Teste serologice in bacteriologie

Determinarea structurii antigenice in bacteriologie se realizeaza prin :

1.reactii de aglutinare (coaglutinare si latex aglutinare )

2. reactii de precipitare

3. Reacţia de fixarea a complementului

In reactia de aglutinare antigenele sunt de natura corpusculara. Reactia de aglutinare consta in rc ac cu ag de pe suprafata unor particule (bacterii, hematii, latex) determinand aglutinarea acestora prin scaderea fortelor electrostatice de repulsie intre particule si formarea unor punti de legatura.

Aglutinarea directa: reprezinta aglutinarea ag naturale ale unor particule de catre ac specifici. Se poate utiliza pt identificarea enterobacteriilor.

Reacţia de coaglutinarea este utilizată, în special în detectarea antigenelor diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şi Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc. Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC 12498) prezintă un conţinut ridicat de proteină A de suprafaţă. Proteina A din peretele celular al stafilococului aureu se leagă de fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulină, lăsând liber fragmentul Fab pentru legarea antigenului. Aglutinarea vizibilă a stafilococilor reprezintă un test pozitiv care indică legătura antigen-anticorp .

De exemplu diagnosticul de laborator in infectia streptococica se face prin :

i) Diagnostic bacteriologic:> testul la bacitracina - se evidentiaza grupul A, singurul sensibil la acest antibiotic> teste de aglutinare indirecta (latexaglutinare)> testul de coaglutinare sau ELISA - se evidentiaza grupurile A, B, C, G> pentru S. pneumoniae se recolteaza sputa (produs patologic) si se efectueaza frotiu> diagnosticul diferential între penumococ si S. viridans se face pe baza reactiei cu bila -testul biolozei Neufeld (pneumococul nu rezista - în prezenta bilei se produce autoliza,  spre deosebire de grupul viridans),  reactiei cu inulina (pneumococul fermenteaza inulina, S. viridans nu), reactiei cu optochin - etil-hidrocupreina (pneumococul e sensibil la optochin, S. viridans nu)> determinarea prezentei capsulei polizaharidice (Ag K), la pneumococ> testul PYR - enterococii sunt PYR pozitivi> cultivarea: mediu agar-sânge (aparitia hemolizei, colonii de tip S sau M)ii) Diagnostic serologic:

> reactia ASLO - pt S. pyogenes; titrul normal ASLO este de 200 unitati (maxim 250).> teste serologice pentru determinarea prezentei si titrului Ac pentru alte structuri antigenice (streptokinaza, hialuronidaza, anti-carbohidrat, anti-MAP)

Determinarea grupelor antigenice:

Streptococul de grup A – sensibil la bacitracina

Testul cu bacitracina – evidentiaza inhibitia dezvoltarii culturii in jurul rondelei cu bacitracina pe o zona de minim 10mm.

Testul Camp – se face pt identificarea grupului B (Agalactie)

Pe geloza sange se insamanteaza o tulpina de stafilococ β hemolitic in striu. Perpendicular se insamanteaza streptococul. Daca streptococul e de grup β elibereaza factorul Camp care mareste hemoliza stafilococului, la intalnirea celor 2 striuri apare o zona de hemoliza mai intensa.

Reactia de aglutinare – pe lama R.de coaglutinare – se foloseste o tulpina de stafilococ, tulpina Cawan1 bogat in proteina (a). Reacţia de coaglutinarea este utilizată, în special în detectarea antigenelor diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şi Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc.

- Reactia de latex-aglutinare – cu trusa antigenic

2. Reacţia de precipitare inelarã

Antigenul şi serul sunt puse în contact în tuburi capilare, astfel încât să nu se amestece, dar să se păstreze interfaţa limpede. Rezultatul pozitiv este dat de apariţia unui precipitat alb la nivelul interfeţei, după 15-20 minute.

Reacţia poate fi utilizată în:

pentru gruparea streptococilor; reacţia Ascoli – folosită în diagnosticul retrospectiv al antraxului; reacţia Vincent-Bellot – utilizată în diagnosticul infecţiilor meningococice.

3.Reacţia de fixarea a complementului este foarte mult utilizată în cercetare şi în laboratoarele clinice în scopul diagnosticãrii infecţiei cu M. pneumoniae, micozelor, pentru identificarea paraziţilor, virusurilor, a infecţiei cu Treponema pallidum (testul Wassermann).

Serologia sifilisului

Sifilisul este o boala infectioasa si contagioasa determinata de Treponema pallidum, spirocheta patogena care se transmite prin contact sexual sau pe cale transplacentara, exceptional prin contact sanguin (intepatura, transfuzie).

De rutina, diagnosticul sifilisului se bazeaza pe metodele serologice care sunt disponibile in majoritatea laboratoarelor. Metodele directe (microscopia cu fond intunecat, imunofluorescenta, inocularea la animal) raman apanajul laboratoarelor de specialitate. Raspunsul imun fata de infectie include producerea de anticorpi fata de o paleta larga de antigene, fiind implicati atat anticorpi nespecifici (anticardiolipina/reagine) cat si anticorpi specifici antitreponemici. Primul raspuns demonstrabil este reprezentat de anticorpii specifici antitreponemici de tip IgM, care pot fi detectati la sfarsitul celei de a 2-a saptamani de infectie; anticorpii antitreponemici de tip IgG apar mai tarziu, in saptamana a patra. Astfel, la debutul simptomatologiei clinice majoritatea pacientilor prezinta anticorpi IgM si IgG.Anticorpii nespecifici se pozitiveaza dupa aproximativ 4 saptamani de la contactul infectant. Tratamentul si infectia HIV asociata pot afecta raspunsul imun. Titrul anticorpilor nespecifici si cel al anticorpilor specifici IgM scade rapid dupa tratamentul adecvat in sifilisul precoce, dar anticorpii specifici IgG persista indefinit.Tinand cont de particularitatile raspunsului imun, testele serologice pentru sifilis pot fi clasificate in 2 mari categorii:1. Teste care pun in evidenta anticorpi nespecifici (teste non-treponemice):- VDRL – Venereal Disease Research Laboratory;- RPR – Rapid Plasma Reagin test.2. Teste care pun in evidenta anticorpi specifici (teste treponemice):- TPHA – Treponema pallidum Haemagglutination Assay – (hemaglutinare pasiva - detecteaza anticorpi totali IgG si IgM);- FTA – ABS (Fluorescent Treponemal Antibody – Absorbtion de tip IgG si IgM);- EIA (de tip IgG si IgM).

SIFILIS PRECOCE (INFECTIOS)

Durata de la expunere Forme clinice

9-90 zile Sifilis primar

6 sapt.-6 luni (4-8 sapt. de la leziunea primara)

Sifilis secundar

≤ 2 ani Sifilis latent precoce

SIFILIS TARDIV (NEINFECTIOS)

> 2 ani Sifilis latent tardiv

3-20 ani Sifilis tertiar (gomatos, cardiovascular, neurosifilis)

SIFILIS CONGENITAL

< 2 ani de la nastere (inclusiv nasterea de fat mort)

Sifilis congenital precoce

≥ 2 ani Sifilis congenital tardiv

Nota: Transmiterea transplacentara se produce in stadiul de de sifilis precoce; au fost descrise insa cazuri si in stadiul de sifilis latent tardiv

Testele non-treponemice sunt rapide, usor de efectuat, au un cost redus si prezinta o sensibilitate foarte buna, in special in stadiul precoce al infectiei. Principalul lor dezavantaj este ca se asociaza cu o rata importanta de rezultate fals pozitive, in special la gravide (la aceasta categorie, aproximativ 28% din rezultatele pozitive pentru RPR pot fi biologic fals pozitive). Rezultatele pot fi exprimate calitativ sau semicantitativ; titrurile VDRL/RPR sunt crescute la pacientii cu infectie acuta, reinfectie sau reactivare a unei infectii din antecedente care nu a fost tratata adecvat. Aproximativ 72-84% din pacientii cu sifilis primar sau secundar prezinta o scadere de 4 ori a titrului VDRL/RPR, la 6 luni dupa incheierea unui tratament corect. Astfel, testele non-treponemice sunt utile nu numai pentru identificarea infectiei ci si pentru monitorizarea eficientei tratamentului.

Testele treponemice sunt folosite pentru a confirma testele screening pozitive. Au o incidenta de rezultate fals pozitive mai scazuta decat testele reaginice. Nu sunt in general recomandate pentru screening-ul infectiei deoarece au sensibilitate mai redusa decat testele non-treponemice in primele 2-3 saptamani ale stadiului de sifilis primar. Acest tip de anticorpi persista toata viata; nu sunt utili in monitorizarea eficientei terapeutice.

Recomandari pentru determinarea serologiei sifilis

In prezenta semnelor si simptomelor de infectie cu Treponema pallidum sau alte boli cu transmitere sexuala

Test screening prenatal (in trimestrul I, III si la nastere)

Test screening premarital

Test screening la angajare, asigurari de viata, etc.

Test screening pentru donatorii de sange si de organe

Detectarea sau excluderea infectiei la pacientii HIV pozitivi

Monitorizarea raspunsului la tratament (RPR cantitativ)

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).

Specimen recoltat - sange venos.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; determinarea se executa imediat; daca acest lucru nu este posibil, serul se stocheaza la 2-8ºC.

Volum proba - minim 1 mL ser.

Cauze de respingere a probei – specimen hemolizat, lipemic sau contaminat bacterian.

Metoda de lucru

Pot fi folosite doua categorii de metode de lucru:

I. METODE CLASICE

VDRL: lipozomii aflati in suspensie produc o reactie de floculare vizibila in prezenta reaginelor din serul pacientului.

RPR (reagin plasma response)

o Antigenul VDRL modificat contine microparticule de carbune care agrega in prezenta anticorpilor de tip reaginic din serul pacientulului

o Reactie calitativa si semicantitativa

o Detecteaza anticorpi nespecifici pentru infectia cu Treponema pallidum produsi ca reactie la materialul lipoid eliberat din celulele afectate ale gazdei si la materialul lipoproteic eliberat de spirochete.

TPHA:

o Reactie de hemaglutinare pasiva intre eritrocite de pui stabilizate si sensibilizate cu un extract antigenic de Treponema pallidum (tulpina Nichols) si anticorpii antitreponemici prezenti in serul bolnavului

o Reactie calitativa si cantitativa

o Detecteaza anticorpi specifici pentru infectia cu Treponema pallidum.

II. METODE IMUNOTURBIDIMETRICE AUTOMATE

A. RPR

● Particulele de polistiren latex captusite cu antigene lipidice (cardiolipina si lecitina) reactioneaza cu anticorpii de tip reaginic din serul pacientului formand aglutinate; aglutinarea induce cresterea turbiditatii amestecului de reactie care poate fi masurata ca absorbanta la 700 nm cu ajutorul unui fotometru; titrul reaginelor poate fi determinat prin masurarea turbiditatii la doua momente diferite, dupa initierea reactiei.

● Reactie cantitativa.

Valori de referinta si exprimarea rezultatului

I. METODE CLASICE

A. Pentru VDRL/RPR:

negativ (-)

pozitiv (de la + la ++++)

Daca se efectueaza un test semicantitativ, se va comunica impreuna cu intensitatea reactiei si titrul corespunzator ultimei dilutii care a indicat un rezultat pozitiv.

B. Pentru TPHA:

negativ (-)

echivoc

pozitiv (de + la ++++).

II. METODE IMUNOTURBIDIMETRICE AUTOMATE

A. Pentru RPR

● rezultatul se exprima in R.U. (unitati RPR); 1 R.U. corespunde unui titru RPR 1/1 la reactia clasica.

● negativ: <1 R.U.

● limita de detectie: 0.4 R.U.

In cazul obtinerii unui rezultat pozitiv la unul sau la ambele teste analizorul repeta automat determinarile folosind o dilutie standard 1/8. In situatia in care titrul anticorpilor este foarte mare se efectueaza dilutii manuale.

Un rezultat pozitiv la oricare din cele 2 teste este verificat si prin metoda clasica; in cazul in care se foloseste numai metoda clasica, un rezultat pozitiv va fi confirmat cu o a doua trusa de reactivi. In cazul in care se obtin rezultate discordante se va solicita repetarea recoltarii probei6.

Interpretarea rezultatelor

Algoritm de diagnostic. Un algoritm simplu pentru diagnosticul de sifilis se face pornind de la VDRL si TPHA.

VDRL = negativ; TPHA = negativ

- serologie negativa

- rezultatul nu exclude un diagnostic de sifilis la debut; in caz de suspiciune clinica se recomanda repetarea serologiei peste 2 saptamani sau efectuarea FTA-ABS IgM sau EIA IgM care se pot pozitiva precoce.

VDRL = negativ; TPHA = pozitiv

- infectie veche tratata

- eventual ar mai putea fi vorba de un sifilis intr-o faza foarte timpurie: in caz de suspiciune clinica se recomanda repetarea serologiei peste 2 saptamani sau efectuarea FTA-ABS IgM sau EIA IgM;

- alte posibilitati: reactie fals pozitiva la TPHA, sifilisul latent tardiv la care diagnosticul este uneori dificil, reactii incrucisate cu treponematozele non veneriene (pian, bejel, pinta) la pacientii originari din zone endemice.

VDRL = pozitiv; TPHA = pozitiv

- sifilis recent sau vechi, netratat sau tratat tarziu

Nota: in sifilisul primar valorile sunt slab pozitive, in cel secundar, titrul anticorpilor este crescut. In absenta semnelor clinice, un nivel la limita al anticorpilor face dificila interpretarea serologica. Se pune problema unui sifilis latent precoce sau a unui tratament antibiotic urmat de pacient. La pacientii tratati tardiv, serologia poate ramane pozitiva, dar urmarirea in dinamica a titrului anticorpilor cu diminuarea semnificativa a VDRL –ului ajuta la stabilirea diagnosticului.

VDRL = pozitiv; TPHA = negativ

- in cazul unui VDRL intens pozitiv, este cel mai probabil vorba de un rezultat biologic fals pozitiv (se pune adesea problema existentei anticorpilor anticardiolipinici); oricum se recomanda repetarea serologiei peste 2-3 saptamani (eventual determinari cantitative in dinamica)

- in cazul unui VDRL slab pozitiv se recomanda efectuarea FTA-ABS; daca acest test este negativ este vorba de un rezultat biologic fals pozitiv; daca testul este pozitiv poate fi vorba de un sifilis precoce si in acest caz se recomanda repetarea serologiei peste 2-3 saptamani (profilul serologic cel mai frecvent intalnit in sifilisul primar este VDRL + ,TPHA +; foarte rar, in stadii precoce ale sifilisului primar, TPHA este negativ, FTA-ABS fiind pozitiv)8;9.

A. Pentru VDRL:

Reactii fals pozitive:

Infectii bacteriene: pneumonie pneumococica, scarlatina, lepra, febra recurenta, endocardita bacteriana, malarie, rickettsioza, psittacoza, leptospiroza, sancrul moale, tuberculoza, pneumonie cu mycoplasma, tripanosomiaza.

Infectii virale: variola, varicela, rujeola, mononucleoza infectioasa, oreion, hepatita virala, SIDA.

Cauze neinfectioase: graviditate, boli hepatice cronice, neoplasme avansate, mielom multiplu, boli ale tesutului de colagen, transfuzii multiple, varsta inaintata.

Serurile puternic lipemice (lactescente) pot influenta testul.

B. Pentru TPHA:

Reactii fals pozitive:

Mononucleoza infectioasa, lupus, lepra, malarie, febra recurenta, leptospiroza Nivel anormal de Ig G sau Ig M

Treponematoze nevenerice: pian, bejel, pinta

Serurile puternic lipemice (lactescente) pot influenta testul.

Diagnostic serologic in virusologie

Bolile virale la aceste boli diagnosticul serologic se pune pe baza prezentei anticorpilor specifici in ser. Dar aceste analize se fac numai in spitalele de boli infectioase si in institutele de cercetare. Pentru depistarea bolilor virale se folosesc urmatorele analize: reactia de hemaglutinare (HA), reactia de fixare a complementului (RFC) si reactia de seroneutralizare (RSN). Cu ajutorul acestor reactii serologice se poate pune diagnosticul de gripa, de rujeola, de oreion, de poliomielita, etc. Ca laboratorul sa poata preciza diagnosticul de boala virala este necesar sa analizeze de doua ori serul bolnavului: la inceputul bolii si dupa 7-10 zile, pentru a constata cresterea concentratiei de anticorpi. Aceste analize se mai fac si pentru cercetarea anticorpilor care iau nastere in organismul omului dupa diferitele vaccinari (contra gripei, rujeolei, poliomielitei, etc.) in vederea aprecierii eficientei vaccinarilor.

O analiza curenta care se face pentru diagnosticul hepatitei virale le tip B este aceea care depisteaza antigenul Australia (Ag Au). Se cunoaste ca exista cel putin doua tipuri de hepatita virala, produse de virusul de tip A si respectiv de tip B.

- tipul A de virus este transmis omului pe cale orala (apa, alimente, maini nespalate) si produce o hepatita cu caracter epidemic si cu o perioada de incubatie scurta, de 2-6 saptamani. Acest tip de hepatita nu se poate diagnostica imunologic deoarece bolnavii nu poseda in sange antigen Australia.

- tipul B de virus este transmis omului prin injectii, transfuzii, operatii, pe cale genitala si probabil pe cale orala. Hepatita produsa de acest virus se intalneste sub forma de cazuri izolate si are o perioada lunga de incubatie (2-6 luni). Acest tip de hepatita se poate diagnostica cu ajutorul laboratorului cautand in singele bolnavului antigenul Australia sau antigenul hepatitei B (Ag HBs), care se

crede ca este chiar virusul hepatitei virale tip B. Trebuie mentionat ca acest antigen se gaseste nu numai in hepatita virala cu icter (galbinare) ci si in hepatita fara icter, fapt care ajuta la stabilirea unui diagnostic si tratament prococe. In unele cazuri antigenul Australia apare in sangele bolnavilor chiar inainte de aparitia primelor semne de boala, situatie care, de asemenea, ajuta la punerea unui diagnostic precoce. Dupa vindecarea fazei acute a hepatitei, la marea majoritate a bolnavilor, antigenul Australia dispare din sange. Persistenta acestui antigen in sangele bolnavului, mai multe luni dupa vindecarea clinica, presupune ca hepatita nu este vindecata din punctul de vedere al laboratorului si ca boala poate trece in hepatita cronica. Trebuie stiut ca exista si bolnavi de hepatita virala acuta tip B, la care nu se poate pune in evidenta antigenul Australia. In concluzie, cercetarea antigenului Australia este importanta pentru:

- diagnosticarea unei hepatite virale acute sau cronice de tip B

- constatarea momentului in care AgAu au disparut din sange (vindecarea bolii)

- depistarea persoanelor chiar sanatoase care poarta virusul in sange acestea prezinta riscul de a transmite si raspandi hepatita virala la alti oameni

- depistarea AgAu la subiectii care doneaza sange; persoanele care poseda AgAu nu pot fi donatori pentru ca sangele lor poate provoca hepatita de transfuzie la persoanele care primesc acest sange.

Reacţia de hemaglutinarea cu participarea virusuri:

Unele virusuri, de exemplu virusul gripal, paragripal, urlian, adenovirusul şi virusul febrei galbene pot produce aglutinarea eritrocitelor umane, precum şi a eritrocitelor de cocoş, por de Guineea, şoarece şi alte animale.

Această reacţie este utilizată pentru detectarea şi titrarea virusurilor hemaglutinante în materialele de cultură. Pe de altă parte, inhibarea reacţiei de hemaglutinare poate fi folosită pentru decelarea anticorpilor în probele de ser. Aceasta este cunoscută ca testul inhibării hemaglutinării virale (HAI).

Prin legarea covalentã sau necovalentã de diferitele antigene de pe suprafaţa hematiei, utilitatea testului poate fi extinsă şi la detectarea anticorpilor pentru alte antigene decât cele aflate pe hematii.

Reacţia de neutralizare

Această reacţie se bazează pe capacitatea anticorpului de a bloca efectul antigenelor toxice, litice sau infectante prin combinaţii specifice dintre antigen şi anticorp „in vivo” sau „in vitro”.

Neutralizarea virusurilor

Neutralizarea activităţii virale este cea mai sensibilă şi specifică metodă pentru determinarea identităţii unui izolat şi pentru determinarea anticorpilor specifici în serul pacientului.Dacă anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iar infectivitatea este blocată. O fracţiune a virusului infectant poate rămâne chiar şi în prezenţa antiserului specific, astfel încât infecţia poate fi mai degrabă amânată, decât blocată complet. Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitate cunoscută. Pentru testarea serologică, suspensia din virusurile de referinţă este testată împotriva serurilor de testat.Aceastã reacţie se poate folosi pentru evidenţierea:- efectului citopatic (cel mai frecvent);

- hemadsorbţiei şi hemaglutinãrii pentru evidenţierea orthomyxovirusurilor şi paramyxovirusurilor;- inhibiţiei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu roşu-fenol prin dezvoltarea celulelor, dacă replicarea virusurilor a fost neutralizată;

- reducerii “plãcii”: celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectate aşezarea monostratificatã cu soluţie de agar nutritiv, care conţine un colorant vital, cum ar fi roşu neutru; celulele infectate apar ca “plãci” necolorate faţă de fundalul roşu format de celulele viabile; reducerea numărului de “plãci” indică reacţia de neutralizare.

Diagnosticul serologic in HIV

Boală infecţioasă transmisibilă specific umană, caracterizată printr-o evoluţie stadială cronică, cu manifestări clinice iniţiale de boală acută benignă, urmate de o lungă stare de sănătate aparentă şi în final de reapariţia manifetărilor clinice.

Diagnosticul de laborator

-Serologic – detectare a anticorpilor anti-HIV

-Virusologic – detectare sau cuantificare a ARN viral sau ADN proviral

-Imunologic –numărătoare LCD4

Diagnosticul serologic

detectarea anticorpilor anti HIV

1.Teste standard

-Teste serologice de depistare – ELISA -testul screening

-Teste serologice de confirmare – Western blot (Wb)

2.Teste alternative – necesită confirmare prin teste standard

-Home Kits

3.Teste rapide

-Probe biologice: sânge integral, ser, sânge capilar, plasmă,

imunoglobuline, sânge uscat, lichid oral, urină;

-Exemple: SUDS, Ora Sure, Calypte HIV1

Rezultat pozitiv = Individ infectat cu HIV care poate infecta şi pe alţii

≠Individul are SIDA sau că va dezvolta în mod necesar SIDA

Rezultat negativ = În momentul testării, nu au fost detectaţi anticorpii anti HIV

≠ Individul nu este sigur infectat cu HIV sau că este imun /rezistent la HIV

- testele serologice sunt negative in "fereastra imunologica" = perioada dintre momentul infectarii cu HIV si aparitia anticorpilor HIV- dureaza variabil, de obicei cateva saptamani.

Diagnostic serologic in micologie

Metode si tehnici folosite in efectuarea examenului micologic

Termenul generic de fung defineste o grupare de structuri biotice eucariote, imobile, unicelulare sau organizate in structuri pluricelulare, a caror evidentiere individuala necesita dispozitive optice de tipul microscoapelor. In alternativa cu acest termen, dar cu aceeasi semnificatie semantica se utilizeaza si denumirile de micromiceti, ciuperci microscopice, mucegaiuri, drojdii etc. Sa facut aceasta precizare expresa pentru a accentua faptul ca obiectul de studiu al micrologiei medicale sunt ciupercile microscopice, bioentitati capabile sa manifeste o puternica si extinsa acctiune antisanogena, atat prin colonizarea substraturilor alimentare si furajera pe care le depreciaza sau carora le confera un grad inalt de toxicitate, cat si prin afectarea directa a organismelor omului si animalelor, declansand stari morbide specifice (micoze) a caror evolutie este de cele mai multe ori trenanta si rebela la tratament.

In acest scop se utilizeaza mai multe metode de examen paraclinic :- testul florescentei;- examenul microscopic al probelor patologice;- examenul frotiurilor dupa colorare;- insamantarea probelor patogenice pe medii specifice;- examenul caracterelor biochimice;- examenul histologic;- diagnosticul experimental;- identificarea AND-ului specific;- diagnosticul imunologic.

Diagnosticul imunologic- Diagnosticul imunologic se bazeaza fie pe identificarea antigenelor sau anticorpilor circulanti, fie pe evidentierea starii hipersensibilizare. In functie de aceasta, se folosesc metode serologice pentru identificarea anticorpilor sau antigenelor si metode de evidentiere a starii de hipersensibilizare.Cercetarea starii de hipersensibilitate cutanata- pentru evidentierea starii de hipersensibilizare se utilizeaza antigene solubile metabolice sau somatice care sunt injectate intradermic.Se pune, astfel, in evidenta hipersensibilizarea de tip intarziat si, mai rar, hipersenzibilizarea de tip imediat.- Pentru prepararea tricofitinei se folosesc una sau mai multe specii de dermatofiti, mai ales cele bogate in organe de fructificare (de exemplu Trichiphyton mentagrophytes).- Levurina este un antigen preparat dintr-un filtrat steril de cultura de Candida albicans- Hipersensibilizarea intarziata apare in aproximativ 15 zile dupa infectia micotica si dureaza mai mult timp. Pozitivitatea in cazul reactiei intarziate se caracterizeaza prin aparitia, la 24-72 de ore, a unei reactii papulo-eritematoase cu diametrul de cel putin 0,5 cm. Reactia poate fi mai puternica cu ulcere si nercoze. Reactia negativa la inocularea intradermica nu inseamna intotdeauna absenta infectie.- Anergia poate fi cauzata de carente alimentare, malnutritie, diabet, cancer, etc.- Hipersensibilizarea de tip imediat este pusa in ecidenta rapid (15-30 minute) si se caracterizeaza printr-o reactie papulo-eritematoasa de tip urticariform.- In cazul reactiilor intense, se pot constata si fenomene de ordin general: cefalee,curbatura, stare febrila. Uneori, se pot produce o exacerbare a focarelor de boala existente (reactie de focar). Pot aparea si mici leziuni diseminate in vecinatatea focarului sau in alte zone ale corpului. Este vorba de asa-numitele tricofitide.- Evidentierea anticorpilor poate fi facuta utilizand diferite forme de dezvoltare ale micetelor (spori, filamente miceliene) sau antigene solubile. In acest scop, sunt utilizate urmatoarele metode: reactia de aglutinare, reactia de precipitare in lichid sau geloza, reactia imunoezimatica(ELISA). Pentru a fi eficiente, aceste metode trebuie sa fie specifice si sensibile. Metoda imunoelectroforezei pare a fi cea mai specifica.- False reactii pozitive pot apare la pacientii care au trecut prin boala sau care au fost injectati cu antigene. Reactii negative pot fi intalnite la animalele imunodepresate, din diverse motive, datorita titrul redus de anticorpi. De asemenea, la inceputul infectiei micotice (8-14 zile) titlu de anticorpi este redus.- Nivelul anticorpilor este cu atat mai mare cu cat invazia tisulara este mai pronuntata, dar prezenta anticorpilor nu este o dovada a unei micoze evolutive. [2]- Coccidioidina este folosita ca antigen in reactia de precipitare pentru diagnosticul coccidioidomicozei.- Extracte carbohidrate din culturi de Sporotrichum schenckii sau din mediul de cultura unde a crescut fungul au fost folosite ca antigene in testul de precipitare pentru sporotrihoza [1]Evidentierea antigenelor ( de exemplu Criptococcus neoformans, Aspergillus funigatus) prin aglutinarea particulelor de latex sensibilizate cu anticorpi monoclonali.Metode imunohistochimice – punerea in evidenta a antigenelor tisulare prin intermediul anticorpilor poli sau monoclonali prin tehnici de imunoflorescenta sau de imunoenzimologie.

Markeri cu rol diagnostic bazati pe reactia antigen anticorp

HLA-B27

Testul are drept scop sa stabileasca daca este prezent sau nu pe suprafata leucocitelor antigenul HLA-B27, pentru a evalua posibilitatea existentei unei boli autoimune asociate cu acest marker.

Antigenul HLA-B27 este intalnit la 90-95% din pacientii cu spondilita ankilopoietica, detinand un rol important in aparitia bolii, in timp ce incidenta sa in populatia generala este de aproximativ 8%.

Rudele de gradul intai HLA-B27 pozitive ale pacientilor cu spondilita ankilopoietica au intr-un procent de 10-20% simptome clinice si radiologice de boala sau numai modificari radiologice. Studiile pe gemenii monozigoti arata o concordanta a bolii de 60%;  pentru cei dizigoti concordanta este de 20-25%.

Intre HLA-B27 si o proteina a agentului infectios Klebsiella pneumoniae exista un mimetism molecular, ceea ce ar putea implica existenta unei patogenii bacteriene a spondilitei ankilopoietice. Alte afectiuni autoimune asociate cu HLA-B27 sunt:

-sindromul Reiter (artrita reactiva): incidenta HLA-B27 este de 60-80%;

-artrita idiopatica juvenila: incidenta HLA-B27 este de 50% in forma de debut cu artrita asociata entesitei;

-artrita psoriazica: incidenta HLA-B27 este de 50% la pacientii care asociaza afectare axiala;

-bolile inflamatorii ale intestinului: incidenta HLA-B27 este de 50% la pacientii care asociaza spondilita.

Pregatire pacient – nu este necesara o pregatire speciala.

Specimen recoltat – sange venos.

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul.

Cauze de respingere a probei - folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate.

Metoda – reactie de polimerizare in lant (PCR) cu detectie colorimetrica dupa hibridizarea cu sonde specifice pe stripuri; testul detecteaza urmatoarele subtipuri HLA-B27: 02-17, 19-21, 24, 25, 27, 28, 30, 32-36.

Valori de referinta – HLA-B27 negativ.

Limite si interferente

HLA-B27 nu este un test screening pentru o spondilartropatie seronegativa. Rezultatul trebuie interpretat intotdeauna in contextul clinic al pacientului.

Testul nu detecteaza urmatoarele subtipuri de HLA-B27: 01, 18, 23, 26, 29, 31

CEA

CEA este o glicoproteina cu greutate moleculara de 180kD, care are o componenta carbohidrat variabila (45-60%). La fel ca AFP (alfa-fetoproteina), CEA apartine grupului antigenelor oncofetale care sunt produse in perioada embrionara si fetala. In timpul dezvoltarii embrionului, CEA se formeaza in pancreas si in tractul gastrointestinal ca un antigen de suprafata celulara. Sinteza CEA este supresata dupa nastere si, in consecinta, valorile acestuia sunt scazute la adultul sanatos (apare in cantiati foarte mici in tesutul intestinal, pancreatic si hepatic).

Cresteri semnificative ale concentratiei CEA sunt intalnite in diverse neoplazii (cancer colorectal, pancreatic, gastric, pulmonar, mamar, cervical, ovarian).

Determinarea CEA in lichidul cefalorahidian poate fi utila in diagnosticarea unor tumori primare si secundare ale sistemului nervos central, iar dozarea lui in lichidul pleural este utila in diagnosticul pleureziilor paraneoplazice din carcinoame pulmonare, mamare, digestive si ovariene (in asociere cu CA 125). 

Recomandari pentru determinarea CEA - monitorizarea pacientilor (raspuns la tratament, posibil indicator al recurentei tumorale si al prognosticului) cu diferite neoplazii (cancer colorectal, mamar, pulmonar, gastric, pancreatic, ovarian)

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).

Specimen recoltat - sange venos.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare;

Volum proba – minim 0.5 mL ser.

Cauze de respingere a probei

• specimen hemolizat;• specimen expus la temperatura ridicata;• specimen contaminat bacterian.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemilumiscenta (ECLIA).

Valori de referinta - <3.4 ng/mL (nefumatori);  <4.3 ng/mL (fumatori).

Limite si interferente

CEA nu poate fi folosit in scop de screening.

Cresteri usoare sau moderate (rar peste 10 ng/mL) sunt intalnite la fumatori si in unele afectiuni benigne ale intestinului (colita ulceroasa, boala Crohn, polipoze), pancreasului (pancreatite), ficatului (ciroza hepatica, hepatita cronica), rinichilor (insuficienta renala), plamanilor (emfizem pulmonar) si glandelor mamare.

AFP

AFP reprezinta prima proteina (antigen) decelata in asociatie cu unele tipuri de neoplazii; este o glicoproteina omoloaga albuminei, sintetizata in cursul perioadei fetale in tractul gastrointestinal, ficat si sacul vitelin. In functie de varsta gestationala, AFP ajunge pe cale transplacentara in circulatia materna, atingand un maxim de concentratie in saptamanile 32-36.

Dupa nastere, nivelul seric de AFP scade progresiv, dar cu fluctuatii mari, astfel ca valori similare cu ale adultului normal sunt atinse abia dupa aproximativ 10 luni.

La adult se intalnesc concentratii crescute de AFP- tranzitorii sau persistente – in afectiuni hepatice benigne si in procese de regenerare hepatica; niveluri foarte crescute se asociaza cu dezvoltarea carcinomului primitiv hepatic si cu tumori germinative de origine testiculara, ovariana sau extragonadala.

Decelarea AFP in serul uman se face prin diverse metode , in functie de cresterea gradului de determinare (adica a gradului de sensibilitate ,in sensul de a depista cantitati din ce in ce mai mici de AFP).Aceste metode au fost ierarhizate aftfel:

-imunoelectroforeza

-imunodifuzia

-difuzia dubla

-electroimunodifuzia cantitativa

-contraimunoelectroforeza

-metode radio-imunologice

Recomandari pentru determinarea AFP

Ca marker tumoral:

Indicatii absolute:

• suspiciune de carcinom hepatocelular;    

• tumori germinative non-seminomatoase de origine testiculara, ovariana sau extragonadala;

• monitorizarea tratamentului la pacienti cu tumori germinative sau carcinom hepatocelular.

La pacientii cu tumori germinative AFP trebuie determinat impreuna cu HCG total. In cancerul testicular acesti markeri trebuie evaluati inainte de orhiectomie si apoi masurati seriat dupa interventia chirurgicala. Rata de reducere a nivelului seric trebuie comparata cu rata normala de disparitie a AFP (timp de injumatatire < 7 zile) si HCG total (timp de injumatatire < 3 zile). Programul de monitorizare include determinari lunare de AFP, HCG total si LDH in decursul primului an si la 2 luni in urmatorii 2 ani.

Orice pacient cu examen histopatologic sugestiv pentru seminom pur, dar care prezinta AFP crescut trebuie considerat ca avand tumora testiculara non-seminomatoasa si tratat corespunzator. In plus AFP reprezinta un factor de prognostic independent pentru tumorile testiculare non-seminomatoase.

Indicatii relative

• monitorizarea pacientilor cu ciroza hepatica pentru depistarea precoce a cancerului hepatic;

• monitorizarea pacientilor cu risc crescut de tumori germinative (criptorhidism, gemeni monozigoti, unul dintre ei avand cancer testicular)

Ca marker de monitorizare in sarcina

Daca scopul determinarii AFP este screening-ul prenatal pentru depistarea afectiunilor de tip anencefalie, spina bifida, boala Langdon Down, trisomie 21, trisomie 18 etc., gravida va mentiona exact varsta sarcinii stabilita echografic sau data ultimei menstruatii. Serul matern poate fi recoltat intre saptamanile 14-19 de sarcina, momentul ideal pentru recoltare fiind saptamanile 16-18 de sarcina. Daca se obtine o valoare crescuta pentru AFP, determinarea se va repeta dupa 1 saptamana.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).

Specimen recoltat - sange venos.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza serul proaspat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C.

Volum proba – minim 0.5 mL ser.

Cauze de respingere a probei

• specimen hemolizat;

• specimen expus la temperatura ridicata;

• specimen contaminat bacterian.

NOTA: specimenul care prezinta turbiditate sau particule in suspensie trebuie clarificat prin centrifugare.

Metode

a) imunochimica cu detectie prin electrochemilumiscenta (ECLIA)

b) imunochimica cu detectie prin chemiluminiscenta.

Valori de referinta

Pentru AFP ca marker tumoral valorile variaza in functie de metoda de lucru:

a)<7.0 ng/mL

b)<6.0 ng/mL.

La gravide rezultatele se interpreteaza in functie de varsta gestationala.

Limite si interferente

Nivelurile de AFP sunt rareori crescute in tumorile testiculare aflate in stadiul I de boala.

Desi cu o incidenta scazuta, cresteri ale AFP mai pot fi inregistrate si in alte tumori: gastrointestinale, pancreatice, pulmonare.

Printre afectiunile benigne in care pot aparea niveluri crescute de AFP se numara: hepatita, ciroza, obstructia de cai biliare, sindromul ataxie-telangiectazie, tirozinemia ereditara.

Dupa amniocenteza valoarea obtinuta pentru AFP nu corespunde nivelului real.

BETA 2 MICROGLOBULINA

Beta 2 microglobulina (β2-M) este o proteina cu masa moleculara de 11,8 kDa, ce constituie lantul usor al antigenelor complexului major de histocompatibilitate (HLA) clasa I, fiind, prin urmare, prezenta in membrana tuturor celulelor nucleate. La persoanele sanatoase, beta 2 microglobulina este sintetizata la o rata relativ constanta in timpul proceselor de regenerare celulara, principala sursa de producere fiind limfocitul.

Deoarece limfocitul este principala sursa de sinteza, toate afectiunile caracterizate prin proliferare limfocitara, cum ar fi: infectiile virale, bolile imune, mielomul multiplu, leucemiile limfocitare cronice, limfoamele Hodgkin si non Hodgkin sunt asociate cu cresteri ale nivelului plasmatic de β2-M. In afectiunile ce asociaza o activare exagerata a raspunsului imun celular ca bolile autoimune, mononucleoza infectioasa, episoadele de reject de transplant se inregistreaza,

de asemenea, valori ridicate ale β2-M. Pacientii cu SIDA, in special cei cu infectii oportuniste, prezinta o valoare ridicata a β2-M in ser.

Recomandari pentru determinarea beta 2 microglobulinei - monitorizarea evolutiei si evaluarea terapiei in mielomul multiplu, boala Hodgkin, limfomul non-Hodgkin si leucemia limfatica cronica; monitorizarea progresiei infectiei cu HIV; detectarea episoadelor de reject dupa un transplant allogenic de maduva hematogena; detectarea infectiei incipiente cu CMV; monitorizarea functiei renale dupa transplant. 

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).

Specimen recoltat - sange venos.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza serul proaspat;

Volum proba – 1 mL ser.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat.

Metoda - imunochimica cu detectie prin chemiluminiscenta (CLIA).

Valori de referinta - 0,9 – 2,0 mg/L.

Interpretarea rezultatelor

Concentratia serica a β2-M, precum si excretia ei urinara ofera informatii importante doar in prezenta manifestarilor clinice, fiind un marker fidel pentru evaluarea stadiului si prognosticului bolii.

In leucemia limfatica cronica nivelul seric al β2-M creste proportional cu stadiul bolii; astfel intr-un studiu clinic pacientii netratati prezinta valori plasmatice ce variaza intre 2–2,8 mg/L in stadiul 0; 2,7–5,3 mg/L in stadiile I si II si, respectiv, 4,4–16,9 mg/L in stadiile III si IV. Formele cu grad scazut de malignitate se caracterizeaza prin nivele ce nu depasesc 5 mg/L. Pe de alta parte 71% din remisiunile complete se intalnesc la pacientii cu valori ale β2-M sub 3 mg/L.

In limfoamele non-Hodgkin cu celula mare β2-M impreuna cu lactat dehidrogenaza (LDH) constituie markeri predictivi pentru absenta recaderilor si supravietuire. Astfel, niveluri crescute ale ambilor markeri (β2-M > 3 mg/L) se asociaza cu remisiuni si supravietuire de scurta durata.

In cazul bolnavilor cu limfom Hodgkin valorile plasmatice ale β2-M se coreleaza cu incarcatura tumorala si prognosticul bolii; astfel 5-32% din pacientii in stadiile I si II si 43-71% din cei din stadiile III si IV prezinta nivele  >3 mg/L. Valoarea concentratiei serice a β2-M este un factor

important in evaluarea evolutiei bolii, lucru demonstrat intr-o serie de studii clinice, ce dovedesc ca un procent mic de pacienti cu remisiune completa au nivele plasmatice mai mari de 3 mg/L.

In mielomul multiplu β2-M este cel mai valoros factor prognostic disponibil de rutina, fiind inclus in sistemul international de stadializare a acestei afectiuni. Acesta depinde atat de incarcatura tumorala cat si de functia renala. Niveluri crescute de β2-M constituie un marker predictiv pentru decesul precoce, precum si pentru esecul tratamentului cu doze mari. Formulele care corecteaza concentratia β2-M pentru efectul prezentei insuficientei renale nu au imbunatatit valoarea sa predictiva; valoarea β2-M este prognostica si la pacientii cu functie renala normala. Totusi dupa doi ani de supravietuire concentratiile initiale de β2-M isi pierd valoarea prognostica.