teza 10 - rezumate · 2010. 9. 1. · title teza 10 - rezumate author: dori created date: 1/12/2010...

66
UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE HORTICULTURĂ Ing. CRISTIAN RADU SISEA STUDIUL CONłINUTULUI DE ORGANISME MODIFICATE GENETIC DIN UNELE PRODUSE ALIMENTARE PE BAZĂ DE SOIA ŞI PORUMB (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) CONDUCĂTOR ŞTIINłIFIC Prof. univ. dr. ing. DORU PAMFIL Cluj-Napoca 2009

Upload: others

Post on 29-Jan-2021

5 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

  • UNIVERSITATEA DE ŞTIIN łE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă

    VETERINAR Ă CLUJ-NAPOCA

    ŞCOALA DOCTORAL Ă

    FACULTATEA DE HORTICULTUR Ă

    Ing. CRISTIAN RADU SISEA

    STUDIUL CONłINUTULUI DE ORGANISME MODIFICATE GENETIC

    DIN UNELE PRODUSE ALIMENTARE PE BAZ Ă DE SOIA ŞI PORUMB

    (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

    CONDUCĂTOR ŞTIIN łIFIC

    Prof. univ. dr. ing. DORU PAMFIL

    Cluj-Napoca

    2009

  • Rezumat al tezei de doctorat

    2

    CUPRINS

    în cadrulrezumatului

    în cadrul tezei

    INTRODUCERE ............................................................................................. 4CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNOŞTINłELOR ÎN

    DOMENIUL OMG-URILOR................................................................. 61.1. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC ....................................... 6

    1.1.1. Introducerea organismelor modificate genetic................................. 61.1.2. Răspândirea PMG-urilor................................................................... 71.1.3. Impactul potenŃial al PMG-urilor ..................................................... 8

    1.2. MONITORIZAREA OMG-URILOR.................................................... 91.2.1. LegislaŃia europeană şi cea românească referitoare la OMG-

    uri ....................................................................................................... 91.2.2. Etapele analitice incluse în procedura integrată de testare

    OMG a produselor alimentare ......................................................... 101.2.2.1. Procedura integrată de testare OMG........................................ 101.2.2.2. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor testării OMG .......... 11

    1.3. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR................................ 12CAPITOLUL II. MATERIAL ŞI METODE................................................. 13

    2.1. LABORATORUL DE TESTARE ....................................................... 132.2. MATERIALUL BIOLOGIC................................................................ 13

    2.2.1. Evenimentele de transformare studiate .......................................... 132.2.2. Probele utilizate în cadrul experimentelor...................................... 14

    2.3. EŞANTIONAREA............................................................................... 152.4. PREGĂTIREA PROBELOR ............................................................... 162.5. EXTRACłIA ADN-ULUI................................................................... 162.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN ....................................... 17

    2.6.1. Cuantificarea spectrofotometrică.................................................... 182.6.2. Evaluarea stării de fragmentare a moleculelor de ADN................. 182.6.3. Confirmarea absenŃei substanŃelor inhibitoare ............................... 18

    2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE ÎN CADRUL TESTĂRII OMG...................................................................................................19

    2.8. TESTAREA OMG CALITATIVĂ ...................................................... 202.8.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului ............................................ 222.8.2. DetecŃia rapidă (screening) a OMG-urilor ..................................... 222.8.3. Identificarea evenimentelor de transformare.................................. 23

    2.9. TESTAREA CANTITATIVĂ A OMG-URILOR............................... 242.9.1. Metodologia real-time PCR utilizată în cazul testării OMG.......... 242.9.1.1. Introducerea analizei real-time PCR......................................... 242.9.1.2. Principiul real-time PCR........................................................... 242.9.1.3. Materialele de referinŃă certificate............................................ 262.9.1.4. Sisteme de detecŃie ..................................................................... 26

    2.9.2. Confirmarea absenŃei inhibitorilor PCR......................................... 27

    ...............10

    ...............17

    ...............17

    ...............17

    ...............29

    ...............33

    ...............43

    ...............43

    ...............48

    ...............49

    ...............53

    ...............55

    ...............57

    ...............57

    ...............60

    ...............61

    ...............68

    ...............72

    ...............78

    ...............80

    .............100

    .............101

    .............105

    .............109

    .............109

    .............120

    .............145

    .............146

    .............150

    .............153

    .............153

    .............155

    .............172

    .............181

    .............190

  • Rezumat al tezei de doctorat

    3

    2.9.3. Cuantificarea ADN-ului MG.......................................................... 272.9.4. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 ............ 282.9.4.1. Cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000........................... 282.9.4.2. Cuantificarea pe platforma LightCycler 480............................. 29

    2.9.5. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176...................... 292.10. EVALUAREA ŞI VALIDAREA METODELOR ANALITICE ...... 29

    2.10.1. Validarea şi acreditarea metodelor analitice................................. 292.10.2. Incertitudinea de măsurare............................................................ 31

    CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUłII ............................................ 323.1. PREGĂTIREA PROBELOR TEST .................................................... 323.2. TESTAREA METODELOR DE EXTRACłIE A ADN-ULUI.......... 323.3. IZOLAREA ADN-ULUI ÎN CADRUL PROTOCOLULUI

    INTEGRAT DE TESTARE ............................................................... 333.4. TESTAREA OMG CALITATIVĂ ...................................................... 34

    3.4.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului ............................................ 343.4.2. Screeningul OMG........................................................................... 343.4.3. Identificarea evenimentelor de transformare.................................. 353.4.4. Considerente generale pentru testarea calitativă ............................ 35

    3.5. TESTAREA OMG CANTITATIVĂ ...................................................373.5.1. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe

    platforma Rotor-Gene 3000 ............................................................. 373.5.2. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe

    platforma LightCycler 480............................................................... 383.5.3. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176...................... 383.5.4. Considerente generale pentru testarea cantitativă .......................... 39

    3.6. REZULTATE GENERALE ALE TESTĂRII OMG........................... 41CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI............................................................... 43BIBLIOGRAFIE............................................................................................ 49

    .............191

    .............197

    .............198

    .............200

    .............202

    .............206

    .............207

    .............221

    .............237

    .............237

    .............238

    .............252

    .............257

    .............257

    .............263

    .............266

    .............269

    .............270

    .............270

    .............274

    .............276

    .............279

    .............282

    .............285

    .............293

  • Rezumat al tezei de doctorat

    4

    INTRODUCERE

    Plantele (de cultură) modificate genetic (PMG) (genetically modified crop/GMC)

    reprezintă tehnologia agricolă cu cea mai rapidă răspândire din istorie (Raney, 2006),

    precum şi subiectul celor mai intense controverse referitoare la introducerea şi utilizarea

    biotehnologiilor moderne. Acest tip de organisme modificate genetic (OMG) (genetically

    modified organism/GMO) au fost obŃinute încă din anii 1980, momentul introducerii

    pentru prima dată în cultura comercială fiind însă discutabil. Mai mulŃi autori (Hails şi

    Kinderlerer, 2003; Zhou et al., 1995, în Nap et al., 2003; James şi Krattiger, 1996) afirmă

    că PMG-urile au fost utilizate în China, în scop comercial, încă de la sfârşitul anilor 1980

    sau începutul anilor 1990. În ceea ce priveşte utilizarea în alimentaŃia umană, tomatele

    FlavrSavr reprezintă primele plante de cultură modificate genetic destinate acestui scop

    (Lüthy, 1999; James şi Krattiger, 1996). Introducerea lor pe piaŃă s-a făcut în 1996.

    Opiniile referitoare la utilzarea PMG-urilor pot fi încadrate în două curente. Pe de

    o parte, cultivarea la scară largă este văzută ca având numeroase beneficii economico-

    sociale şi ecologice, iar de cealaltă parte, opozanŃii noii tehnologii insistă asupra

    potenŃialelor efecte negative pe care OMG-urile le pot provoca asupra echilibrului

    ecosistemelor, economiei, sănătăŃii etc.

    Conform ligislaŃiei europene (ex. Regulamentul 1829/2003 şi Regulamentul

    1830/2003), cultivarea OMG-urilor şi procesarea sau comercializarea sub formă de

    alimente, furaje sau material săditor se face doar după parcurgerea unui proces de

    autorizare. Pentru a fi autorizate, OMG-urile trebuie să îndeplinească anumite cerinŃe

    referitoare la siguranŃă şi liberă alegere, care au de fapt rolul de a asigura coexistenŃa, la

    orice nivel, cu produsele convenŃionale (Wikipedia, 2009; GMO Compass, 2006c). Este

    astfel protejat dreptul producătorilor, comercianŃilor şi consumatorilor de a alege, iar

    instrumente ca trasabilitatea, etichetarea sau monitorizarea post-market, introduse prin

    noile actele normative, au rolul de a permite identificarea OMG-urilor de-a lungul

    lanŃului de producŃie şi consum.

    Din cele prezentate anterior se poate concluziona că ingineria genetică şi

    produsele derivate din aceasta reprezintă deja un domeniu important la nivel global, care

  • Rezumat al tezei de doctorat

    5

    se dezvoltă continuu, având potenŃialul de a genera numeroase beneficii, dar şi efecte

    negative. Cu toate că până în momentul de faŃă nu există dovezi clare, care să

    fundamenteze temerile legate de posibile urmări nefavorabile ale utilizării OMG-urilor,

    se recomandă o abordare prudentă.

    În Ńara noastră, soia şi porumbul au fost singurele plante MG cultivate în scop

    comercial. Deşi opoziŃia publicului faŃă de aceste culturi este, în general, evidentă,

    fermierii susŃin că beneficiile economice obŃinute sunt considerabile. Aceste aspecte au

    fost evidenŃiate de rapoartele Serviciului Străin de Agricultură din cadrul

    Departamentului de Agricultură al Statelor Unite (USDA Foreign Agricultural Service)

    (Cionga, 2005; Higgins, 2000), precum şi de publicaŃii din Ńara noastră.

    Astăzi, cultivarea PMG-urilor în România se face pe suprafeŃe foarte restrânse, în

    principal datorită implementării legislaŃiei europene care, odată cu aderarea Ńării noastre

    la UE, la 1 ianuarie 2007, a impus renunŃarea la soia MG. Această legislaŃie

    reglementează strict domeniul biotehnologiilor şi în special cultivarea PMG-urilor. În

    consecinŃă, în cadrul UE şi implicit în România, doar două evenimente de transformare

    (MON810 şi T25, ambele la porumb) mai sunt încă autorizate pentru cultivare (Comisia

    Europeană, 2009; GMO Compass, 2009).

    În ceea ce priveşte activitatea de testare OMG, s-au creat şi în România premisele

    dezvoltării unui sistem adecvat, capabil să asigure punerea în aplicare a noilor prevederi

    legale referitoare la trasabilitatea, etichetarea şi monitorizarea post-market a produselor

    alimentare care conŃin OMG-uri, permiŃând astfel o alegere informată şi conştientă

    (informed choice) de-a lungul lanŃului de producŃie şi comercializare (Lee et al., 2006;

    Zafar et al., 2004).

    În vederea armonizării politicilor naŃionale cu cele europene, au fost demarate

    procese de acreditare a unor laboratoare de testare OMG, care să corespundă standardelor

    acceptate la nivel internaŃional. În acest context se înscrie şi tematica prezentei teze,

    motivată, în principal, de existenŃa unui contract CEEX Modul IV (nr. 229/2005) care a

    urmărit crearea unui laborator naŃional pentru evaluarea şi certificarea conformităŃii

    produselor alimentare de origine vegetală ce conŃin OMG-uri. Laboratorul a fost denumit

    CERT-OMG.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    6

    Activitatea de monitorizare presupune efectuarea unor analize moleculare

    specifice, concretizate prin detecŃia, identificarea şi cuantificarea materialului MG. În

    practica testării OMG sunt folosite metode imunologice, bazate pe analiza proteinelor,

    sau metode bazate pe tehnologia PCR (polymerase chain reaction) ce utilizează ADN-ul

    ca analit. Cele mai performante şi deci cele mai utilizate, sunt metodele din a doua

    categorie (Žel et al., 2008).

    Un aspect foarte important referitor la procesul de acreditare al laboratoarelor

    OMG este reprezentat de necesitatea validării metodelor analitice, problematică care a

    preocupat şi colectivul laboratorului nostru.

    CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNO ŞTINłELOR ÎN

    DOMENIUL OMG-URILOR

    1.1. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC

    1.1.1. Introducerea organismelor modificate genetic

    Exceptând liniile modificate genetic (MG) răspândite în aproape toate regiunile

    globului, cultivarurile utilizate la scară largă pentru obŃinerea produselor alimentare sunt

    rezultatul domesticirii formelor sălbatice iniŃiale. Metodologia clasică de recombinare a

    genelor responsabile pentru expresia caracterelor de interes, necesită un consum

    semnificativ de resurse materiale, dar mai ales de timp. Un alt dezavantaj major al

    metodelor clasice este reprezentat de incapacitatea introducerii unei singure caracteristici,

    fără a fi necesară recombinarea genoamelor întregi. Cel mai important neajuns al

    ameliorării clasice este reprezentat însă de imposibilitatea transferului de material genetic

    între organisme îndepărtate din punct de vedere taxonomic. Aceste două limitări pot fi

    depăşite, cel puŃin în parte, prin aplicarea tehnologiilor de transformare genetică.

    Protocolului asupra BiosecurităŃii de la Cartagena (The Cartagena Protocol on

    Biosafety/CPB) definşte organismele vii modificate (living modified organisms/LMOs)

    ca fiind acele entităŃi vii (inclusiv cele sterile, virusurile şi viroizii) ce posedă o nouă

  • Rezumat al tezei de doctorat

    7

    combinaŃie de material genetic obŃinută prin utilizarea biotehnologiilor moderne (CPB,

    2000). Deşi face referire la aceeaşi categorie de fiinŃe, Directiva Consiliului 2001/18/CE

    le numeşte organisme modificate genetic, denumire care a fost preluată şi este astăzi

    utilizată în întreaga lume, la toate nivelurile. Conform Directivei, sintagma „organism

    modificat genetic” descrie entităŃile vii, exceptând fiinŃele umane, a căror material

    genetic a suferit modificări ce nu pot fi generate prin mecanisme naturale de hibridare sau

    recombinare. În acest caz, termenul „organism” subliniază capacitatea entităŃii biologice

    în cauză de a se înmulŃi şi de a-şi trasmite informaŃia genetică în descendenŃă.

    Aplicată speciilor cultivate, sintagma se referă la plantele în genomul cărora a fost

    introdusă stabil, prin transformare genetică, informaŃie genetică provenită de la o altă

    specie, efectul dorit fiind exprimarea acesteia în organismul gazdă. Procesul de

    introducere şi funcŃionare (exprimare) a genelor în specii neînrudite este denumit

    transformare genetică.

    1.1.2. Răspândirea PMG-urilor

    Fig. 1. EvoluŃia suprafeŃei (milioane ha) globale cultivate cu plante transgenice. Sursă: James (2009).

    Extinderea OMG-urilor în culturile agricole s-a făcut foarte rapid în anii care au

    urmat introducerii lor pe piaŃă. Astfel, din 1996 şi până la sfârşitul anului 2008, suprafaŃa

    globală cultivată cu OMG-uri a crescut de peste 70 ori, ajungând în prezent la 125

  • Rezumat al tezei de doctorat

    8

    milioane hectare (Figura 1), ceea ce reprezintă aproximativ 8% din suprafaŃa agricolă

    mondială (James, 2008). Cea mai mare parte din culturile transgenice este concentrată în

    SUA, Argentina, Brazilia, India şi Canada care, împreună cu alte câteva Ńări, sunt

    considerate marile cultivatoare de PMG-uri ale lumii („biotech mega-countries”).

    În UE, cultivarea OMG-urilor se face la scară mult mai mică, importurile de

    materii prime destinate obŃinerii produselor alimentare şi furajelor fiind însă foarte

    frecvente. În ceea ce priveşte Ńara noastră, la nivelul anului 2008, suprafaŃa atribuită

    culturilor transgenice nu a depăşit 50.000 ha (James, 2009; James, 2008).

    1.1.3. Impactul potenŃial al PMG-urilor

    Opiniile referitoare la utilitatea şi riscurile inerente utilizării PMG-urilor sunt

    foarte diferite. Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure şi necesare

    societăŃii umane, în timp ce opozanŃii le consideră neesenŃiale şi potenŃial cauzatoare de

    efecte negative asupra sănătăŃii şi mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi însă

    corectă din simplu considerent că PMG-urile nu reprezintă o categorie omogenă, punerea

    în balanŃă a beneficiilor şi riscurilor trebuind făcută pentru fiecare caz în parte (Pretty,

    2000). Analiza impactului potenŃial al introducerii şi utilizării PMG-urilor are în vedere o

    serie de factori ca: implicaŃiile tehnice pentru practica agricolă; inputurile din agricultură;

    fluxul de gene; biodiversitatea; impactul economic; avantajele pentru sistemul sanitar;

    riscurile pentru sănătatea consumatorilor şi organismele non-Ńintă; asigurarea securităŃii

    alimentare; implicaŃiile de natură etică sau culturală.

    Pe baza celor studiate, concluzionăm că utilizarea PMG-urilor, ca în cazul oricărei

    alte tehnologii, prezintă o serie de avantaje, dar pot genera şi riscuri pentru mediu şi

    sănătate. Trebuie de asemenea subliniat că pericolul nu este reprezentat întotdeauna de

    tehnologia în sine, ci mai degrabă de utilizarea iraŃională.

    O serie din situaŃiile întâlnite demonstrează clar posibilitatea formulării unor

    păreri diferite, sau chiar opuse, pe baza aceleiaşi informaŃii, datorită deosebirilor în ceea

    ce priveşte percepŃia, valorile sociale, orientările politice, sistemul legislativ şi

    capacitatea de acŃiune colectivă (Yogendra, 2004, în Deisingh şi Badrie 2005). De aceea

    considerăm că informarea corectă a publicului, precum şi implemetarea metodologiei de

  • Rezumat al tezei de doctorat

    9

    testare în laboratoare, sunt două obiective importante în conjunctura comercializării

    PMG-urilor ca atare sau sub formă de produse alimentare derivate, iar lucarea de faŃă

    reprezintă o contribuŃie la eforturile de atingere a acestora în Ńara noastră.

    1.2. MONITORIZAREA OMG-URILOR

    1.2.1. LegislaŃia europeană şi cea românească referitoare la OMG-uri

    Introducerea deliberată în mediu, cultivarea, schimburile transfrontaliere şi

    utilizarea în alimentaŃie a OMG-urilor sunt reglementate la nivelul UE de un set de

    proceduri stricte, ce alcătuiesc un larg cadru legislativ (Mazzara et al., 2008).

    Principale instrumente legale adoptate în cadrul UE pentru reglementarea acestui

    domeniu sunt: Directiva 2001/18/CE referitoare la introducerea deliberată în mediu a

    OMG-urilor; Regulamentul 1829/2003 privind produsele alimentare şi furajele MG;

    Regulamentul 1830/2003 privind trasabilitatea şi etichetarea OMG-urilor şi trasabilitatea

    alimentelor destinate alimentaŃiei umane sau animale, produse din OMG-uri, şi de

    modificare a Directivei 2001/18/CE; Regulamentului 641/2004 privind normele de

    aplicare a Regulamentului nr. 1829/2003; Regulamentul 1981/2006 privind normele de

    aplicare a articolului 32 din Regulamentul nr. 1829/2003; Recomandarea 2004/787/EC.

    Aceste acte normative au introdus sau consolidat diferite principii sau concepte

    referitoare la domeniul OMG-urilor: evaluarea riscului asupra mediului; informarea

    cetăŃenilor; alegerea conştientă/informată; etichetarea (labeling) şi trasabilitatea

    (traceability) în toate etapele plasării pe piaŃă; monitorizarea post-market (post-market

    monitoring); pragul de etichetare al conŃinutului MG (i.e. 0,9%) şi modul de interpretare

    a acestuia; coexistenŃa culturilor transgenice cu toate celelalte sisteme agricole;

    Laboratorul Comunitar de ReferinŃă pentru Alimente şi Furaje Modificate Genetic

    (Community Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed/CRL-

    GMFF); ReŃeaua Europeană de Laboratoare OMG (European Network of GMO

    Laboratories/ENGL) etc. A fost stabilit şi rolul în acest domeniu a diferitelor instituŃii

    europene ca: Autoritatea Europeană pentru SiguranŃă Alimentară (European Food Safety

    Authority/EFSA); CRL-GMFF; Centrul Comun de Cercetare (al Comisiei) (Joint

  • Rezumat al tezei de doctorat

    10

    Research Centre/JRC); ENGL; Unitatea de Biotehnologii şi OMG-uri (Biotechnology

    and GMOs Unit/B&GMOs) a Institutului pentru Sănătate şi ProtecŃia Consumatorului

    (Institute for Health and Consumer Protection/IHCP); Institutul pentru Materiale de

    ReferinŃă şi Măsurători (Institute of Reference Materials and Measurements/IRMM).

    1.2.2. Etapele analitice incluse în procedura integrată de testare OMG a produselor

    alimentare

    Necesitatea monitorizării OMG-urilor şi a implementării metodologiei de testare,

    atât în cazul soiei şi porumbului, cât şi al altor taxoni, rezidă în principal din contextul

    geo-politico-economic în care se găseşte România sau alte state membre UE. Astfel, deşi

    legislaŃia cu privire la cultivarea OMG-urilor este restrictivă, schimburile comerciale

    transfrontaliere oferă posibilitatea introducerii acestui tip de produse pe piaŃa alimentară

    (Ujhelyi et al. 2007).

    Aplicarea legislaŃiei privitoare la etichetarea produselor care conŃin material MG

    se face pe baza rezultatelor obŃinute de către laboratoare specializate. În viziunea

    europeană, acreditarea laboratoarelor de testare OMG, în conformitate cu standardele ISO

    specifice (i.e. ISO/CEI 17025), este considerată ca fiind un element necesar pentru

    desfăşurarea controalelor oficiale (Directiva 93/99/EEC în Schulze, 2008; Recomandarea

    2004/787/EC). Acest tip de strategie va trebui aplicat şi în cazul „Laboratorului naŃional

    de referinŃă pentru evaluarea şi certificarea conformităŃii produselor vegetale care conŃin

    organisme modificate genetic” (CERT-OMG), USAMV Cluj-Napoca, de aceea etapele

    analitice, metodele şi procedurile utilizate în această lucrare urmează recomandările şi

    liniile directoare stabilite sau acceptate la nivelul spaŃiului comunitar.

    1.2.2.1. Procedura integrată de testare OMG

    Pentru detecŃia elementelor genetice specifice OMG-urilor, majoritatea

    laboratoarelor utilizează metodologii bazate pe reacŃia PCR şi real-time PCR (Morisset et

    al., 2009). Toate procedurile de acest fel identificate în literatura de specialitate, urmează

    acelaşi principiu general, fiind însă diferite din perspectiva includerii/excluderii sau

  • Rezumat al tezei de doctorat

    11

    complexităŃii anumitor etape. Sursele folosite direct pentru elaborarea metodologiei de

    lucru utilizată în această lucrare (Figura 2) sunt Querci (2004) şi Querci et al. (2005).

    Caracteristicile fiecăreia dintre aceste etape analitice vor fi discutate în

    subcapitolele următoare.

    Fig. 2. Succesiunea etapelor analitice în cadul metodologiei de testare OMG. După Querci (2004), modificat.

    1.2.2.2. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor testării OMG

    Conform legislaŃiei europene (i.e. Directiva 18/2001/CE), OMG-urile

    comercializate ca produse în sine sau ca ingrediente ale altor produse trebuie etichetate

    corespunzător, în funcŃie de noul prag limită introdus de Regulamentul 1829/2003 –

    0,9%, la nivel de ingredient. În acest context, odată ce un produs a fost identificat pozitiv

  • Rezumat al tezei de doctorat

    12

    pentru unul sau mai multe evenimente de transformare, următoarele etape ale analizei au

    ca scop determinarea cantitativă a conŃinutului OMG, iar pe baza rezultatelor obŃinute se

    va lua decizia de etichetare. În cazul evenimentelor de transformare neautorizate pentru

    comercializare în UE, procedura de testare este similară cu cea descrisă anterior. PrezenŃa

    acestora este însă total interzisă (zero tolerance policy) (GMO Compass, 2007).

    1.3. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

    Din cele prezentate anterior se desprinde concluzia că una dintre componentele

    esenŃiale ale cercetărilor şi aplicaŃiilor actuale în domeniul OMG-urilor este reprezentată

    de testatea calitativă şi cantitativă.

    DetecŃia şi cuantificarea evenimentelor de transformare GTS 40-3-2 (Roundup

    Ready) la soia şi Bt176 (Maximizer) la porumb a constituit obiectul principal de studiu al

    prezentei teze de doctorat, în scopul implementării acestor metodologii în cadrul

    laboratorului CERT-OMG al USAMV Cluj-Napoca.

    În conformitate cu principiile de analiză a conŃinutului OMG descrise în literatura

    de specialitate (ex. Querci et al., 2005; Querci, 2004), în cadrul cercetărilor noastre s-a

    avut în vedere realizarea următoarelor obiective: dobândirea competenŃelor teoretice şi

    practice necesare desfăşurării activităŃilor specifice acestui domeniu; prospectarea pieŃei

    în vederea identificării produselor alimentare pe bază de soia sau porumb; revizuirea

    procedurilor de eşantionare; pregătirea probelor pentru analiză; extracŃia ADN-ului;

    evaluarea caracteristicilor extractelor obŃinute; detecŃia ADN-ului specific taxonului

    analizat utilizând reacŃia PCR ; detecŃia OMG-urilor utilizând metode screening bazate pe

    reacŃia PCR; identificarea evenimentelor de transformare utilizând reacŃia PCR;

    cuantificarea conŃinutului MG prin real-time PCR; stabilirea metodologiei de testare

    OMG şi validarea metodelor în vederea implementării şi acreditării acestora în cadrul

    Laboratorului CERT-OMG, USAMV Cluj-Napoca.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    13

    CAPITOLUL II. MATERIAL ŞI METODE

    2.1. LABORATORUL DE TESTARE

    Pentru buna desfăşurare a fluxului analitic şi obŃinerea unor rezultate de încredere

    este esenŃială existenŃa unui spaŃiu adecvat şi cu dotare corespunzătoare. De aceea,

    urmarea liniilor directoare şi respectarea normelor acceptate la nivel internaŃional sunt

    aspecte de importanŃă majoră, mai ales în cazul în care se doreşte acreditarea metodelor

    de testare.

    ExperienŃele descrise au fost efectuate în laboratoarele Centrului de Cercetare

    pentru Markeri Genetici din cadrul FacultăŃii de Horticultură, USAMV Cluj-Napoca.

    SpaŃiul existent aici nu îndeplineşte cerinŃele enunŃate anterior, motiv pentru care se

    doreşte transferarea activităŃilor într-un nou spaŃiu conceput şi dotat corespunzător.

    Acesta din urmă corespunde laboratorului CERT-OMG, situat în cadrul Institutului

    pentru ŞtiinŃele VieŃii al USAMV Cluj-Napoca şi va permite funcŃionarea în condiŃiile

    necesare acreditării metodelor de testare, proces care a fost de altfel iniŃiat.

    2.2. MATERIALUL BIOLOGIC

    2.2.1. Evenimentele de transformare studiate

    Alegerea celor două evenimente de transformare, GTS 40-3-2 şi Bt176, pentru

    experienŃele propuse, a fost făcută având în vedere considerente ca: importanŃa pe care

    porumbul şi soia MG o au în agricultură; stadiul autorizaŃiei pentru comercializarea

    acestor OMG-uri în cadrul UE, la nivelul anului 2006; volumul mare de informaŃie

    disponibilă pentru testarea acestor două evenimente de transformare.

    Evenimentul de transformare la soia (Glycine max) GTS 40-3-2, comercializat sub

    denumirea Roundup Ready (RR), a fost creat de Monsanto în scopul utilizării erbicidelor

    totale pe bază de glifosat pentru controlul buruienilor în culturile comerciale. Simplitatea

    acestui sistem a reprezentat unul dintre motivele succesului rapid pe care la avut în rândul

    cultivatorilor (AGBIOS, 2009b). Soia Roundup Ready este cultivată pentru boabe

  • Rezumat al tezei de doctorat

    14

    destinate alimentaŃiei umane (în special sub formă de ulei, fracŃiuni proteice şi fibre) şi a

    animalelor (în special sub formă de şrot) (Querci şi Mazzara, 2004b).

    GTS 40-3-2 a fost obŃinut prin introducerea în varietatea comercială A5403

    (Asgrow Seed Company) a genei EPSPS, izolată din linia CP4 a speciei Agrobacterium

    tumefaciens (Lin et al., 2000). Gena introdusă codifică o proteină EPSPS insensibilă, în

    general, la acŃiunea glifosatului, care poate astfel metaboliza aminoacizii aromatici

    necesari plantei, chiar şi în cazul aplicării erbicidului Roundup (Deisingh şi Badrie, 2005;

    Querci şi Mazzara, 2004).

    Syngenta Crop Protection AG deŃine în prezent drepturile de proprietate pentru

    evenimentul de transformare la porumb (Zea mays) Bt176, comercializat sub denumirile

    Maximizer, NaturGard sau KnockOut.

    Bt176 este rezistent la atacul sfredelitorului tulpinilor (european corn borer/ECB)

    (Ostrinia nubilalis), dăunător important pentru cultura porumbului (AGBIOS, 2009a).

    Planta produce o variantă trunchiată a proteinei CryIA(b), ce corespunde regiunii de la

    capătul N al acesteia. Proteina nativă provine de la Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki

    linia HD-1 şi are acŃiune insecticidă împotriva anumitor specii de insecte din ordinul

    Lepidoptera. Evenimentul Bt176 exprimă de asemenea gena bar clonată de la specia

    bacteriană Streptomyces hygroscopicus, care codifică enzima fosfinotricin-N-

    acetiltransferaza (phosphinothricin-N-acetyltransferase/PAT) (AGBIOS, 2009a; Querci şi

    Mazzara, 2004).

    2.2.2. Probele utilizate în cadrul experimentelor

    Clasificarea produselor care pot fi testate pentru prezenŃa OMG-urilor se poate

    face după: gradul de procesare; tipul ingredientelor; modul de prezentare; gradul de

    umiditate. Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoaştere cât mai bună a

    proprietăŃilor intrinseci ale probelor ajută la alegerea celor mai potrivite metode de

    eşantionare, pregătire şi extracŃie.

    Literatura de specialitate menŃionează o paletă largă de produse alimentare ce pot

    conŃine soia şi/sau porumb MG. Pe piaŃa din Ńara nostră, produsele de larg consum ce

    conŃin soia sunt mai reduse ca număr. Din punctul de vedere al consumatorului acestea

  • Rezumat al tezei de doctorat

    15

    pot fi clasificate după cum urmează: texturatele proteice - cele mai răspândite produse

    alimentare din soia, motiv pentru care au reprezentat principala categorie de probe

    necunoscute testate în cadrul experimentelor; produse (ex. cremă vegetală de brâză, pate

    vegetal, salam vegetal) în care extractul proteic din soia înlocuieşte ingredientele de

    origine animală; laptele de soia, iaurturi şi băuturi răcoritoare; tofu; batoane energizante;

    orice sortiment de ciocolată (conŃine lecitină ca aditiv); mâncare pentru nou-născuŃi;

    suplimentele proteice; ulei vegetal. În cazul porumbului există următoarele tipuri de

    probe: mălai, boabe la conservă, fulgi, amidon modificat (aditiv alimentar), ulei, sirop.

    Cu toate că soia şi porumbul destinate alimentaŃiei umane ajung de obicei la

    consumatorul final sub formă procesată, testarea seminŃelor este de asemenea importantă

    deoarece conceptul de trasabilitate, impus de legislaŃia europeană în vigoare, prevede ca

    etichetarea să fie făcută chiar dacă materialul MG nu este detectabil în produsul finit.

    O categorie importantă de probe este reprezentată de materialele de referinŃă

    certificate (MRC). Aceastea sunt matrici cu caracteristici cunoscute, indispensabile

    pentru validarea metodelor sau rezultatelor .

    2.3. EŞANTIONAREA

    În practica testărilor OMG, operaŃiunea de eşantionare nu revine laboratoarelor de

    testare, fiind efectuată de personal specializat din cadrul instituŃiilor abilitate ale statului.

    Dorim să subliniem însă importanŃa acestei operaŃiuni care influenŃează semnificativ

    etapele ulterioare desfăşurate în laborator, precum şi corectitudinea rezultatelor obŃinute.

    Procesul de eşantionare reprezintă întodeauna o sursă de eroare care apare atunci

    când din lotul de dimensiuni mari se aleg obiecte pentru a constitui proba ce va fi utilizată

    direct în laborator (Querci et al., 2005, Zafar et al., 2004). O bună practică de eşantionare

    asigură reducerea erorilor, ceea ce înseamnă de fapt creşterea gradului de

    reprezentativitate al probei pentru populaŃia din care provine. În acest scop trebuie

    cunoscute, în primul rând, proprietăŃile populaŃiei iniŃiale. În cazul testării OMG

    caracterizarea poate fi extrem de dificilă şi diferă în funcŃie de tipul produsului luat în

    considerare (ex. produse pocesate comparativ cu cele neprocesate sau produse ambalate

    compartiv cu cele în vrac).

  • Rezumat al tezei de doctorat

    16

    2.4. PREGĂTIREA PROBELOR

    Înainte de izolarea analitului este necesară aplicarea anumitor operaŃiuni de

    pregătire a probelor (reducerea mărimii, mărunŃire, umectare sau omogenizare), în funcŃie

    de caracteristicile matricii supuse analizelor (Querci et al., 2005). Scopul acestora este de

    a facilita izolarea şi purificare analitului.

    În general, a fost necesară doar mărunŃirea, omogenizarea şi reducerea în

    dimensiuni a probei de laborator. Doar în cazul matricilor uscate, umectarea probei

    înainte de extracŃie poate duce la îmbunătăŃirea rezultatelor. De asemenea, în cazul

    probelor uscate, se poate realiza o separare a fracŃiunilor, astfel încât proba test să fie

    constituită din particule cu granulaŃie cât mai fină.

    IniŃial, mărunŃirea a fost făcută prin mojarare în azot lichid, iar ulterior s-a trecut la

    utilizarea unei mori cu cuŃite rotative, Grindomix GM 200 (Retsch).

    2.5. EXTRACłIA ADN-ULUI

    După cum s-a specificat într-unul dintre subcapitolele anterioare, reacŃia PCR,

    clasică sau real-time, stă la baza celor mai utilizate metode de testare OMG. În cadrul

    analizelor ce au la bază această reacŃie, analitul este reprezentat de ADN, a cărui izolare

    şi purificare constituie astfel prima etapă a testării OMG, specifică biologiei moleculare.

    PerformanŃele analizei PCR pot fi însă influenŃate semnificativ de caracteristicile

    intrinseci ale probei şi de performanŃele metodei de extracŃie, aspecte ce se reflectă în

    absenŃa/prezenŃa inhibitorilor PCR şi în calitatea şi cantitatea ADN-ului din extracte (Di

    Pinto et al., 2007). Cele mai importante caracteristici ale extractelor utilizate în analizele

    PCR sunt cantitatea, calitatea şi puritatea, care, dacă sunt nesatisfăcătoare, reduc

    sensibilitatea metodei sau fac imposibilă testarea OMG (Engel şi Moreano, 2003, în

    Smith şi Maxwell, 2007; Deisingh şi Badrie, 2005).

    ExistenŃa unei largi varietăŃi de metode destinate extracŃiei şi purificării acizilor

    nucleici impune, în primul rând, alegerea celei mai potrivite tehnici. De aceea, primul

    obiectiv, în ceea ce priveşte obŃinerea ADN-ului, a fost testarea comparativă a şase

    metode de extracŃie: un protocol pe bază de CTAB (după Somma, 2004, şi SR EN ISO

  • Rezumat al tezei de doctorat

    17

    21571:2006); kitul DNeasy Plant Mini (Qiagen); kitul QIAamp Stool DNA Mini

    (Qiagen); kitul High Pure GMO Sample Preparation (Roche); kitul MagNA Pure LC

    DNA Isolation (Roche) în combinaŃie cu extractorul automat MagNA Pure LC (Roche);

    kitul Maxwell 16 Tissue DNA Purification (Promega) în combinaŃie cu Maxwell 16

    (Promega). În cazul fiecărui protocol de bază (vezi: Somma, 2004, şi SR EN ISO

    21571:2006; Qiagen ,2006; Qiagen, 2007; Roche, 2004; Roche, 2009, şi Sakai et al.,

    2002; Koller şi Storts et al., 2006, şi Promega, 2006) au fost efectuate mici modificări.

    Evaluarea metodelor de extracŃie a avut la bază procedura aplicată de CRL-

    GMFF (vezi CRL-GMFF, 2007) pentru validarea metodologiei ce trebuie ataşată

    documentaŃiei de autorizare a OMG-urilor, conform Regulamentului 1829/2003. S-au

    evaluat următoarele caracteristici, ultimele două nefiind incluse în procedura model:

    concentraŃia ADN-ului; cantitatea de ADN recuperat; deviaŃia standard a repetabilităŃii;

    puritatea extractului; gradul de fragmentare; absenŃa inhibitorilor reacŃiei PCR; timpul de

    lucru aproximativ; costul aproximativ pentru o probă.

    Datorită costurilor ridicate ale MRC-urilor, testarea performanŃelor metodelor de

    extracŃie s-a făcut pe o probă necunoscută sub formă de texturate (felii) proteice din soia

    (T4). A fost aleasă această probă deoarece reprezintă cea mai răspândită categorie de

    produse alimentare pe bază soia din Ńara noastră şi este caracterizată printr-o procesare

    medie, situându-se din acest punct de vedere între materiile prime (seminŃe) şi alimentele

    cu cel mai înal grad de procesare (ex. pate, ulei). Ulterior, metodele au fost verificate şi

    cu alte tipuri de matrici.

    În etapa de analiză propriu-zisă, extracŃiile au fost efectuate în duplicat (SR EN

    ISO 21571:2006; Querci et al., 2005; Germini et al., 2004), fiind incluse şi probele de

    control indicate în SR EN ISO 24276:2006.

    2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN

    Înainte de efectuarea analizei OMG este necesară testarea pretabilităŃii extractelor

    la amplificare PCR clasică, dar mai ales la cea de tip real-time. Criteriile ce au în vedere

    în acest context sunt cantitatea de ADN recuperat şi calitea extractului şi a ADN-ului

    (Cankar et al., 2006; Meyer, 1999).

  • Rezumat al tezei de doctorat

    18

    2.6.1. Cuantificarea spectrofotometrică

    Datorită în principal avantajelor de ordin practic, cuantificare spectrofotometrică a

    extractelor este des utilizată în practică, multe spectrofotometre fiind concepute special

    pentru determinarea concentraŃiei şi purităŃii moleculelor biologice. Trebuie însă avut în

    vedere faptul că valorile obŃinute nu sunt exacte (sunt, de obicei, supraestimate), existând

    o serie de factori ce determină apariŃia unor erori semnificative (MATC, 2009)

    Determinările au fost efectuate cu instrumentul NanoDrop Nd-1000 UV/Vis 1µl

    Spectrophotometer (Labtech International) conectat la un PC pe care a fost instalat

    software-ul spectrofotometrului.

    2.6.2. Evaluarea stării de fragmentare a moleculelor de ADN

    Integritatea structurală a moleculelor de ADN reprezintă o caracteristică

    importantă pentru succesul reacŃiei PCR deoarece un grad ridicat de fragmentare creşte

    probabilitatea ca numărul copiilor amplificabile ale secvenŃei Ńintă să fie insuficient,

    respectiv sub limita de detecŃie/cuantificare (Berdal şi Holst-Jensen, 2001). Pentru

    evaluarea acestei însuşiri se poate utiliza migrarea electroforetică în gel de agaroză şi

    marcarea cu EtBr (ex. Debode et al., 2007; CRL-GMFF, 2007; Corbisier et al., 2005)

    Migrarea s-a făcut în gel de agaroză 1% (w/v) (sistem TAE) la o intensitate a

    curentului electric de 10 V/cm. Gelul trebuie să aibă grosimea mai mică de 1 cm, iar după

    migrare gelul este incubat în soluŃie de EtBr timp de 15 minute, la temperatura camerei şi

    sub agitare uşoară. SoluŃia de colorare este obŃinută prin diluarea EtBr în tampon TAE

    1X, la o concentraŃie finală de 0,01 mg/ml.

    Vizualizarea şi înregistrarea rezultatelor s-a făcut cu ajutorul sistemului

    BioSpectrum AC Imaging System (Ultra-Violet Products, UVP).

    2.6.3. Confirmarea absenŃei substanŃelor inhibitoare

    După cum s-a menŃionat şi în subcapitolele anterioare, succesul extracŃiei în

    cadrul analizelor OMG depinde de performanŃele metodei utilizate, respectiv capacitatea

  • Rezumat al tezei de doctorat

    19

    acesteia de a recupera o cantitate suficientă de ADN amplificabil şi de a elimina

    substanŃele inhibitoare (Waiblinger et al., 2006). PrezenŃa acestora din urmă în extract şi

    influenŃa pe care o au asupra activităŃii polimerazei, pot fi evidenŃiate printr-un

    experiment real-time PCR, amplificând o genă endogenă în diluŃii seriale ale extractului

    (CRL-GMFF, 2007; Reiting et al., 2007; Foti et al., 2006; Lee et al., 2006; Waiblinger et

    al., 2006; Cankar et al., 2006; SR EN ISO 21570:2006). Acest tip de analiză reprezintă o

    foarte bună modalitate de evaluare a pretabilităŃii extractelor la amplificarea real-time

    PCR, constituind o parte esenŃială a validării efectuate în cadrul laboratorului (in-house

    validation), înainte de verificarea printr-un studiu de comparare interlaboratoare

    (Waiblinger et al., 2006).

    2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE ÎN CADRUL TESTĂRII OMG

    Tipurile de metode ce pot fi utilizate pentru testarea OMG sunt numeroase şi

    variate, atât din punct de vedere al analitului, cât şi în ceea ce priveşte complexitatea

    tehnică şi metodologică. Cele mai utilizate sunt prezentate în continuare.

    Dintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite

    în practica testării OMG. Acestea au la bază interacŃiunea anticorp-antigen, proteina

    rezultată în urma expresiei transgenei în organismul gazdă reprezentând antigenul. Există

    două formate ale imunotestelor – ELISA şi teste rapide de tipul stripurilor (lateral flow

    strips), care diferă, în principal, prin gradul de complexitate şi performanŃa rezultatelor.

    Datorită limitelor ce le caracterizează, aceste strategii sunt mai puŃin utilizate, doar

    testele rapide găsindu-şi o largă aplicabilitate pentru efectuarea screeningului probelor

    proaspete (boabe/seminŃe, plante), în afara laboratorului.

    ReacŃia PCR permite amplificarea selectivă, într-un număr foarte mare de copii, a

    unei secvenŃe ADN prezentă într-o proporŃie relativ redusă în cadrul unui amestec

    complex de fragmente ADN (Zafar et al., 2004). Analiza produşilor rezultaŃi prin

    amplificare într-o reacŃie PCR clasică permite formularea unei concluzii calitative („da”

    sau „nu”) asupra prezenŃei OMG-urilor în proba testată. În practică, evaluarea

    ampliconilor se face, în general, prin separare electroforetică în gel de agaroză, marcare

    cu EtBr, vizualizare în prezeŃa luminii UV şi compararea cu probe standard.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    20

    Pentru obŃinerea informaŃiilor cantitative referitoare la conŃinutul de acizi nucleici,

    este utilizată tehnica real-time PCR care reprezintă o variantă mult mai performantă a

    reacŃiei PCR clasice.

    Tehnica microarray are la baza hibridarea moleculară dintre două fragmente

    complementare de ADN. În contextul testării OMG, este utilizată în combinaŃie cu

    amplificarea PCR multiplex, corespunzând, practic, etapei post-PCR – analiza produşilor

    de reacŃie. Această tehnică are o mare capacitate de procesare, constituind o strategie

    foarte potrivită pentru o problemă majoră cu care se confruntă domeniul testării OMG –

    creşterea numărului de evenimente de transformare.

    O mare parte din probele care fac obiectul testărilor OMG este reprezentată de

    matrici alimentare. Acestea se caracterizează de obicei printr-un intens grad de procesare,

    în special sub influenŃa temperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorită faptului că

    termostabilitatea ADN-ului este mai bună decât a proteinelor (Anklam et al., 2002, în

    Taverniers et al., 2005; Gachet et al. 1999), reacŃia PCR este cea mai potivită tehnică

    pentru detecŃia, identificarea şi cuantificarea OMG-urilor (Anklam et al., 2002, în

    Angonesi Brod et al., 2007; Taverniers et al., 2005; Berdal şi Holst-Jensen, 2001).

    2.8. TESTAREA OMG CALITATIVĂ

    ReacŃia PCR are la bază mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului şi este

    utilizată pentru amplificarea unei secvenŃe Ńintă de ADN într-un număr mare de copii

    (Kubista et al., 2006), fiind considerată un „fotocopiator molecular” (Dalgleish, 2007)

    sau o metodologie de „xeroxare a ADN-ului” (NCHGR,1992).

    Pentru ca amplificarea să aibă loc, sunt necesari doi primeri oligonucleotidici care

    flanchează secvenŃa de ADN Ńintă, nucleotide libere, o polimerază termostabilă şi ioni de

    Mg într-o soluŃie tampon. ReacŃia se desfăşoară în cadrul unui ciclu repetitiv de

    temperaturi. În prima etapă a amplificării PCR, temperatura înaltă are rolul de a separa

    catenele dublului helix de ADN. Temperatura este apoi coborâtă pentru a facilita alipirea

    (hibridarea moleculară) primerilor oligonucleotidici la secvenŃa Ńintă. În ultima etapă

    temperatura are o valoare optimă pentru activitatea polimerazei care extinde primerii prin

    alipirea unor noi nucleotide, în prezenŃa ionilor de Mg. În contextul amplificării PCR,

  • Rezumat al tezei de doctorat

    21

    cele trei etape constituie un ciclu individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR (PCR

    cycle/step). După fiecare ciclu, catenele de ADN nou sintetizate servesc ca matriŃe în

    ciclul următor. Principalul produs al acestei reacŃii exponenŃiale este un segment dublu-

    catenar de ADN a cărui terminaŃii corespund capetelor 5’ ale primerilor oligonucleotidici.

    Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dată de distanŃa dintre cei doi

    primeri.

    Elementele definitorii ale unui protocol PCR sunt instrumentul utilizat pentru

    amplificare (thermal cyclerul) şi componentele reacŃiei: secvenŃa Ńintă, primerii, ADN

    polimeraza, nucleotidele libere, soluŃia tampon şi ionii de Mg, numărul ciclurilor de

    amplificare.

    Testele calitative oferă informaŃii referitoare la prezenŃa/absenŃa ADN-ului Ńintă

    din proba analizată. Acest tip de analiză constă, de obicei, în parcurgerea mai multor

    etape analitice, fiecare corespunzând unei amplificări PCR. Prima etapă presupune

    detecŃia ADN-ului specific taxonului din care derivă OMG-ul analizat, secvenŃa Ńintă

    aparŃinând în acest caz unei gene caracteristice speciei respective (genă de referinŃă).

    Această analiză are rolul de a elimina posibilitatea obŃinerii unor rezultate fals negative

    ce pot apare în cazul în care extractul de ADN nu are parametri corespunzători pentru

    amplificare, fiind uneori inclusă într-o procedură mai amplă de evaluare a caracteristiclor

    ADN-ului izolat (vezi subcapitolul 2.5), alături de alte analize specifice.

    Urmează apoi screeningul, etapă în care se realizează identificarea probelor ce

    conŃin material MG. În această etapă se realizează trierea probelor, fiind eliminate din

    etapele ulterioare ale procesului analitic cele fără conŃinut transgenic. Screeningul este

    necesar mai ales în cazul probelor despre care nu există informaŃii suficiente referitoare la

    prezenŃa materialului MG. Chiar dacă aceste informaŃii sunt disponibile, efectuarea

    screeningului este totuşi benefică, putând oferi indicii referitoare la prezenŃa unor

    evenimente de transformare neaşteptate. łintele pentru amplificare corespund secvenŃelor

    celor mai utilizate elemente transgenice (ex. promotorul 35S, ternimatorul nos).

    Probele identificate pozitiv în cea de-a doua etapă vor fi testate în vederea

    determinării precise a OMG-urilor, amplificând regiuni specifice fiecărui eveniment de

    transformare.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    22

    În general, în cadrul experimentelor calitative pe care le-am efectuat au fost amplificate

    ambele extracte obŃinute din pentru fiecare probă, iar amplificările au fost făcute în duplicat. Nu

    au fost însă utilizate probele de control cu caracter neobligatoriu.

    În vederea eficientizării procesului de testare, pe baza informaŃiilor originale a fost

    conceput un singur protocol de amplificare care a fost generalizat la toate perechile de

    primeri.

    2.8.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului

    În cadrul acestei etape au fost urilizate următoarele perechi de primeri:

    • GMO3/GMO4, creaŃi de Meyer et al., în 1996, pentru detecŃia genei lectinei

    de la soia (Le1), iar apoi utilizaŃi de Meyer şi Jaccaud (1997) în a doua fază a

    unui protocol de tip „nested PCR”, destinat amplificării ADN-ului extras din

    alimente procesate (Querci şi Mazzara, 2004);

    • Lektin1/Lektin6, creaŃi de Tengel et al. (2001) pentru detecŃia genei Le1;

    • ZEIN3/ZEIN4, proiectaŃi de Studer et al. (1997) pentru faza a doua a unui

    protocol nested PCR, care viza detecŃia genei zeinei (Ze1) de la porumb;

    • CP3/CP4, creaŃi de Thion et al. (2002); amplifică un segment situat la nivelul

    secvenŃei trnL specifică genomului cloroplastelor; evident, această metodă nu

    permite discriminarea taxonilor.

    2.8.2. DetecŃia rapidă (screening) a OMG-urilor

    Pentru experimentele efectuate în această lucrare etapa de screening nu este

    esenŃială, obiectul analizelor constituidu-l doar evenimentele de transformare GTS 40-3-2

    şi Bt176. Etapa a fost însă inclusă pentru a demonstra aplicabilitatea protocoalelor de

    screening. SecvenŃele Ńintă utilizate corespund promotorului P-E35S, respectiv

    terminatorului nos.

    Primerii folosiŃi pentru screening sunt:

  • Rezumat al tezei de doctorat

    23

    • p35S-cf3/p35S-cr4; acest protocol conceput de Lipp et al. (2001) este

    specific promotorului 35S, prezent în ambele evenimente de transformare

    studiate (Querci şi Mazzara, 2004),

    • CaMV1/CaMV2 (Wolf et al., 2000), specifici promotorului 35S;

    • HA-nos118f/HA-nos118r, creaŃi de Lipp et al. (2001) (Querci şi Mazzara,

    2004); reacŃia are ca rezultat amplificarea unui fragment al terminatorului

    nos şi se poate aplica doar în cazul soiei MON4-3-2, porumbul Bt176

    neconŃinând acest element genic.

    Screeningul a fost efectuat şi cu kitul Biogenics Standard produs de Biotools

    (http://www.biotools.eu). Acesta permite identificarea promotorului 35S şi a

    terminatorului nos şi include de asemenea reacŃii de detecŃie a genei lectinei care indică

    prezenŃa soiei, a genei invertazei care indică prezenŃa porumbului şi a genei rbcL din

    genomul cloroplastelor, care indică prezenŃa materialului de origine vegetală.

    Amplificările se desfăşoară separat, conform pricipiilor PCR-ului clasic, iar rezultatele

    amplificării sunt evaluate prin electroforeză în gel de agaroză şi marcare cu EtBr. În acest

    caz, au fost utilizate protocoalele indicate de producător, cu mici modificări.

    2.8.3. Identificarea evenimentelor de transformare

    DetecŃia specifică a casetei genice CTP/EPSPS din linia de soia Roundup Ready a

    fost efectuată cu perechile de primeri GMO9/GMO5, GMO8/GMO7 şi RR01/RR04.

    Primele două seturi au fost proiectate de Meyer şi Jaccaud (1997) pentru detecŃia

    specifică a soiei Roundup Ready în cadrul unui protocol nested PCR (Querci şi Mazzara,

    2004), iar cel de-al treilea set a fost utilizat pentru prima dată de Studer et al., în 1998.

    Pentru a detecta gena sintetică CryIA(b), specifică evenimentului Bt176, au fost

    folosite perechile de primeri CRYIA1/CRYIA2 şi CRYIA3/CRYIA4, proiectate de

    Studer et al. (1997) pentru detecŃia specifică a genei sintetice CryIA(b) în cadrul unui

    protocol nested PCR.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    24

    2.9. TESTAREA CANTITATIVĂ A OMG-URILOR

    2.9.1. Metodologia real-time PCR utilizată în cazul testării OMG

    2.9.1.1. Introducerea analizei real-time PCR

    Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea

    stabilirii unei corelaŃii directe între cantitatea produsului de amplificare acumulat şi

    numărul iniŃial de copii ale moleculei Ńintă (Weighardt, 2004). ParticularităŃile reacŃiei

    PCR convenŃionale nu permit realizarea unei astfel de corelaŃii, principala cauză fiind

    eficienŃa defectuoasă a amplificării, care nu este constantă între diferitele reacŃii, dar mai

    ales între ciclurile aceleiaşi reacŃii (Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004). Această limită

    a fost depăşită în 1992 de către Higuchi şi colaboratorii săi, care au iniŃiat analiza cineticii

    reacŃiei de amplificare prin crearea metodei real-time PCR capabilă să detecteze produşii

    de amplificare odată cu formarea şi acumularea acestora (Kubista et al., 2006; Weighardt,

    2004).

    Metodologia real-time PCR utilizată astăzi este o îmbunătăŃire a tehnicii iniŃiale

    create de Higuchi et al. şi reprezintă cea mai performantă strategie de cuantificare a

    acizilor nucleici (Cankar et al., 2006; Miraglia et al., 2004, şi Anklam et al., 2002, în

    Engel et al., 2006; Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004; Alary et al., 2002). Pe lângă

    precizia cuantificării, a crescut şi capacitatea de analiză, iar incidenŃa erorilor şi a

    rezultatelor fals pozitive este mult redusă (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002).

    2.9.1.2. Principiul real-time PCR

    Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea secvenŃei

    Ńintă, iar în tandem cu aceştia constructe oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de

    molecule incluse în mediul de reacŃie indică acumularea produsului PCR (Burns et al.,

    2004). Astfel, de-a lungul mai multor cicluri de amplificare constructele

    oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secvenŃei Ńintă vor determina

    modificarea semnificativă a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004).

  • Rezumat al tezei de doctorat

    25

    Fig. 3. DiferenŃele dintre analiza PCR convenŃională (a, b) şi analiza real-time PCR (c, d). Graficele (b, d) reprezintă concentraŃia produşilor PCR (axa OY) în funcŃie de conŃinutul OMG procentual al probei iniŃiale (axa OX), în punctul A. (a) Punctul A în care sunt colectate datele pentru analiză reprezintă un anumit număr de cicluri de amplificare. (b) Se observă că probele B şi C, în cazul cărora a intervenit fenomenul de plafonare, conŃin cantităŃi de ampliconi similare, cu toate că numerele iniŃiale de copii Ńintă diferă de zece ori. SituaŃia este asemănătoare în cazul probelor C şi D. Este astfel ilustrată lipsa proporŃionalităŃii dintre concentraŃia ADN-ului şi porduşii PCR. (c) Punctul A în care sunt colectate datele pentru analiză reprezintă o anumită valoare a concentraŃiei ampliconilor. (d) Se observă existenŃa unei relaŃii de liniaritate directă între produşii PCR şi concentraŃia ADN-ului în faza exponenŃială a amplificării, corelarea celor două valori fiind posibilă.

    După Fagan în Ahmed (2002) modificat.

    În cadrul reacŃiei PCR convenŃionale, determinarea este făcută într-un singur

    punct, la sfarşitul amplificării (determinare end-point). De aceea proporŃionalitatea între

    cantitatea finală de ampliconi şi cea iniŃială de copii ale secvenŃei Ńintă Ńintă este redusă,

    nefiind posibilă cuantificarea (Figura 3a şi b). S-a demonstrat totuşi empiric, că această

    proporŃionalitate există în timpul fazei exponenŃiale a amplificării, înainte să intervină

    plafonarea. Astfel, dacă se cunoaşte numărul de cicluri necesare pentru atingerea unei

    anumite concentraŃii a moleculei Ńintă, numărul iniŃial de copii ale acesteia poate fi

    determinat cu precizie (Figura 3c şi d). Pentru calcularea concentraŃiei moleculei de

    interes într-o probă necunoscută este necesară utilizarea unei curbe de calibrare

    (denumită şi curbă standard) (Burns et al., 2004) obŃinută prin analiza unui set de

    calibratori (probe standard) (Taverniers et al., 2005) reprezentat de probe al căror număr

    iniŃial de copii ale secvenŃei Ńintă este cunoscut (Figura 3a şi c).

    ConŃinut iniŃial

    Numărul de cicluri PCR ConŃinutul iniŃial

    Numărul de cicluri PCR ConŃinutul iniŃial

    ConŃinut iniŃial

    Pro

    duşi P

    CR

    Pro

    duşi P

    CR

    Pro

    duşi P

    CR

    Cic

    luri

    PC

    R

  • Rezumat al tezei de doctorat

    26

    Atât în cazul probelor standard, cât şi al celor necunoscute, monitorizarea

    acumulării produşilor de reacŃie odată cu desfăşurarea amplificării se face prin

    înregistrarea emisiei fluorescente a unor substanŃe speciale aflate în mediul de reacŃie.

    Este evident că între semnalul fluorescent şi cantitatea de ampliconi formaŃi există o

    relaŃie de proporŃionalitate directă, ambele crescând odată cu numărul de cicluri de

    amplificare (Kubista et al., 2006; Grove, 1999, în Burns et al., 2004).

    2.9.1.3. Materialele de referinŃă certificate

    Materialele de referinŃă certificate reprezintă o categorie de probe foarte

    importante în cadrul testării OMG, fiind utilizate pentru controlul calităŃii sau validarea

    metodelor (IRMM, 2008; Trapmann et al., 2007; Querci et al., 2005). În ceea ce priveşte

    testările cantitative, MRC-urile joacă un rol crucial, cel de calibratori ADN (Querci et al.,

    2005; Taverniers et al., 2005; Burns et al., 2004) necesari construirii curbelor standard.

    În această situaŃie, variabila independentă necesară construirii acestor curbe cu ajutorul

    regresiei liniare, este reprezentată de valoarea pentru care MRC-urile sunt certificate.

    Problematica referitoare la disponibilitatea unor MRC-uri adecvate este

    recunoscută de comunitatea ştiinŃifică implicată în testarea OMG, fiind însă clară şi

    imposibilitatea creării unei game de MRC-uri care să acopere toate necesităŃile (Cankar et

    al., 2006).

    2.9.1.4. Sisteme de detecŃie

    Există două categorii de sisteme ce pot fi utilizate pentru monitorizarea

    amplificării: sisteme care utilizează substanŃe de intercalare (ex. EtBr, SYBR Green I, LC

    Green, BOXTO); sisteme care utilizează sonde/primeri marcaŃi cu fluorocromi (ex.

    TaqMan, FRET, Molecular Beacons, Scorpions, TaqMan MGB).

    În cazul optimizării corespunzătoare a reacŃiei de amplificare, sistemul de detecŃie

    utilizat nu este important decât sub aspect economic, substanŃele de intercalare fiind mult

    mai ieftine. De cealaltă parte, sondele/primerii marcaŃi asigură optimizarea uşoară a

  • Rezumat al tezei de doctorat

    27

    protocolului de amplificare, din perspectiva specificităŃii, aceste sisteme fiind îndeosebi

    recomandate în cazul reacŃiilor multiplex.

    2.9.2. Confirmarea absenŃei inhibitorilor PCR

    Această analiză a fost efectuată pe platforma LightCycler 480 (Roche) utilizând

    kitul LightCycler 480 Probes Master (Roche). Kitul conŃine un master mix universal

    pentru reacŃii real-time PCR bazate pe sistemul de detecŃie TaqMan, iar primerii şi

    sondele (Lectin-F/Lectin-R/Lectin-TMP pentru soia GTS 40-3-2, respectiv ZM1-R/ZM1-

    F/ZM1 pentru Bt176) au fost achiziŃionate separat. Protocoalele de amplificare au fost

    preluate din SR EN ISO 21570:2006. Cele două sisteme au fost create pentru detecŃia

    ADN-ului specific taxonului (i.e. soia, rspectiv porumb), fiind utilizate şi în cadrul unor

    protocoale de cuantificare a evenimentelor de transformare GTS 40-3-2, respectiv Bt176.

    2.9.3. Cuantificarea ADN-ului MG

    Prin testarea OMG cantitativă, materialul transgenic dintr-o probă nu poate fi

    exprimat decât procentual, sub forma raportului dintre cantitatea de ADN MG şi cea de

    ADN total corespunzător taxonului analizat (Vaïtilingom et al., 1999). Există însă câteva

    aspecte referitoare la modul de exprimare a conŃinutului procentual de OMG-uri, care

    trebuie menŃionate. În primul rând, prin Regulamentele 1829/2003 şi 1830/2003 a fost

    stabilit pragul conŃinutului procentual de OMG-uri ce trebuie avut în vedere pentru

    aplicarea etichetării, respectiv 0,9%, la nivel de ingredient. IniŃial, nu a fost însă indicată

    nicio unitate de măsură pentru acest prag, implementarea prevederilor legislative

    referitoare la etichetare fiind astfel problematică (Moens et al., 2005). Ieşirea din acest

    impas s-a făcut odată cu introducerea Recomandării 2004/787/EC. Această defineşte

    „procentul de ADN MG” ca fiind raportul dintre numărul copiilor de ADN MG şi

    numărul copiilor de ADN specific taxonului Ńintă, calculat la nivel de genom haploid. Se

    face de asemenea precizarea că procentul de ADN MG amintit anterior să fie utilizat

    pentru exprimarea rezultatelor analizelor cantitative.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    28

    Strategia de cuantificare descrisă în continuare a fost aplicată în cazul ambelor

    evenimente de transformare studiate.

    Pentru calculul conŃinutului MG a fost folosită metoda curbei standard,

    amplificările pentru cele două secvenŃe Ńintă desfăşurându-se deci în paralel, într-un

    sistem simplex.

    Amplificările au fost efectuate în triplicat pentru toate tipurile de probe (Cankar et

    al., 2006; Foti et al., 2006; Moens et al., 2005; Querci et al., 2005; Applied Biosystems,

    2001).

    În ceea ce priveşte curbele standard, au fost utilizate cinci puncte de calibrare.

    Querci et al. (2005) şi Foti (2004) recomandă de asemenea amplificarea probelor

    necunoscute atât nediluate, cât şi diluate (ex. 1:10), pentru a evalua efectul inhibitorilor

    asupra eficienŃei de amplificare.

    2.9.4. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2

    2.9.4.1. Cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000

    Pentru cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000 a fost utilizat kitul Biogenics

    RoundUp Ready Soya QT (Biotools), dedicat acestui aparat. Protocolul de lucru a fost

    elaborat pe baza considerentelor prezentate anterior şi a instrucŃiunilor producătorului.

    S-a realizat amplificarea şi detecŃia unei secvenŃe de referinŃă, i.e. gena lectinei de

    la soia (Le1), precum şi a unei secvenŃe specifice evenimentului de transformare GTS 40-

    3-2 (soia Roundup Ready) (Biotools, 2008). Cele două reacŃii de amplificare se

    desfăşoară independent în cadrul aceleiaşi analize de tip real-time PCR (reacŃii simplex),

    conform parametrilor metodei curbelor standard.

    Probele care constituie punctele curbei standard sunt pregătite ca diluŃii seriale ale

    soluŃiei de calibrare inclusă în kit (PC SOYA).

    MenŃionăm că au fost efectuate anumite modificări ale protocolului de bază

    indicat de producătorul kitului. Acestea au vizat modul de pregătirea a probelor standard

    şi amestecul de reacŃie.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    29

    2.9.4.2. Cuantificarea pe platforma LightCycler 480

    Pentru cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 a fost utilizată şi

    platforma LightCycler 480 în combinaŃie cu kitul LightCycler 480 Probes Master

    (Roche). Acesta include un master mix universal de tip „hot-start” optimizat pentru real-

    time PCR, sistem TaqMan, la care utilizatorul adaugă elementele de amplificare şi

    detecŃie ce conferă specificitate reacŃiei, respectiv primerii şi sonda TaqMan (i.e. Lecti-

    F/Lectin-R/Lectin-TMP, pentru gena Le1, respectiv RSR-F/RSR-R/RSR-TMP pentru

    transgenă). La realizarea amestecului de reacŃie şi a condiŃiilor de amplificare au fost

    avute în vedere recomandările producătorului (Roche, 2006) şi informaŃiile din SR EN

    ISO 21750:2006. Pentru construirea curbelor standard s-a utilizat soluŃia de calibrare

    inclusă în kitul Biogenics RoundUp Ready Soya QT.

    2.9.5. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176

    Analizele au fost efectuate pe platforma Rotor-Gene 3000, utilizând kitul

    Biogenics Bt-176 Maize QT (Biotools), dedicat acestui aparat.

    Metoda presupune amplificarea şi detecŃia unei secvenŃe de referinŃă, i.e. gena

    invertazei (ivr1) şi a unei secvenŃe transgenice, în scopul determinării conŃinutului relativ

    de ADN specific evenimentului de transformare Bt176 (porumbul Maximizer) (Biotools,

    2007). Cele două reacŃii de amplificare se desfăşoară independent în cadrul aceleiaşi

    analize real-time PCR (reacŃii simplex).

    Modificările protocolului de bază au fost aceleaşi ca şi în cazul kitului Biogenics

    RoundUp Ready Soya QT.

    2.10. EVALUAREA ŞI VALIDAREA METODELOR ANALITICE

    2.10.1. Validarea şi acreditarea metodelor analitice

    Furnizarea unor rezultate analitice corecte, care îndeplinesc anumite cerinŃe de

    calitate, reprezintă elementul esenŃial în cadrul activităŃii de testare a produselor

  • Rezumat al tezei de doctorat

    30

    alimentare. De aceea, laboratorul trebuie să fie capabil să îşi desfăşoare activitatea în

    conformitate cu toate standardele naŃionale sau internaŃionale în domeniu (SR EN

    ISO/CEI 17025:2005), cel mai important aspect tehnic fiind reprezentat de utilizarea unor

    metode analitice adecvate. Prin aceasta se înŃelege necesitatea ca laboratorul să

    folosească metode validate oficial, dacă aceastea sunt disponibile, sau cel puŃin metode în

    cazul cărora s-a demonstrat capacitatea producerii unor rezultate sigure şi repetabile

    (Querci et al., 2005).

    Alte activităŃi pe care laboratorul trebuie să le implementeze în vederea obŃinerii

    unor rezultate de calitate sunt: asigurarea trasabilităŃii; efectuarea controlului intern al

    calităŃii (internal quality control/IQC sau in-house quality assurance); participarea la

    comparări/studii de comparare interlaboratoare (interlaboratory studies sau

    collaborative/ring trials); acreditarea conform unui standard adecvat – în cazul

    laboratoarelor de testare OMG este vorba de ISO/CEI 17025 (ENGL, 2008; Trapmann et

    al., 2007).

    Utilizarea unor metode precise şi exacte şi implementarea măsurilor de asigurare a

    calităŃii vor permite laboratoarelor să furnizeze rezultate corecte, de încredere şi

    comparabile la nivel internaŃional, acestea constituind premisele pentru desfăşurarea

    controlului oficial al OMG-urilor comercializate (Morisset et al., 2009; Žel et al., 2008;

    Thompson et al., 2002).

    Validarea reprezintă confirmarea prin examinare şi furnizarea unor dovezi

    obiective care demonstrează îndeplinirea cerinŃelor specifice unui anumit mod de

    utilizare intenŃionată (SR EN ISO/CEI 17025:2005). A valida o metodă înseamnă a

    investiga dacă scopul acesteia, reprezentat de obŃinerea unor rezultate analitice cu un

    nivel acceptabil de incertitudine, este atins (Thompson et al., 2002).

    Dintre instrumentele de asigurare a calităŃii în cadrul laboratoarelor de testare,

    acreditarea este considerată ca fiind cel mai detaliat şi important (Querci et al., 2005).

    ISO defineşte acreditarea ca fiind procesul prin care o instituŃie abilitată recunoaşte

    formal faptul că laboratorul operează conform unui sistem de calitate şi este competent şi

    capabil, din punct de vedere tehnic, să furnizeze rezultate valide. Aceasta nu garantează

    însă corectitudinea rezultatului obŃinut, dar asigură îndeplinirea anumitor cerinŃe esenŃiale

    de calitate precum şi un cadru care să permită identificarea neconformităŃilor (Querci et

  • Rezumat al tezei de doctorat

    31

    al., 2005). Acreditarea laboratoarelor de testare se desfăşoară în conformitate cu ISO/CEI

    17025:2005, recunoscut la nivel internaŃional ca stadard esenŃial în definirea cerinŃelor

    generale pentru competenŃa tehnică a laboratoarelor de testare şi calibrare (Žel et al.,

    2008).

    Parametri care trebuie avuŃi în vedere, în contextul validării şi acreditării

    metodelor de testare, sunt (ENGL, 2008; Žel et al., 2008; Trapmann et al., 2007; SR EN

    ISO 24276:2006; Žel et al., 2006; Germini et al., 2004; SR ISO 5725-1:1997):

    aplicabilitatea (applicability/fitness for purpose); practicabilitatea (practicability);

    specificitatea/selectivitatea (specificity/selectivity); sensibilitatea (sensibility); robusteŃea

    (robustness); limita de detecŃie (limit of detection/LOD); limita de cuantificare (limit of

    quantification/LOQ); nivelul critic (critical level/LC); exactitatea (accuracy); justeŃea

    (trueness); raza dinamică (dymic range); repetabilitatea (repetability), sau precizia

    intradeterminare (între probe diferite analizate în paralel); reproductibilitatea

    (reproducibility), sau precizia interdeterminări; incertitudinea de măsurare (measurement

    uncertainty/MU). Criteriile de acceptare pentru aceşti parametri sunt cele difinite de

    ENGL (ENGL, 2008; Mazzara et al., 2008):

    2.10.2. Incertitudinea de măsurare

    Incertitudinea de măsurare (IM) este parametrul cel mai util pentru descrierea

    calităŃii unei măsurători (Trapmann et al., 2007) deoarece furnizează dovezi referitoare la

    aplicabilitatea metodei, iar procedura de estimare a acesteia permite identificarea

    factorilor care contribuie la variaŃia rezultatelor (Burns şi Valdivia, 2007).

    Trebuie reŃinut că IM este întotdeauna asociată procesului analitic, indiferent dacă

    este sau nu inclusă în raportul de analiză. Mai mult, doar în cazul în care valoarea

    incertitudinii extinse a fost estimată şi este specificată, rezultatul raportat poate fi utilizat

    în practică fără nicio îndoială (Trapmann et al., 2007). Astfel, în cazul testării OMG

    cantitative, IM trebuie scăzută din rezultatul măsurătorii, iar valoarea rezultată va fi cea

    folosită pentru evaluarea conformităŃii cu legislaŃia în vigoare.

    IM apare datorită unor factori a căror incidenŃă nu poate fi (întotdeauna) evitată.

    Utilizarea procedurilor de lucru validate corespunzător şi implementarea măsurilor de

  • Rezumat al tezei de doctorat

    32

    asigurare a calităŃii vor permite însă obŃinerea unor rezultate cu un înal grad de

    repetabilitate, iar bugetul de incertitudine va fi redus. Un design experimental adecvat

    contribuie de asemenea la reducerea IM şi facilitează estimarea corectă a acesteia (Burns

    şi Valdivia, 2007).

    Cu toate că importanŃa estimării incertitudinii asociate testării OMG este evidentă,

    cercetările şi aplicaŃiile în domeniu nu sunt pe deplin formate, motiv pentru care un astfel

    de exerciŃiu este destul de dificil.

    CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUłII

    3.1. PREGĂTIREA PROBELOR TEST

    În urma experimentelor efectuate s-a constatat că mărunŃirea mecanică a probelor

    este mai expeditivă şi necesită mai puŃin efort din partea operatorului, comparativ cu

    mojararea manuală în azot lichid.

    Un aspect important pentru obŃinerea unor concentraŃii de ADN satisfăcătoare este

    reprezentat de gradul de mărunŃire al particulelor ce intră în alcătuirea probei test. În

    vederea maximizării performanŃelor metodei de extracŃie, se recomandă utilizarea unei

    fracŃiuni cu granulaŃie cât mai fină.

    3.2. TESTAREA METODELOR DE EXTRACłIE A ADN-ULUI

    În cazul kitului DNeasy Plant Mini şi al extracŃiei automatizate cu Maxwell 16

    rezultatele obŃinute în final au fost total nesatisfăcătoare. În schimb, protocolul pe bază de

    CTAB şi kiturile QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen), HighPure GMO Sample

    Preparation (Roche) şi MagNA Pure LC DNA Isolation (Roche) au produs rezultate

    mulŃumitoare. După cum era de aşteptat, extractele obŃinute din probe intens procesate au

    avut caracteristici mai slabe, iar în cazul tuturor celorlalte tipuri de probe acestea au fost

    considerate relativ bune.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    33

    Subliniem că evaluarea spectrofotometrică şi electroforetică a extractelor are doar

    caracter orientativ. Cea mai mare relevanŃă o are testarea amplificabilităŃii extractului,

    principiu care, în practică, a fost inclus în mai multe tipuri de metodologii utilizate pentru

    verificarea influenŃei substanŃelor inhibitoare.

    Rezultatele testării comparative a metodelor de extracŃie sunt prezentate sintetic în

    Figura 4.

    Fig. 4. Compararea principalelor caracteristici de performanŃă ale metodelor de extracŃie.

    Este dificilă găsirea unei metode de extracŃie care să satisfacă toate necesităŃile şi

    să permită în orice situaŃie obŃinerea unor rezultate optime. De aceea, în funcŃie de

    nevoile şi resursele laboratorului, metoda pentru care se optează poate fi diferită de la caz

    la caz. În ceea ce priveşte experimentele pe care le-am desfăşurat, au fost selectate două

    metode: kitul QIAamp DNA Stool Mini, pentru izolarea ADN-ului din probele pe bază

    de soia; protocolul CTAB, izolarea ADN-ului din probele pe bază de porumb.

    3.3. IZOLAREA ADN-ULUI ÎN CADRUL PROTOCOLULUI INTEGRAT DE

    TESTARE

    Rezultatele obŃinute au fost în concordanŃă cu cele reliefate în etapa anterioară. S-

    a observat din nou posibilitatea aplicării cu uşurinŃă a metodelor de extracŃie în cazul

    matricilor alimentare nedificile şi importanŃa testării pretabilităŃii la PCR.

    S-a remarcat de asemenea corelaŃia pozitivă între gradul de mărunŃire al probei şi

    extractibilitatea ADN-ului, conform indicaŃiilor din literatura de specialitate (ex.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    34

    Moreano et al., 2005a, în Engel et al., 2006). Trebuie însă acordată o atenŃie deosebită

    creşterii temperaturii în timpul mărunŃirii probei, fenomen ce poate determina reducerea

    considerabilă a cantităŃii extrase de ADNdc (Corbisier et al., 2005). Adăugarea apei va

    reduce influenŃa termică negativă.

    3.4. TESTAREA OMG CALITATIVĂ

    3.4.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului

    Această analiză constituie o alternativă pentru verificarea efectului de inhibiŃie

    prin testarea real-time PCR a unei serii de diluŃii a extractului (Lee et al., 2006). Suntem

    însă de părere că prima strategie nu poate stabili clar măsura în care substastanŃele

    inhibitoare acŃionează, fiind astfel necesar ca în analiza cantitativă ulterioară să fie

    incluse două diluŃii ale extractului.

    Am optat pentru această variantă din raŃionamente economice, testarea extractelor

    prin real-time PCR fiind mult mai costisitoare, mai ales dacă se utilizează un sistem real-

    time bazat pe principiul TaqMan.

    În cazul primerilor specifici pentru genele de referinŃă, Le1 la soia, respectiv Ze1

    la porumb, toate probele extrase au prezentat produsul de amplificare aşteptat. Probele de

    control au prezentat de asemenea rezultatele aşteptate pentru validarea corectitudinii

    analizelor. Î

    3.4.2. Screeningul OMG

    După cum reiese din cele prezentate în Capitolul II, prezenŃa elementelor genice

    specifice evenimentelor de transformarea a fost verificată în mai multe moduri,

    rezultatele obŃinute fiind aceleaşi. În cazul tuturor probelor cunoscute au fost obŃinute

    rezultatele aşteptate, iar în cazul probeleor necunoscute, prezenŃa ADN-ului transgenic a

    fost evidenŃiată doar în cazul a patru probe de seminŃe de soia.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    35

    3.4.3. Identificarea evenimentelor de transformare

    În cazul ambelor evenimente de transformare, rezultatele obŃinute au fost în

    concordanŃă cu cele din etapa anterioară, confirmând aplicabilitatea protocoalelor testate.

    3.4.4. Considerente generale pentru testarea calitativă

    Rezultatele obŃinute prin testarea calitativă pentru soia MG nu sunt surprinzătoare.

    În ceea ce priveşte probele cunoscute şi cele de control, acestea au generat rezultatele

    aşteptate, confirmând astfel că metodele utilizate fucŃionează corespunzător şi au fost

    aplicate corect.

    În cazul probelor neprocesate de soia (boabe) este încă destul de probabilă

    existenŃa multor surse, reprezentate în special de producători mici, care deŃin, intenŃionat

    sau nu, material MG, cu toate că utilizarea acestuia în cultură este interzisă. De aceea

    obŃinerea unor rezultate pozitive pentru anumite probe era de aşteptat.

    În ceea ce priveşte produsele procesate, anumite rezultate neoficiale au afirmat

    prezenŃa soiei MG, deşi în cadrul laboratorului nostru nu am putut confirma acest lucru.

    După cum s-a menŃionat anterior, în cazul probelor pe bază de porumb, prezenŃa

    ADN-ul transgenic în probele necunoscute era improbabilă datorită faptului că acest

    eveniment de transformare nu mai este autorizat pt comercializare în UE. Celelalte probe

    s-au comportat conform aşteptărilor.

    Teoretic, lipsa produşilor PCR specifici evenimentelor de transformare analizate

    poate avea mai multe cauze: în primul rând, lipsa materialului MG din proba analizată;

    prezenŃa materialului MG într-o cantitate foarte mică; degradarea ADN-ului în timpul

    procesării, astfel încât analiza nu mai poate fi efectuată.

    Reamintim de asemnea că rezultatele obŃinute în cazul fiecărei probe au coincis

    de-a lungul tuturor etapelor testării calitative.

    Deoarece a fost testat un număr mare de primeri, în vederea eficientizării

    procesului, s-a utilizat un singur master mix şi un singur program de amplificare,

    conceput pe baza celor descrise în lucrările de specialitate. Avînd în vedere rezultatele

    obŃinute, putem afirma că niciuna dintre metodele testate nu este lipsită de robusteŃe.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    36

    Totuşi, în cazul în care se optează pentru implementarea unui anumit set de primeri, este

    recomandată utilizarea protocolului original în vederea maximizării performanŃelor

    metodei.

    În Figura 5 sunt prezentate câteva dintre rezultatele obŃinute în această etapă.

    (a)

    (b)

    (c)

    Fig. 5. Rezultate ale testării PCR calitative. Probe: S1 şi S2, seminŃe de soia; R20, MRC soia RR; B1 şi B50, MRC porumb Bt176; E, probă de control pentru mediul de lucru; B, proba neutră de control a extracŃiei; C+, probă pozitivă de control pentru ADN-ul Ńintă; C-, probă negativă de control pentru ADN-ul Ńintă; NTC, probă de control a reactivilor; M, marker ADN. (a) DetecŃia genei lectinei de la soia (Le1) cu primerii Lektin1/Lektin6. (b) Screening OMG a probelor din soia utilizând primerii p35S-cf3/p35S-cr4, specifici promotorului P-35S. (c) DetecŃia genei Cry1A(b) introdusă în Bt176, utilizând primerii CRYIA1/CRYIA2.

    420 pb

    B1 B50 M E B C- NTC

    500 pb

    100 pb

    S2 R20 M E B C- NTC

    400 pb

    S1 S2 M E B C+ C- NTC

    318 pb

    123 pb

  • Rezumat al tezei de doctorat

    37

    3.5. TESTAREA OMG CANTITATIVĂ

    3.5.1. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe platforma Rotor-

    Gene 3000

    În cadrul acestui experiment au fost cuantificate MRC-urile ce conŃin soia MG,

    precum şi probele sub formă de boabe, identificate pozitiv în etapa anterioară. Rezultatele

    sunt prezentate în Tabelul 1.

    Modul de prelucrare a datelor a avut la bază studiile publicate de Foti et al.

    (2006), Huang şi Pan (2005) şi Vaïtilingom et al. (1999). Datele avute la dispoziŃie nu au

    permis şi evaluarea reproductibilităŃii sau a IM.

    Conform criteriilor enunŃate de ENGL, atât biasul, cât şi RSDr, nu trebuie să

    depăşească ±25% de-a lungul întregii raze dinamice (ENGL, 2008; Wiseman, 2002, în

    Burns şi Valdivia, 2007). Subliniem faptul că datele utilizate pentru calculele anterioare

    nu acoperă întreaga rază dinamică şi sunt bazate pe un număr redus de măsurători. Cu

    toate acestea considerăm că rezultatele sunt promiŃătoare.

    Tabelul 1.

    Evaluarea justeŃei şi a repetabilităŃii determinărilor cantitative la soia Roundup Ready

    Analiza rt-PCR şi prelucrarea datelor Rezultate Probă R102 R202 R502 S13

    1 1,02 1,89 5,63 57,93 2 0,97 2,09 4,55 64,21 3 1,17 2,21 5,43 63,14

    Determinare

    4 - - 5,04 - ConŃinut OMG teoretic (%) 1 2 5 - Media 1,053 2,063 5,163 61,67 Eroare (bias) (%) 5,333 1,666 3,25 - Abaterea standard a repetabilităŃii (SDr) 0,104 0,162 0,476 3,36 Abaterea std. rel. a repetabilităŃii (RSDr)

    1 9,881% 7,834% 9,224% 5,44% 1 Se obŃine ca raport între abaterea standard şi medie. 2 MRC pentru soia MG. ConŃinutul teoretic de soia MG este de 1% (R10), 2% (R20), respectiv 5% (R50). 3 Probă de soia boabe.

  • Rezumat al tezei de doctorat

    38

    În cazul celorlate probe (i.e. două MRC-uri şi trei probe de soia boabe identificate

    pozitiv în etapa de analiză calitativă) a fost efectuată o singură determinare cantitativă a

    materialului MG derivat din soia GTS 40-3-3. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3.

    3.5.2. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe platforma

    LightCycler 480

    Scopul acestei etape a fost utilizarea unui sistem de cuantificare diferit de cel

    bazat pe instrumentul Rotor-Gene 3000. În acest mod s-a dorit evaluarea influenŃei

    sistemului de cuantificare (instrument + software + master mix) asupra rezultatelor

    analitice.

    Rezultatele nu fost însă cele aşteptate. Amplificarea secvenŃei transgenice Ńintă în

    soluŃia de calibrare PC SOYA a fost problematică, nereuşindu-se optimizarea acestui

    protocol de lucru astfel încât să fie posibilă construirea curbei standard aferentă

    sistemului transgenic şi cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2. O

    posibilă explicaŃie este omologia imperfectă dintre primeri/sonadă şi siturile de alipire de

    pe secvenŃa inclusă în soluŃia de calibrare. SituaŃia este însă mai complexă deoarece alura

    curbelor de amplificare indică mai degrabă prezenŃa fenomenului de inhibiŃie sau

    pregătirea incorectă a probelor standard.

    Sistemul transgenic de detecŃie real-time PCR a funcŃionat însă corespunzător în

    cazul extractelor ADN obŃinute din MRC-uri. Deşi nu s-a efectuat cuantificarea, datele

    obŃinute în cazul mai multor serii de diluŃii indică posibilitatea folosirii acestui protocol

    în scopul dorit.

    ReacŃia corespunzătoare sistemului de referinŃă a funcŃionat de asemenea conform

    aşteptărilor, atât în cazul calibratorului, cât şi a celorlalte probe, acest protocol fiind

    ulterior utilizat pentru evaluarea influenŃei inhibitorilor în extractele ADN .

    3.5.3. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176

    În cadrul acestui experiment, probele cuantificate au fost reprezentate de MRC-

    uri, o parte din rezultatele obŃinute fiind prezentate în Tabelul 2. Modul de prelucrare a

  • Rezumat al tezei de doctorat

    39

    datelor a avut la bază studiile publicate de Foti et al. (2006), Huang şi Pan (2005) şi

    Vaïtilingom et al. (1999). Datele avute la dispoziŃie nu au permis şi evaluarea

    reproductibilităŃii sau a IM.

    Tabelul 2.

    Evaluarea justeŃei şi a repetabilităŃii determinărilor cantitative la porumbul Bt176

    Analiza rt-PCR şi prelucrarea datelor Rezultate Probă B102 B202 B502

    1 0,90 1,91 5,82 2 1,21 2,11 5,15 Determinare 3 1,09 2,45 5,32

    ConŃinut OMG teoretic (%) 1 2 5 Media 1,07 2,16 5,43 Eroare (bias) (%) 6,67 7,83 8,6 Abaterea standard a repetabilităŃii (SDr) 0,156 0,273 0,348 Abaterea std. rel. a repetabilităŃii (RSDr)

    1 14,654 12,659 6,414 1 Se obŃine ca raport între abaterea standard şi medie. 2 MRC pentru porumbul MG. ConŃinutul teoretic de porumb MG este de 1% (B10), 2% (B20), respectiv 5% (B50).

    Conform criteriilor enunŃate de ENGL