF

(solubilitate, temperatura de topire, absorbţia luminii), cât şi a studiului morfologic şi al

comportării la prelucrare, se poate concluziona că PHB-ICCF s-a evidenţiat printr-o

comportare identică cu martorul (PHB Fluka) având proprietăţi ce îl recomandă ca

biomaterial pentru suporturi naturale polimerice.

9. În vederea creşterii stabilităţii şi biodisponibilităţii inhibitorilor proteazici a fost

necesară imobilizarea acestora pe suporturi polimerice. Aceasta s-a făcut prin metode

de imobilizare prin includere şi adsorbţie cu obţinere de filme polimerice, precum şi

prin obţinerea de nanoparticule învelite cu straturi de polimer (chitosan) şi acid

hialuronic în care a fost entrapat inhibitorul proteazic.

10.În urma imobilizării inhibitorilor CVTI şi MoCTI pe suporturile formate din CH-PHB şi

CH se poate trage concluzia că prin metodele de imobilizare utilizate compozitul format

din CH-PHB-CVTI a prezentat nivelul cel mai mare de încărcare pe suport.

11.Caracterizarea imobilizatelor pe suporturi polimerice biodegradabile cu activitate

biologică s-a efectuat pe 2 tipuri de substanţe, enzima şi inhibitorului ei. S-au ales:

tripsina şi inhibitorul proteazic din soia, STI, efectuându-se studii ale comportării

acestora la imobilizare şi caracteristicile cinetice în diferite soluţii (ser fiziologic şi

soluţie tampon de HCl-KCl 0,015 M pH 2). Concluzia ce se poate trage în urma acestor

teste este că, spre deosebire de eliberarea tripsinei, eliberarea inhibitorul STI din

membrană este favorizată de pH-ul acid. Filmul cu STI imobilizat a eliberat lent

inhibitorul comparativ cu cel enzimatic, în aceleaşi condiţii. Deci, biomaterialele

obţinute pot fi folosite în scopuri medicale pentru medicamentele retard.

12.Testele de biocompatibilitate in vitro a biopreparatelor cu activitate inhibitoare

proteazică obţinute prin imobilizarea inhibitorilor CVTI şi MoCTI, pe suporturile

polimerice, CH-PHB şi chitosan, au arătat că preparatul CH-PHB-CVTI nu prezintă

citotoxicitate în culturile celulare ceea cei îi conferă aplicabilitatea în domeniul medical.

13.Nanoparticulele obţinute prin metoda „layer by layer” corespund din punct de vedere

al formei şi dimensiunilor, respectiv au diametrul sub 278 nm şi au reţinut în învelişul

de hidrogel inhibitorul proteazic LUTI (randament de imobilizare de 82-87%), care

prezintă activitate de inhibare proteazică şi după o lună de păstrare la 40C.

14.Prin testele de biocompatibilitate in vitro nu a fost detectată citotoxicitate în culturile

celulare cu inhibitorul LUTI şi cu nanoparticulele magnetice de hidrogel, viabilitatea lor

descreşte cu creşterea concentraţiilor, dar se menţine la 65%.

15.Nanostructurile obţinute nu au prezentat toxicitate şi nu stimulează creşterea şi

dezvoltarea bacteriilor sau fungilor (aspect neabordat până acum). Datorită miezului

magnetic, aceste nanoparticule obţinute pot fi dirijate printr-un câmp magnetic direct

la o zonă ţintă (ţesut, organ).

16.Testarea in vivo a inhibitorului proteazic din seminţe de in, LUTI, efectuată din punct

de vedere al toleranţei locale şi al potenţialului sensibilizant a condus la concluzia că

inhibitorul este bine tolerat pe tegumente şi la nivelul mucoasei conjunctive, precum şi

că acesta nu a dat reacţii de sensibilizare (edem sau eritem), ceea ce dovedeşte lipsa

potenţialului sensibilizant al LUTI testat.